KR102379824B1 - 간기능 개선에 효능이 있고, 기호성이 향상된 한약재 혼합 음료의 제조방법 및 이의 제조방법으로 제조된 음료 - Google Patents
간기능 개선에 효능이 있고, 기호성이 향상된 한약재 혼합 음료의 제조방법 및 이의 제조방법으로 제조된 음료 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 간기능 개선에 효능이 있고, 기호성이 향상된 한약재 혼합 음료의 제조방법 및 이의 제조방법으로 제조된 음료에 관한 것으로, 울금, 대추, 칡, 숙지황, 당귀, 황기, 천궁, 구기자, 건생강, 상지, 복령, 인진쑥 및 지구자를 세척한 후, 상기 한약재를 혼합한 다음 열수 추출하여 한약재 혼합 추출물을 획득하는 단계;를 포함하여 제조된 한약재 혼합 음료는 알코올 섭취에 의해 손상된 간기능을 회복시키고, 알코올 섭취에 의해 증가된 혈청 및 간 조직의 지질을 감소시키는 효과가 우수하고, 이취 및 이미가 나지 않고 소비자들의 기호에 부합한다는 이점이 있다.
더욱이 혼합물 추출시, 일반 정제수를 사용하는 것 이외에 염지하수를 추가로 혼합함으로써 고농축 천연 용존 미네랄 및 수용성 칼슘을 음료에 포함할 수 있고, 염지하수의 기능성 물질을 음료에 포함함으로써 손쉽게 섭취할 수 있다는 장점이 있다.
더욱이 혼합물 추출시, 일반 정제수를 사용하는 것 이외에 염지하수를 추가로 혼합함으로써 고농축 천연 용존 미네랄 및 수용성 칼슘을 음료에 포함할 수 있고, 염지하수의 기능성 물질을 음료에 포함함으로써 손쉽게 섭취할 수 있다는 장점이 있다.
Description
본 발명은 간기능 개선에 효능이 있고, 기호성이 향상된 한약재 혼합 음료의 제조방법 및 이의 제조방법으로 제조된 음료에 관한 것이다.
간은 동물의 주요 기관중 하나로 해독작용, 단백질의 합성, 글리코겐과 같은 양분의 저장, 지방의 대사, 담즙과 요소의 생성 및 적혈구의 분해 등 여러 역할을 수행하며, 다양한 생화학적 작용을 조절하면서 평상시 건강의 유지를 위한 기본적인 조절기능을 가지고 있다.
간은 우리 체내에서 독소로 인식될 수 있는 각종 약물이나 술, 기타 독성물질을 분해, 대사하여 배설될 수 있는 형태로 만들어 소변이나 담즙을 통해서 배출하는 작용을 한다. 간경변증 환자에서는 이러한 해독작용이 저하되어 약물, 술, 독성물질에 의한 위험성이 증가될 수 있으므로 유의하여야 한다. 그리고, 간은 중요한 면역기관이며 동시에 체내의 살균작용을 담당한다. 대장 점막을 통해서 혈액에 흡수되어 몸으로 들어간 균은 간을 거치면서 쿠퍼 세포라는 대식작용(균을 잡아먹는 기능)을 하는 세포에 의해 다 죽기 때문에 약 1% 미만의 세균만이 무사히 간을 통과해서 나갈 수 있다. 그러나 간경변증 환자에게서는 이 기능이 저하되어 각종 세균에 감염되기 쉬우며 대표적인 예가 여름철에 익히지 않은 어패류를 먹고 발생하는 비브리오 패혈증으로 특히 간경변증 환자에게서 집중적으로 발생한다.
따라서 평소 간에 무리가 가지 않는 생활습관과 올바른 식생활, 적절한 운동을 통해 간을 보호하기 위한 노력이 필요하다. 하지만 현대인들은 바쁜 일상으로 인하여 이러한 건강관리를 위한 균형을 유지하는데 어려움을 겪고 있으므로 간의 건강 상태를 유지할 수 있도록 도움이 되는 식품을 섭취할 필요가 있다.
한편, 한국등록특허 제1930026호에 간기능 개선에 효능이 있는 흑마늘 음료의 제조방법이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1817282호에 간기능 개선 및 항산화 활성이 증진된 새싹보리 혼합 음료의 제조방법이 개시되어 있지만, 본 발명의 간기능 개선에 효능이 있고, 기호성이 향상된 한약재 혼합 음료의 제조방법 및 이의 제조방법으로 제조된 음료에 관해 개시된 바 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로, 울금, 대추, 칡, 숙지황, 당귀, 황기, 천궁, 구기자, 건생강, 상지, 복령, 인진쑥 및 지구자를 혼합한 다음 열수 추출하여 획득한 한약재 혼합 추출물의 제조방법을 제공하고, 상기 제조방법으로 제조된 한약재 혼합 추출물을 포함하는 음료가 간기능 개선에 효과적이며, 기호성이 향상되는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은
1) 울금, 대추, 칡, 숙지황, 당귀, 황기, 천궁, 구기자, 건생강, 상지, 복령, 인진쑥 및 지구자를 세척한 후, 물과 상기 세척된 한약재를 혼합하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 한약재 혼합물을 열수 추출하는 단계;를 포함하는 간기능 개선에 효능이 있고, 기호성이 향상된 한약재 혼합 음료의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 간기능 개선에 효능이 있고, 기호성이 향상된 한약재 혼합 음료를 제공한다.
