KR102366667B1 - Anti-met 항체 및 그 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 작용제성 anti-MET 항체와 질병의 치료학적 치료를 위한 이의 용도에 관한 것이다. 본 항체는 MET로 알려진 인간 및 마우스 간세포 성장 인자 (HGF) 수용체에 높은 친화성으로 결합하고, 인간 및 마우스 둘다에서 MET의 작용제이므로, HGF 결합 효과와 비슷한 분자적 및 세포성 효과를 발휘한다.

Description

ANTI-MET 항체 및 그 용도
본 발명은 MET라고도 알려져 있는 인간 및 마우스 간세포 성장인자 (HGF) 수용체와 높은 친화성으로 결합하는, 항체 및 항원 결합 단편에 관한 것이다. 이 항체 및 항원 결합 단편은 인간 및 마우스에서 MET의 작용제로서, HGF 결합 효과와 비슷한 분자적 효능과 세포성 효능을 나타낸다. 또한, 본 발명은 MET의 작용제인 항체 및 항원 결합 단편의 치료학적 용도에 관한 것이다.
HGF는 세포 증식, 이동, 분화 및 생존을 포함한 특징적인 생물학적 기능들을 매개하는 간엽 기원의 다면발현성 사이토카인 (pleiotropic cytokine)이다. 또한 MET로 지칭되는 HGF 수용체는 모든 상피 세포, 내피 세포, 근육 세포, 신경 세포, 조골 세포, 조혈 세포 및 다양한 면역계 구성성분 등의 다양한 조직들에서 발현된다.
HGF 및 MET의 신호전달은 배아 발생 과정에서 핵심적인 역할을 수행하는데, 전구 세포의 이동을 안내하고 세포의 생존 또는 사멸을 결정한다. 성인에서는, HGF/MET 신호전달은 보통 때는 쉬고 있다가 상처 치유 및 조직 재생시 재개된다. 일부 암 및 종양은 숙주 유기체에서 종양의 생존 및 증식을 촉진하기 위해 HGF/MET 신호전달을 이용한다. 따라서, HGF-MET 축 (axis)의 저해는, 비록 성공율이 제한적이긴 하지만, 항암 치료에 인기 있는 타겟이 되어 왔다.
재조합 HGF는, 조직 치유 및 재생에서의 그 역할로 인해, 퇴행성 질환, 염증 질환, 자가면역 질환, 대사 질환 및 이식 관련 장애 등의 다수 병태의 치료제로서도 연구되어 왔다. 그러나, 재조합 HGF는 약리학적 특성이 좋지 않아, 생물학적으로 활성 상태가 되기 위해서는 단백질분해에 의한 활성화 (protelytic activation)가 요구되며, 활성화되면 생체내 반감기가 매우 짧고, 공업적인 제조가 복잡하고, 비용이 많이 든다.
HGF를 모방하는 방식으로 MET를 활성화하는 작용제성 (agonistic) anti-MET 항체가 대안으로서 제시된 바 있다.
HGF 활성을 적어도 부분적으로 모방하는 다음과 같은 항체들이 개시된 바 있다: (i) 3D6 마우스 항-인간 MET 항체 (미국 특허 제 6,099,841); (ii) 5D5 마우스 항-인간 MET 항체 (미국 특허 제 5,686,292); (iii) NO-23 마우스 항-인간 MET 항체 (미국 특허 제 7,556,804 B2); (iv) B7 인간 나이브 항-인간 MET 항체 (미국 특허 출원번호 2014/0193431 A1); (v) DO-24 마우스 항-인간 MET 항체 (Prat et al., Mol Cell Biol. 11, 5954-5962, 1991; Prat et al., J Cell Sci. 111, 237-247, 1998); 및 (vi) 항체 DN-30 마우스 항-인간 MET 항체 (Prat et al., Mol Cell Biol. 11, 5954-5962, 1991; Prat et al., J Cell Sci. 111, 237-247, 1998).
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지금까지 제조된 작용제성 anti-MET 항체, 예를 들어, 배경기술에서 언급된 것들은 종종 길항성 분자를 동정하고자 하는 공정에서 부산물로서 얻어진 것으로, 치료학적 용도를 위한 작용제 분자로서 명시적으로 설계된 것은 아니다. 또한, 종래의 anti-MET 항체의 가장 분명한 한계는, (인간 나이브 파지 라이브러리를 이용해 동정된 B7을 제외하고는) 이 항체들이 마우스 시스템에서 구축되었다는 것이고; 그래서, 이러한 항체는 마우스 MET에 교차 반응성을 나타내진 않을 것으로 보인다. 자기-항원과의 미미한 교차 반응성이 원칙적으로는 가능하더라도, 이러한 상호작용은 일반적으로 매우 낮은 친화성을 가진다.
교차 반응성의 부재가 마우스 암 모델에서는 (마우스 암 모델은 인간 이종이식체를 이용하므로) 중요한 것은 아니지만, 항체가 마우스 조직 및 세포에 대해 작용해야 할 필요가 있는, 재생 의학 또는 비-암성 인간 질병들에 대한 전-임상 마우스 모델에서는 인간과 마우스 MET 간의 항체 교차 반응성이 중요한 요건이다.
전-임상 모델에서 항체를 평가하기 위해서는, 작용제성 anti-MET 항체는 마우스 MET와 교차 반응하여야 할 뿐만 아니라, 이 항체는 인간 MET에 대한 친화성과 동일하거나 또는 비슷한 친화성으로 마우스 MET에 결합하는 것이 바람직하며, 또한 이 항체는 인간 시스템에서 이 항체가 유발하는 효과와 동일하거나 비슷한 효과를 마우스 시스템에서 유발하는 것이 바람직하며 - 그렇지 않다면 전-임상 모델에서 수행되는 실험으로는 인간 상황을 예측하지 못할 것이다. 실시예에서 입증된 바와 같이, 종래의 anti-MET 작용제 항체들 중 어느 것도 마우스 MET에 대해 친화성을 나타내지 않으며, 종래의 어떠한 항체도 마우스 및 인간 시스템 둘다에서 동일 내지 유사한 수준의 결합 및 작용제 효과를 발휘하지 못하는 것은 분명하다.
본 발명은 인간 및 마우스 MET 둘다에 고 친화성으로 결합하도록 설계 제조된 anti-MET 작용제 항체를 제공한다. 이러한 항체는, (i) 인간 및 마우스 MET 생물 시스템 둘다에서 작용제 활성을 나타내며 - 즉, 이들 항체는 MET 신호전달을 유발하며 - 일부는 HGF와 비슷하거나 또는 더 높은 신호전달을 가짐; (ii) 완전한 스펙트럼 (full spectrum)의 HGF-유발성 생물학적 활성을 유도하여, 재조합 HGF의 유효한 대체물을 제시하며; (iii) 종래의 항체와 직접적으로 비교해 마우스 MET에 대한 결합성이 우수하고, (iv) 1 pM 정도의 낮은 농도에서도 생물학적으로 유의한 작용제 활성을 나타내고, (v) 마우스에서 혈장내 반감기가 수일이어서, 치료학적 항체용으로는 매우 낮은 용량인 1 ㎍/kg으로도 이미 약리학적으로 포화된 농도에 도달하며, (vi) 마우스의 급성 신장 손상 모델에서 신장 기능과 신장 온전성을 보존하고, (vii) 마우스의 급성 간 손상 모델에서 간 부전을 예방하고, 간세포 손상을 길항하며, (viii) 마우스의 만성 간 손상 모델에서 항-섬유성, 항-염증성 및 친(pro)-재생 활성을 나타내며, (ix) 마우스 궤양성 결장염 모델과 마우스 염증성 장 질환 모델에서 체중 감소를 방지하고, 장 출혈을 약화시키고, 결장 온전성을 보존하고, 염증을 억제하고, 상피 재생을 촉진하며, (x) 1형 당뇨병 마우스 모델에서 인슐린 비의존적인 글루코스 흡수를 촉진하며, (xi) 2형 당뇨병 마우스 모델에서 인슐린 내성을 해결하고, (xii) 마우스의 비-알코올성 지방간염 (NASH) 모델에서 지방간을 개선하고, 섬유증을 억제하며, 간 기능을 회복시키며; (xiii) 당뇨병성 궤양 마우스 모델에서 상처 치유를 가속화하고; (xiv) 라투스 노르베기쿠스 (Rattus norvegicus) MET 및 마카카 파스시쿨라리스 (Macaca fascicularis) MET와 교차 반응하므로, 최초 인간 임상 실험에 적용하기 전에 필요한 2종의 척추동물에서 독성 및 약리학적 연구의 수행을 가능하게 하며, (xv) 인간, 마우스, 랫 및 시노몰구스 마카크 간에 보존된 에피토프를 인지하므로, 동물 모델들에서 우수한 유용성을 제공한다.
따라서, 일 측면에서, 본 발명은, 고 친화성 인간 MET 단백질 (hMET) 및 고 친화성 마우스 MET 단백질 (mMET)에 결합하며; hMET 작용제 및 mMET 작용제인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 특정 구현예들에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하나 이상의 중쇄 가변성 도메인 (VH)과 하나 이상의 경쇄 가변성 도메인 (VL)을 포함하여, 여기서 VH 및 VL 도메인은, Fab로서 테스트하였을 때, hMET에 대해 1 x 10-3 s-1 내지 1 x 10-2 s-1, 선택적으로 1 x 10-3 s-1 내지 6 x 10-3 s-1 범위의 해리 속도 (off-rate) (Biacore에 의해 측정된 koff)와 mMET에 대해 1 x 10-3 s-1 내지 1 x 10-2 s-1, 선택적으로 1 x 10-3 s-1 내지 6 x 10-3 s-1 범위의 해리 속도 (Biacore에 의해 측정된 koff)를 나타낸다. 특정 구현예들에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 hMET 및 mMET에 대해 동등한 친화성 (equivalent affinity)을 가진다.
특정 구현예들에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 hMET의 인산화를 유도하고, mMET의 인산화를 유도한다. 특정 구현예들에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 3.0 nM 미만, 선택적으로 2.0 nM 미만의 EC50 (포스포-MET ELISA에 의한 측정시) 로 hMET의 인산화를 유도하고, 3.0 nM 미만, 선택적으로 2.0 nM 미만의 EC50 (포스포-MET ELISA에 의한 측정시)로 mMET의 인산화를 유도한다. 특정 구현예들에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 hMET의 인산화 및 mMET의 인산화를 동등하게 (equivalently) 유도한다.
특정 구현예들에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 hMET에 대해 높은 인산화 효능을 나타내며, mMET에 대해서도 높은 인산화 효능을 나타낸다. 특정 구현예들에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 1 nM 미만의 EC50 및/또는 80% 이상의 Emax (포스포-MET ELISA에서 HGF-유도성 활성화의 %로서)로 hMET의 인산화를 유도하고, 1 nM 미만의 EC50 및/또는 80% 이상의 Emax (포스포-MET ELISA에서 HGF-유도성 활성화의 %로서)로 mMET의 인산화를 유도한다. 다른 특정 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 hMET에 대해 낮은 인산화 효능을 나타내며, mMET에 대해 낮은 인산화 효능을 나타낸다. 특정 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 1nM-5nM의 EC50 및/또는 60-80%의 Emax (포스포-MET ELISA에서 HGF-유도성 활성화의 %로서)로 hMET의 인산화를 유도하고, 1nM-5nM의 EC50 및/또는 60-80%의 Emax (포스포-MET ELISA에서 HGF-유도성 활성화의 %로서)로 mMET의 인산화를 유도한다.
특정 구현예들에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 세포와의 접촉시 HGF-유사 세포성 반응을 유도하고, 마우스 세포와의 접촉시 HGF-유사 세포성 반응을 유도한다. 특정 구현예들에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 세포와의 접촉시 및 마우스 세포와의 접촉시 HGF-유사 세포성 반응을 완전하게 유도한다. 특정 구현예들에서, HGF-유사 세포성 반응의 완전한 유도 (full induction)는 (i), (ii) 및/또는 (iii) 중 1, 2 또는 3가지 방법으로 측정가능하다:
(i) 세포 분산 분석 (cell scattering assay)에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체 또는 이의 항원 결합 단편 농도 0.1-1.0 nM 농도에서 최대 HGF-유도성 분산에 상응하는 세포 분산을 유도함;
(ii) 항-세포자살 세포 분석에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 HGF의 1.1x 미만의 EC50 및/또는 HGF에서의 관찰 결과에 대해 90% 보다 높은 Emax (비-세포자살성 대조군 세포의 ATP 총 함량에 대한 %로서 측정)를 나타냄; 및/또는
(iii) 분지 형태형성 분석 (branching morphogenesis assay)에서, 상기 항체로 처리된 세포는 동일 (non-zero) 농도의 HGF에 의해 유도되는 구체 (spheroid) 당 분지 개수 보다 90% 보다 높은 수준으로 분지를 형성함.
특정 구현예들에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 세포와의 접촉시 및 마우스 세포와의 접촉시 HGF-유사 세포성 반응을 일부 유도한다. 특정 구현예들에서, HGF-유사 세포성 반응의 일부 유도는 (i), (ii) 및/또는 (iii)의 방법으로 측정가능하며:
(i) 세포 분산 분석에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체 농도 1 nM 이하에서 상동적인 HGF 0.1 nM에 의해 유도되는 결과에 대해 25% 이상의 세포 분산을 유도함;
(ii) 항-세포자살 세포 분석에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 HGF에 대해 7.0x 이하의 EC50 및/또는 HGF에서의 관찰 결과에 대해 50% 이상의 Emax 세포 생존성을 나타냄; 및/또는
(iii) 분지 형태형성 분석에서, 항체로 처리된 세포는 동일 (non-zero) 농도의 HGF에 의해 유도되는 구체 당 분지 개수에 대해 25% 이상의 수준으로 분지를 형성하고;
항체 및/또는 항원 결합 단편이 HGF-유사 세포성 반응을 완전히 유도하는 것은 아니다.
특정 구현예들에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 HGF 경쟁인자 (competitor)이다. 특정 구현예들에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 5 nM 이하의 IC50 및/또는 50% 이상의 Imax로 hHGF의 hMET와의 결합과 경쟁하고, 5 nM 이하의 IC50 및/또는 50% 이상의 Imax로 mHGF의 mMET와의 결합과 경쟁한다. 특정 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 hHGF 및 mHGF와 동등하게 경쟁한다. 특정 구현예들에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 HGF 완전 경쟁인자 (full HGF competitor)이다. 특정 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 2 nM 미만의 IC50 및/또는 90% 보다 높은 Imax로 hHGF와 경쟁하고, 2 nM 미만의 IC50 및/또는 90% 보다 높은 Imax로 mHGF와 경쟁한다. 특정 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 HGF 부분 경쟁인자이다. 이러한 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 2-5 nM의 IC50 및/또는 50%-90%의 Imax로 hHGF와 경쟁하고, 2-5 nM 미만의 IC50 및/또는 50%-90%의 Imax로 mHGF와 경쟁한다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 시노몰구스 원숭이 (마카카 시노몰구스) MET와 같은 유인원의 MET와 교차 반응성을 나타낼 수 있으며, 랫 기원 (라투스 노르베기쿠스)의 MET와 교차 반응성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 MET의 아미노산 잔기 123번부터 223번까지의 영역 (문헌 전체에서 인간 MET의 위치 번호는 유전자은행 서열 # X54559를 참조함)에 결합할 수 있다. 또한, 인간 MET의 아미노산 224-311번의 에피토프에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 또한, 인간 MET의 아미노산 314-372번의 인간 MET의 에피토프에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 또한, 인간 MET의 아미노산 546-562의 인간 MET의 에피토프에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다
또한, 아미노산 잔기 Ile367을 포함하는 인간 MET의 에피토프에 결합할 수 있는 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 또한, 인간 MET의 아미노산 잔기 Asp372을 포함하는 인간 MET의 에피토프에 결합할 수 있는 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 특정 구현예들에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 MET의 아미노산 잔기 Ile367 및 Asp372를 포함하는 인간 MET의 에피토프에 결합한다.
또한, 인간 MET의 아미노산 잔기 Thr555를 포함하는 인간 MET의 에피토프에 결합할 수 있는 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
또한, 본 발명은, H-CDR1, H-CDR2 및 H-CDR3를 포함하는 중쇄 가변성 도메인과 L-CDR1, L-CDR2 및 L-CDR3를 포함하는 경쇄 가변성 도메인을 포함하며, 다음과 같이 정의되는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다:
H-CDR1은 서열번호 2, 9, 16, 23, 30, 37, 44, 51, 58, 65 및 72로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고;
H-CDR2는 서열번호 4, 11, 18, 25, 32, 39, 46, 53, 60, 67 및 74로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고;
H-CDR3는 서열번호 6, 13, 20, 27, 34, 41, 48, 55, 62, 69 및 76으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고;
L-CDR1은 서열번호 79, 86, 93, 100, 107, 114, 121, 128, 135, 142 및 149로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고;
L-CDR2는 서열번호 81, 88, 95, 102, 109, 116, 123, 130, 137, 144 및 151로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고; 및
L-CDR3는 서열번호 83, 90, 97, 104, 111, 118, 125, 132, 139, 146 및 153으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 H-CDR1, H-CDR2 및 H-CDR3를 포함하는 중쇄 가변성 도메인과 L-CDR1, L-CDR2 및 L-CDR3를 포함하는 경쇄 가변성 도메인을 포함하며, 다음과 같이 정의되는 항체 또는 항원 결합 단편을 제공한다:
H-CDR1은 서열번호 44로 나타낸 아미노산 서열을 포함하고;
H-CDR2는 서열번호 46으로 나타낸 아미노산 서열을 포함하고;
H-CDR3는 서열번호 48로 나타낸 아미노산 서열을 포함하고;
L-CDR1은 서열번호 121로 나타낸 아미노산 서열을 포함하고;
L-CDR2는 서열번호 123으로 나타낸 아미노산 서열을 포함하고; 및
L-CDR3는 서열번호 125로 나타낸 아미노산 서열을 포함한다.
이러한 특정 구현예에서, 항체 또는 그 단편의 중쇄 가변성 도메인은 서열번호 167의 아미노산 서열 또는 서열번호 167과 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 동일한 서열을 포함하고, 경쇄 가변성 도메인은 서열번호 168의 아미노산 서열 또는 서열번호 168과 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 동일한 서열을 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 H-CDR1, H-CDR2 및 H-CDR3를 포함하는 중쇄 가변성 도메인과 L-CDR1, L-CDR2 및 L-CDR3를 포함하는 경쇄 가변성 도메인을 포함하며, 다음과 같이 정의되는 항체 또는 항원 결합 단편을 제공한다:
H-CDR1은 서열번호 30으로 나타낸 아미노산 서열을 포함하고;
H-CDR2는 서열번호 32로 나타낸 아미노산 서열을 포함하고;
H-CDR3은 서열번호 34로 나타낸 아미노산 서열을 포함하고;
L-CDR1은 서열번호 107로 나타낸 아미노산 서열을 포함하고;
L-CDR2는 서열번호 109로 나타낸 아미노산 서열을 포함하고; 및
L-CDR3는 서열번호 111로 나타낸 아미노산 서열을 포함한다.
이러한 특정 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편의 중쇄 가변성 도메인은 서열번호 163의 아미노산 서열 또는 서열번호 163과 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 동일한 서열을 포함하며, 상기 경쇄 가변성 도메인은 서열번호 164의 아미노산 서열 또는 서열번호 164와 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 동일한 서열을 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은, H-CDR1, H-CDR2 및 H-CDR3를 포함하는 중쇄 가변성 도메인과, L-CDR1, L-CDR2 및 L-CDR3를 포함하는 경쇄 가변성 도메인을 포함하며,
상기 H-CDR1이 서열번호 9로 나타낸 아미노산 서열을 포함하고;
상기 H-CDR2가 서열번호 11로 나타낸 아미노산 서열을 포함하고;
상기 H-CDR3가 서열번호 13으로 나타낸 아미노산 서열을 포함하고;
상기 L-CDR1이 서열번호 86으로 나타낸 아미노산 서열을 포함하고;
상기 L-CDR2가 서열번호 88로 나타낸 아미노산 서열을 포함하고; 및
상기 L-CDR3가 서열번호 90으로 나타낸 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 항원 결합 단편을 제공한다.
이러한 특정 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편의 중쇄 가변성 도메인은 서열번호 157의 아미노산 서열 또는 서열번호 157과 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 동일한 서열을 포함하고, 경쇄 가변성 도메인은 서열번호 158의 아미노산 서열 또는 서열번호 158과 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 동일한 서열을 포함한다.
추가적인 구현예들에서, 본 발명은, H-CDR1, H-CDR2 및 H-CDR3를 포함하는 중쇄 가변성 도메인과, L-CDR1, L-CDR2 및 L-CDR3를 포함하는 경쇄 가변성 도메인을 포함하며; H-CDR1, H-CDR2 및 H-CDR3가 표 3에 나타낸 Fab의 CDR 세트 (CDR1, CDR2 및 CDR3)로부터 선택되고; L-CDR1, L-CDR2 및 L-CDR3가 표 4에 나타낸 Fab의 CDR 세트 (CDR1, CDR2 및 CDR3)로부터 선택되는, 항체 또는 항원 결합 단편을 제공한다.
특정 구현예들에서, 항체 또는 항원 결합 단편의 중쇄 가변성 도메인은 표 5의 VH 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 동일한 서열을 포함하고, 경쇄 가변성 도메인은 표 5의 VL 아미노산 서열 또는 이와 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 동일한 서열을 포함한다.
VH 도메인의 아미노산 서열의, 지정된 VH 도메인 아미노산 서열 (예, 서열번호 x)과의 서열 동일성이 100% 미만인 구현예는, 그럼에도 불구하고, 프래임워크 영역내 아미노산 서열 변이를 가지면서, 서열번호 x의 VH의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3와 동일한 중쇄 CDR을 포함할 수 있다. 예를 들어, 프래임워크 영역의 하나 이상의 아미노산 잔기는 인간 생식계열 (germline)에 코딩된 인간 VH 도메인 내 등가의 위치에서 발생하는 아미노산 잔기로 치환될 수 있다. 마찬가지로, VL 도메인의 아미노산 서열의, 지의된 VL 도메인 아미노산 서열 (예, 서열번호 y)과의 서열 동일성이 100% 미만인 구현예는, 그럼에도 불구하고, 프래임워크 영역에 아미노산 서열 변이를 가지면서, 서열번호 y의 VL의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3와 동일한 경쇄 CDR을 포함할 수 있다. 예를 들어, 프래임워크 영역의 하나 이상의 아미노산 잔기는 인간 생식계열에 코딩된 인간 VL 도메인 내 등가의 위치에서 발생하는 아미노산 잔기로 치환될 수 있다.