본 발명은 간기능 개선에 효능이 있고, 기호성이 향상된 한약재 혼합 음료의 제조방법 및 이의 제조방법으로 제조된 음료에 관한 것으로, 울금, 대추, 칡, 숙지황, 당귀, 황기, 천궁, 구기자, 건생강, 상지, 복령, 인진쑥 및 지구자를 세척한 후, 상기 한약재를 혼합한 다음 열수 추출하여 한약재 혼합 추출물을 획득하는 단계;를 포함하여 제조된 한약재 혼합 음료는 알코올 처리에 의해 감소된 간 세포 재생율을 증진시키고, 동물 실험에서 알코올 섭취에 의해 증가된 혈중 알코올 함량 및 아세트알데히드의 함량을 감소시키고, 알코올 섭취에 의해 증가된 혈중 AST(aspartate transaminase) 및 ALT(alanine transaminase)의 활성을 감소시키며, 알코올 섭취에 의해 감소된 간 조직 내의 ADH(alcohol dehydrogenase) 및 ALDH(aldehyde dehydrogenase)의 활성을 증가시키며, 알코올 섭취에 의해 증가된 혈청 및 간 조직의 지질을 감소시키는 것을 확인하였다. 또한, 상기 간기능 개선 효과를 확인한 본 발명의 음료는 이취 및 이미가 나지 않고 소비자들의 기호에 부합한다는 이점이 있다.
더욱이 혼합물 추출시, 일반 정제수를 사용하는 것 이외에 염지하수를 추가로 혼합함으로써 고농축 천연 용존 미네랄 및 수용성 칼슘을 음료에 포함할 수 있고, 염지하수의 기능성 물질을 음료에 포함함으로써 손쉽게 섭취할 수 있다는 장점이 있다.
도 1은 본 발명의 한약재 혼합 음료의 알코올 손상에 대한 세포 재생능을 확인한 결과이다. CON은 음성대조군이고, 실리마린은 양성대조군이다. 실험예 1은 일반 정제수를 이용하여 추출한 한약재 혼합 추출물을 포함하는 음료 섭취군이고, 실험예 2는 염지하수가 포함된 정제수를 이용하여 추출한 한약재 혼합 추출물을 포함하는 음료 섭취군이다.
도 2는 알코올을 섭취한 동물모델에서 본 발명의 한약재 혼합 음료에 의한 혈중 알코올 농도 변화(A) 및 아세트알데히드 농도 변화(B)를 확인한 결과이다. NC는 음성대조군이고, EtOH CON은 알코올만 섭취한 대조군이며, 실리마린은 양성대조군이다. 실험예 1은 일반 정제수를 이용하여 추출한 한약재 혼합 추출물을 포함하는 음료 섭취군이고, 실험예 2는 염지하수가 포함된 정제수를 이용하여 추출한 한약재 혼합 추출물을 포함하는 음료 섭취군이다.
도 3은 알코올을 섭취한 동물모델에서 본 발명의 한약재 혼합 음료에 의한 혈중 AST 활성 변화(A) 및 ALT 활성 변화(B)를 측정한 결과이다. NC는 음성대조군이고, EtOH CON은 알코올만 섭취한 대조군이며, 실리마린은 양성대조군이다. 실험예 1은 일반 정제수를 이용하여 추출한 한약재 혼합 추출물을 포함하는 음료 섭취군이고, 실험예 2는 염지하수가 포함된 정제수를 이용하여 추출한 한약재 혼합 추출물을 포함하는 음료 섭취군이다.
도 4는 알코올을 섭취한 동물모델에서 본 발명의 한약재 혼합 음료에 의한 혈중 ADH 활성 변화(A) 및 ALDH 활성 변화(B)를 측정한 결과이다. NC는 음성대조군이고, EtOH CON은 알코올만 섭취한 대조군이며, 실리마린은 양성대조군이다. 실험예 1은 일반 정제수를 이용하여 추출한 한약재 혼합 추출물을 포함하는 음료 섭취군이고, 실험예 2는 염지하수가 포함된 정제수를 이용하여 추출한 한약재 혼합 추출물을 포함하는 음료 섭취군이다.
도 2는 알코올을 섭취한 동물모델에서 본 발명의 한약재 혼합 음료에 의한 혈중 알코올 농도 변화(A) 및 아세트알데히드 농도 변화(B)를 확인한 결과이다. NC는 음성대조군이고, EtOH CON은 알코올만 섭취한 대조군이며, 실리마린은 양성대조군이다. 실험예 1은 일반 정제수를 이용하여 추출한 한약재 혼합 추출물을 포함하는 음료 섭취군이고, 실험예 2는 염지하수가 포함된 정제수를 이용하여 추출한 한약재 혼합 추출물을 포함하는 음료 섭취군이다.
도 3은 알코올을 섭취한 동물모델에서 본 발명의 한약재 혼합 음료에 의한 혈중 AST 활성 변화(A) 및 ALT 활성 변화(B)를 측정한 결과이다. NC는 음성대조군이고, EtOH CON은 알코올만 섭취한 대조군이며, 실리마린은 양성대조군이다. 실험예 1은 일반 정제수를 이용하여 추출한 한약재 혼합 추출물을 포함하는 음료 섭취군이고, 실험예 2는 염지하수가 포함된 정제수를 이용하여 추출한 한약재 혼합 추출물을 포함하는 음료 섭취군이다.
도 4는 알코올을 섭취한 동물모델에서 본 발명의 한약재 혼합 음료에 의한 혈중 ADH 활성 변화(A) 및 ALDH 활성 변화(B)를 측정한 결과이다. NC는 음성대조군이고, EtOH CON은 알코올만 섭취한 대조군이며, 실리마린은 양성대조군이다. 실험예 1은 일반 정제수를 이용하여 추출한 한약재 혼합 추출물을 포함하는 음료 섭취군이고, 실험예 2는 염지하수가 포함된 정제수를 이용하여 추출한 한약재 혼합 추출물을 포함하는 음료 섭취군이다.
본 발명은
1) 울금, 대추, 칡, 숙지황, 당귀, 황기, 천궁, 구기자, 건생강, 상지, 복령, 인진쑥 및 지구자를 세척한 후, 물과 상기 세척된 한약재를 혼합하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 한약재 혼합물을 열수 추출하는 단계;를 포함하는 간기능 개선에 효능이 있고, 기호성이 향상된 한약재 혼합 음료의 제조방법에 관한 것이다.
상기 단계 1)의 혼합은 물 100L에 대하여 울금 0.5~1.5kg, 대추 0.25~0.75kg, 칡 0.25~0.75kg, 숙지황 0.05~0.15kg, 당귀 0.05~0.15kg, 황기 0.05~0.15kg, 천궁 0.05~0.15kg, 구기자 0.1~0.2kg, 건생강 0.1~0.3kg, 상지 0.5~1.5kg, 복령 0.05~0.15kg, 인진쑥 0.02~0.07kg 및 지구자 0.25~0.75kg을 혼합하는 것이고, 바람직하게는 물 100L에 대하여 울금 0.8~1.2kg, 대추 0.4~0.6kg, 칡 0.4~0.6kg, 숙지황 0.08~0.12kg, 당귀 0.08~0.12kg, 황기 0.08~0.12kg, 천궁 0.08~0.12kg, 구기자 0.13~0.17kg, 건생강 0.15~0.25kg, 상지 0.8~1.2kg, 복령 0.08~0.12kg, 인진쑥 0.04~0.06kg 및 지구자 0.4~0.6kg을 혼합하는 것이며, 더 바람직하게는 물 100L에 대하여 울금 1kg, 대추 0.5kg, 칡 0.5kg, 숙지황 0.1kg, 당귀 0.1kg, 황기 0.1kg, 천궁 0.1kg, 구기자 0.15kg, 건생강 0.2kg, 상지 1kg, 복령 0.1kg, 인진쑥 0.05kg 및 지구자 0.5kg을 혼합하는 것이지만, 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 단계 2)의 열수 추출은 80~120℃에서 3~5시간 동안 추출하는 것일 수 있고, 바람직하게는 90~110℃에서 3~5시간 동안 추출하는 것이며, 더 바람직하게는 100℃에서 4시간 동안 추출하는 것이지만, 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현 예에서 상기 단계 1)의 물은 순수한 물 또는 염지하수가 혼합된 물을 사용할 수 있고, 바람직하게는 정제수 또는 5~15%(v/v)의 염지하수가 포함된 정제수를 사용할 수 있으며, 더 바람직하게는 10%(v/v)의 염지하수가 포함된 정제수를 사용하는 것이지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어 '염지하수'는 육지에서 스며든 담수와 바다에서 흘러든 해수가 합쳐져 생성된 것으로, 물속에 녹아있는 염분(鹽分) 등 총 용존 고형물(總溶存固形物)의 함량이 2,000㎎/L 이상인 암반대수층 안의 지하수이다.
염지하수는 높은 미네랄 함량을 보이며, 수온은 16~18℃, pH는 7.3~7.5로 저온 안정성과 계절변동 및 특성변화가 적은 물리적 장점이 있으며, 외부환경에 노출되지 않아 일반세균, 중금속 등 유해성분이 없는 청정한 수자원이다.
본 발명의 염지하수는 염지하수를 획득할 수 있는 곳이라면 어느 곳이라도 상관 없으나, 바람직하게는 경상북도 울진군에서 획득한 염지하수를 사용하였다.