또한, 본 발명은, 본원에 정의된 바와 같이, 상기한 항체의 VH 및 VL 도메인의 인간화 (humanised variant)/생식계열 변이체 (germlined variant), + 친화성 변이체 및 보존적인 아미노산 치환을 함유한 변이체를 포함하는, 항체 및 항원 결합 단편을 제공한다. 구체적으로, 인간 항체, 특히 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 불변 도메인과 융합된, 전술한 라마-유래 Fab의 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는 키메라 항체, 또는 이의 인간 생식계열 변이체를 제공한다. 상기 항체의 중쇄 및 경쇄 가변성 도메인, 또는 이의 생식계열 변이체, 친화성 변이체 또는 보존된 변이체는, 예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, 2-특이성 Fab, 및 Fv 단편, 다이아바디, 선형 항체, 단쇄 항체 분자, 단쇄 가변성 단편 (scFv) 및 다중 특이성 항체와 같은, 통상적인 4-쇄 항체 또는 그외 항원 결합 단백질에 포함될 수 있다. 중쇄 가변성 도메인, 또는 이의 생식계열 변이체, 친화성 변이체 또는 보존된 변이체는 또한 단일 도메인 항체로서 활용될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항원 또는 항원 결합 단편을 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드, 숙주 세포 또는 무세포 발현 시스템 (cell free expression system)에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 발현을 허용하는 조절 서열과 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 및 상기한 발현 벡터를 함유한 숙주 세포 또는 무세포 발현 시스템을 제공한다. 본 발명은, 또한, 항체 또는 항원 결합 단편의 발현을 허용하는 조건에서 숙주 세포 또는 무세포 발현 시스템을 배양하는 단계, 및 발현된 항체 또는 항원 결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는, 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제조하는 방법을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항원 또는 항원 결합 단편 및 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 테라피 (therapy)에 사용하기 위한 본 발명의 항원 또는 항원 결합 단편 또는 본 발명의 약학적 조성물을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 필요한 환자에게 MET 작용제 항체를 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 인간 환자에서 간 손상, 선택적으로 급성 간 손상 또는 만성 간 손상을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 필요한 환자에게 MET 작용제 항체를 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 인간 환자에서 신장 손상, 선택적으로 급성 신장 손상을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 특정 구현예들에서, MET 작용제 항체는 본 발명에 따른 항체 또는 항원 결합 단편이다.
다른 측면에서, 본 발명은 필요한 환자에게 MET 작용제 항체를 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 인간 환자에서 염증성 장 질환, 선택적으로 궤양성 결장염을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 특정 구현예들에서, MET 작용제 항체는 본 발명에 따른 항체 또는 항원 결합 단편이다.
다른 측면에서, 본 발명은 필요한 환자에게 MET 작용제 항체를 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 인간 환자에서 당뇨병, 선택적으로 1형 당뇨병 또는 2형 당뇨병을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 특정 구현예들에서, MET 작용제 항체는 본 발명에 따른 항체 또는 항원 결합 단편이다.
다른 측면에서, 본 발명은 필요한 환자에게 MET 작용제 항체를 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 인간 환자에서 비-알코올성 지방간염을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 특정 구현예들에서, MET 작용제 항체는 본 발명에 따른 항체 또는 항원 결합 단편이다.
다른 측면에서, 본 발명은 필요한 환자에게 MET 작용제 항체를 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 인간 환자, 선택적으로 당뇨병 환자에서 상처를 치료 또는 상처 치유를 촉진하는 방법을 제공한다. 특정 구현예들에서, MET 작용제 항체는 본 발명에 따른 항체 또는 항원 결합 단편이다.
도 1. ELISA에 의해 측정한 인간 MET-Fc로 면역화된 라마의 면역 반응. 인간 MET ECD (hMET) 또는 마우스 MET ECD (mMET) 재조합 단백질을 고상으로 고정시키고, 면역화 (전) 또는 (후) 라마 혈청의 연속 희석물에 노출시켰다. 마우스 항-라마 IgG1 및 HRP-접합된 당나귀 항-마우스 항체를 이용해 결합성을 확인하였다. OD, 광학 밀도; AU, 임의 단위.
도 2. mAb 결합을 담당하는 MET의 도메인을 식별하기 위해 사용된 인간 MET 결손 돌연변이들을 대략적으로 도시한 도. ECD, 세포외 도메인; aa, 아미노산; L. 펩타이드, 리더 펩타이드; SEMA, 세마포린 상동성 도메인 (semaphorin homology domain); PSI 또는 P, 플렉신-세마포린-인테그린 상동성 도메인 (plexin-semaphorin-integrin homology domain); IPT, 면역글로불린-전사 인자-플렉신 상동성 도메인 (mmunoglobulin-transcription factor-plexin homology domain). 우측, 인간 MET의 대응 잔기들은 UniProtKB # P08581에 등재되어 있다.
도 3. anti-MET 항체에 의해 인지되는 에피토프를 정교하게 맵핑하기 위해 사용된 라마-인간 키메라 MET 단백질들을 도시한 도. 라마 MET 및 인간 MET의 세포외 영역은 각각 아미노산 (aa) 931개 및 932개로 구성된다 (라마 MET는 2 aa의 짧은 리더 펩타이드를 가지며, aa 163 뒤에 삽입체를 가진다). 양쪽 수용체 엑토도메인은 리더 펩타이드, 세마포린 상동성 도메인 (SEMA), 플렉신-세마포린-인테그린 상동성 도메인 (PSI 또는 P) 및 4개의 면역글로불린-전사인자-플렉신 상동성 도메인 (IPT)을 가진다. 키메라 CH1-5는 N-말단 라마 영역 다음에 C-말단 인간 영역을 가진다. 키메라 CH6-7은 N-말단 인간 영역 다음에 C-말단 라마 영역을 가진다.
도 4. 웨스턴 블롯팅으로 측정한, 인간 및 마우스 세포에서 인간/마우스에 동등한 anti-MET 항체의 작용제 활성. A549 인간 폐암 세포 및 MLP29 마우스 간 전구 세포를 혈청-고갈시킨 다음 mAb 또는 재조합 인간 HGF (hHGF; A549) 또는 마우스 HGF (mHGF; MLP29)의 농도를 증가시켜 자극시켰다. anti-포스포-MET 항체 (티로신 1234-1235)를 이용한 웨스턴 블롯팅에 의해 MET 자가-인산화를 측정하였다. 또한, anti-total 인간 MET 항체 (A549) 또는 anti-total 마우스 MET 항체 (MLP29)를 이용한 웨스턴 블롯팅으로, 동일 세포 용해물을 분석하였다.
도 5. LOC 인간 신장 상피 세포 및 MLP29 마우스 간 전구 세포를 이용한 분지 형태형성 분석으로 측정한, 인간/마우스에 동등한 anti-MET 항체의 생물학적 활성. 세포 구체 (cell spheroid)를 콜라겐 층 내에 접종한 다음 mAb 또는 재조합 인간 HGF (LOC) 또는 마우스 HGF (MLP29)를 농도를 증가시키면서 노출시켰다. 분지 형태형성을 현미경으로 경시적으로 추적하였으며, 콜로니를 5일 후 촬영하였다.
도 6. 종래 항체와의 비교: 인간-마우스 교차 반응성. 인간 또는 마우스 MET ECD를 고상으로 고정시키고, 항체 (모두 마우스 IgG/λ 포맷)에 항체의 농도를 증가시키면서 노출시켰다. 결합성은 HRP-접합된 항-마우스 Fc 항체를 이용한 ELISA에 의해 확인하였다.
도 7. 종래 항체와의 비교: MET 자가-인산화. A549 인간 폐암 세포 및 MLP29 마우스 간 전구 세포를 48시간 동안 혈청 성장인자를 고갈시킨 다음 항체의 농도를 증가시켜 항체로 자극하였다. 15분 자극 후, 세포를 세포용해시키고, 포획을 위한 anti-MET 항체와 검출을 위한 anti-포스포-티로신 항체를 이용한 ELISA에 의해 포스포-MET 수준을 측정하였다.
도 8. 종래 항체와의 비교: 분지 형태형성. LOC 인간 신장 상피 세포 구체를 콜라겐 층 내에 접종한 다음 농도를 증가시키면서 mAb와 함께 인큐베이션하였다. 분지 형태형성을 현미경으로 경시적으로 추적하였으며, 5일 후 콜로니의 사진을 촬영하였다.
도 9. 종래 항체와의 비교: 분지 형태형성. MLP29 마우스 간 전구 세포 구체를 콜라겐 층 내에 접종한 다음 증가식 방식의 여러가지 농도의 mAb와 함께 인큐베이션하였다. 분지 형태형성을 현미경으로 경시적으로 추적하였으며, 5일 후 콜로니의 사진을 촬영하였다.
도 10. 인간/마우스에 동등한 anti-MET 항체의 혈장 안정성. 단일 볼루스 1 mg/kg 또는 10 mg/kg 항체를 i.p. 주사하고, 주사 후 3, 6, 12 및 24시간 후에 꼬리 정맥에서 혈액 샘플을 취하였다. 혈액 샘플을 가공 처리하고, 혈장내 항체를 ELISA로 측정하였다. (A) 주입 항체의 최고 및 최저 농도. (B) 항체 농도를 Ln 트랜스폼 (Ln transform)에 선형적으로 피팅시켜, 항체 혈장 반감기를 계산하였다.
도 11. 급성 간 부전 모델: 간 기능 마커의 혈장 농도. BALB/c 마우스에 CCl4 용액을 피하 주사하여 급성 간 손상을 유도하였다. 중독 직후에, 마우스를 71G3, 71D6, 71G2 및 비히클 단독 (PBS)의 단일 볼루스 처리에 따라 4개의 그룹으로 무작위 분류하였다. 항체를 5 mg/kg 투여량으로 i.p. 주사로 투여하였다. 각 처리군은 마우스 3마리로 구성되며, 마우스 각각은 중독 후 여러 시점 (12시간, 24시간 및 48시간)에 희생된다. 주사 후 여러 시점 (0, 12, 24 및 48시간)에 혈액 샘플을 취하였다. 부검시, 혈액과 간을 분석을 위해 채취하였다. 간 마커인 아스파르테이트 트랜스아미나제 (AST), 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT) 및 빌리루빈 (BIL)의 혈장 수준을 표준 임상의 생화학적 방법으로 측정하였다.
도 12. 급성 간 부전 모델: 간 조직에 대한 병리학적 조사. 급성 간 손상을 도 11의 설명에서 언급된 바와 같이 BALB/c 마우스에서 유도하였다. 부검시, 간을 적출하고, 조직 분석을 위해 파라핀으로 포매하였다. 조직을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하고, 현미경으로 조사하였다. 각 처리군별 대표적인 이미지를 나타낸다. 배율: 100X.
도 13. 만성 간 손상 모델: 간 기능 마커의 혈장 농도. BALB/c 마우스를 수주간 CCl4에 장기간 노출시켜 간 손상과 섬유증을 유도하였다. 1차 CCl4 주사 직후, 마우스를 71G3, 71D6, 71G2 및 비히클 단독 (PBS)으로 각각 처리하는 4개의 그룹으로 무작위 분류하였다. 항체를 1 mg/kg 투여량으로 i.p. 주사로 주당 3회로 투여하였다. 추가적인 5번째 대조군에는 CCl4 또는 항체를 투여하지 않았으며, 이를 건강한 대조군으로 사용하였다. 6주간 CCl4 장기 중독 후 마우스를 희생시켰다. 부검시, 혈액과 간을 분석을 위해 채취하였다. 간 마커인 아스파르테이트 트랜스아미나제 (AST) 및 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT)의 혈장 농도를 표준 임상 생화학 방법으로 측정하였다.
도 14. 만성 간 손상 모델: Picro Sirius 레드로 염색한 간 절편에 대한 조직학적 검사. 도 13의 설명에서 언급된 바와 같이 BALB/c 마우스를 CCl4에 장기간 노출시켜 간 손상 및 섬유증을 유도하였다. 부검시, 간을 적출하고, 면역-조직화학적 분석을 위해 파라핀으로 포매하였다. 절편을 Picro Sirius 레드로 염색하였다. 각 처리군별 대표적인 이미지를 나타낸다. 배율: 100X.
도 15. 만성 간 손상 모델: anti-alpha 평활근 액틴 (α-SMA) 항체로 염색한 간 절편에 대한 조직학적 검사. 도 13의 설명에서 언급된 바와 같이 BALB/c 마우스를 CCl4에 장기간 노출시켜 간 손상 및 섬유증을 유도하였다. 부검시, 간을 적출하고, 면역-조직화학적 분석을 위해 파라핀으로 포매하였다. 절편을 anti-alpha 평활근 액틴 (α-SMA) 항체로 염색하였다. 각 처리군별 대표적인 이미지를 나타낸다. 배율: 100X.
도 16. 급성 신장 손상 모델: 신장 기능 마커의 혈장 수준. BALB/c 마우스에 HgCl2를 1회 볼루스로 i.p. 주사하여 급성 신부전을 유도하였다. HgCl2 중독 직후에, 마우스를 71G3, 71D6, 71G2 및 비히클 단독 (PBS)으로 각각 처리하는, 4개의 그룹으로 무작위 분류하였다. 항체는 5 mg/kg 투여량으로 24시간 간격으로 i.p. 주사로 투여하였다. HgCl2 주사 후 72시간 경과시 마우스를 희생시켰다. 부검시, 분석을 위해 혈액과 신장을 채취하였다. 혈액요소질소 (BUN) 및 크레아티닌 (CRE)의 혈장 수준을 표준적인 임상 생화학 방법으로 측정하였다.
도 17. 급성 신장 손상 모델: 신장 조직의 조직학적 분석. 도 16 설명에 기술된 바와 같이 BALB/c 마우스에 HgCl2를 주사하여 급성 신부전을 유도하였다. 부검시, 조직 분석을 위해 신장을 추출하여 파라핀으로 포매하였다. 신장 절편을 헤마토실린과 에오신으로 염색하였다. 각 처리에 따른 대표적인 이미지를 도시한다. 배율: 400X.
도 18. 궤양성 결장염 모델: 체중, 질병 활성도 지표 (DAI) 및 결장 길이. 10일간 음용수에 덱스트란 소듐 설페이트 (DSS)를 첨가하여 BALB/c 마우스에서 궤양성 결장염을 유도하였다. 10일에, DSS 처리를 중단하고, 마우스에 표준 음용수를 섭취시켰다. 1일부터 시작해, 마우스를 71G3, 71D6, 71G2 (투여량 1 mg/kg 또는 5 mg/kg) 및 비히클 단독 (PBS) 각각으로 처리되는 7개의 그룹으로 무작위 분류하였다. 추가적인 8번째 대조군에는 DSS 또는 항체를 투여하지 않았으며, 이를 건강한 대조군으로 사용하였다. 12일에, 즉 DSS 투여를 중단한 후 2일째에, 마우스를 희생시켰다. 부검시, 결장을 적출하여 잘 세척한 다음 자를 사용해 길이를 측정하였다. 측정 후, 결장을 파라핀으로 포매하고, 조직 분석을 위해 가공 처리하였다. 실험 전 기간 동안, 마우스 체중을 정기적으로 모니터링하였으며, 궤양성 결장염의 임상 증상을 변의 혈, 직장 출혈 및 변 굳기로 분석하였다. 각 파라미터를 0 (증상 없음)에서 3점 (증상의 최고 발현)까지 점수를 매겼다. 단일 파라미터에 대한 점수를 합하여 0-9 범위로 DAI를 구하였다. (A) 시간 경과에 따른 체중 (0일 대비 %). (B) 시간 경과에 따른 DAI. (C) 부검시 결장의 길이. 범주 당 투여량 1 mg/kg 및 5 mg/kg의 데이타를 명확하게 나타내기 위해 각 그래프로 도시한다.
도 19. 궤양성 결장염 모델: 결장 조직에 대한 조직학적 분석. 도 18의 설명에 언급된 바와 같이 덱스트란 소듐 설페이트 (DSS)에 노출시켜 BALB/c 마우스에서 궤양성 결장염을 유도하였다. 부검시, 결장을 적출하여 길이를 측정한 다음 파라핀으로 포매하고, 조직 분석을 위해 가공 처리하였다. 결장 조직 절편을 헤마톡실린과 에오신으로 염색하여 현미경으로 검경하고, 사진을 촬영하였다. 실험 처리군, 항체 투여량 및 배율을 각 이미지 옆에 나타낸다. 이미지 분석에 대해서는 본문을 참조한다.
도 20. 염증성 장 질환 모델: 체중 및 결장 길이. 에탄올에 용해된 2,4,6-트리니트로벤젠설폰산 (TNBS)을 직장내 주사하여 C57BLKS/J 마우스에서 결장 손상 및 염증을 유도하였다. TNBS 투여 직후에, 71G3, 71D6, 71G2 또는 비히클 단독 (PBS) 처리에 따라 4개의 그룹으로 무작위 분류하였다. 추가로 5번째 대조군에는 TNBS도 항체도 투여하지 않았으며, 이를 건강한 대조군으로 사용하였다. TNBS 투여 후 5일째 마우스를 희생시켰다. 부검시, 결장을 적출하여 길이를 측정하였다. 측정 후, 결장을 파라핀으로 포매하고, 조직 분석을 위해 가공 처리하였다. 실험 전 기간 동안, 마우스의 체중을 매일 측정하였다. (A) 시간에 따른 체중 (0일 대비 %). (B) 부검시 결장의 길이.
도 21. 염증성 장 질환 모델: 결장 조직 절편에 대한 조직학적 분석. 도 20의 설명에 기술된 바와 같이 2,4,6-트리니트로벤젠설폰산 (TNBS)을 직장내 주사하여 BALB/c 마우스에서 결장 손상 및 염증을 유도하였다. 부검시, 결장을 적출하여 길이를 측정하였다. 측정 후, 결장을 파라핀으로 포매하고, 조직 분석을 위해 가공 처리하였다. 결장 조직 절편을 헤마톡실린과 에오신으로 염색하여, 현미경으로 검경하고 사진을 촬영하였다. 이미지 분석에 대해서는 본문을 참조한다.
도 22. 1형 당뇨병 모델: 당뇨병 마우스에서 글루코스 흡수 촉진 및 인슐린과의 협동. BALB/c 마우스에 스트렙토조톡신 (STZ)을 i.p. 주사하여 췌장 베타-세포 변성을 유도하였다. STZ-처리 마우스는 무처리 마우스와 비교해 2배 높은 수준의 평균 기저 혈당 (basal glycemy)를 나타내었다. STZ-처리 마우스를 4개의 그룹으로 무작위 분류하여 각각 71G3, 71D6, 71G2 또는 비히클 단독 (PBS) 처리를 실시하였다. 추가로 5번째 대조군에는 STZ도 항체도 투여하지 않았으며, 이를 건강한 대조군으로 사용하였다. 공복 혈당 농도를 5주간 경시적으로 모니터링하였다. 5주 후 종료시, 당 부하 검사 (GTT) 및 인슐린 부하 검사 (ITT)를 수행하였다. (A) 공복시 경시적인 기저 혈당 수준. (B) GTT: 금식 동물에 글루코스 경구 투여 후, 혈당 수준을 시간 경과에 따라 모니터링한다. (C) ITT: 인슐린을 부분 금식 동물에 i.p. 주사한 후, 혈당 수준을 시간 경과에 따라 모니터링한다.
도 23. 1형 당뇨병 모델: 배양된 세포에서 글루코스 흡수 촉진 및 인슐린과의 공동-작용. C2C12 마우스 근원세포를 근세포로 분화시킨 다음 인간/마우스에 동등한 작용제성 anti-MET 항체 (71G3, 71D6, 71G2)와 함께 인큐베이션하였다. 24시간 후, 항체-처리 세포를 3가지로 나누고, 플루오레센트 글루코스 유사체 2-(N-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-다이아졸-4-일)아미노)-2-데옥시글루코스 (2-NBDG)의 존재 하에 1시간 동안 0 nM, 100 nM 또는 1000 nM 인간 재조합 인슐린으로 급성 자극하였다. 2-NBDG 흡수는 유세포 측정으로 확인하였다. (A) 인간/마우스에 동등한 작용제성 anti-MET 항체 또는 인슐린에 의한 2-NBDG 흡수 유도. (B) 인슐린 존재 또는 부재 하의 71G3에 의한 2-NBDG 흡수 유도. (C) 인슐린 존재 또는 부재 하의 71D6에 의한 2-NBDG 흡수 유도. (D) 인슐린 존재 또는 부재 하의 71G2에 의한 2-NBDG 흡수 유도.
도 24. 2형 당뇨병 모델: db/db 마우스에서 혈당 수준 정상화 및 인슐린 내성 극복. 8주령의 db/db 암컷 마우스 (렙틴 수용체 유전자 lepr에 점 돌연변이를 가지고 있는 C57BLKS/J 변종)를 4개의 그룹으로 무작위 분류하여, 각각 71G3, 71D6, 71G2 또는 비히클 단독 (PBS) 처리를 실시하였다. 항체는 1 mg/kg 투여량으로 i.p. 주사에 의해 주당 2회로 투여하였다. 공복 혈당 농도를 7주간 10일 간격으로 모니터링하였다. 처리 종료시, 즉 마우스가 15주령이 되었을 때, 당 부하 검사 (GTT) 및 인슐린 부하 검사 (ITT)를 대조군으로서 연령-매칭시킨 야생형 C57BLKS/J 마우스를 이용해 수행하였다. (A) 경시적인 혈당 농도. (B) GTT: 공복 동물에 글루코스 경구 투여 후 경시적으로 모니터링한 혈당 농도. (C) ITT: 부분 금식 동물에 인슐린을 i.p. 주사한 후 경시적으로 모니터링한 혈당 농도.
도 25. 비-알코올성 지방간염 (NASH)의 마우스 모델: 조직 검사에 의해 확인된 지방 간 개선. 8주령의 db/db 암컷 마우스를 4개의 그룹으로 무작위 분류하여, 각각 71G3, 71D6, 71G2 또는 비히클 단독 (PBS) 처리를 실시하였다. 항체는 1 mg/kg 투여량으로 i.p. 주사에 의해 주당 2회로 투여하였다. 8주 처리 후, 마우스를 희생시키고, 부검을 실시하였다. 간 기능 마커 분석을 위해 채혈하였다. 간을 적출하여 파라핀 포매한 다음 조직 검사를 위해 가공 처리하였다. 간 절편을 헤마톡실린과 에오신으로 염색하였다. 지방 세포의 세포질은, 표본의 알코올 처리시 지질이 세척 제거되기 때문에, 비어 있는 것으로 나타나며 백색으로 보인다. 각 처리군에 따른 대표적인 이미지를 나타낸다. 배율: 200X.
도 26. 비-알코올성 지방간염 (NASH)의 마우스 모델: Picro Sirius 레드 염색에 의해 확인한 섬유증 억제. 8주령의 db/db 암컷 마우스를 무작위 분류하고, 도 25의 설명에 언급된 바와 같이 처리하였다. 부검시, 조직 검사를 위해 간에 대한 절차를 수행하였다. 섬유증을 부각시키기 위해 간 절편을 Sirius 레드로 염색하였다. 각 처리별 대표적인 이미지를 나타낸다. 배율: 200X.
도 27. 비-알코올성 지방간염 (NASH)의 마우스 모델: 간 기능 마커의 정상화. 8주령의 db/db 암컷 마우스에 도 25의 설명에 언급된 바와 같이 정제된 71G3, 71D6, 71G2 또는 비히클 단독을 처리하였다. 7주 처리 후, 간 기능 마커 분석을 위해 채혈하였다. (A) 아스파르테이트 트랜스아미나제 (AST)의 혈장 농도. (B) 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT)의 혈장 농도.
도 28. 당뇨병성 궤양의 마우스 모델: 상처 치유의 가속화. 8주령의 db/db 당뇨병 마우스를 마취시키고, 피부 바이옵시용 0.8 cm-와이드 서클 펀치 블레이드로 절개하여 우측 뒷쪽 옆구리에 둥근 상처를 만들었다. 상피 전층을 제거하였다. 수술 다음날, 정제된 71G3, 71D6, 71G2 또는 비히클 단독 (PBS) 각각의 처리를 위해, 마우스를 4개의 그룹으로 무작위 분류하였다. 항체는 5 mg/kg 투여량으로 i.p. 주사로 2일 마다 투여하였다. 상처의 직경을 캘리퍼를 사용해 매일 측정하였다. (A) 시간 경과에 따른 상처 면적. (B) 1일 상처 봉합 (wound closure) %로 평균하여 측정한 평균 재-상피화율.
도 29. ELISA에 의해 측정한 라투스 노르베기쿠스 및 마카카 파시쿨라리스 교차 반응성. 범-종 (pan-species) 교차 반응성을 검사하기 위해, 한정된 항체 패널 SEMA 결합 항체 (71D6, 71C3, 71D4, 71A3, 71G2) 및 PSI 결합 항체 (76H10, 71G3)를 선택하였다. 5D5 종래 항체는 대조군으로 사용하였다. 인간, 마우스, 랫 또는 원숭이 MET ECD를 고상으로 고정하고, 증가하는 방식의 여러가지 농도의 mAb (인간 IgG1/λ 형태) 용액에 노출시켰다. HRP-접합된 항-인간 Fc 항체를 사용해 결합성을 확인하였다.
도 30. H. sapiens , M. musculus , R. norvegicus , M. fascicularis 및 L. glama 유래의 MET ECD의 아미노산 서열 정렬. (A) SEMA-결합 항체 (71D6, 71C3, 71D4, 71A3 및 71G2) (인간 MET 서열 서열번호 239; 마우스 MET 서열 서열번호 240; 랫 MET 서열 서열번호 241, cyno MET 서열 서열번호 242, 라마 MET 서열 서열번호 243)에 의해 인지된 영역들에 대한 서열 정렬. 표 12에 나타낸 인간-라마 키메라 방식으로 동정된 아미노산은 밑줄 표시된다. 이 영역에는 인간 및 마우스 MET 간에는 보존되어 있지만 라마 MET에는 없는, 잔기 5개가 존재한다 (Ala 327, Ser 336, Phe 343, Ile 367, Asp 372). 이들 아미노산은 검정색 박스로 표시되며, 순차적인 방식으로 번호 1-5가 기재된다. 이 중, 잔기 4개는 랫과 시노몰구스 원숭이 MET (Ala 327, Ser 336, Ile 367, Asp 372)에도 보존되어 있다. SEMA-결합 항체에 대한 결합을 담당하는 아미노산은 (SEMA의 경우) "S"로 표시된다. 5D5/오나르투주맵에의 결합을 담당하는 아미노산은 (오나르투주맵의 경우) "O"로 표시된다. (B) PSI-결합성 항체 76H10 및 71G3에 의해 인지되는 영역에 대한 서열 정렬 (인간 MET 서열 서열번호 244; 마우스 MET 서열 서열번호 245; 랫 MET 서열 서열번호 246, cyno MET 서열 서열번호 247, 라마 MET 서열 서열번호 248). 표 12에 나타낸 인간-라마 키메라 방식으로 동정된 아미노산은 밑줄 표시된다. 이 영역에는 인간 및 마우스 MET 간에 보존되어 있지만 라마 MET에는 없는 잔기 3개가 존재한다 (Arg 547, Ser 553, Thr 555). 이들 아미노산은 검정색 박스로 표시되며, 순차적인 방식으로 번호 6-8가 기재된다. 이 중, 잔기 2개는 랫과 시노몰구스 원숭이 MET (Ser 553 및 Thr 555)에도 보존되어 있다. PSI-결합 항체에 대한 결합을 담당하는 아미노산은 (PSI의 경우) "P"로 표시된다.
도 31. 정교한 에피토프 맵핑을 위해 사용한 MET 돌연변이들을 대략적으로 도시한 도. 주형으로서 인간 MET ECD를 사용해, 도 30에서 순차적인 번호 1-8로 표시된 주요 잔기들을 여러가지 순열로 돌연변이하여, 돌연변이 A-L을 만들었다. 이들 돌연변이 각각은 표시된 라마의 잔기를 제외하고는 전체 인간 유래이다.
본원에서, 용어 "면역글로불린"은, 임의의 적절한 특이적인 면역반응성 유무와 상관없이, 2개의 중쇄와 2개의 경쇄의 조합을 가진 폴리펩타이드를 포함한다. "항체"는 대상 항원 (예, MET)에 유의한 공지된 특이적인 면역반응성을 가진 상기한 조립체를 지칭한다. 용어 "MET 항체" 또는 "anti-MET 항체"는 본원에서 MET 단백질에 대해 면역 특이성을 나타내는 항체를 지칭한다. 항체 및 면역글로불린은 서로 간에 체인간 공유 결합이 존재하거나 또는 존재하지 않는 경쇄 및 중쇄를 포함한다. 척추동물 시스템에서 기본적인 면역글로불린 구조들은 상대적으로 충분히 파악되어 있다.
일반 용어 "면역글로불린"은 생화학적으로 구분가능한 항체의 5가지 클래스를 포함한다. 5가지 항체 클래스 모두 본 발명의 범위에 포함되지만, 하기 설명은 일반적으로 면역글로불린의 IgG 클래스 분자에 대한 것일 것이다. IgG의 경우, 면역글로불린은 분자량 약 23,000 달톤의 2개의 동일한 경쇄 폴리펩타이드와, 분자량 53,000-70,000 달톤의 2개의 동일한 중쇄 폴리펩타이드를 포함한다. 이들 4개의 체인은 "Y" 형태로 이황화 결합에 의해 연결되어 있으며, 여기서 경쇄 받침대와 중쇄가 "Y"의 입에서 시작하여 가변부까지 연결된다.
항체의 경쇄는 카파 또는 람다 (κ, λ)로 분류된다. 각 중쇄 클래스는 카파 또는 람다 경쇄와 결합할 수 있다. 일반적으로, 경쇄와 중쇄는 서로 공유적으로 결합되며, 면역글로불린이 B 세포 또는 일반적으로 조작된 숙주 세포에 의해 제조되는 경우, 2개의 중쇄의 "꼬리" 영역이 서로 이황화 공유 결합에 의해 또는 비-공유 결합에 의해 결합된다. 중쇄에서, 아미노산 서열은 Y 형태의 포크 말단 위치의 N-말단에서부터 각 체인의 하부 C-말단까지 이어진다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 중쇄가 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론 (γ, μ, α, β, ε)과 이의 서브 클래스 (예, γ1-γ4)로 분류됨을 알 것이다. 이는 항체의 "클래스"를 각각 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE로 결정짓는 체인의 특징이다. 면역글로불린 서브클래스 (이소형), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 등이 잘 특정화되어 있으며, 기능적 특수성을 부여하는 것으로 알려져 있다. 이러한 클래스 및 이소형들 각각의 변형된 버전들은 본 발명의 내용에 비추어 당해 기술 분야의 당업자라면 쉽게 식별할 수 있으며, 따라서 본 발명의 범위에 포함된다.
전술한 바와 같이, 항체의 가변부는 항체가 항원의 에피토프를 선택적으로 인지하여 특이적으로 결합할 수 있게 한다. 즉, 항체의 VL 도메인과 VH 도메인이 조합하여 3차원 항원 결합부를 규정하는 가변부를 형성한다. 이러한 4차원 항체 구조는 Y의 각 암 말단에 존재하는 항원 결합부를 형성한다. 특히, 항원 결합부는 VH 및 VL 체인 각각의 상보성 결정부 (CDR) 3개에 의해 정의된다.
본원에서, 용어 "MET 단백질" 또는 "MET 항원" 또는 "MET"는 상호 호환적으로 사용되며, 야생형 형태에서 간세포 성장인자 (HGF)에 결합하는 수용체 티로신 키나제를 지칭한다. 용어 "인간 MET 단백질" 또는 "인간 MET 수용체" 또는 "인간 MET" 또는 "hMET"는 상호 호환적으로 사용되며, 인간 숙주에서 천연적으로 발현되거나 및/또는 인간 배양 세포주의 표면 상에 발현된 천연 인간 MET 단백질 뿐만 아니라 재조합 형태 및 이의 단편, 그리고 천연적으로 발생하는 돌연변이 형태 등의, 인간 MET (GenBank accession number: X54559)를 지칭한다. 용어 "마우스 MET 단백질" 또는 "마우스 MET 수용체" 또는 "마우스 MET" 또는 "mMET"는 상호 호환적으로 사용되며, 마우스 숙주에서 천연적으로 발현되거나 및/또는 마우스 배양 세포주의 표면 상에 발현된 천연 마우스 MET 단백질 뿐만 아니라 재조합 형태 및 이의 단편, 그리고 천연적으로 발생하는 돌연변이 형태 등의, 마우스 MET (GenBank accession number: NM_008591)를 지칭한다.
본원에서, 용어 "결합부"는 대상 타겟 항원 (예, hMET)에 대한 선택적인 결합을 담당하는 폴리펩타이드의 영역을 포함한다. 결합 도메인은 하나 이상의 결합부를 포함한다. 예시적인 결합 도메인은 항체 가변성 도메인을 포함한다. 본 발명의 항체 분자는 하나의 결합부 또는 복수 (예, 2, 3 또는 4)의 결합부를 포함할 수 있다.
본원에서, 지정된 단백질 (예, MET 항체 또는 이의 항원 결합 단편) "로부터 유래된"이라는 용어는 폴리펩타이드의 기원을 지칭하는 것이다. 일 구현예에서, 특정 출발 폴리펩타이드로부터 유래되는 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열은 CDR 서열 또는 이와 관련된 서열이다. 일 구현예에서, 특정 출발 폴리펩타이드로부터 유래되는 아미노산 서열은 인접하지 않다. 예를 들어, 일 구현예에서, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR은 출발 항체로부터 유래된다. 일 구현예에서, 특정 출발 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열로부터 유래되는 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열은 출발 서열과 기본적으로 동일하거나, 또는 적어도 3-5개의 아미노산, 적어도 5-10개의 아미노산, 적어도 10-20개의 아미노산, 적어도 20-30개의 아미노산 또는 적어도 30-50개의 아미노산으로 구성된 상기한 출발 서열의 영역과 동일하거나, 또는 출발 서열이 기원인 것으로 당해 기술 분야의 당업자가 식별가능한 영역과 동일하다. 일 구현예에서, 출발 항체로부터 유래된 하나 이상의 CDR 서열을 변형시켜 변이체 CDR 서열, 예를 들어 변이체 CDR 서열이 MET 결합 활성을 유지하고 있는 친화성 변이체를 제조한다.
"낙타과-유래" --- 바람직한 특정 구현예에서, 본 발명의 MET 항체 분자는 낙타과 동물을 MET-유래 항원으로 능동 면역화하여 생성된 낙타과의 통상적인 항체로부터 유래된 프래임워크 아미노산 서열 및/또는 CDR 아미노산 서열을 포함한다. 그러나, 낙타과-유래 아미노산 서열을 포함하는 MET 항체는 인간 아미노산 서열 (즉, 인간 항체) 또는 그외 낙타과를 제외한 포유류 종으로부터 유래된 프래임워크 및/또는 불변부 서열을 포함하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 인간 또는 인간을 제외한 영장류 프래임워크 영역, 중쇄 영역 및/또는 힌지 영역이 대상 MET 항체에 포함될 수 있다. 일 구현예에서, 하나 이상의 비-낙타과 아미노산은 "낙타과-유래" MET 항체의 프래임워크 영역에 존재할 수 있으며, 예를 들어 낙타과 프래임워크 아미노산 서열은 대응되는 인간 또는 인간을 제외한 영장류 아미노산 잔기가 존재하는 영역에 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다. 또한, 낙타과-유래 VH 및 VL 도메인 또는 이의 인간화 변이체는 인간 항체의 불변 도메인에 연결되어, 본원에 도처에 기술된 바와 같이, 키메라 분자를 형성할 수 있다.
본원에서, "보존적인 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 비슷한 측쇄를 가진 아미노산 잔기로 치환된 것이다. 염기성 측쇄 (예, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예, 아스파르트산, 글루탐산), 비-하전된 극성 측쇄 (예, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비-극성 측쇄 (예, 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), beta-분지형 측쇄 (예, 트레오닌, 발린, 이소루신) 및 방향족 측쇄 (예, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘) 등의, 비슷한 측쇄를 가진 아미노산 잔기 패밀리는 당해 기술 분야에 정의되어 있다. 즉, 면역글로불린 폴리펩타이드에서 비-필수 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리에 속하는 다른 아미노산 잔기로 치환될 수 있다. 다른 구현예에서, 아미노산의 스트링 (string)은 측쇄 패밀리 구성원과 순서 및/또는 조성이 다른 구조적으로 비슷한 스트링으로 치환될 수 있다.
본원에서, 용어 "중쇄 영역"은 면역글로불린 중쇄의 불변 도메인으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 중쇄 영역을 포함하는 폴리펩타이드는 CH1 도메인, 힌지 (예, 상, 중 및/또는 하 힌지부) 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 이의 변이체 또는 단편 중 하나 이상을 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 면역글로불린 중쇄 (예, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인)의 Fc 영역을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 적어도 불변 도메인의 영역 (예, CH2 도메인 전체 또는 일부)이 결핍될 수 있다. 특정 구현예들에서, 불변 도메인의 하나 이상, 바람직하게는 전체가 인간 면역글로불린 중쇄로부터 유래된다. 예를 들어, 바람직한 일 구현예에서, 중쇄 영역은 전체 인간 힌지 도메인 (fully human hinge domain)을 포함한다. 다른 바람직한 구현예에서, 중쇄 영역은 전체 인간 Fc 영역 (예, 인간 면역글로불린 유래의 힌지, CH2 및 CH3 도메인)을 포함한다.
특정 구현예들에서, 중쇄 영역의 구성적인 (constituent) 불변 도메인은 여러가지 면역글로불린 분자들로부터 유래된다. 예를 들어, 폴리펩타이드의 중쇄 영역은 IgG1 유래의 CH2 도메인과 IgG3 또는 IgG4 분자 유래의 힌지부를 포함할 수 있다. 다른 구현예들에서, 불변 도메인은 여러가지 면역글로불린 분자의 영역들을 포함하는 키메라 도메인이다. 예를 들어, 힌지는 IgG1 분자 유래의 제1 영역과 IgG3 또는 IgG4 분자 유래의 제2 영역을 포함할 수 있다. 전술한 바와 같이, 당해 기술 분야의 당업자는, 중쇄 영역의 불변 도메인이 천연 (야생형) 면역글로불린 분자와의 아미노산 서열과 상이하도록 변형될 수 있음을 이해할 것이다. 즉, 본원에 기술된 본 발명의 폴리펩타이드는 중쇄 불변 도메인 (CH1, 힌지, CH2 또는 CH3) 및/또는 경쇄 불변부 도메인 (CL) 중 하나 이상의 변이 또는 변형을 포함할 수 있다. 예시적인 변형으로는 하나 이상의 도메인에서 하나 이상의 아미노산의 부가, 결손 또는 치환 등이 있다.
본원에서, "키메라" 단백질은 제1 아미노산 서열이 본래 천연적으로는 연결되어 있지 않은 제2 아미노산 서열에 연결된 것이다. 아미노산 서열은 통상적으로 융합 폴리펩타이드로 묶인 별개의 단백질로서 존재하거나, 또는 통상적으로 동일한 단백질에 존재하지만 융합 폴리펩타이드에서 새로운 배열로 배치될 수 있다. 키메라 단백질은, 예를 들어, 화학 합성에 의해, 또는 펩타이드 영역이 바람직한 관계로 코딩된 폴리뉴클레오티드를 구축 및 번역함으로써, 제조할 수 있다. 예시적인 키메라 MET 항체로는, 인간 항체, 예를 들어 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 불변 도메인에 융합된 또는 마우스 항체, 예를 들어, 마우스 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c 또는 IgG3의 불변 도메인에 융합된, 낙타과-유래 VH 및 VL 도메인 또는 이의 인간화 변이체를 포함하는, 융합 단백질 등이 있다.
본원에서, 용어 "가변부" 및 "가변성 도메인"은 상호 호환적으로 사용되며, 동일한 의미를 가지는 것으로 의도된다. 용어 "가변성"은 가변성 도메인 VH 및 VL의 특정 영역이 항체들 간에 서열상 매우 상이하며, 각각의 특정 항체가 타겟 항원에 대한 결합 및 특이성에 이용되는 것을 의미한다. 그러나, 가변성이 항체의 가변성 도메인 전체에 균등하게 분포하는 것은 아니다. 항원 결합부의 일부를 구성하는 VL 도메인 및 VH 도메인 각각에는 "과가변성 루프"로 지칭되는 3개의 세그먼트가 몰려있다. Vλ 경쇄 도메인의 제1, 제2 및 제3 과가변성 루프는 본원에서 L1(λ), L2(λ) 및 L3(λ)로 언급되며, VL 도메인에서 잔기 24-33 (L1(λ), 9, 10 또는 11개의 아미노산 잔기로 구성됨), 49-53 (L2(λ), 3개의 아미노산 잔기로 구성됨) 및 90-96 (L3(λ), 5개의 아미노산 잔기로 구성됨)를 포함하는 것으로 정의될 수 있다 (Morea et al., Methods 20, 267-279, 2000). VKappa 경쇄 도메인의 제1, 제2 및 제3 과가변성 루프는 본원에서 L1(κ), L2(κ) 및 L3(κ)로 언급되며, VL 도메인에서 잔기 25-33 (L1(κ), 6, 7, 8, 11, 12 또는 13개의 아미노산 잔기로 구성됨), 49-53 (L2(κ), 3개의 아미노산 잔기로 구성됨) 및 90-97 (L3(κ), 6개의 아미노산 잔기로 구성됨)을 포함하는 것으로서 정의될 수 있다 (Morea et al., Methods 20, 267-279, 2000). VH 도메인의 제1, 제2 및 제3 과가변성 루프는 본원에서 H1, H2 및 H3으로 언급되며, VH 도메인에서 잔기 25-33 (H1, 7, 8 또는 9개의 아미노산 잔기로 구성됨), 52-56 (H2, 3 또는 4개의 아미노산 잔기로 구성됨) 및 91-105 (H3, 길이 변동성이 큼)를 포함하는 것으로서 정의될 수 있다 (Morea et al., Methods 20, 267-279, 2000).
달리 언급되지 않는 한, 용어 L1, L2 및 L3는 각각 VL 도메인의 제1, 제2 및 제3 과가변성 루프를 지칭하며, Vκ 및 Vλ 이소형 둘다에서 수득되는 과가변성 루프를 망라한다. 용어 H1, H2 및 H3는 각각 VH 도메인의 제1, 제2 및 제3 과가변성 루프를 지칭하며, 공지된 임의의 중쇄 이소형, 예를 들어, γ, ε, δ, α 또는 μ로부터 수득되는 과가변성 루프를 망라한다.
과가변성 루프 L1, L2, L3, H1, H2 및 H3는 후술한 바와 같이 정의되는 "상보성 결정부" 또는 "CDR"의 일부를 각각 포함할 수 있다. 과가변성 루프 (HV)는 구조를 토대로 정의되는 반면, 상보성 결정부 (CDR)는 서열 가변성을 토대로 정의되고, HV와 CDR의 경계가 일부 VH 및 VL 도메인에서 다를 수 있기 때문에, 용어 "과가변성 루프" 및 "상보성 결정부"는 엄격하게 동의어가 아니다 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991).