상기 한약재 혼합 음료는 상기 단계 2) 이후에, 한약재 혼합 열수 추출물 100 중량부에 대하여 타우린 0.1~0.5 중량부, 과라나 추출물 분말 0.05~0.15 중량부 및 사양벌꿀 1.5~2.5 중량부를 추가로 더 혼합할 수 있고, 바람직하게는 한약재 혼합 열수 추출물 100 중량부에 대하여 타우린 0.2~0.4 중량부, 과라나 추출물 분말 0.08~0.12 중량부 및 사양벌꿀 1.9~2.3 중량부를 추가로 더 혼합하는 것이며, 더 바람직하게는 한약재 혼합 열수 추출물 100 중량부에 대하여 타우린 0.33 중량부, 과라나 추출물 분말 0.11 중량부 및 사양벌꿀 2.18 중량부를 추가로 더 혼합하는 것이지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현 예에서, 상기 간기능 개선에 효능이 있고, 기호성이 향상된 한약재 혼합 음료는 바람직하게는
1) 울금, 대추, 칡, 숙지황, 당귀, 황기, 천궁, 구기자, 건생강, 상지, 복령, 인진쑥 및 지구자를 세척한 후, 물 100L에 대하여 상기 세척된 울금 0.5~1.5kg, 대추 0.25~0.75kg, 칡 0.25~0.75kg, 숙지황 0.05~0.15kg, 당귀 0.05~0.15kg, 황기 0.05~0.15kg, 천궁 0.05~0.15kg, 구기자 0.1~0.2kg, 건생강 0.1~0.3kg, 상지 0.5~1.5kg, 복령 0.05~0.15kg, 인진쑥 0.02~0.07kg 및 지구자 0.25~0.75kg을 혼합하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 한약재 혼합물을 80~120℃에서 3~5시간 동안 열수 추출하는 단계;를 포함하여 제조될 수 있고,
더 바람직하게는
1) 울금, 대추, 칡, 숙지황, 당귀, 황기, 천궁, 구기자, 건생강, 상지, 복령, 인진쑥 및 지구자를 세척한 후, 물 100L에 대하여 상기 세척된 울금 0.8~1.2kg, 대추 0.4~0.6kg, 칡 0.4~0.6kg, 숙지황 0.08~0.12kg, 당귀 0.08~0.12kg, 황기 0.08~0.12kg, 천궁 0.08~0.12kg, 구기자 0.13~0.17kg, 건생강 0.15~0.25kg, 상지 0.8~1.2kg, 복령 0.08~0.12kg, 인진쑥 0.04~0.06kg 및 지구자 0.4~0.6kg을 혼합하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 한약재 혼합물을 90~110℃에서 3~5시간 동안 열수 추출하는 단계;를 포함하여 제조될 수 있으며,
더욱더 바람직하게는
1) 울금, 대추, 칡, 숙지황, 당귀, 황기, 천궁, 구기자, 건생강, 상지, 복령, 인진쑥 및 지구자를 세척한 후, 물 100L에 대하여 상기 세척된 울금 1kg, 대추 0.5kg, 칡 0.5kg, 숙지황 0.1kg, 당귀 0.1kg, 황기 0.1kg, 천궁 0.1kg, 구기자 0.15kg, 건생강 0.2kg, 상지 1kg, 복령 0.1kg, 인진쑥 0.05kg 및 지구자 0.5kg을 혼합하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 한약재 혼합물을 100℃에서 4시간 동안 열수 추출하는 단계;를 포함하여 제조되는 것이지만, 이에 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 간기능 개선에 효능이 있고, 기호성이 향상된 한약재 혼합 음료에 관한 것이다.
상기 음료는 간기능 개선 효과가 있고, 이취 및 이미가 나지 않아 소비자 기호도가 향상되는 효과가 있다.
이하, 제조예 및 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 제조예 및 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
제조예 1. 배합 재료에 따른 한약재 혼합 추출물의 제조
한약재 혼합 음료의 제조를 위해, 하기 표 1에 개시된 바와 같이 한약재를 혼합한 후, 100℃에서 4시간 동안 열수 추출하였다.
재료(단위) | 실험예 1 | 비교예 1 | 비교예 2 | ||
정제수(L) | 100 | 100 | 100 | ||
울금(kg) | 1.00 | 0.6 | - | ||
대추(kg) | 0.50 | - | 0.60 | ||
칡(갈근)(kg) | 0.50 | 0.6 | 1.00 | ||
숙지황(건지황)(kg) | 0.10 | - | - | ||
당귀(kg) | 0.10 | 0.5 | - | ||
황기(kg) | 0.10 | 0.5 | - | ||
천궁(kg) | 0.10 | - | 0.50 | ||
구기자(kg) | 0.15 | - | 1.00 | ||
건생강(kg) | 0.20 | 0.6 | - | ||
상지(kg) | 1.00 | 0.6 | - | ||
복령(kg) | 0.10 | - | 0.50 | ||
인진쑥(kg) | 0.05 | 1.00 | 0.80 | ||
지구자(kg) | 0.50 | - | - |
제조예 2. 배합비에 따른 한약재 추출물의 제조
배합비에 따른 한약재 혼합 음료를 제조를 위해, 하기 표 2에 개시된 바와 같이 배합비에 따라 한약재를 혼합한 후, 100℃에서 4시간 동안 열수 추출하였다.
재료(단위) | 실험예 1 | 비교예 3 | 비교예 4 |
정제수(L) | 100 | 100 | 100 |
울금(kg) | 1.00 | 0.50 | 1.50 |
대추(kg) | 0.50 | 0.80 | 0.10 |
칡(갈근)(kg) | 0.50 | 0.20 | 0.40 |
숙지황(건지황)(kg) | 0.10 | 0.15 | 0.05 |
당귀(kg) | 0.10 | 0.05 | 0.25 |
황기(kg) | 0.10 | 0.10 | 0.08 |
천궁(kg) | 0.10 | 0.20 | 0.10 |
구기자(kg) | 0.15 | 0.50 | 0.30 |
건생강(kg) | 0.20 | 0.30 | 0.10 |
상지(kg) | 1.00 | 1.00 | 0.50 |
복령(kg) | 0.10 | 0.10 | 0.10 |
인진쑥(kg) | 0.05 | 0.10 | 0.02 |
지구자(kg) | 0.50 | 0.40 | 0.90 |
제조예 3. 염지하수를 첨가한 정제수를 이용한 한약재 추출물의 제조
상기 실험예 1과 동일한 배합으로 한약재 추출물을 제조하되, 염지하수가 10%(v/v) 포함된 정제수를 사용하여 열수 추출하였다(실험예 2).
본 발명에 사용된 염지하수는 염지하수 1L 당 칼슘이온 1168.7mg, 마그네슘이온 1001mg, 칼륨이온 103.4mg, 나트륨이온 8757.7mg을 포함하고 있다.
염지하수를 첨가한 정제수를 이용하여 한약재 추출물을 제조한 후, 성분 분석을 의뢰한 결과, 첨가하지 않은 나트륨 및 칼슘이 각각 56.4mg/100ml, 19.6mg/100ml 측정되었으며, 이는 수용성 나트륨과 칼슘은 해양암반수에서 기인된 것으로 추정된다.
제조예 4. 타우린, 과라나 추출물 분말 및 사양벌꿀이 혼합된 한약재 혼합 음료의 제조
상기 실험예 1과 동일한 배합으로 제조된 한약재 혼합 열수 추출물 100 중량부에 대하여 타우린 0.33 중량부, 과라나 추출물 분말 0.11 중량부 및 사양벌꿀 2.18 중량부를 추가로 더 혼합하여 한약재 혼합 음료를 제조하였다(실험예 3).
과라나 추출물의 분말은 과라나 열수 추출물을 분말화한 후, 덱스트린과 혼합한 것이다.
실시예 1. 한약재 혼합 음료의 간기능 개선 효과
상기 실험예 1 및 실험예 2의 한약재 혼합 추출물의 간기능 개선 효과를 확인하였다.
1) 알코올에 의해 손상된 간 세포의 재생활성 측정
실험에 사용된 일반 간 세포(Chang cell)는 한국 세포주 은행(KCLB)으로부터 분양받아 사용하였으며, 10%(v/v) FBS를 첨가한 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
세포 재생활성은 세포 생존율을 측정하여 확인하였으며, 세포 생존율은 MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 분석 방법을 이용하였다.
구체적으로, 96 웰 플레이트에 1×105cells/well로 세포를 동일하게 분주하고, 24시간 동안 배양한 후, 각 시료를 100㎍/mL의 농도가 되도록 배지에 첨가한 다음 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 재배양하였다. 음성대조군(CON)을 제외한 모든 군에 5%(v/v) 에탄올을 처리하고, 24시간 후 상층액을 제거한 뒤 MTT 용액을 첨가하고 3시간 동안 추가 배양하였다. 그 후, 상층액을 제거하고 200㎕의 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 첨가한 다음 불용성의 포즈마잔 크리스탈(formazan crystal)을 용해한 후, 상기 용해액을 570nm에서 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 계산하였다. 측정 결과는 음성대조군에 대한 상대적 세포 생육도(relative cell viability)로 표기하였다.
그 결과, 도 1에 개시된 바와 같이 본 발명의 실험예 1 및 실험예 2는 에탄올 첨가에 의해 감소된 세포 생존율을 증가시키므로, 간 세포 재생활성이 있다는 것을 확인하였다.
2) 알코올을 섭취한 동물모델에서 간기능 개선 효과 확인
- 실험동물 및 분류
생후 5주령(130~150g)된 SD(Sprague-Dawley)계 수컷 흰쥐를 오리엔트바이오(Gyeonggi-do, Korea)로부터 분양 받아, 1주일 동안 순화시켰다. 그 후, 6주령이 되었을 때 난괴법(randomized block design)으로 그룹을 분리하였다.
사육실의 온도는 22℃, 습도는 55%를 유지하였으며, 6시부터 18시까지 일광조절을 유지하는 환경에서 사육하였다. 적응기간 동안 동물들의 특이사항을 관찰하여 기록하였으며, 식이와 물은 자유로이 섭취할 수 있도록 하였다.
- 실험군 처치방법
실험 그룹은 음성대조군(NC), 알코올 투여군(EtOH CON), 양성대조군으로 에탄올 및 실리마린 2.5 또는 5mg/kg BW 투여군, 본 발명의 실험예 1(일반 정제수를 이용하여 추출한 한약재 혼합 추출물을 포함하는 음료) 및 실험예 2(염지하수가 포함된 정제수를 이용하여 추출한 한약재 혼합 추출물을 포함하는 음료)를 250 또는 500mg/kg BW 투여한 군으로 분류하였다.
알코올과 시험물질은 흰 쥐의 kg 단위 체중 당 2mL 용량으로 경구 투여하였다. 또한, 사료 섭취로 인해 나타날 수 있는 위장관을 통한 알코올의 흡수 방해 현상을 배재하기 위해 알코올을 경구 투여하기 전 18시간 동안 절식시킨 후, 1주 동안은 20%(v/v) EtOH을 처리한 후 30분 후 시험 물질을 급여하였으며, 2주째는 40%(v/v) EtOH을 처리한 후 30분 후 시험 물질을 급여하였다.
혈중 에탄올 농도, 아세트알데히드 농도 및 효소 활성을 측정하기 위해 14일 째 투여 후 18시간 동안 절식 시킨 뒤 15일 째 알코올과 각각의 시료를 경구 투여 하였으며, 알코올 투여 3시간 후 마취시켜 복부 하대정맥에서 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액은 4℃, 3,000rpm에서, 15분간 원심 분리하여 혈청을 분리하였으며, 분리된 혈청으로부터 알코올 및 아세트알데히드 농도, AST, AST, ADH 및 ALDH 효소 활성을 측정하였고, 지질함량을 분석하였다.