VL 도메인과 VH 도메인의 CDR은 전형적으로 다음과 같은 아미노산을 포함하는 것으로 정의될 수 있다: 경쇄 가변성 도메인에서 잔기 24-34 (CDRL1), 50-56 (CDRL2) 및 89-97 (CDRL3), 중쇄 가변성 도메인에서 잔기 31-35 또는 31-35b (CDRH1), 50-65 (CDRH2) 및 95-102 (CDRH3) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991). 따라서, HV는 해당 CDR에 포함될 수 있으며, 본원에서 언급되는 VH 및 VL 도메인의 "과가변성 루프"는 달리 언급되지 않은 한 해당 CDR을 포괄하는 것으로, 또는 그 반대로 해석되어야 한다.
가변성 도메인에서 보존성이 보다 높은 영역을 후술한 바와 같이 프래임워크 영역 (FR)이라고 한다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변성 도메인들은 각각 대체적으로 3개의 과가변성 루프에 의해 연결된 베타-시트 구조를 취하고 있는 4개의 FR (각각 FR1, FR2, FR3 및 FR4)를 포함한다. 각 체인에서 과가변성 루프는 FR에 의해 인접하게 유지되며, 다른 체인의 과가변성 루프와 함께 항체의 항원-결합부를 형성하게 된다. 항체의 구조 분석을 통해 상보성 결정부에 의해 형성된 결합부의 서열 및 형태 간의 상관성이 밝혀졌다 (Chothia et al., J. Mol. Biol. 227, 799-817, 1992; Tramontano et al., J. Mol. Biol, 215, 175-182, 1990). 이것의 높은 서열 가변성에도 불구하고, 루프 6개 중 5개가 "정규 구조 (canonical structure)"로 지칭되는 주-쇄 형태들로 된 소형 레페토리를 항상 취한다. 이러한 형태는 일차적으로 루프의 길이에 의해 결정되고, 이차적으로는 패킹, 수소 결합 또는 비통상적인 주-쇄 형태를 취할 수 있는 능력을 결정하는 루프 및 프래임워크 영역내 특정 위치에서의 중요 잔기의 존재에 의해 결정된다.
본원에서, 용어 "CDR" 또는 "상보성 결정부"는 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드 둘다의 가변부 내에서 발견되는 비-인접한 항원 조합 부위 (non-contiguous antigen combining site)를 의미한다. 이러한 특정한 영역은 Kabat et al., J. Biol. Chem. 252, 6609-6616, 1977, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991, by Chothia et al., J. Mol. Biol. 196, 901-917, 1987, 및 MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262, 732-745, 1996에 의해 개시된 바 있으며, 여기서 정의는 서로 비교할 경우 아미노산 잔기의 중첩 또는 서브세트를 포함한다. 상기한 인용 문헌 각각에서 정의되는 CDR을 포함하는 아미노산 잔기들은 비교를 위해 기술된다. 바람직하게는, 용어 "CDR"은 서열 비교시 Kabat에 의해 규정되는 CDR이다.
표 1: CDR 정의.
Figure 112019009348154-pct00001
1잔기 넘버링은 상기 Kabat 문헌의 정의에 따름
2잔기 넘버링은 상기 Chothia 문헌의 정의에 따름
3잔기 넘버링은 상기 MacCallum 문헌의 정의에 따름
본원에서, 용어 "프래임워크" 또는 "FR 영역"은 가변부의 일부이지만 CDR의 일부는 아닌 아미노산 잔기를 포함한다 (예, CDR에 대한 Kabat 정의에 따름). 따라서, 가변부 프래임워크는 약 100-120개의 아미노산 길이이지만, CDR의 바깥쪽 아미노산만 포함한다. Kabat에 의해 정의되는 중쇄 가변성 도메인 및 CDR에 대한 구체적인 예로, 프래임워크 영역 1은 1-30번의 아미노산을 포함하는 가변부 도메인에 해당하며; 프래임워크 영역 2는 36-49번의 아미노산을 포함하는 가변부의 도메인에 해당하며; 프래임워크 영역 3은 66-94번의 아미노산을 포함하는 가변부의 도메인에 해당하며; 프래임워크 영역 4는 103번 아미노산부터 가변부 말단까지를 포함하는 가변부의 도메인에 해당한다. 경쇄의 프래임워크 영역은 중쇄 가변부 CDR에 의해 비슷하게 분리되어 있다. 마찬가지로, Chothia et al. 또는 McCallum et al.에 의한 CDR 정의에 따르면, 프래임워크 영역의 경계는 전술한 바와 같이 각각의 CDR 말단에 의해 분리된다. 바람직한 구현예에서, CDR는 Kabat에 의해 정의되는 바와 같이 정의된다.
천연 항체에서, 각 모노머 항체에 존재하는 6개의 CDR은, 항체가 수성 환경에서 3차원 구조를 취함에 따라 항원 결합부를 형성하도록 특이적으로 위치된 아미노산들로 된 짧고 비-인접한 서열들이다. 나머지 중쇄 및 경쇄 가변성 도메인들은 아미노산 서열에 대해 분자간 가변성이 거의 없으며, 프래임워크 영역으로 지칭된다. 프래임워크 영역은 대체적으로 베타-시트 구조를 취하며, CDR들이 베타-시트 구조를 연결하는, 일부 경우에 그 일부를 연결하는 루프를 형성한다. 즉, 이들 프래임워크 영역은 체인간 비-공유적 상호작용에 의해 6개의 CDR을 올바른 오리엔테이션으로 배치시키는 스캐폴드를 형성하는 역할을 한다. 위치된 CDR에 의해 형성되는 항원 결합부가 면역반응성 항원의 에피토프에 대한 표면 상보성을 규정한다. 이러한 상보성 표면은 항체가 면역반응성 항원 에피토프에 비-공유 결합하도록 조장한다. CDR의 위치는 당해 기술 분야의 당업자라면 쉽게 식별할 수 있다.
본원에서, 용어 "힌지부"는 CH1 도메인을 CH2 도메인과 연결하는 중쇄 분자의 부분을 포함한다. 이 힌지부는 대략 잔기 25개로 구성되며, 유연하여, 2개의 N-말단 항원 결합부가 독립적으로 움직일 수 있게 해준다. 힌지부는 3개의 구분되는 도메인으로 분할될 수 있다: 상, 중 및 하 힌지 도메인 (Roux et al., J. Immunol. 161, 4083-4090, 1998). "완전 인간" 힌지부를 포함하는 MET 항체는 아래 표 2에 나타낸 힌지부 서열들 중 하나를 포함할 수 있다.
표 2: 인간 힌지부 서열.
Figure 112019009348154-pct00002
본원에서 용어 "CH2 도메인"은 통상적인 넘버링 시스템을 이용해, 예를 들어, 항체의 244번 잔기에서 360번 잔기까지 연장되는 중쇄 분자의 영역을 포함한다 (잔기 244 - 360, Kabat 넘버링 시스템; 및 잔기 231-340, EU 넘버링 시스템; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). CH2 도메인은, 다른 도메인과 근접하게 쌍을 형성하지 않는다는 점에서, 독특하다. 오히려, 2개의 N-연결된 분지형 탄수화물 체인이 온전한 천연 IgG 분자의 2개의 CH2 도메인 사이에 위치한다. 또한, CH3 도메인은 CH2 도메인에서 IgG 분자의 C-말단까지 연장되고 약 108개의 잔기를 포함하는 것으로, 잘 입증되어 있다.
본원에서, 용어 "단편"은 무손상 또는 완전한 항체 또는 항체 체인과 비교해 아미노산 잔기가 몇개 적은 항체 또는 항체 체인의 파트 또는 영역을 의미한다. 용어 "항원 결합 단편"은 항원에 결합하거나 또는 항원 결합 (즉, hMET 및 mMET에 대한 특이적인 결합)에 대해 무손상 항체 (이것이 유래된 무손상 항체)와 경쟁하는 면역글로불린 또는 항체의 폴리펩타이드 단편을 의미한다. 본원에서, 항체 분자의 "단편"이라는 용어는 항체의 항원 결합 단편, 예를 들어, 항체 경쇄 가변성 도메인 (VL), 항체 중쇄 가변성 도메인 (VH), 단쇄 항체 (scFv), F(ab')2 단편, Fab 단편, Fd 단편, Fv 단편 및 싱글 도메인 항체 단편 (DAb)을 포함한다. 단편은, 예를 들어, 무손상 또는 완전한 항체 또는 항체 체인에 대한 화학적 또는 효소적 처리에 의해 또는 재조합 방식에 의해 수득될 수 있다.
본원에서 용어 "결합가 (valency)"는 폴리펩타이드 내 잠재적인 타겟 결합부의 개수를 의미한다. 각 타겟 결합부는 하나의 타겟 분자 또는 타겟 분자의 하나의 특이적인 부위에 특이적으로 결합한다. 폴리펩타이드가 2 이상의 타겟 결합부를 포함할 경우, 각각의 타겟 결합부는 동일한 또는 서로 다른 분자와 특이적으로 결합할 수 있다 (예, 서로 다른 리간드 또는 서로 다른 항원, 또는 동일 항원의 서로 다른 에피토프에 결합할 수 있다). 대상 결합 분자는 hMET에 특이적인 하나 이상의 결합부를 가진다.
본원에서, 용어 "특이성"은 소정의 타겟, 예컨대, hMET, mMET에 결합할 수 있는 결합력 (면역반응할 수 있는 능력)을 의미한다. 폴리펩타이드는 단일 특이성이며 타겟에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 결합부를 포함할 수 있거나, 또는 폴리펩타이드는 다중 특이성이며 서로 다른 타겟 또는 동일한 타겟에 특이적으로 결합하는 2 이상의 결합부를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체는 2 이상의 타겟에 특이적이다. 예를 들어, 일 구현예에서, 본 발명의 다중 특이적인 결합 분자는 hMET와 제2 타겟 분자에 결합한다. 이러한 맥락에서, 제2 타겟 분자는 hMET 이외의 다른 분자이거나 또는 mMET이다.
용어 "에피토프"는 항체와 접촉하는 항원 (예, 인간 MET) 영역(들)을 의미한다. 에피토프는 선형적일 수 있으며, 즉 싱글 아미노산 서열에의 결합을 수반할 수 있거나, 또는 입체적일 수 있으며, 즉, 반드시 인접한 것은 아닐 수 있는 항원의 다양한 영역 내 2 이상의 아미노산 서열과의 결합을 수반할 수 있다. 본원에 제공된 항체는 인간 MET 단백질의 세포외 도메인 내 여러 가지 (중첩성 또는 비-중첩성) 에피토프에 결합할 수 있다.
본원에서, 폴리펩타이드와 관련하여 용어 "합성"은 천연적으로 생성되지 않은 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 예를 들어, 비-천연 폴리펩타이드는, 천연 폴리펩타이드의 변형된 형태 (예, 부가, 치환 또는 결손 등의 돌연변이를 포함함)이거나, 또는 아미노산 선형 서열에서 본래 천연적으로 연결되지 않은 (천연 또는 비-천연) 제2 아미노산 서열과 연결된 (천연 또는 비-천연) 제1 아미노산 서열을 포함한다.
본원에서 용어 "조작된"은 합성 방식에 의해 (예, 재조합 기법, 시험관내 펩타이드 합성, 효소적 또는 화학적 펩타이드 커플링 또는 이들 기법의 일부 조합) 핵산 또는 폴리펩타이드 분자를 조작하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 조작되며, 그 예로는 인간화된 및/또는 키메라 항체, 및 항원 결합, 안정성/반감기 또는 작동자 기능과 같은 한가지 이상의 특성을 개선하도록 조작된 항체 등이 있다.
본원에서, 용어 "변형된 항체"는 천연적이지 않도록 변형된 합성 형태의 항체, 예를 들어, 2 이상의 중쇄 영역을 포함하지만, 2개의 완전한 중쇄를 포함하지 않는 항체 (예, 도메인 결손된 항체 또는 미니바디); 2 이상의 서로 다른 항원 또는 하나의 항원에서 서로 다른 에피토프에 결합하도록 변형된 다중 특이성 형태의 항체 (예, 이중 특이성, 3중 특이성 등); scFv 분자와 연결된 중쇄 분자 등) 등을 포함한다. ScFv 분자는 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 미국 특허 5,892,019에 기술되어 있다. 아울러, 용어 "변형된 항체"는 항체의 다가 형태 (예, 3가, 4가 등, 동일 항원의 3 카피 이상에 결합하는 항체)를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 변형된 항체는 CH2 도메인이 결핍된 하나 이상의 중쇄 영역과 수용체 리간드 쌍의 하나의 멤버의 결합 영역을 포함하는 폴리펩타이드의 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질이다.
또한, 본원에서, 용어 "변형된 항체"는 본 발명의 MET 항체의 아미노산 서열 변이체를 지칭하는데 사용될 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 본 발명의 MET 항체가 오리지날 MET 항체와 비교해 아미노산 서열이 변형된 변이체 MET 항체를 제조하도록 변형될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, "비-필수" 아미노산 잔기 (예, CDR 및/또는 프래임워크 잔기에서)에 보존적인 치환 또는 변화를 유도하는 뉴클레오티드 또는 아미노산 치환이 행해질 수 있다. 아미노산 치환은 하나 이상의 아미노산의 천연 또는 비-천연 아미노산으로의 치환을 포함할 수 있다.
본원에서, 용어 "인간화 치환 (humanising substitution)"은 본 발명의 MET 항체 (예, 낙타과-유래 MET 항체)의 VH 또는 VL 도메인 내 특정 위치에 존재하는 아미노산 잔기가 참조되는 인간 VH 또는 VL 도메인의 대응되는 위치에서 생성된 아미노산 잔기로 치환되는 아미노산 치환을 의미한다. 참조되는 인간 VH 또는 VL 도메인은 인간 생식계열에 의해 코딩된 VH 또는 VL 도메인일 수 있다. 인간화 치환은 본원에 정의된 MET 항체의 프래임워크 영역 및/또는 CDR에서 행해질 수도 있다.
본원에서 용어 "인간화 변이체"는 참조 MET 항체와 비교해 하나 이상의 "인간화 치환"을 포함하는 변이체 항체를 지칭하며, 여기서 참조 항체의 영역 (예, VH 도메인 및/또는 VL 도메인 또는 하나 이상의 CDR을 포함하는 이의 일부)은 비-인간 종으로부터 유래된 아미노산 서열을 가지며, "인간화 치환"은 비-인간 종 유래의 아미노산 서열에서 이루어진다.
본원에서, 용어 "생식계열 변이체 (germlined variant)"는, "인간화 치환"으로 본 발명의 MET 항체 (예, 낙타과-유래 MET 항체)의 VH 또는 VL 도메인 내 특정 위치(들)에 존재하는 하나 이상의 아미노산이 인간 생식계열에 의해 코딩된 참조 인간 VH 또는 VL 도메인 내 대응되는 위치에 생성된 아미노산으로 치환이 이루어진, "인간화 변이체"를 구체적으로 지칭하기 위해 사용된다. 임의의 소정의 "생식계열 변이체"의 경우, 생식계열 변이체로 치환되는 치환 아미노산 잔기는 하나의 인간 생식계열-코딩된 VH 또는 VL 도메인으로부터 독점적으로 또는 대부분 취해지는 것이 일반적이다. 용어 "인간화 변이체" 및 "생식계열 변이체"는 본원에서 종종 상호 호환적으로 사용된다. 낙타과 유래 (예, 라마 유래) VH 또는 VL 도메인에 하나 이상의 "인간화 치환"의 도입시, 낙타과 (라마)-유래 VH 또는 VL 도메인의 "인간화 변이체"가 제조된다. 치환되는 아미노산 잔기가 하나의 인간 생식계열-코딩된 VH 또는 VL 도메인 서열로부터 독점적으로 또는 대부분 취해진다면, 그 결과는 낙타과 (라마)-유래 VH 또는 VL 도메인의 "인간 생식계열 변이체일 수 있다.
본원에서, 용어 "친화성 변이체"는 본 발명의 참조 MET 항체와 비교해 아미노산 서열에 하나 이상의 변화를 가진 변이체 항체를 지칭하며, 이때 친화성 변이체는 참조 항체와 비교해 hMET 및/또는 mMET에 대한 친화성에 변화를 나타낸다. 바람직하게는, 친화성 변이체는 참조 MET 항체와 비교해 개선된 hMET 및/또는 mMET 친화성을 나타낼 것이다. 개선은 hMET 및/또는 mMET에 대한 낮은 KD로서, 또는 hMET 및/또는 mMET에 대한 느린 해리 속도로서 나타날 수 있다. 친화성 변이체는 전형적으로 참조 MET 항체와 비교해 CDR에 하나 이상의 아미노산 서열 변화를 나타낸다. 이러한 치환은 천연 아미노산 잔기 또는 비-천연 아미노산 잔기일 수 있는 여러가지 아미노산 잔기로 CDR내 해당 위치에 존재하는 오리지날 아미노산이 치환되는 결과를 나타낼 수 있다. 아미노산 치환은 보존적이거나 또는 비-보존적일 수 있다.
본원에서, "인간 상동성이 높은 (high human homology)" 항체는, 중쇄 가변성 도메인 (VH)과 경쇄 가변성 도메인 (VL)을 포함하되 이둘을 합하여 가장 비슷한 매칭되는 인간 생식계열 VH 및 VL 서열과 90% 이상의 아미노산 서열 동일성을 나타내는, 항체를 의미한다. 인간 상동성이 높은 항체는 인간 생식계열 서열과 충분히 높은 %의 서열 동일성을 나타내는 천연 비-인간 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 항체를 포함할 수 있으며, 그 예로는 낙타과의 통상적인 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 항체 뿐만 아니라 상기한 항체의 조작된, 특히 인간화 또는 생식계열 변이체 및 "완전한 인간" 항체 등이 있다.
일 구현예에서, 인간 상동성이 높은 항체의 VH 도메인은 프래임워크 영역 FR1, FR2, FR3 및 FR4 전역에서 하나 이상의 인간 VH 도메인에 대해 80% 이상의 아미노산 서열 동일성 또는 서열 상동성을 나타낼 수 있다. 다른 구현예들에서, 본 발명의 폴리펩타이드의 VH 도메인과 가장 유사한 매칭되는 인간 생식계열 VH 도메인 서열 간의 아미노산 서열 동일성 또는 서열 상동성은 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이하 또는 심지어 100%일 수 있다.
일 구현예에서, 인간 상동성이 높은 항체의 VH 도메인은 가장 유사한 매칭되는 인간 VH 서열과 비교해 프래임워크 영역 FR1, FR2, FR3 및 FR4 전역에서 하나 이상 (예, 1-10)의 아미노산 서열 미스매치를 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 인간 상동성이 높은 항체의 VL 도메인은 프래임워크 영역 FR1, FR2, FR3 및 FR4 전역에서 하나 이상의 인간 VL 도메인에 대해 80% 이상의 아미노산 서열 동일성 또는 서열 상동성을 나타낼 수 있다. 다른 구현예들에서, 본 발명의 폴리펩타이드의 VL 도메인과 가장 유사한 매칭되는 인간 생식계열 VL 도메인 서열 간의 아미노산 서열 동일성 또는 서열 상동성은 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이하 또는 심지어 100%일 수 있다.
일 구현예에서, 인간 상동성이 높은 항체의 VL 도메인은 가장 유사한 매칭되는 인간 VL 서열과 비교해 프래임워크 영역 FR1, FR2, FR3 및 FR4 전역에서 하나 이상 (예, 1-10)의 아미노산 서열 미스매치를 포함할 수 있다.
인간 상동성이 높은 항체와 인간 생식계열 VH 및 VL 간의 서열 동일성 %를 분석하기 앞서, H1 및 H2 또는 L1 또는 L2 (및 L3)에 대한 정규 폴드 (canonical fold)의 동일한 조합으로 인간 생식계열 세그먼트의 패밀리를 식별할 수 있는, 정규 폴드 (canonical fold)를 정할 수 있다. 그런 후, 대상 항체의 가변부와 서열 상동성이 가장 높은 인간 생식계열 패밀리 멤버를 서열 상동성의 점수를 매겨 선택한다. 매칭성이 가장 높은 인간 생식계열를 결정하고 서열 동일성/상동성 %를 결정하는 절차는 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있다.
인간 상동성이 높은 항체는 인간 또는 인간-유사 정규 폴드 구조를 가진 과가변성 루프 또는 CDR을 포함한다. 일 구현예에서, 인간 상동성이 높은 항체의 VH 도메인 또는 VL 도메인 내 하나 이상의 과가변성 루프 또는 CDR은 비-인간 항체, 예를 들어 낙타과의 종으로부터 유래되는 통상적인 항체의 VH 또는 VL 도메인으로부터 수득되거나 또는 유래될 수 있지만, 인간 항체에서 발생하는 정규 폴드 구조와 실질적으로 동일한 예측되는 또는 실제 정규 폴드 구조를 가진다. 일 구현예에서, 인간 상동성이 높은 항체의 VH 도메인에서 H1과 H2는, 인간 항체에서 발생하는 정규 폴드 구조와 실질적으로 동일한 예측되는 또는 실제 정규 폴드 구조를 나타낸다.
인간 상동성이 높은 항체는, 과가변성 루프 H1과 H2가, 하나 이상의 인간 생식계열 VH 도메인에서 발생하는 것으로 알려진 정규 구조들의 조합과 동일한 정규 폴드 구조들의 조합을 형성하는, VH 도메인을 포함할 수 있다. H1 및 H2에 정규 폴드 구조의 특정 조합들만 인간 생식계열에 의해 코딩된 VH 도메인에서 실제 발생하는 것으로 관찰된 바 있다. 일 구현예에서, 인간 상동성이 높은 항체의 VH 도메인 내 H1 및 H2는 비-인간 종, 예를 들어, 낙타과 종의 VH 도메인으로부터 수득될 수 있지만, 인간 생식계열 또는 체세포 돌연변이된 VH 도메인에서 발생하는 것으로 공지된 정규 폴드 구조들의 조합과 동일한 예측되는 또는 실제 정규 폴드 구조들의 조합을 형성한다. 비-제한적인 구현예에서, 인간 상동성이 높은 항체의 VH 도메인에서 H1과 H2는 비-인간 종, 예를 들어 낙타과 종의 VH 도메인으로부터 수득될 수 있으며, 다음과 같은 정규 폴드 조합들 중 하나를 형성한다: 1-1, 1-2, 1-3, 1-6, 1-4, 2-1, 3-1 및 3-5. 인간 상동성이 높은 항체는 인간 VH와의 높은 서열 동일성/서열 상동성을 나타내며; 인간 VH와의 구조 상동성을 나타내는 과가변성 루프를 함유하는, VH 도메인을 포함할 수 있다.