적출한 실험동물의 간 조직은 PBS(phosphate buffered saline) 용액에 여러 번 세척하여 표면의 이물질을 제거한 후 칭량하였고, 액체 질소에 급냉시킨 후 시료 분석 시까지 -70℃에서 보관 후 간 조직의 지질 함량 분석에 사용하였다.
- 결과
① 혈중 알코올 및 아세트알데히드 측정
혈중 알코올 농도는 Bucher(1951)의 방법을 이용하여 제조한 에탄올 측정용 kit(R-Biopharm, Germany)로 분석하였다. 이인산 칼륨 완충액(Potassium diphosphate buffer, pH 9.0) 3ml에 NAD 1 타블렛(0.8mg)을 녹인 후, 0.1mL의 혈청을 첨가한 다음 3분 동안 반응시켰다. 그 후 340nm에서 흡광도 측정한 값을 A1이라 하고, 다시 0.05mL의 ADH를 가하여 5분 동안 반응시킨 후 340nm에서 흡광도 측정한 값을 A2라 하였으며, 알코올 농도는 하기 식 1과 같이 계산하였다.
[식 1]
알코올(mmol/L)=[(V×MW)/(ε×d×v×2×1000)]×ΔA
V: 최종 부피
v: 샘플 부피
MW: 분석에 사용된 기질의 분자량
d: 빛 통로(light path)
ε: 340nm에서 NADH의 소화 계수(extinction coefficient)=6.3
ΔA: (A2-A1)샘플-(A2-A1)공백(blank)
혈청 아세트알데히드 농도는 Lundquist(1974)의 방법을 이용하여 제조한 아세트알데히드 측정용 kit(R-Biopharm, Germany)로 분석하였다. 이인산 칼륨 완충액(Potassium diphosphate buffer, pH 9.0) 3ml에 NAD 1 타블렛(0.8mg)을 녹인 후, 0.2mL의 혈청을 첨가한 다음 3분 동안 반응시켰다. 그 후 340nm에서 흡광도 측정한 값을 A1이라 하고, 다시 0.05mL의 ALDH를 가하여 5분 동안 반응시킨 후 340nm에서 흡광도 측정한 값을 A2라 하였으며, 아세트알데히드 농도는 알코올 농도 계산식과 동일하게 계산하였다.
그 결과, 도 2에 개시된 바와 같이 알코올 투여에 의해 증가된 알코올 농도 및 아세트알데히드 농도가 본 발명의 실험예 1 및 실험예 2 처리에 의해 감소하는 것을 확인하였다.
② 혈중 AST 및 ALT 효소 활성 측정
혈중 AST 측정은 Reitman-Frankel(1957)의 방법을 이용하여 제조한 AST-ALT 측정용 kit(AM 101, Asan, Korea)를 사용하여 측정하였다. 기질액(α-케토글루탐산, L-아스파르트산) 1mL을 37℃에서 5분 동안 전 반응 시키고 혈청 0.2mL을 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응한 다음 정색시약(2,4-dinitro phenylhydrazine) 1mL을 첨가하여 실온에서 20분간 방치한 후 0.4N NaOH 10mL을 첨가하여 반응을 중지한 다음 505nm에서 증류수를 대조로 흡광도를 측정하였다. AST 활성치는 표준용액의 검량선에 기준하여 산출하였다.
혈중 ALT 측정은 Reitman-Frankel(1957)의 방법을 이용하여 제조한 AST-ALT 측정용 kit(AM 101, Asan, Korea)를 사용하여 측정하였다. 기질액(α-케토글루탐산, L-아스파르트산) 1mL을 37℃에서 5분 동안 전 반응 시키고 혈청 0.2mL을 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응한 다음 정색시약(2,4-dinitro phenylhydrazine) 1mL을 첨가하여 실온에서 20분간 방치한 후 0.4N NaOH 10mL을 첨가하여 반응을 중지한 다음 505nm에서 증류수를 대조로 흡광도를 측정하였다. ALT 활성치는 표준용액의 검량선에 기준하여 산출하였다.
그 결과, 도 3에 개시된 바와 같이 알코올 투여에 의해 증가된 AST 및 ALT 활성이 본 발명의 실험예 1 및 실험예 2 처리에 의해 감소하는 것을 확인하였다.
③ 혈중 ADH 및 ALDH 효소 활성 측정
간 조직 내 ADH 활성도는 Bergmeyer의 방법(1974)에 의하여 측정하였다. 0.2M NaOH/글리신 버퍼(pH 9.6)에 0.67mM NAD 용액과 효소액 0.05mL를 첨가하여 37℃에서 5분간 전 반응시켰다. 그 후, 100mM 에탄올을 첨가하여 혼합한 다음 즉시 340nm에서 흡광도를 측정하였다. 상기 용액을 다시 37℃에서 5분간 반응시킨 후, 340nm에서의 흡광도로 NADH의 생성량을 측정하고 표준 검량선을 이용하여 활성도를 산출하였다. 효소의 활성도는 1분간 1mg의 단백질이 생성한 NADH의 양을 nmol로 표기하였다.