전체 1차 아미노산 서열 동일성 측면에서 인간 상동성이 높은 항체의 VH 도메인과의 매칭성이 가장 높은 인간 VH 생식계열 서열에 대해 "교정"하기 위해, 인간 상동성이 높은 항체의 VH 도메인에서 H1 및 H2에 정규 폴드 및 이들의 조합이 존재하는 것이 유익할 수 있다. 예를 들어, 가장 높은 서열 매칭성이 인간 생식계열 VH3 도메인에 대한 것이라면, 인간 VH3 도메인에서 일반적으로 발생하는 정규 폴드 조합을 형성하는 것이 H1 및 H2에 유리할 수 있다. 이는, 특히, 비-인간 종으로부터 유래된 인간 상동성이 높은 항체, 예를 들어 낙타과의 통상적인 항체로부터 유래된 VH 및 VL 도메인을 포함하는 항체, 특히 인간화된 낙타과 VH 및 VL 도메인을 포함하는 항체의 경우에 중요할 수 있다.
즉, 일 구현예에서, 인간 상동성이 높은 MET 항체의 VH 도메인은 프래임워크 영역 FR1, FR2, FR3 및 FR4 전역에서 인간 VH 도메인과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이하 또는 심지어 100%의 서열 동일성 또는 서열 상동성을 나타낼 수 있으며, 동일 항체 내 H1 및 H2와 더불어, 비-인간 VH 도메인으로부터 (예, 낙타과 종, 바람직하게는 라마로부터 유래) 수득되지만, 동일한 인간 VH 도메인에서 자연적으로 발생하는 것으로 공지된 정규 폴드 조합과 동일한 예측되거나 또는 실제 정규 폴드 구조의 조합을 형성한다.
다른 구현예들에서, 인간 상동성이 높은 VL 도메인에서 L1과 L2는 비-인간 종 (예, 낙타과-유래 VL 도메인)으로부터 수득되는 각각의 것이며, 각각은 인간 항체에서 발생하는 정규 폴드 구조와 실질적으로 동일한 예측되거나 또는 실제 정규 폴드 구조를 나타낸다.
인간 상동성이 높은 VL 도메인에서 L1과 L2는, 인간 생식계열 VL 도메인에서 발생하는 것으로 알려진 정규 폴드 구조의 조합과 동일한 예측되거나 또는 실제 정규 폴드 구조의 조합을 형성할 수 있다. 비-제한적인 구현예에서, 인간 상동성이 높은 항체 (예, 낙타과-유래 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 인간화 변이체)의 Vλ 도메인에서 L1과 L2는 다음과 같은 정규 폴드 조합들 중 하나를 형성할 수 있다: 11-7, 13-7(A,B,C), 14-7(A,B), 12-11, 14-11 및 12-12 (Williams et al., J. Mol. Biol. 264, 220-232, 1996에 따라 정의됨, http://www.bioc.uzh.ch/antibody/Sequences/Germlines/VBase_hVL.html에 표시됨). 비-제한적인 구현예에서, Vκ 도메인 내 L1 및 L2는 다음과 같은 정규 폴드 조합들 중 하나를 형성할 수 있다: 2-1, 3-1, 4-1 및 6-1 (Tomlinson et al., EMBO J. 14, 4628-4638, 1995에 따라 정의됨, http://www.bioc.uzh.ch/antibody/Sequences/Germlines/VBase_hVK.html에 표시됨). 다른 구현예에서, 인간 상동성이 높은 항체의 VL 도메인에서 L1, L2 및 L3 3종 모두 실질적인 인간 구조를 나타낼 수 있다. 바람직하게는, 인간 상동성이 높은 항체의 VL 도메인은 인간 VL과 높은 서열 상동성/서열 동일성을 모두 나타내고, 또한 VL 도메인 내 과가변성 루프는 인간 VL과 구조 상동성을 나타낸다.
일 구현예에서, 인간 상동성이 높은 MET 항체의 VL 도메인은 프래임워크 영역 FR1, FR2, FR3 및 FR4 전역에서 인간 VL 도메인과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이하 또는 심지어 100%의 서열 동일성 또는 서열 상동성을 나타낼 수 있으며, 과가변성 루프 L1 및 과가변성 루프 L2와 더불어, 동일한 인간 VL 도메인에서 자연적으로 발생하는 것으로 공지된 정규 폴드 조합과 동일한 예측되거나 또는 실제 정규 폴드 구조의 조합을 형성할 수 있다.
물론, 인간 VH와 높은 서열 동일성/서열 상동성을 나타내며 인간 VH의 과가변성 루프와 구조 동일성을 또한 나타내는 VH 도메인은, 인간 VL과 높은 서열 동일성/서열 상동성을 나타내며 인간 VL의 과가변성 루프와 구조 동일성을 또한 나타내는 VL 도메인과 조합되어, 인간-코딩된 VH/VL 쌍과의 최대 서열 및 구조 상동성을 가진 VH/VL 쌍 (예, 낙타과-유래 VH/VL 쌍)을 함유한 인간 상동성이 높은 항체를 제공할 것을 예상된다.
인간-유사 정규 폴드 구조체의 존재에 대한 낙타과-유래 (예, 람다-유래) CDR, VH 도메인 또는 VL 도메인을 평가하기 위한 절차는 WO 2010/001251 및 WO 2011/080350에 기술되어 있으며, 이의 내용은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
본원에서, 용어 "친화성" 또는 "결합 친화성"은 항체 결합 맥락에서 당해 기술 분야의 통상의 의미에 기초하여 이해되어야 하며, 항원과 항체 또는 이의 항원 결합 단편 상의 결합부 간의 결합 세기 및/또는 결합 안정성을 반영한다.
본원에 제공되는 anti-MET 항체는 인간 MET (hMET)에 대한 고 친화성 결합 및 또한 마우스 MET (mMET)에 대한 고 친화성 결합을 특징으로 한다. hMET 및 mMET에 대한 결합 친화성은 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지된 표준 기법을 이용해 분석할 수 있다.
일 구현예에서, 정의된 VH/VL 쌍을 포함하는 Fab 클론의 결합 친화성은 표면 플라즈몬 공명으로, 예를 들어, Biacore™ system을 사용해 분석할 수 있다. 본 발명의 항체 및 항원 결합 단편의 VH/VL 쌍을 포함하는 Fab 클론은, 전형적으로, hMET에 대해 1 x 10-3 s-1 내지 1 x 10-2 s-1, 선택적으로 1 x 10-3 s-1 내지 6 x 10-3 s-1 범위의 해리 속도를 나타낸다. 이러한 범위의 해리 속도는, Fab 및 대응되는 2가 mAb가 hMET에 대해 고 친화성 결합을 나타낸다는 의미로서, 이해될 수 있다. 마찬가지로, 본 발명의 항체 및 항원 결합 단편의 VH/VL 쌍을 포함하는 Fab 클론은 전형적으로 후술한 실시예에 기술된 바와 같이, Biacore™에 의한 측정시 mMET에 대해 1 x10-3 내지 1 x 10-2 s-1, 선택적으로 1 x10-3 내지 6 x 10-3 s-1 범위의 해리 속도를 나타낸다. 이러한 범위의 해리 속도는, Fab 및 대응되는 2가 mAb가 mMET에 대해 고 친화성 결합을 나타낸다는 의미로서, 이해될 수 있다. 따라서, 인간 및 뮤라인 MET 둘다에 대해 언급한 범위에 해당되는 해리 속도를 나타내는 Fab는 hMET에 대해 고 친화성 결합과 mMET에 대해 고 친화성 결합을 나타내며, 즉, Fab는 hMET와 mMET 간에 교차 반응성을 나타낸다. 인간 및 뮤라인 MET에 대한 해리 속도가 (각각) 언급된 범위내인 Fab 2개를 포함하는 2가 mAb는, 또한, 인간 MET에 대한 고 친화성 결합과 뮤라인 MET에 대한 고 친화성 결합을 나타내는 것으로 이해된다.
또한, 결합 친화성은 특정 항체에 대한 해리 상수로서 또는 KD로서 표시될 수 있다. KD 값이 낮을수록 항체와 이의 타겟 항원 간의 결합 강도가 더 강하다. KD는, 예를 들어, SPR 측정에 의해 결정된 Kon과 Koff 속도를 조합하여, 결정할 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 항체 및 항원 결합 단편은, mAb로 측정시, mMET 및 hMET에 대해 0.1 nMol/L 미만의 KD를 나타낸다.
또한, 인간 및 뮤라인 MET에 대한 결합 친화성은, 예를 들어, mAb를 ELISA 또는 유세포 측정을 이용하여 MET를 발현하는 포유류 세포주에 대한 결합성을 검사하는, 첨부된 실시예에 기술된 바와 같이 세포성 시스템을 이용해 평가할 수 있다. hMET 또는 mMET에 대한 고 친화성은, 예를 들어, 실시예 3에 기술된 바와 같이, ELISA에서 0.5 nM 이하의 EC50로 표시될 수 있다.
요컨대, 본 발명은, 적어도 부분적으로는, 고 친화성으로 hMET 및 mMET에 결합하는 항체 및 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 본 발명에 따른 MET 항체 및 항체 단편의 특성 및 특징은 추가적인 상세 설명에서 설명될 것이다.
본원에 기술된 고 친화성의 hMET 및 mMET 교차 반응성 항체 및 항원 결합 단편은 MET 작용제이다. 본원에서, MET 작용제는 MET 수용체에 결합시 (부분 또는 완전한) MET 신호전달을 유발한다. 본 발명에 따른 MET 작용제 항체 및 항원 결합 단편은 hMET의 작용제 및 mMET의 작용제이다. hMET 또는 mMET의 결합에 대한 본원에 기술된 항체의 작용제 활성은 상동적인 HGF-MET 결합시 (즉 인간 HGF 결합성 hMET, 마우스 HGF 결합성 mMET) 유발되는 분자적 반응과 세포성 반응을 (적어도 부분적으로) 모방하는 분자 및/또는 세포성 반응으로 표시될 수 있다. 이러한 반응을 자극하는 항체는 또한 본원에서 ""anti-MET 작용제", "작용제 항체" 및 이의 문법적 변형 형태로 언급된다. 마찬가지로, 이러한 반응을 부분적으로 또는 완전히 자극하는 항체는 본원에서 "부분 MET 작용제" 또는 "부분 작용제", 또는 "완전 MET 작용제" 또는 "완전 작용제"로 각각 언급된다. 본 발명의 항체 및 항원 결합 단편이 인간 및 마우스 시스템 둘다에서 MET 신호전달을 유도한다는 점에 주목하며, 즉, 이는 hMET 및 mMET의 작용제이다. 따라서, 이하 설명들은, 본 발명의 항체 및 항원 결합 단편에 의한 hMET의 결합으로 유도되는 반응과 본 발명의 본 발명의 항체 및 항원 결합 단편에 의한 mMET의 결합으로 유도되는 반응 둘다에 적용된다.
본 발명의 항체 및 항원 결합 단편에 의한 MET 작용제 활성 (agonism)은, MET 수용체의 인산화와 같은 분자 반응 및/또는 예를 들어, 세포 분산 분석, 항-세포자살 분석 및/또는 분지 형태형성 분석에서 검출가능한 등의, 세포성 반응에 의해 나타낼 수 있다. 이러한 분자 반응 및 세포성 반응은 아래에서 추가로 기술된다.
(i) MET 수용체의 인산화. 이와 관련하여, MET 작용제 항체 또는 항원 결합 단편은, 항체 또는 항원 결합 단편의 결합이 수용체-리간드 결합 부재 하에 MET의 자가-인산화를 유발할 경우, MET를 인산화하며, 즉, 인간 hMET에 항체 또는 항원 결합 단편이 결합하면 hHGF의 부재 하에 hMET가 인산화되며, mMET에 항체 또는 항원 결합 단편이 결합하면 mHGF의 부재 하에 mMET가 인산화된다. MET의 인산화는 당해 기술 분야에 공지된 방법으로, 예를 들어, 웨스턴 블롯팅 또는 포스포-MET ELISA에 의해 측정할 수 있다 (실시예 6 및 Basilico et al., J Clin Invest. 124, 3172-3186, 2014). 본원에 기술된 항체 및 항원 결합 단편은 hMET에 대해 "높은 인산화 효능" 또는 "낮은 인산화 효능"을 나타낼 수 있으며, mMET에 대해 "높은 인산화 효능" 또는 "낮은 인산화 효능"을 나타낼 수 있다. 이와 관련하여, 항체 또는 항원 결합 단편은, 항체 또는 단편이 mMET에 대해 HGF (<1nM)와 비슷한 EC50 및/또는 80% 이상의 EMAX (최대 HGF-유도성 활성화에 대한 %)의 효능을 나타내고; hMET에 대해 HGF (<1nM)와 비슷한 EC50 및/또는 80% 이상의 EMAX (최대 HGF-유도성 활성화에 대한 %)의 효능을 나타낼 경우, "고 인산화 효능"을 나타내는 것이다. 항체 또는 항원 결합 단편은, 항체가 mMET에 대해 1nM-5nM의 EC50 및/또는 60-80% 이상의 EMAX (최대 HGF-유도성 활성화에 대한 %)의 효능을 나타내고; hMET에 대해 1nM-5nM의 EC50 및/또는 60-80% 이상의 EMAX (최대 HGF-유도성 활성화에 대한 %)의 효능을 나타낼 경우, "저 인산화 효능"을 나타내는 것이다.
(ii) HGF-유사 세포성 반응 유도. MET 작용제 활성은 본 실시예에 기술된 세포 분산 분석, 항-세포자살 분석 및/또는 분지 형태형성 분석과 같은 분석을 이용해 측정할 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명에 따른 MET 작용제 항체 또는 항원 결합 단편은, 상동적인 HGF에 노출된 후 관찰되는 반응과 (적어도 부분적으로) 비슷한 반응 등의 반응을 세포성 분석에서 유도한다. 예를 들어, MET 작용제는, 항체 (예, IgG1)에 노출된 세포와 비교해, 항체에 반응하여 세포 분산 (cell scattering)의 증가; 32 nM 미만의 EC50 및/또는 무처리 세포와 비교해 20% 보다 높은 세포 생존성의 Emax를 가진, 약물-유발성 세포 자살에 대한 보호 효능; 및/또는 항체 또는 항원 결합 단편에 노출된 세포 구체 제조물에서 구체 당 분지의 개수 증가로, 나타날 수 있다.
본원에 기술된 항체 및 항원 결합 단편은, 사용 분석법에 따라, 인간 세포와의 접촉시 HGF-유사 세포 반응을 "완전히 유도" 또는 "부분적으로 유도"할 수 있거나, 또는 마우스 세포와의 접촉시 HGF-유사 세포 반응을 "완전히 유도" 또는 "부분적으로 유도"할 수 있다.
이와 관련하여, 항체 또는 단편에 의한 HGF-유사 세포 반응의 "완전한 유도"는 다음과 같이 측정할 수 있다:
세포 분산 분석에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 0.1-1.0 nM 농도에서 상동적인 HGF 0.1 nM에 적어도 동등한 수준의 세포 분산 증가를 유도함;
항-세포자살 분석에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 HGF에 대해 1.1x 이하의 EC50 및/또는 HGF에서의 관찰 결과에 대해 90% 보다 높은 Emax 세포 생존성을 나타냄; 및/또는
분지 형태형성 분석에서, 항체 또는 항원 결합 단편으로 처리된 세포는 동일 (non-zero) 농도의 HGF에 의해 유도되는 구체 당 분지 개수와 비교해 90% 보다 높은 수준으로 분지를 형성함.
이와 관련하여, 항체 또는 항원 결합 단편이 전술한 바와 같은 HGF-유사 세포 반응을 "완전히 유도"하지 않는다면, HGF-유사 세포 반응의 "부분적인 유도"는 다음과 같이 측정할 수 있다:
세포 분산 분석에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 항체의 농도가 1 nM 이하일 경우 상동적인 HGF 0.1 nM에 의해 유발되는 수준에 대해 25% 이상으로 세포 분산 수준을 유도함;
항-세포자살 분석에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 HGF에 대해 7.0x 이하의 EC50 및/또는 HGF에서의 관찰 결과에 대해 50% 보다 높은 Emax 세포 생존성을 나타냄; 및/또는
분지 형태형성 분석에서, 항체 또는 항원 결합 단편으로 처리된 세포는 동일 (non-zero) 농도의 HGF에 의해 유도되는 구체 당 분지 개수의 25% 이상에 해당되는 수준을 나타냄.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 항체 및 항원 결합 단편은 hMET 작용제 및 mMET 작용제이다. 즉, 항체가 HGF-유사 세포 반응을 (부분적으로 또는 완전히) 유도하는 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편이 인간 세포와 접촉되었을 때 HGF-유사 세포 반응이 (부분적으로 또는 완전히) 유도되며, 항체 또는 항원 결합 단편이 마우스 세포와 접촉되었을 때 HGF-유사 세포 반응이 (부분적으로 또는 완전히) 유도된다.
결합 영역을 맵핑 (실시예 4)한 결과, 본 발명의 anti-MET 항체는 MET의 PSI 도메인 내 또는 MET의 SEMA 도메인 내 MET의 에피토프를 인지하는 것으로 확인되었다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 MET, 바람직하게는 인간 MET의 PSI 도메인 내 에피토프를 인지한다. 특정 다른 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 MET, 바람직하게는 인간 MET의 SEMA 도메인 내 에피토프를 인지한다.
특정 구현예들에서, SEMA 도메인 내 에피토프를 인지하는 항체 또는 항원 결합 단편은 SEMA β-프로펠러 (propeller)의 블레이드 (blade) 상에 위치한 에피토프를 인지한다. 특정 구현예들에서, 에피토프는 SEMA β-프로펠러의 블레이드 4 또는 5 상에 위치한다. 이러한 특정 구현예에서, 에피토프는 인간 MET의 아미노산 314-372 사이에 위치한다. 특정 구현예들에서, 에피토프는 SEMA β-프로펠러의 블레이드 1-4 또는 1-3 상에 위치한다. 특정 구현예들에서, 에피토프는 인간 MET의 아미노산 27-313 사이에, 또는 인간 MET의 아미노산 27-225 사이에 위치한다.
특정 구현예들에서, MET의 PSI 도메인 내 에피토프를 인지하는 항체 또는 항원 결합 단편은 MET, 바람직하게는 인간 MET의 아미노산 516-545 사이에 위치한다. 특정 구현예들에서, MET의 PSI 도메인 내 에피토프를 인지하는 항체 또는 항원 결합 단편은 MET, 바람직하게는 인간 MET의 아미노산 546-562 사이에 위치한다.
특정 측면에서, 본원에 기술된 항체는 인간 및 마우스 MET 전체에서 보존된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 MET의 세포외 도메인 내 에피토프를 인지한다. 바람직한 구현예에서, 본원에 기술된 항체는 인간 MET, 마우스 MET, 랫 MET 및 유인원 (예, 시노몰구스) MET 전체에서 보존된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 MET의 세포외 도메인 내 에피토프를 인지한다.
특정 구현예들에서, 본 발명의 항체는 인간 MET의 아미노산 잔기 123번부터 잔기 223번까지의 영역에 위치한 인간 MET의 에피토프를 인지한다. 특정 구현예들에서, 본 발명의 항체는 인간 MET의 아미노산 잔기 224번부터 잔기 311번까지의 영역에 위치한 인간 MET의 에피토프를 인지한다. 특정 구현예들에서, 본 발명의 항체는 인간 MET의 아미노산 잔기 314번부터 잔기 372번까지의 영역에 위치한 인간 MET의 에피토프를 인지한다. 특정 구현예들에서, 본 발명의 항체는 인간 MET의 아미노산 잔기 546번부터 잔기 562번까지의 영역에 위치한 인간 MET의 에피토프를 인지한다.
특정 구현예들에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 아미노산 잔기 Ile367을 포함하는 인간 MET의 에피토프를 인지한다. 특정 구현예들에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 MET의 아미노산 잔기 Asp372를 포함하는 인간 MET의 에피토프를 인지한다. 특정 구현예들에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 아미노산 잔기 Ile367 및 Asp372를 포함하는 인간 MET의 에피토프를 인지한다.
이러한 특정 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 MET의 아미노산 잔기 314번부터 잔기 372번까지의 영역에 위치한 인간 MET의 에피토프를 인지하며, 여기서 에피토프는 아미노산 잔기 Ile367을 포함한다. 이러한 특정 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 MET의 아미노산 잔기 314번부터 잔기 372번까지의 영역에 위치한 인간 MET의 에피토프를 인지하며, 여기서 에피토프 아미노산 잔기 Asp371을 포함한다. 이러한 특정 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 MET의 아미노산 잔기 314번부터 잔기 372번까지의 영역에 위치한 인간 MET의 에피토프를 인지하며, 여기서 에피토프는 아미노산 잔기 Ile367 및 Asp372를 포함한다.
특정 구현예들에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 MET의 아미노산 잔기 Thr555를 포함하는 인간 MET의 에피토프에 결합한다.
이러한 특정 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 MET의 아미노산 잔기 546번부터 잔기 562번까지의 영역에 위치한 인간 MET의 에피토프를 인지하며, 이 에피토프는 아미노산 잔기 Thr555를 포함한다.
항체 또는 이의 항원 결합 단편이 다수의 아미노산 잔기들로 구성된 에피토프를 인지할 수 있는 것으로 이해될 것이다. 에피토프는 선형, 입체구조 또는 조합일 수 있다. 에피토프가 아미노산의 특정 영역 내에 있는 것으로 명시된 경우, 에피토프는 항체 또는 단편에 접촉되는 영역 내의 하나 이상의 아미노산으로 형성될 수 있다. 즉, 본 발명의 특정 구현예에서, 인지되는 에피토프가 명시된 아미노산 잔기 (예, Ile367, Asp372, Thr555)를 포함하는 한, 항체 또는 이의 단편은 명시된 영역 (예, 아미노산 314-372 또는 546-562) 내 복수의 아미노산 잔기 (인접한 또는 비-인접한)로 구성된 에피토프를 인지할 수 있는 것으로 이해될 것이다. 항체의 에피토프의 일부로서 인지되는 잔기를 확인하는 방법은 당해 기술 분야의 당업자들에게 익숙하며, 예를 들어 실시예 4 및 26에 기술된 방법을 포함한다.
본 발명의 anti-MET 항체 및 항원 결합 단편이 HGF에 의해 인지되는 결합 도메인과 중첩되거나 또는 근접한 에피토프에 결합하므로, 항체 및 항원 결합 단편은 상동적인 MET의 결합에 대해 HGF와 (적어도 부분적으로) 경쟁할 수 있다 (즉, hMET에 대해 인간 HGF와 경쟁하고, mMET 결합에 대해 마우스 HGF와 경쟁함). 즉, 항체 또는 항원 결합 단편은 결합 분석으로, 예를 들어, 실시예 5에 기술된 바와 같은 ELISA에 의해 상동적인 MET에 대한 HGF의 결합을 직접 또는 간접적으로 방지한다. 따라서, 특정 구현예들에서, 본 발명의 MET 항체 및 항원 결합 단편은 상동적인 MET의 결합에 대해 마우스 및 인간 HGF와 경쟁한다. 이러한 방식으로 HGF와 경쟁하는 항체 또는 항원 결합 단편은 또한 본원에서 "HGF 경쟁인자"로서 언급된다. 항체 또는 항원 결합 단편이 MET 결합에 대해 HGF와 경쟁하는 지를 확인하기 위한 분석은 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 경쟁 ELISA에서, HGF 경쟁인자는 5 nM 이하의 IC50 및/또는 50% 이상의 Imax (포화시 최고 경쟁 %)를 나타낼 수 있다. 본 발명의 항체 및 항원 결합 단편은 mMET와의 결합에 대해 마우스 HGF와, hMET와의 결합에 대해 인간 HGF와 경쟁한다.
본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 상동적인 MET 결합에 대해 HGF와 "완전히 경쟁"하거나 또는 "부분적으로 경쟁"할 수 있다. 이와 관련하여, "완전한 경쟁인자"는, 경쟁 분석에서, 예를 들어, ELISA에서, 2 nM 미만의 IC50 및/또는 적어도 90%의 Imax를 나타내는, 항체 또는 항원 결합 단편일 수 있다. 특정 구현예들에서, "완전한 경쟁인자"는 1 nM 미만의 IC50 및/또는 >90%의 Imax를 나타낸다. "부분 경쟁인자"는 경쟁 분석에서, 예를 들어, ELISA에서, 2-5 nM의 IC50 및/또는 50-90%의 Imax를 나타내는, 항체 또는 항원 결합 단편일 수 있다. 주어진 값은 상동적인 MET의 결합에 대한 마우스 HGF 및 인간 HGF의 경쟁에 적용된다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 및 마우스 둘다의 MET를 인지하는 능력을 가지므로, 유용하다. 본원에 기술된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 이것이 mMET 및 hMET에 결합시 동등한 특성을 나타낼 경우에, 특히 유용하다. 이러한 동등성 (equivalence)으로 인해 항체를 전-임상 뮤라인 질병 모델에서 분석할 수 있으며, 항체는 인간 상황에서 동일하거나 또는 비슷한 특성을 나타낼 것으로 예상된다.
따라서, 특정 구현예들에서, 본 발명의 항체 및 결합 단편은 hMET 및 mMET에 대해 동등한 결합 친화성을 나타낸다. 이와 관련하여, "동등한 결합 친화성"은, hMET에 대한 항체 또는 항원 결합 단편의 친화성이 mMET에 대한 항체의 친화성의 0.5-1.5배이라는 의미로 이해된다. 특정 구현예들에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 mMET에 대한 항체 또는 항원 결합 단편의 친화성의 0.8-1.2배의 치환성을 나타낸다.
명확하게 하기 위한 예로서, mMET 및 hMET에 대해 동등한 친화성을 가진 항체 또는 항원 결합 단편은, Fab 단편으로서 측정하였을 때, mMET에서 나타나는 해리 속도에 0.5-1.5배로 hMET에 대한 해리 속도를 나타낸다. 예를 들어, mMET에 대해 2.6 x10-3 s-1의 해리 속도를 나타내는, mMET 및 hMET에 대해 동등한 친화성을 가진, 항체는, hMET에 대해 1.3-3.9 x10-3 s-1의 해리 속도를 나타낼 것이다. 다른 예로, mMET 및 hMET에 대해 동등한 친화성을 가진 항체 또는 항원 결합 단편은, mMTE에 대한 항체 또는 단편의 EC50의 0.5-1.5배 수준의 hMET에 대한 EC50를 나타낼 수 있다 (예, ELISA 또는 유세포 측정으로 측정). 예를 들어, mMET에 대한 EC50이 0.1 nMol/L인, mMET 및 hMET에 대해 동등한 친화성을 가진 항체는, hMET에 대해 0.05-0.15 nMol/L의 EC50을 나타낼 것이다.
특정 구현예들에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 mMET 및 hMET의 동등한 작용제이다. 이와 관련하여, "동등"은, hMET의 결합시 유도되는 MET 작용제 활성 수준이 mMET 결합시 유도되는 신호전달 수준의 0.5-1.5배이라는 의미로 이해된다. 특정 구현예들에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 mMET 결합시 유도되는 신호전달 수준의 0.8-1.2배 수준으로, hMET 결합시 MET 신호전달을 유도한다.
특정 구현예들에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은, 본원에 기술된 한가지 이상의 MET 작용제 활성 분석으로 측정하였을 때, 동등한 mMET 및 hMET 작용제이다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 MET의 동등한 인산화를 유도하고, 약물-유발성 세포자살에 대해 동등한 보호 효과를 발휘하고, 및/또는 분지 형태형성 분석에서 동등한 수준의 분지 형성을 유도할 수 있다. 특정 구현예들에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 본원에 기술된 모든 분석으로 측정하였을 때 동등한 MET 작용제 활성을 나타낸다.
명확하게 하기 위해, 본 발명의 항체에 의한 MET의 동등한 인간화는 항체의 hMET에 대한 EC50이 mMET에 대한 EC50의 0.5-1.5x인 것으로 검출될 수 있다. 예를 들어, mMET에 대한 EC50이 2.9 nM이라면, 이 항체는 hMET에 대한 EC50이 1.45-4.35 nM 범위일 경우 hMET 인산화를 동등하게 유도할 것이다. 마찬가지로, 항-세포자살 분석에서 나타나는 동등한 MET 작용제 활성은, 인간 세포에서 Emax가 마우스 세포에서의 Emax의 0.5-1.5x인 것으로 검출될 수 있다. 예를 들어, 마우스 세포에서 Emax가 37.5%이고, 인간 세포에서의 Emax가 18.75-56.25% 범위일 경우, 이 항체는 동등한 hMET 작용제인 것이다. 분지 형태형성 분석에서 확인되는 동등한 MET 작용제 활성은, 인간 세포 구체를 항체에 노출시킨 후 관찰되는 분지의 개수가 마우스 구체를 동일 (non-zero) 농도에 노출시킨 후 관찰되는 분지의 개수의 0.5-1.5x인 것으로, 검출될 수 있다. 예를 들어, 0.5 nM 항체에 노출 후 마우스 세포에서 발생되는 분지의 수가 14개이라면, 0.5 nM 항체에 노출 후 인간 세포에서 발생되는 분지의 개수가 7-21개 범위일 경우 이 항체는 동등한 hMET 작용제일 것이다.
마찬가지로, hMET 및 mMET의 동등한 작용제 활성은 동등한 세포 분산에 의해 나타날 수 있다. 이러한 분석의 결과 특성은 0.5-1.5 인자 (factor)의 적용이 적절하지 않다는 것을 의미한다. 세포 분산 분석에서, hMET 및 mMET의 동등한 작용제 활성은, 항체에 노출된 인간 세포에서의 세포 분산 점수가 동일 (non-zero) 농도에 노출된 마우스 세포에서의 세포 분산 점수의 +/- 1인 것으로, 나타낼 수 있다. 예를 들어, 항체 0.33 nM에 노출된 마우스 세포의 세포 분산 점수가 2이라면, 동일 항체 0.33 nM에 노출된 인간 세포에서의 세포 분산 점수가 1-3일 경우, 이 항체는 hHGF의 동등한 작용제일 것이다.
특정 구현예들에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 mMET와 hMET 간의 동등한 HGF 경쟁을 나타낸다. 이와 관련하여, "동등한 HGF 경쟁"은, hMET에 대한 인간 HGF와 항체 또는 항원 결합 단편의 경쟁 수준이 mMET에 대한 마우스 HGF와 항체 또는 항원 결합 단편의 경쟁 수준의 0.5-1.5배인 의미로 간주된다. 특정 구현예들에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은, 인간 HGF와의 경쟁 수준이, mMET에 대한 마우스 HGF와 항체 또는 항원 결합 단편의 경쟁 수준의 0.8-1.2배이다.
예를 들어, 인간 HGF 및 마우스 HGF와 항체의 동등한 경쟁은, 인간 HGF-hMET 결합과 경쟁하는 항체의 IC50이 마우스 HGF-mMET 결합과 경쟁하는 항체의 IC50의 0.5-1.5배인 것으로 검출가능할 수 있다. 예를 들어, mHGF-mMET 결합에 대한 IC50이 0.34 nM이라면, HGF-hMET 결합에 대한 IC50이 0.17-0.51 nM 범위일 경우에, 이 항체는 hHGF 및 mHGF와 동등하게 경쟁하는 것이다.
특정 구현예들에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 랫 MET 및/또는 마카크 MET와 교차 반응한다. 랫 및 마카크 MET 중 하나 또는 둘다와의 교차 반응성은, 독성 실험을 랫 및/또는 마카쿠 모델 시스템에서 수행할 수 있다는 점에서 유용하다. 이와 관련하여, 항체가 시노몰구스 또는 랫 MET와 교차 반응성을 나타내는 지의 유무는, 첨부된 실시예 25에 기술된 바와 같은, ELISA에 의해 측정할 수 있다.
본원에 기술된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 낙타과 종의 VH 도메인 또는 VL 도메인으로부터 수득되는 하나 이상의 과가변성 루프 또는 상보성 결정부를 포함할 수 있다. 특히, 항체 또는 항원 결합 단편은, 이계 교배된 낙타과 동물, 예를 들어 라마를 인간 MET 항원으로 능동 면역화함으로써 수득되는, VH 및/또는 VL 도메인 또는 이의 CDR을 포함할 수 있다.
"낙타과 종의 VH 도메인 또는 VL 도메인으로부터 수득되는 과가변성 루프 또는 상보성 결정부"는, 과가변성 루프 (HV) 또는 CDR이 낙타과 면역글로불린 유전자에 의해 코딩되는 과가변성 루프 또는 CDR의 아미노산 서열과 동일한 또는 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가진다는 것을 의미한다. 이와 관련하여, "면역글로불린 유전자"는 생식계열 유전자, 재정렬된 면역글로불린 유전자, 및 또한 체세포 돌연변이된 유전자를 포함한다. 즉, 낙타과 종의 VH 또는 VL 도메인으로부터 수득되는 HV 또는 CDR의 아미노산 서열은, 성숙한 낙타과의 통상적인 항체에 존재하는 HV 또는 CDR의 아미노산 서열과 동일할 수 있다. 이러한 맥락에서 용어 "로부터 수득되는"은, MET 항체의 HV 또는 CDR이 낙타과 면역글로불린 유전자에 의해 본래 코딩된 아미노산 서열 (또는 이의 약간의 변이체)을 구현한다는 의미에서, 구조 관계를 내포한다. 그러나, 이는 MET 항체를 제조하기 위해 사용되는 제조 공정 측면에서 구체적인 관계를 반드시 내포하여야 하는 것은 아니다.
낙타과-유래 MET 항체는 특히 라마, 단봉낙타, 알파카, 비쿠냐, 구아나코우 또는 카멜 등의 임의의 낙타과 종으로부터 유래될 수 있다.
낙타과-유래의 VH 및 VL 도메인 또는 이의 CDR을 포함하는 MET 항체는, 전형적으로, 재조합으로 발현된 폴리펩타이드이며, 키메라 폴리펩타이드일 수 있다. 용어 "키메라 폴리펩타이드"는 인접하게 이루어지는 2 이상의 펩타이드 단편의 병렬에 의해 구축되는 인공 (비-천연) 폴리펩타이드를 지칭한다. 이 정의에는 2종 이상의 종, 예를 들어, 낙타 및 인간에 의해 코딩되는 펩타이드 단편들의 병렬에 의해 구축되는 "종" 키메라 폴리펩타이드가 포함된다.
낙타과-유래 CDR은 아래 표 3 및 4에 나타낸 CDR 서열들 중 하나를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 전체 (entire) VH 도메인 및/또는 전체 VL 도메인은 낙타과의 종으로부터 수득될 수 있다. 특정 구현예에서, 낙타과-유래 VH 도메인은 서열번호 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173 또는 175로 나타낸 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 낙타과-유래 VL 도메인은 서열번호 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174 또는 176으로 나타낸 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이후, 낙타과-유래 VH 도메인 및/또는 낙타과-유래 VL 도메인을, 낙타 아미노산 서열에 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결손을 도입하는, 단백질 조작을 실시할 수 있다. 이러한 조작된 변화는 바람직하게는 낙타과 서열을 기준으로 아미노산 치환을 포함한다. 이러한 변화는, 낙타과-코딩된 VH 또는 VL 도메인 내 하나 이상의 아미노산 잔기가 상동적인 인간-코딩된 VH 또는 VL 도메인 내 상응하는 장기로 치환되는, "인간화" 또는 "생식계열화 (germlining)"를 포함한다.
낙타과 동물 (예, 라마)을 인간 MET 항원으로 능동 면역화함으로써 수득되는 분리된 낙타과 VH 및 VL 도메인은, 본 발명에 따른 MET 항체를 조작하기 위한 토대로서 사용될 수 있다. 무손상 낙타과 VH 및 VL 도메인을 출발 물질로 하여, 낙타과 출발 서열에서 시작하여 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결손을 조작할 수 있다. 특정 구현예에서, 이러한 치환, 삽입 또는 결손은 VH 도메인 및/또는 VL 도메인의 프래임워크 영역에 존재할 수 있다. 일차 아미노산 서열에서 이러한 변화의 목적은 아마도 비우호적인 특성 (예, 인간 숙주에서의 면역원성 (소위 인간화), 잠재적인 산물 이종성 (heterogeneity) 부위 및/또는 불안정성 부위) (당화, 탈아민화, 이성질화 등)을 줄이기 위해, 또는 분자의 일부 다른 우호적인 특성 (예, 용해성, 안정성, 생체이용성 등)을 강화하기 위한 것일 수 있다. 다른 구현예에서, 일차 아미노산 서열에서의 변화는 능동 면역화에 의해 수득되는 낙타과 VH 및/또는 VL 도메인의 하나 이상의 과가변성 루프 (또는 cDR)에서 조작될 수 있다. 이러한 변화는 항원 결합 친화성 및/또는 특이성을 강화하거나, 또는 아마도 비우호적인 특성, 예를 들어, 인간 숙주에서의 면역원성 (소위 인간화), 잠재적인 산물 이종성 및/또는 불안정성, 당화, 탈아민화, 이성질화 등을 줄이기 위해, 또는 분자의 일부 다른 우호적인 특성, 예를 들어, 용해성, 안정성, 생체이용성 등을 강화하기 위해, 도입될 수 있다.
따라서, 일 구현예에서, 본 발명은, 낙타과-유래 VH 또는 VL 도메인과 비교해, VH 도메인 또는 VL 도메인의 하나 이상의 프래임워크 또는 CDR 영역에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 변이체 MET 항체를 제공하며, 예로, 비-제한적으로, 서열번호 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173 또는 175에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 낙타과 VH 도메인 및 서열번호 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174 또는 176에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 낙타과 VL 도메인을 포함한다.
특정 구현예들에서, 낙타과-유래 VH 및 VL 도메인 (또는 이의 조작된 변이체)과 비-낙타과 항체, 예를 들어 인간-코딩된 불변 도메인 (또는 이의 조작된 변이체) 유래의 하나 이상의 불변 도메인을 포함하는 "키메라" 항체 분자를 제공한다. 이러한 구현예에서, 바람직하게는, VH 도메인과 VL 도메인은 둘다 동일한 낙타 종으로부터 수득되며, 예를 들어 (조작된 아미노산 서열 변형을 도입하기 전에) VH 및 VL 둘다 라마로부터 유래될 수 있다. 이러한 구현예에서, VH 및 VL 도메인 둘다 단일 동물, 특히 인간 MET 항원으로 능동 면역화된 단일 동물로부터 유래될 수 있다.
본 발명은, 특정 구현예들에서, 키메라 낙타과/인간 항체, 특히, VH 및 VL 도메인이 완전한 낙타과 서열 (예, 라마 또는 알파카)이고 항체의 나머지는 완전한 인간 서열인, 키메라 항체를 포괄할 수 있다. MET 항체는 낙타과-유래 VH 및 VL 도메인, 또는 이의 CDR의 "인간화된" 또는 "생식계열화된" 변이체를 포함하는 항체, 및 VH 및 VL 도메인이 낙타과 동물을 인간 MET 항원으로 능동 면역화하여 수득한 낙타과 VH 및 VL 도메인과 비교해 프래임워크 영역에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 낙타과/인간 키메라 항체를 포함할 수 있다. 이러한 "인간화"는 출발 낙타과 VH 또는 VL 도메인 내 미스매칭된 아미노산 잔기를 인간 생식계열-코딩된 VH 또는 VL 도메인에서 발견되는 등가의 잔기로 치환함으로써 인간 생식계열 VH 또는 VL 도메인과의 서열 동일성 %를 증가시킨다.
본 발명은, 특정 구현예에서, 키메라 낙타과/마우스 항체, 특히 VH 및 VL 도메인이 완전한 낙타과 (예, 라마 또는 알파카) 서열이고 항체의 나머지가 완전한 마우스 서열인 키메라 항체를 포괄할 수 있다.
본 발명의 MET 항체 또는 항원 결합 단편은, 또한, 낙타과 항체, 예를 들어 인간 MET 단백질로 능동 면역시켜 제조된 낙타과 MET 항체로부터 유래되거나 또는 낙타과 유전자에 의해 코딩된 CDR (또는 과가변성 루프)가 인간 VH 및 VL 프래임워크 상에 그래프팅되고 항체의 나머지는 완전히 인간 기원의 것인, CDR-grafted 항체일 수도 있다. 이러한 CDR-grafted MET 항체는 아래 표 3 및 4에 나타낸 아미노산 서열을 가진 CDR을 포함할 수 있다.
낙타과-유래 MET 항체는, VH 도메인 및/또는 VL 도메인의 과가변성 루프(들) 또는 CDR(들)이 인간 MET에 대해 생성된 통상적인 낙타과 항체로부터 수득되지만, 상기 (낙타과-유래) 과가변성 루프 또는 CDR 중 하나 이상이 낙타과-코딩된 서열과 비교해 하나 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결손을 포함하도록 조작된, 변이체를 포함한다. 이러한 변화는 과가변성 루프/CDR의 "인간화"를 포함한다. 이러한 방식으로 조작된 낙타과-유래 HV/CDR은 낙타과-코딩된 HV/CDR의 아미노산 서열과 "실질적으로 동일한" 아미노산 서열을 여전히 나타낼 수 있다. 이와 관련하여, "실질적으로 동일한"은 낙타과-코딩된 HV/CDR과의 1개 이하 또는 2개 이하의 아미노산 서열의 미스 매치를 허용할 수 있다. MET 항체에 대한 구체적인 구현예는 표 3 및 4에 나타낸 CDR 서열의 인간화 변이체를 포함할 수 있다.
낙타과 (예, 라마) 통상적인 항체는 US 12/497,239에 기술된 하기 요인으로 인해 인간 치료학적 물질로서 유용성을 가진 항체를 제조하는 유익한 출발점을 제공해주며, 상기 특허 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다:
1) 낙타과 VH 및 VL 도메인 및 이의 인간 카운터파트 간의 높은 서열 상동성 %;
2) 낙타과 VH 및 VL 도메인의 CDR과 이의 인간 카운터파트 간의 높은 구조 상동성 (즉, 인간-유사 정규 폴드 구조 및 정규 폴드의 인간-유사 조합).
낙타과 (예, 라마) 플랫폼은 또한 수득될 수 있는 MET 항체의 기능 다양성 측면에서 현저한 이점을 제공한다.
인간 테라피 (human therapy)에 있어 낙타과 VH 및/또는 낙타과 VL 도메인을 포함하는 MET 항체의 유용성은, 천연 낙타과 VH 및 VL 도메인의 "인간화"에 의해, 예를 들어 인간 숙주에 낮은 면역원성을 부여하기 위해, 추가로 개선할 수 있다. 인간화의 전반적인 목적은, 부모 VH 및 VL 도메인에 의해 형성된 항원 결합부의 특이성 및 친화성을 유지하면서 VH 및 VL 도메인이 인간 개체에 도입되었을 때 최소한의 면역원성을 나타내는, 분자를 제조하고자 하는 것이다.
인간화, 소위 "생식계열화 (germlining)"를 위한 한가지 방법은 인간 VH 또는 VL 도메인의 생식계열 서열에 가깝게 만들기 위한, 낙타과 VH 또는 VL 도메인의 아미노산 서열에서의 조작 변화를 수반한다.
낙타과 VH (또는 VL) 도메인 및 인간 VH (또는 VL) 도메인 간의 상동성 결정은, (소정의 VH 또는 VL 도메인에서) 변화시킬 낙타과 아미노산 잔기의 선정 및 적절한 치환 아미노산 잔기(들) 선정을 위한, 인간화 공정의 중요한 단계이다.
다수의 새로운 낙타과 VH (및 VL) 도메인 서열의 정렬, 전형적으로 타겟 항원에 결합하는 것으로 공지된 체세포 돌연변이된 VH (또는 VL) 도메인, 인간 생식계열 VH (또는 VL) 서열, 인간 VH (또는 VL) 컨센서스 서열 및 라마 파코스에서 이용가능한 생식계열 서열 정보를 토대로 통상적인 낙타과 항체의 생식계열화 방식이 개발되었다.