ALDH 활성도는 Koivula와 Koivusalo 방법(1975)을 이용하여 측정하였다. 0.1M 피로인산사나트륨 버퍼(tetrasodium pyrophosphate decahydrate buffer)에 13.3mM NAD 용액, 16.7mM 피라졸 용액 그리고 효소액 0.05mL를 첨가하여 37℃에서 5분간 전 반응시켰다. 여기에 60mM 프로피온알데히드(propionaldehyde) 용액을 첨가한 후 즉시 340nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 후 상기 용액을 다시 37℃에서 5분간 반응시켜 반응종료 후 340nm에서의 흡광도로 NADH의 생성량을 측정하였고 표준 검량선을 이용하여 그 활성도를 산출하였다. 효소의 활성도는 1분간 1mg의 단백질이 생성한 NADH의 양을 nmol로 표기하였다.
그 결과, 도 4에 개시된 바와 같이 알코올 투여에 의해 감소되었던 ADH 및 ALDH 활성이 본 발명의 실험예 1 및 실험예 2 처리에 의해 증가하는 것을 확인하였다.
④ 혈중 및 간 조직의 지질 함량 측정
혈중 및 간 조직의 총 콜레스테롤은 Allain 등(1974)의 효소법을 응용한 측정용 시약(AM 202-K, 아산제약)을 사용하여 측정하였다. 혈청 콜레스테롤은 CE(cholesterol ester) 및 유리 콜레스테롤 두 형태로 존재하므로, 이들 모두를 정량하기 위하여 혈청 중 에스테르형의 콜레스테롤을 콜레스테롤에스테라제(cholesterol esterase)에 의해, 지방산과 유리형 콜레스테롤을 콜레스테롤산화효소(cholesterol oxidase)에 의해 Δ4-콜레스텐온(cholestenon)으로 바꾸어 과산화효소와 기질인 H2O2, 페놀, 4-아미노-안티피린을 혼합하여 적색으로 발색시키고 500nm에서 흡광도를 측정한 후 콜레스테롤 표준곡선과 비교하여 정량하였다.
간 조직 콜레스테롤은 Folch 등(Folch et al., 1957)의 방법을 수정하여 사용하였다. 간 조직 1g을 취한 후 6mL 클로로포름:메탄올(2:1, v/v) 용액과 2mL 증류수로 균질화하고, 상기 균질액을 4℃, 1,000rpm에서, 10분간 원심분리하여 하층액(클로로포름 층)을 획득한 후 분석에 이용하였다. 하층액 500㎕를 취한 후 24시간 동안 자연건조시키고, 50㎕ 트립톤X100:클로로포름(1:1, v/v) 용액을 첨가한 후 섞어주었다. 그 후 450㎕ 클로로포름으로 희석한 뒤 총량이 500㎕가 되도록 하고 이 용액 10㎕를 취한 후 12시간 동안 건조시켜 측정에 사용하였다.
혈청 및 간 조직 지질추출물 중 중성지질 정량은 효소법에 의한 정량용 kit 시약(AM 157S-K, 아산제약)으로 측정하였다. 간 조직 지질추출물은 총 콜레스테롤 정량과 동일하게 하층액을 사용하였으며, 하층액 10㎕를 취하여 12시간 동안 자연건조 시킨 후 50㎕ 메탄올로 용해시켜 kit로 정량하였다.
혈청 및 간 조직의 HDL-C(High density lipoprotein cholesterol)의 정량은 효소법에 의한 정량용 kit 시약(AM 203, 아산제약)으로 측정하였다. 간 조직 지질추출물은 총 콜레스테롤 정량과 동일한 방법으로 추출하여 측정에 사용하고, 콜레스테롤 표준액과 비교하여 정량하였다.
혈청 및 간 조직의 LDL-C(Low density lipoprotein cholesterol)의 정량은 중성지질 함량이 400mg/dL 이상일 때 Friedewald 공식에 의해 계산되므로, 하기 식 2에 의해 계산하였다.
[식 2]
LDL-C=TC-[HDL-C+(TG/5)
동맥경화지수(Athrogenic index, AI)는 하기 식 3에 의해 계산하였다.
[식 3]
AI=[(TC-HDL-C)]/HDL-C
그 결과, 하기 표 3에 개시된 바와 같이 알코올 투여에 의해 증가되었던 혈중 TG, TC, LDL-C 및 동맥경화지수가 본 발명의 실험예 1 및 실험예 2 처리에 의해 감소하였고, 알코올 투여에 의해 감소하였던 HDL-C는 본 발명의 실험예 1 및 실험예 2 처리에 의해 증가하는 것을 확인하였다.
또한, 하기 표 4에 개시된 바와 같이 알코올 투여에 의해 증가되었던 간 조직의 TG 및 TC가 본 발명의 실험예 1 및 실험예 2 처리에 의해 감소하였다.