이러한 방식은, WO 2011/080350에 개시되어 있으며 원용에 의해 본 명세서에 포함되며, (i) 낙타과-유래 VH 또는 VL 도메인 또는 이의 CDR에서 치환할 "낙타과" 아미노산 잔기를 선택하고, (ii) 임의의 소정의 낙타과 VH (또는 VL) 도메인을 인간화하는 경우, 치환시킬 치환 "인간" 아미노산 잔기를 선택하는데, 적용할 수 있다. 이러한 방식은 표 3 및 4에 나타낸 아미노산 서열을 가진 낙타과-유래 CDR의 인간화 변이체를 제조하는데 이용할 수 있으며, 또한 표 5에 나타낸 서열을 가진 낙타과-유래 VH 및 VL 도메인의 생식계열화에도 이용할 수 있다.
MET 항체는, VH 도메인과 VL 도메인이 둘다 존재하는, 다양한 여러가지 구현예를 취할 수 있다. 용어 "항체"는 본원에서 가장 넒은 의미로 사용되며, 비-제한적으로, 인간 MET 단백질 및 마우스 MET 단백질에 대해 적절한 면역 특이성을 나타내는 한, 단일클론 항체 (전장 단일클론 항체 포함), 다클론 항체, 다중 특이적인 항체 (예, 2 특이성 항체)를 포괄한다. 본원에서, 용어 "단일클론 항체"는 실질적으로 상동적인 항체, 즉 집단을 구성하는 개개 항체들이 최소한으로 존재할 수 있는 가능성있는 천연 돌연변이를 제외하고는 동일한 집단으로부터 수득되는 항체를 지칭한다. 단일클론 항체는 고 특이성이며, 단일 항원 부위에 대한 것이다. 또한, 전형적으로 항원 상의 서로 다른 결정기 (에피토프)에 대한 서로 다른 항체를 포함하는 통상적인 (다클론) 항체 제조물과 대조적으로, 각 단일클론 항체는 항원 상의 단일 결정기 또는 에피토프에 대한 것이다.
"항체 단편"은 전장 항체의 일부, 일반적으로 이의 항원 결합성 또는 가변성 도메인을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2, 2 특이성 Fab's, 및 Fv 단편, 다이아바디, 선형 항체, 단쇄 항체 분자, 단쇄 가변성 단편 (scFv) 및 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이성 항체 등이 있다 (Holliger and Hudson, Nature Biotechnol. 23:1126-1136, 2005를 참조하며, 이의 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨).
비-제한적인 구현예에서, 본원에 제공된 MET 항체는 CH1 도메인 및/또는 CL 도메인을 포함할 수 있으며, 이의 아미노산 서열은 완전히 또는 실질적으로 인간 서열이다. MET 항체가 인간 치료학적 용도로 의도되는 경우, 항체의 전체 불변부 또는 이의 적어도 일부는 완전한 또는 실질적인 인간 아미노산 서열을 가지는 것이 전형적이다. 따라서, CH1 도메인, 힌지부, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CL 도메인 (존재하는 경우 CH4 도메인) 중 하나 이상 또는 임의 조합은 그 아미노산 서열이 완전히 또는 실질적으로 인간일 수 있다. 이러한 항체는 임의의 인간 이소형, 예를 들어, IgG1의 것일 수 있다.
유익하게는, CH1 도메인, 힌지부, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CL 도메인 (존재하는 경우 CH4 도메인)은 모두 완전히 또는 실질적인 인간 아미노산 서열을 가질 수 있다. 인간화 또는 키메라 항체, 또는 항체 단편의 불변부와 관련하여, 용어 "실질적으로 인간"은 인간 불변부와 90% 이상 또는 92% 이상 또는 95% 이상 또는 97% 이상 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 의미한다. 이러한 맥락에서 용어 "인간 아미노산 서열"은 생식계열, 재정렬된 및 체세포 돌연변이된 유전자를 포함하는 인간 면역글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열을 지칭한다. 이러한 항체는 임의의 인간 이소형일 수 있으며, 인간 IgG4 및 IgG1이 특히 바람직하다.
또한, "완전한 인간 (fully human)" 힌지부의 존재가 명확하게 필요한 구현예들을 제외하고는, 인간 서열에 대해 하나 이상의 아미노산 부가, 결손 또는 치환에 의해 변형된 "인간" 서열의 불변 도메인을 포함하는 MET 항체를 제공한다.
본 발명의 MET 항체에서 "완전한 인간" 힌지부의 존재는 항체의 면역원성을 최소화하고 안정성을 최적화하는데 유익할 수 있다.
본원에 제공되는 MET 항체는 임의 이소형의 것일 수 있다. 인간 치료학적 용도로 의도된 항체는, 전형적으로, IgA, IgD, IgE IgG, IgM 타입, 종종 IgG 타입의 것일 것이며, IgG 타입일 경우 이는 4가지 서브 클래스 IgG1, IgG2a 및 b, IgG3 또는 IgG4 중 임의의 것에 속할 수 있다. 이들 서브 클래스 각각에서는, Fc 영역 내 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결손이 허용되거나, 또는 예를 들어 Fc-의존적인 기능성을 강화 또는 약화하기 위해 다른 구조적 변형이 허용된다.
비-제한적인 구현예에서, 하나 이상의 아미노산의 치환, 삽입 또는 결손이 중쇄 및/또는 경쇄의 불변부, 특히 Fc 영역 내에서 이루어질 수 있는 것으로 예상된다. 아미노산 치환으로 치환되는 아미노산의 서로 다른 천연 아미노산 또는 비-천연 또는 변형된 아미노산으로의 치환을 달성할 수 있다. 예를 들어 (예, N- 또는 O-연결된 당화 부위의 삽입 또는 결손에 의한) 당화 패턴의 변화 등의 그외 구조 변형도 허용된다. MET 항체의 의도한 용도에 따라, Fc 수용체에 대한 결합 특성에 대해 본 발명의 항체를 변형시키는 것이, 예를 들어 작동자 기능을 조절하는 것이 바람직할 수 있다.
특정 구현예들에서, MET 항체는, 항체 이소형과 본래 관련있는 하나 이상의 항체 작동자 기능을 낮추거나 또는 실질적으로 없애기 위해 변형된, 소정의 항체 이소형, 예를 들어, 인간 IgG1의 Fc 영역을 포함할 수 있다. 비-제한적인 구현예에서, MET 항체는 임의의 항체 작동자 기능이 실질적으로 없을 수 있다. 이와 관련하여, "항체 작동자 기능"은 항체-의존적인 세포성 세포독성 (ADCC), 보체-의존적인 세포독성 (CDC) 및 항체-의존적인 세포성 식세포작용 (ADCP) 중 하나 이상 또는 전체를 포함한다.
MET 항체의 FC 영역의 아미노산 서열은, (돌연변이를 가지지 않는 야생형 카운터파트 항체와 비교해) 하나 이상의 항체 작동자 기능을 줄이는 효과를 가진, 아미노산 치환, 결손 또는 삽입과 같은 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 이러한 여러가지 돌연변이는 항체 조작 분야에 공지되어 있다. 본원에 언급된 MET 항체에 포함되는 것이 적합한 비-제한적인 예로는 인간 IgG4 또는 인간 IgG1의 Fc 도메인에 다음과 같은 돌연변이를 포함한다: N297A, N297Q, LALA (L234A, L235A), AAA (L234A, L235A, G237A) 또는 D265A (아미노산 잔기 넘버링은 인간 IgG1에서 EU 넘버링 시스템에 따름).
본원에 기술된 MET 항체와 "교차-경쟁하"는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 본 발명의 MET 항체가 결합하는 부위(들)와 동일하거나 또는 이와 중첩되는 부위(들)에서 인간 MET에 결합하고, 본 발명의 MET 항체가 결합하는 부위(들)와 동일하거나 또는 이와 중첩되는 부위(들)에서 마우스 MET에 결합하는 것이다. 경쟁성 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 예를 들어 항체 경쟁 분석을 통해 식별할 수 있다. 예를 들어, 정제된 또는 부분 정제된 인간 MET의 샘플을 고체 지지체에 결합시킬 수 있다. 그런 후, 본 발명의 항체 화합물 또는 이의 항원 결합 단편 및 본 발명의 이러한 항체 화합물과 경쟁할 수 있는 것으로 추정되는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 첨가한다. 2가지 분자 중 하나는 표지한다. 표지된 화합물과 비-표지된 화합물이 MET 상의 별개의 구분되는 부위에 결합한다면, 표지된 화합물은 추정되는 경쟁성 화합물의 존재 여부에 상관없이 동일한 수준으로 결합할 것이다. 그러나, 만일 상호작용 부위들이 동일하거나 또는 중첩된다면, 비-표지된 화합물과 경쟁할 것이며, 항원에 결합된 표지된 화합물의 양은 감소할 것이다. 비-표지된 화합물이 과량으로 존재한다면, 표지된 화합물은 존재하더라도 극히 소량만 결합할 것이다. 본 발명의 목적에서, 경쟁성 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 본 발명의 항체 화합물의 MET에 대한 결합성을 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 99%까지 낮추는 것이다. 이러한 경쟁 분석을 수행하는 절차에 대한 상세 내용은 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있으며, 예를 들어, Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1988, 567-569, 1988, ISBN 0-87969-314-2에서 확인할 수 있다. 이러한 분석은 정제된 항체를 이용함으로써 정량적으로 행할 수 있다. 하나의 항체를 자체 타이트레이션함으로써 표준 곡선을 확립하고, 즉 동일 항체가 표지물질 및 경쟁인자 둘다로 사용된다. 비-표지된 경쟁성 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 표지된 분자의 플레이트에 결합하는 것을 저해하는 저해력을 타이트레이션한다. 그 결과를 플롯팅하고, 원하는 결합 저해 수준에 도달하는데 필요한 농도를 비교한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 MET 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자, 또한 숙주 세포 또는 무세포 발현 시스템에서 항원 결합성 폴리펩타이드의 발현을 허용하는 조절 서열과 작동가능하게 연결된 본 발명의 MET 항체를 코딩하는 뉴클드 서열을 포함하는 발현 벡터, 및 이러한 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포 또는 무세포 발현 시스템을 제공한다.
본 발명의 MET 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자는, 예를 들어, 재조합 DNA 분자를 포함한다. 용어 "핵산", "폴리뉴클레오티드" 또는 "폴리뉴클레오티드 분자"는 본원에서 상호 호환적으로 사용되며, 단일 가닥 또는 이중 가닥의 임의의 DNA 또는 RNA 분자를 지칭하며, 단일 가닥일 경우 이의 상보적인 서열을 지칭한다. 핵산 분자와 관련하여, 특정 핵산의 서열 또는 구조는 일반 규칙에 따라 본원에서 기술되며 5'에서 3' 방향으로 서열을 나타낸다. 본 발명의 일부 구현예에서, 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 "단리"된다. 이 용어는, 핵산 분자에 적용할 경우, 기원한 유기체의 천연 게놈에서 바로 인접한 서열로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 예를 들어, "단리된 핵산"은 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 같은 벡터에 삽입되거나, 또는 원핵생물 또는 진핵생물 세포 또는 비-인간 숙주 유기체의 게놈 DNA에 통합된 DNA 분자를 포함할 수 있다. RNA에 적용할 경우, 용어 "단리된 폴리뉴클레오티드"는 전술한 단리된 DNA 분자에 의해 코딩된 ENA 분자를 주로 지칭한다. 다른 예로, 이 용어는 천연 상태 (즉 세포 또는 조직 내)에서 결합된 다른 핵산으로부터 정제/분리된, RNA 분자를 지칭할 수 있다. 단리된 폴리뉴클레오티드 (DNA 또는 RNA)는 생물학적 또는 합성 수단에 의해 직접 제조되며, 제조 중에 존재하는 다른 성분들로부터 분리된 분자를 또한 나타낼 수 있다.
본 발명에 따른 MET 항체를 재조합 방식으로 제조하기 위해, 이를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 (표준 분자 생물학 기법을 이용해) 제조하고 이를 선택된 숙주 세포 또는 무세포 발현 시스템에서 발현하기 위해 복제가능한 벡터에 삽입할 수 있다. 적합한 숙주 세포는 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포, 특히 포유류 세포일 수 있다. 사용가능한 포유류 숙주 세포주의 예로는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주 (293 세포 또는 현탁 배양으로 증식시키기 위해 서브클로닝한 293 세포, Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-74, 1977); 베이비 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 중국 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216, 1980); 마우스 세르톨리 세포 (TM4; Mather, Biol. Reprod. 23:243-252, 1980); 마우스 골수종 세포 SP2/0-AG14 (ATCC CRL 1581; ATCC CRL 8287) 또는 NS0 (HPA culture collections no. 85110503); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 그린 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 랫 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68, 1982); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간종양 세포주 (Hep G2), 뿐만 아니라 DSM의 PERC-6 세포주 등이 있다. 이들 숙주 세포 각각에 사용하기 적합한 발현 벡터 역시 당해 기술 분야에 공지되어 있다.
용어 "숙주 세포"는 일반적으로 배양된 세포주를 지칭함에 유념하여야 한다. 본 발명에 따른 항원 결합성 폴리펩타이드를 코딩하는 발현 벡터가 도입되는 모든인간은 "숙주 세포"의 정의에서 명시적으로 제외된다.
중요한 측면에서, 본 발명은 MET 항체의 발현을 허용하는 조건 하에 MET 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (예, 발현 벡터)를 포함하는 숙주 세포 (또는 무세포 발현 시스템)를 배양하는 단계; 및 발현된 MET 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명의 MET 항체의 제조 방법을 제공한다. 이러한 재조합 발현 공정은, 인간 치료학적 용도로 의도된 단일클론 항체 등의 본 발명에 따른 MET 항체를 대량 생산하는데 이용할 수 있다. 생체내 치료학적 용도로 적합한 재조합 항체를 대량 제조하는데 적합한 벡터, 세포주 및 제조 방법은 일반적으로 당해 기술 분야에서 이용가능하며, 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 공지되어 있을 것이다.
본원에 제공되는 MET 항체는 테라피에, 특히 질병의 치료학적 처리에, 특히 비-제한적인 예로, 퇴행성 질환, 염증성 질환, 자가면역 질환, 대사성 질환, 이식-관련 장애 및 상처 치유 등의 MET 기능을 자극하는 것이 유익한 병태에 유용성을 가진다. 이와 관련하여, 본원에 제공되는 MET 항체는, 상기한 병태를 치료하는데 치료학적 유용성을 가진, MET 작용제, 예를 들어 HGF의 더 넓은 클래스의 예이다.
간세포는, 증식을 촉진하고 세포자살로부터 보호하는 HGF의 기본 타겟인, MET를 발현한다. MET 신호전달을 유도하는 MET 항체는 마우스 간 손상 모델에서 급성 간 손상 및 만성 손상 둘다에서 간 세포를 보호하는 것으로 본원에 확인되었다 (실시예 16 및 17). 본원에 이미 기술된 바와 같이, 본 발명의 항체는 마우스 시스템에서와 등가의 특성을 인간 시스템에서 나타내며, 따라서 인간 간 손상 측면에서 비슷한 보호 효과를 부여할 것으로 예상된다. 따라서, 일 측면에서, 본 발명은, MET 신호전달을 유도하는 MET 항체를 치료학적 유효량으로 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간 환자에서 간 손상을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 특정 구현예들에서, 이 방법은 급성 간 손상을 치료 또는 예방하는 방법이다. 특정 구현예들에서, 이 방벙은 만성 간 손상을 치료 또는 예방하는 방법이다. 특정 구현예들에서, 항체는 본원에 기술된 항체이다.
신장 상피 세포는 MET를 현저한 수준으로 발현하며, HGF 자극에 민감하다. MET 신호전달을 유도하는 MET 항체는 본원에서 급성 신장 손상 마우스 모델에서 보호를 부여하는 것으로 확인되었다 (실시예 18). 전술한 바와 같이, 본 발명의 항체는 인간 시스템에서 마우스 시스템에서와 등가의 특성을 나타내며, 따라서 인간 신장 손상에 대해 비슷한 보호 효과를 부여하는 것으로 예상할 수 있다. 따라서, 일 측면에서, 본 발명은, MET 신호전달을 유도하는 MET 항체를 치료학적 유효량으로 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간 환자에서 신장 손상을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 특정 구현예들에서, 본 방법은 급성 신장 손상을 치료 또는 예방하는 방법이다. 특정 구현예들에서, 항체는 본원에 기술된 항체이다.
또한, 본원에서 (실시예 19 및 20), MET 신호전달을 유도하는 MET 항체의 투여는 염증성 장 질환 (IBD), 예를 들어 궤양성 결장염의 마우스 모델에서 효과적인 치료를 제공하는 것으로 입증되었다. 따라서, 일 측면에서, 본 발명은, MET 신호전달을 유도하는 MET 항체를 치료학적 유효량으로 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간 환자에서 IBD를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 특정 구현예들에서, 본 방법은 궤양성 결장염의 치료 또는 예방 방법이다. 특정 구현예들에서, 항체는 본원에 기술된 항체이다.
MET 신호전달을 유도하는 MET 항체의 투여가 1형 및 2형 당뇨병 등의 당뇨병에서 대사 기능을 회복시킬 수 있는 것으로 또한 입증되었다 (실시예 21 및 22). 특히 1형 당뇨병 모델 (실시예 21)에서, MET 항체는 글루코스 흡수를 촉진하는 것으로 확인된다. 또한, MET 항체를 인슐린과 함께 투여하면 글루코스 흡수에 상승적인 효과가 발생하였다. 2형 당뇨병 모델 (실시예 22)에서, MET 항체는 글루코스 조절을 정상화하고 인슐린 내성을 낮추는 것으로 확인된다. 따라서, 일 측면에서, 본 발명은, MET 신호전달을 유도하는 MET 항체를 치료학적 유효량으로 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간 환자에서 당뇨병을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 특정 구현예들에서, 본 방법은 1형 당뇨병의 치료 또는 예방 방법이다. 이러한 특정 구현예에서, 본 방법은 환자에 인슐린의 투여를 더 포함한다. 특정 구현예들에서, 본 방법은 2형 당뇨병의 치료 방법이다. 특정 구현예들에서, 항체는 본원에 기술된 항체이다.
또한, 본원에서, MET 신호전달을 유도하는 MET 항체의 투여는 비-알코올성 지방간염 (NASH)에 대한 마우스 모델에서 지방간의 정도를 낮출 수 있는 것으로 입증되었다 (실시예 23). 특히, MET 항체는 지방 세포의 수와 섬유증의 정도를 낮출 수 있었다. 따라서, 일 측면에서, 본 발명은, MET 신호전달을 유도하는 MET 항체를 치료학적 유효량으로 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간 환자에서 NASH를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 특정 구현예들에서, 항체는 본원에 기술된 항체이다.
또한, 본원에서, MET 신호전달을 유도하는 MET 항체의 투여가 상처 치유를 촉진할 수 있는 것으로 입증되었다 (실시예 24). 아울러, MET 항체는 상처 치유가 손상된 당뇨병 마우스에서 상처 치유를 촉진할 수 있었다. 따라서, 일 측면에서, 본 발명은, MET 신호전달을 유도하는 MET 항체를 치료학적 유효량으로 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간 환자에서 상처 치유를 촉진하는 방법을 제공한다. 특정 구현예들에서, 인간 환자는 당뇨병, 선택적으로 1형 당뇨병 환자이다. 특정 구현예들에서, 항체는 본원에 기술된 항체이다.
실시예
본 발명은 아래 비-제한적인 실험 실시예를 참조하여 더욱 이해될 것이다.
실시예 1: 라마의 면역화
라마의 면역화 및 말초혈 림프구 (PBL)의 회수 뿐만 아니라 이후의 RNA 추출 및 항체 단편의 증폭은, 문헌에 기술된 바와 같이 수행하였다 (De Haard et al., J. Bact. 187:4531-4541, 2005). 성체 라마 (Lama glama) 2마리에, 인간 IgG1의 Fc 영역 (MET-Fc; R&D Systems)에 융합된 인간 MET의 세포외 도메인 (ECD)으로 구성된 키메라 단백질을 근육내 주사함으로써, 면역화하였다. 각 라마에는 6주간 주당 1회 주사하였으며, 총 6회 주사하였다. 각 주사는 프레운드의 불완전 보강제 중의 0.2 ml 단백질로 구성되며, 목에 2 스팟으로 나누어 수행하였다.
면역 반응을 조사하기 위해 면역화 전 및 면역화 이후에 혈액 샘플 10 ml을 채혈하였다. 마지막 면역화 후 약 1주에, 혈액 400 ml을 채혈하고, Ficoll-Paque 방법을 이용해 PBL을 수득하였다. 페놀-구아니딘 티오시아네이트 방법 (Chomczynski et al., Anal. Biochem. 162:156-159, 1987)으로 총 RNA를 추출하고, SuperScriptTM III First-Strand Synthesis System 키트 (Life Technologies)를 이용한 랜덤 cDNA 합성의 주형으로 사용하였다. 라마 IgG1 및 VL-CL 도메인 (κ 및 λ)의 VH-CH1 영역을 코딩하는 cDNA를 증폭시켜 파지미드 벡터 pCB3에 서브클로닝하였다 (de Haard et al., J Biol Chem. 274:18218-18230, 1999). E. coli 균주 TG1 (Netherland Culture Collection of Bacteria)를 재조합 파지미드로 형질전환하여, 4종의 Fab-발현 파지 라이브러리를 구축하였다 (면역화된 라마 당 하나의 λ 라이브러리 및 하나의 κ 라이브러리). 다양성 (diversity)은 108-109 범위였다.