Parameter | Serum | |||||
TG (mg/dL) |
TC (mg/dL) |
HDL-C (mg/dL) |
LDL-C (mg/dL) |
동맥경화지수 | ||
NC | 35.17±1.63 | 65.74±1.16 | 35.13±2.27 | 22.88±1.87 | 0.87±0.03 | |
EtOH CON | 51.32±3.28 | 80.48±2.28 | 25.22±2.06 | 39.15±3.40 | 2.19±0.08 | |
양성대조군 (Silymarin) |
2.5mg/kg | 45.79±1.69 | 73.23±2.55 | 29.36±3.84 | 33.23±1.53 | 1.49±0.10 |
5mg/kg | 37.30±4.83 | 65.43±3.98 | 36.91±3.56 | 24.57±2.90 | 0.77±0.06 | |
실험예 1 | 250mg/kg | 45.28±3.77 | 74.90±4.26 | 29.03±2.89 | 31.79±2.99 | 1.58±0.13 |
500mg/kg | 43.11±2.61 | 69.98±1.32 | 32.89±3.13 | 27.89±3.02 | 1.13±0.20 | |
실험예 2 | 250mg/kg | 45.32±2.03 | 75.18±2.01 | 28.99±2.11 | 31.29±1.66 | 1.59±0.09 |
500mg/kg | 42.57±4.28 | 70.12±3.00 | 32.11±3.45 | 28.33±1.83 | 1.18±0.11 |
Parameter | Liver | |||
TG (mg/g) |
TC (mg/g) |
|||
NC | 14.32±0.22 | 2.81±0.11 | ||
EtOH CON | 18.01±1.76 | 4.02±0.12 | ||
양성대조군 (Silymarin) |
2.5mg/kg | 16.46±1.02 | 2.69±0.23 | |
5mg/kg | 15.63±0.89 | 2.40±0.31 | ||
실험예 1 | 250mg/kg | 16.59±1.23 | 3.06±0.25 | |
500mg/kg | 15.87±0.34 | 2.98±1.02 | ||
실험예 2 | 250mg/kg | 16.23±0.44 | 2.99±0.08 | |
500mg/kg | 15.88±1.06 | 2.83±0.23 |
실시예 2. 한약재 혼합 음료의 관능검사
본 발명의 한약재 혼합 음료의 관능검사는 30~50대 여성 15명 및 남성 15명 총 30명을 대상으로 실시하였다. 맛, 향, 색감, 종합적 기호도에 대한 관능검사는 9점 척도법을 사용하여 진행하였으며, 점수가 높을수록 긍정적 평가를 의미한다.
1) 배합 재료에 따른 한약재 혼합 추출물이 포함된 음료
배합 재료에 따른 한약재 혼합 추출물이 포함된 음료의 관능검사 결과, 색감의 차이는 실험예 1, 비교예 1 및 비교예 2에서 거의 없었으나, 실험예 1은 쓴맛이 중화되고, 한약재 특유의 향이 감소하여 비교예 1 및 비교예 2에 비해 쉽게 섭취할 수 있었고, 종합 기호도가 가장 현저하였다.
맛 | 향 | 색감 | 종합 기호도 | |
실험예 1 | 8.4 | 7.9 | 7.4 | 8.5 |
비교예 1 | 5.6 | 5.5 | 7.3 | 5.6 |
비교예 2 | 5.3 | 5.2 | 7.4 | 5.1 |
2) 배합비 재료에 따른 한약재 혼합 추출물
배합비에 따른 한약재 혼합 추출물이 포함된 음료의 관능검사 결과, 색감의 차이는 실험예 1, 비교예 3 및 비교예 4에서 거의 없었고, 실험예 1이 비교예 3 및 4에 비해 쓴맛이 적고, 이취가 없어 부드럽게 섭취할 수 있었고, 종합 기호도가 가장 우수하였다.
맛 | 향 | 색감 | 종합 기호도 | |
실험예 1 | 8.4 | 7.9 | 7.4 | 8.5 |
비교예 3 | 7.8 | 7.5 | 7.4 | 7.5 |
비교예 4 | 7.5 | 7.4 | 7.3 | 7.3 |
또한, 실험예 1과 염지하수가 첨가된 실험예 2는 종합적 기호도에 차이가 없었으며, 타우린, 과라나 추출물 분말 및 사양벌꿀이 혼합된 실험예 3의 음료는 실험예 1에 비해 단맛이 강화되어 더욱 편하게 섭취할 수 있어 기호도가 가장 우수하였다.
Claims (6)
1) 울금, 대추, 칡, 숙지황, 당귀, 황기, 천궁, 구기자, 건생강, 상지, 복령, 인진쑥 및 지구자를 세척한 후, 5~15%(v/v)의 염지하수가 포함된 물 100L에 대하여 상기 세척된 울금 0.8~1.2kg, 대추 0.4~0.6kg, 칡 0.4~0.6kg, 숙지황 0.08~0.12kg, 당귀 0.08~0.12kg, 황기 0.08~0.12kg, 천궁 0.08~0.12kg, 구기자 0.13~0.17kg, 건생강 0.15~0.25kg, 상지 0.8~1.2kg, 복령 0.08~0.12kg, 인진쑥 0.04~0.06kg 및 지구자 0.4~0.6kg을 혼합하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 한약재 혼합물을 90~110℃에서 3~5시간 동안 열수 추출하는 단계;를 포함하는 간기능 개선에 효능이 있고, 기호성이 향상된 한약재 혼합 음료의 제조방법.
2) 상기 단계 1)의 한약재 혼합물을 90~110℃에서 3~5시간 동안 열수 추출하는 단계;를 포함하는 간기능 개선에 효능이 있고, 기호성이 향상된 한약재 혼합 음료의 제조방법.
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제1항에 있어서, 상기 단계 2) 이후에, 한약재 혼합 열수 추출물 100 중량부에 대하여 타우린 0.1~0.5 중량부, 과라나 추출물 분말 0.05~0.15 중량부 및 사양벌꿀 1.5~2.5 중량부를 추가로 더 혼합하는 단계;를 추가하는 것을 특징으로 하는 간기능 개선에 효능이 있고, 기호성이 향상된 한약재 혼합 음료의 제조방법.
제1항 또는 제5항의 제조방법으로 제조된 간기능 개선에 효능이 있고, 기호성이 향상된 한약재 혼합 음료.
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