항원에 대한 면역 반응을 ELISA로 조사하였다. 이를 위해, 인간 MET (UniProtKB # P08581; aa 1-932) 및 마우스 MET (UniProtKB # P16056.1; aa 1-931)의 ECD를 표준 단백질 조작 기법을 통해 수득하였다. 인간 또는 마우스 MET ECD 재조합 단백질을 고상 (100 ng/well, 96-웰 플레이트)에 고정시키고, 면역화 전 (0일) 또는 이후 (45일)에 라마 혈청의 연속 희석물에 노출시켰다. 결합은 마우스 항-라마 IgG1IgG1 (Daley et al., Clin. Vaccine Immunol. 12, 2005)과 HRP-접합된 당나귀 항-마우스 항체 (Jackson Laboratories)를 사용해 확인하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 라마 2마리는 인간 MET ECD에 대한 면역 반응을 나타내었다. 인간 MET의 세포외 영역이 이의 마우스 오르솔로그와의 상동성이 87%이라는 점에 부합하여, 마우스 MET ECD에서도 상당히 양호한 교차 반응성 수준이 관찰되었다.
실시예 2: 인간 및 마우스 MET에 결합하는 Fab 선택 및 스크리닝
전술한 라이브러리로부터 표준 파지 디스플레이 프로토콜에 따라 Fab-발현성 파지를 제조하였다. 선별하기 위해, 파지를 먼저 고정된 재조한 인간 MET ECD에 흡착시키고, 세척한 다음 트립신으로 용출시켰다. 인간 MET ECD로 선별 2 사이클을 수행한 후, 마우스 MET ECD를 사용해 동일한 방식으로 다시 사이클을 2번 수행하였다. 동시에, 인간 MET ECD 사이클을 마우스 MET ECD 사이클과 교대로 실시하는 총 4번의 사이클을 수행하여 파지를 선별하였다. 2번의 방식으로 선별된 파지를 모아, TG1 E. coli에 감염시켰다. 각각의 콜로니를 분리하고, IPTG (Fermentas)를 사용해 Fab의 분비를 유도하였다. 박테리아의 Fab-함유성 페리플라즘 분획을 수집하고, 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 의해 인간 및 마우스 MET ECD에 대한 결합성을 테스트하였다. 인간 또는 마우스 MET ECD를 소듐 아세테이트 완충제 (GE Healthcare) 중의 아민 커플링을 이용해 CM-5 칩에 고정시켰다. Fab를 함유한 페리플라즘 추출물을 BIACORE 3000 장치 (GE Healthcare)에 유속 30 ㎕/min로 로딩하였다. Fab 해리 속도 (koff)를 2분 주기로 측정하였다. 인간 및 마우스 MET에 대한 Fab의 결합성을 고상에서 MET ECD와 용액 중의 페리플라즘 조 추출물을 이용해 ELISA에 의해 추가로 규명하였다. Fab는 MYC flag를 가지도록 조작되었으므로, 결합은 HRP-접합된 anti-MYC 항체 (ImTec Diagnostics)로 확인하였다.
SPR 및 ELISA 둘다에서 인간 및 마우스 MET에 결합한 Fab를 선별하고, 이의 해당 파지에 대해 서열분석을 실시하였다 (LGC Genomics). 교차 반응성 Fab 서열을 VH CDR3의 서열 길이의 내용에 따라 패밀리로 분류하였다. VH 패밀리는 IMTG (International Immunogenetics Information System) 명명법에 기초하지 않은 내부 번호가 부여되었다. 전체적으로, 8개의 VH 패밀리에 속하는 인간/마우스 교차 반응성 Fab 11종을 식별할 수 있었다. 중쇄 가변부의 CDR 및 FR 서열은 표 3에 나타낸다. 경쇄 가변부의 CDR 및 FR 서열은 표 4에 나타낸다. 중쇄 및 경쇄 가변부의 전체 아미노산 서열은 표 5에 나타낸다. 중쇄 및 경쇄 가변부의 전체 DNA 서열은 표 6에 나타낸다.
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다양한 Fab 패밀리들과 이의 인간 및 마우스 MET에 결합하는 능력은 표 7에 나타낸다.
표 7: 인간 MET (hMET) 및 마우스 MET (mMET) 둘다에 결합하는 Fab. Fab를 VH CDR3 서열을 기초로 패밀리로 분류한다. 인간 및 마우스 MET ECD에 대한 Fab의 결합성을 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 및 ELISA에 의해 측정하였다. SPR 값은 koff (s-1)를 나타낸다. ELISA 값은 400 nm에서의 광학 밀도 (OD)이다 (AU, 임의 단위). SPR 및 ELISA 둘다 페리플라즘 조 추출물을 사용해 수행하였다. 추출물내 Fab 농도는 측정하지 않았다. 값은 3번의 독립적인 측정의 평균이다.
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실시예 3: mAb에 Fab 키메라 제조
선별된 Fab 단편의 VH 및 VL (κ 또는 λ) 도메인을 코딩하는 cDNA를, 인간 IgG1의 CH1, CH2 및 CH3와 인간 CL (κ 또는 λ)을 각각 코딩하는 cDNA를 함유한 2개의 개별 pUPE 포유류 발현 벡터 (U-protein Express) 내에 조작하였다. 라마-인간 키메라 항체의 중쇄 및 경쇄 전체 아미노산 서열은 표 8에 나타낸다.
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제조된 키메라 라마-인간 IgG1 분자의 (포유류 세포의 일시적인 형질감염에 의한) 생산 및 (단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의한) 정제는 U-protein Express에 위탁하였다. MET에 대한 키메라 mAb의 결합성을 고상에서 hMET 또는 mMET ECD과 용액 중에 항체를 증가식 농도 (0-20 nM)로 사용하여 측정하였다. 결합은 HRP-접합된 항-인간 Fc 항체 (Jackson Immuno Research Laboratories)를 이용해 확인하였다. 이러한 분석에서, 키메라 라마-인간 항체들 모두 피코몰 친화성으로 인간 및 마우스 MET에 결합하는 것으로 확인되었으며, EC50은 0.06 nM 내지 0.3 nM였다. 결합력 (EMAX)은 아마도 고정된 항원에 일부 에피토프의 노출로 인해 항체 간 차이가 있었지만, 인간 및 마우스 세팅에서 비슷하였다. EC50 및 EMAX 값을 표 9에 나타낸다.
표 9: 고상에 고정된 MET 및 용액 중에 항체를 증가식 농도 (0-20 nM)로 사용한 ELISA에 의해 측정한 인간 및 마우스 MET에 대한 키메라 mAb의 결합성. EC50 값을 nMol/L로 표시한다. EMAX 값은 450 nm에서의 광학 밀도 (OD)로 표시한다 (AU, 임의 단위).
Figure 112019009348154-pct00013
또한, 키메라 항-MET 항체가 살아있는 세포에서 천연 인간 및 마우스 MET에 결합하는 지를 분석하였다. 이를 위해, 증가시키는 방식으로 여러가지 항체 농도 (0-100 nM)를 A549 인간 폐암 세포 (American Type Culture Collection) 또는 MLP29 마우스 간 전구 세포 (Prof. Enzo Medico, University of Torino, Strada Provinciale 142 km 3.95, Candiolo, Torino, Italy; Medico et al., Mol Biol Cell 7, 495-504, 1996)와 인큐베이션하였으며, 이들 2가지 세포는 MET를 생리학적 수준으로 발현하는 세포이다. 세포에 대한 항체 결합을 피코에리트린-접합된 항-인간 IgG1 항체 (eBioscience) 및 CyAn ADP analyser (Beckman Coulter)를 이용해 유세포 측정으로 분석하였다. 인간 MET 결합에 대한 양성 대조군으로서 시판 마우스 항-인간 MET 항체 (R&D Systems) 및 피코에리트린-접합된 항-마우스 IgG1 항체 (eBioscience)를 사용하였다. 마우스 MET에 대한 양성 대조군으로는 시판 염소 항-마우스 MET 항체 (R&D Systems) 및 피코에리트린-접합된 항-염소 IgG1 항체 (eBioscience)를 사용하였다. 항체들 모두 인간 및 마우스 세포 둘다에 용량 의존적인 결합성을 나타내었으며, EC50 값은 0.2 nM - 2.5 nM이었다. ELISA에서 수득한 데이타와 일관되게, 최대 결합성 (EMAX)은 항체에 따라 달랐지만, 인간 및 마우스 세포에서 비슷하였다. 이러한 결과는, 키메라 라마-인간 항체가 인간 및 마우스 세포 시스템 둘다에서 본래의 입체 구조에서 막-결합된 MET를 인지한다는 것을, 보여준다. EC50 및 EMAX 값은 표 10에 나타낸다.
표 10: 항체를 상향식 농도 (0-50 nM)로 사용한 유세포 측정에 의해 측정한 인간 및 마우스 세포에 대한 키메라 mAb의 결합성. EC50 값을 nMol/L로 표시한다. EMAX 값은 대조군에 대한 %로 표시한다.
Figure 112019009348154-pct00014
실시예 4: 항체 결합을 담당하는 수용체 영역
항체 (이하, 인간/마우스에 동등한 항-MET 항체로 표시됨)가 인간 및 마우스 MET 둘다에 인지하는 결합하는 수용체 영역을 맵핑하기 위해, 기술된 바와 같이 제조된 인간 MET로부터 유래된 조작된 단백질 패널에 대한 결합성을 측정하였다 (Basilico et al, J Biol. Chem. 283, 21267-21227, 2008). 이 패널에는 다음이 포함된다 (도 2): 전체 MET ECD (Decoy MET); MET ECD 결핍성 IPT 도메인 3 및 4 (SEMA-PSI-IPT 1-2); MET ECD 결핍성 IPT 도메인 1-4 (SEMA-PSI); 단리된 SEMA 도메인 (SEMA); IPT 도메인 3 및 4 (IPT 3-4)를 포함하는 단편. 조작된 MET 단백질을 고상에 고정시키고, 용액 중의 키메라 항체에 증가식 농도 (0-50 nM) 조건 하에 노출시켰다. 결합은 HRP-접합된 항-인간 항체 (Jackson Immuno Research Laboratories)를 사용해 확인하였다. 표 11에 나타낸 바와 같이, 이러한 분석에서, mAb 7종이 SEMA 도메인내 에피토프를 인지하고, 다른 4종은 PSI 도메인내 에피토프를 인지하는 것으로 확인되었다.
표 11: 도 2에 언급된 MET 결손 돌연변이 패널에 대한 인간/마우스에 동등한 항-MET 항체의 결합성. 항체 결합을 담당하는 MET 도메인은 우측 마지막 칸에 나타낸다.
Figure 112019009348154-pct00015
항체 결합을 담당하는 MET의 영역을 정교하게 추가로 맵핑하기 위해, 본 발명의 항체와 라마 MET (면역글로불린 생산에 사용된 유기체) 간의 교차 반응성의 부재를 조사하였다. 이를 위해, 기술된 바와 같이 전체 MET ECD를 포괄하는 라마-인간 및 인간-라마 키메라 MET 단백질 시리즈를 제작하였다. 키메라 (도 3)를 고상에 고정한 다음 여러가지 증가식 농도의 mAb 용액 (0-20 nM)에 노출시켰다. 결합을 HRP-접합된 항-인간 Fc 항체 (Jackson Immuno Research Laboratories)를 사용해 확인하였다. 이러한 분석에서, SEMA-결합성 mAb 5종 (71D6, 71C3, 71D4, 71A3, 71G2)이, 7-bladed SEMA β-프로펠러의 블레이드 4-5에 해당되는 (Stamos et al., EMBO J. 23, 2325-2335, 2004) 영역인, 인간 MET의 314-372 사이에 위치한 에피토프를 인지하는 것으로 확인되었다. 다른 2종의 SEMA-결합성 mAb (74C8, 72F8)는, 각각 SEMA β-프로펠러의 블레이드 1-3 및 1-4에 해당되는, 123-223 및 224-311 사이에 위치한 에피토프를 인지한다. PSI-결합성 mAb (76H10, 71G3, 76G7, 71G12)는 2종의 PSI 키메라 어느 것에도 어떠한 유의한 결합성을 나타내지 않았다. 표 11에 제시된 결과를 감안하면, 이들 항체는 인간 MET의 546과 562 사이에 위치한 에피토프를 인지할 가능성이 있다. 이러한 결과는 표 12에 요약 개시된다.
표 12: ELISA에 의해 측정한 인간/마우스에 동등한 항-MET 항체에 의해 인지된 에피토프의 맵핑. 인간 MET ECD (hMET) 또는 라마 MET ECD (lMET) 뿐만 아니라 도 3에 기술된 라마-인간 MET 키메라 단백질을 고상에 고정한 다음 여러가지 증가 농도의 mAb에 노출시켰다.
Figure 112019009348154-pct00016
실시예 5: HGF 경쟁 분석
상기한 분석에서, 일부의 인간/마우스에 동등한 항-MET 항체에 의해 인지되는 에피토프가, MET에의 결합시 HGF가 결합하는 영역과 중첩될 수 있는 것으로 시사된 바 있다 (Stamos et al., EMBO J. 23, 2325-2335, 2004; Merchant et al., Proc Natl Acad Sci USA 110, E2987-2996, 2013; Basilico et al., J Clin Invest. 124, 3172-3186, 2014). 이를 조사하기 위해, ELIAS에 의해 mAb와 HGF 간의 경쟁을 조사하였다. 재조합 인간 및 마우스 HGF (R&D Systems)의 N-말단에 NHS-LC-바이오틴 (Thermo Scientific)을 사용해 바이오틴을 부착시켰다. 인간 또는 마우스의 MET-Fc 단백질 (R&D Systems)을 고상에 고정시킨 다음 인간 또는 마우스의 0.3 nM 바이오틴화된 HGF에 여러가지 증가 농도 (0-120 nM)의 항체의 존재 하에 노출시켰다. MET에의 HGF 결합은 HRP-접합된 스트렙타비딘 (Sigma-Aldrich)으로 확인하였다. 표 13에 나타낸 바와 같이, 이러한 분석으로 인간/마우스에 동등한 항-MET mAb를 2개의 그룹으로 분류할 수 있었다: 완전한 HGF 경쟁인자 (71D6, 71C3, 71D4, 71A3, 71G2), 및 부분적인 HGF 경쟁인자 (76H10, 71G3, 76G7, 71G12, 74C8, 72F8).
표 13: ELISA에 의해 측정한 MET에의 결합에 대해 HGF와 경쟁하는 인간/마우스에 동등한 항-MET 항체의 경쟁력. MET-Fc 키메라 단백질 (인간 또는 마우스)를 고상에 고정한 다음 지정된 농도의 바이오틴화된 HGF (인간 또는 마우스)에, 농도를 증가시키는 방식으로 여러 농도의 항체의 존재 하에 노출시켰다. MET에 대한 HGF 결합을 HRP-접합된 스트렙타비딘을 이용해 확인하였다. 항체-HGF 경쟁성은 IC50 (50% 경쟁을 달성하는 농도) 및 IMAX (포화에 도달한 최대 경쟁성 %)로 표시한다.
Figure 112019009348154-pct00017
일반적으로, SEMA 결합 항체는 PSI 결합 항체 보다 훨씬 효과적으로 HGF를 디스플레이하였다. 특히, SEMA β-프로펠러의 블레이드 4 및 5 내부의 에피토프를 인지하는 항체가 가장 강력한 HGF 경쟁인자였다 (71D6, 71C3, 71D4, 71A3, 71G2). 이러한 결과는, SEMA 블레이드 5가 HGF의 α-체인에 대한 고 친화성 결합부를 함유한다는 사실과 일치한다 (Merchant et al., Proc Natl Acad Sci USA 110, E2987-2996, 2013). PSI 도메인은 HGF와 직접 참여하는 것으로 확인되지 않았지만, SEMA 도메인과 IPT 영역 사이에 HGF의 수용을 조절하는 '힌지'로서 기능하는 것으로 제시된 바 있다 (Basilico et al., J Clin Invest. 124, 3172-3186, 2014). 따라서, PSI에의 mAb (76H10, 71G3, 76G7, 71G12) 결합은, 리간드와의 직접 경쟁에 의해서가 아니라, 이러한 프로세스를 간섭함으로써 또는 입체 간섭에 의해 MET에의 HGF 결합을 방해하는 것으로 보인다. 마지막으로, SEMA β-프로펠러의 블레이드 1-3이 HGF의 β-체인의 낮은 친화성 결합을 담당하여, MET 활성화에 중요한 역할을 하지만 HGF-MET 결합 강도에 일부 부분적으로 기여하는 것으로 확인되었다 (Stamos et al., EMBO J. 23, 2325-2335, 2004). 이는, MET의 이러한 영역에의 mAb (74C8, 72F8) 결합이 HGF의 부분 경쟁인자인 이유를 설명해줄 수 있었다.
실시예 6: MET 활성화 분석
수용체 티로신 키나제에 대한 면역글로불린은, 이의 2가 특성으로 인해, 수용체 작용제 활성을 나타내어 천연 리간드의 작용을 모방할 수 있다. 이를 조사하기 위해, 수용체 활성화 분석에서 MET의 자가-인산화를 촉진하는 인간/마우스에 동등한 항-MET 항체의 능력을 조사하였다. A549 인간 폐암 세포 및 MLP29 마우스 간 전구 세포를 48시간 동안 혈청 성장인자가 고갈되게 처리한 다음 여러가지 농도의 항체 (0-5 nM)와 재조합 HGF (A549 세포, 재조합 인간 HGF, R&D Systems; MLP29 세포, 재조합 마우스 HGF, R&D Systems)로 자극하였다. 15분간 자극 후, 세포를 빙랭한 포스페이트 완충화된 염수 (PBS)로 2번 헹군 다음 문헌에 언급된 바와 같이 세포용해하였다 (Longati et al., Oncogene 9, 49-57, 1994). 단백질 라이세이트를 전기영동에 의해 전개시키고, 인간 또는 마우스에 상관없이 MET의 인산화 형태 (티로신 1234-1235)에 특이적인 항체 (Cell Signaling Technology)를 사용해 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다. 동일한 라이세이트를, 또한 anti-total 인간 MET 항체 (Invitrogen) 또는 anti-total 마우스 MET 항체 (R&D Systems)를 이용한 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다. 이러한 분석에서, 모든 인간/마우스에 동등한 항체들이 MET 작용제 활성을 나타내는 것으로 확인되었다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 일부 항체는 HGF와 비슷한 수준으로 MET 자가-인산화를 촉진하였다 (71G3, 71D6, 71C3, 71D4, 71A3, 71G2, 74C8). 그외 일부 (76H10, 76G7, 71G12, 72F8)는 효과가 약했으며, 이는 특히 항체 저 농도에서 명확하였다. MET 활성화 활성과 HGF-경쟁 활성 간의 명확한 상관성은 관찰되지 않았다.
더 많은 정량 데이타를 입수하기 위해, 항체의 작용제 활성을 또한 포스포-MET ELISA로 규명하였다. 이를 위해, A549 및 MLP29 세포를 전술한 바와 같이 혈청-고갈시킨 다음 여러가지 농도의 mAb (0-25 nM)로 자극하였다. 재조합 인간 (A549) 또는 마우스 (MLP29) HGF를 대조군으로서 사용하였다. 세포를 세포용해시키고, 포스포-MET 수준을 문헌에 기술된 바와 같이 ELISA로 측정하였다 (Basilico et al., J Clin Invest. 124, 3172-3186, 2014). 간략하게는, 96웰 플레이트를 마우스 항-인간 MET 항체 또는 랫 항-마우스 MET 항체 (둘다 R&D Systems)로 코팅한 다음 세포 용해물과 함께 인큐베이션하였다. 포획된 단백질을, 세척 후, 바이오틴-접합된 항-포스포-티로신 항체 (Thermo Fisher)와 함께 인큐베이션하고, HRP-접합된 스트렙타비딘 (Sigma-Aldrich)을 사용해 결합을 확인하였다.
이러한 분석 결과는 웨스턴 블롯팅에 의해 수득된 데이타와 일치하였다. 표 14에 나타낸 바와 같이, 71G3, 71D6, 71C3, 71D4, 71A3, 71G2 및 74C8은 MET를 강력하게 활성화하는 반면, 76H10, 76G7, 71G12 및 72F8은 훨씬 낮은 효과를 나타내었다. 임의 경우에, 항체들 모두 인간 및 마우스 세포에서 비슷한 효과를 나타내었다.
표 14: ELISA에 의해 측정한 인간 및 마우스 세포에서 인간/마우스에 동등한 항-MET 항체의 작용제 활성. A549 인간 폐암 세포 및 MLP29 마우스 간 전구 세포를 혈청-고갈시킨 다음 농도를 증가시키는 방식으로 여러가지 농도의 mAb로 자극하였다. 재조합 인간 HGF (hHGF; A549) 또는 마우스 HGF (mHGF; MLP29)를 대조군으로 사용하였다. 세포 용해물을 포획을 위한 anti-total MET 항체와 확인을 위한 anti-포스포-티로신 항체를 사용한 ELISA에 의해 분석하였다. 작용제 활성은 EC50 (nM) 및 EMAX (HGF 활성 %)로 나타낸다.
Figure 112019009348154-pct00018
실시예 7: 스캐터 분석 (scatter assay)
인간/마우스에 동등한 항-MET 항체의 작용제 활성이 생물학적 활성으로 나타날 수 있는 지를 평가하기 위해, 인간 및 마우스 상피 세포에 대한 스캐터 분석을 수행하였다. 이를 위해, HPAF-II 인간 췌장 선암종 세포 (American Type Culture Collection)와 MLP29 마우스 간 전구 세포를 농도를 증가시키는 방식으로 여러가지 농도의 재조합 HGF (인간 또는 마우스; R&D Systems)로 자극하고, 세포 분산을 기존에 공지된 바와 같이 현미경으로 24시간 후에 검경하였다 (Basilico et al., J Clin Invest. 124, 3172-3186, 2014). 이러한 예비 분석을 통해, HGF-유도성 세포 분산은 양쪽 세포주에서 약 0.1 nM에서 포화에 도달할 때까지 직선형인 것으로 확인되었다. 이러한 HGF 표준 곡선을 토대로, 0 (HGF 부재시 세포 분산 모두 없음) 내지 4 (0.1 nM HGF 존재시 최대 세포 분산)의 점수 체계 확립하였다. HPAF-II 및 MLP29 세포를 농도를 증가시키는 방식으로 여러가지 농도의 인간/마우스에 동등한 항-MET 항체로 자극하였으며, 세포 분산을 상기 점수 체계를 사용해 24시간 후에 측정하였다. 표 15에 나타낸 바와 같이, 이러한 분석에서, 테스트한 mAb 모두 인간 및 마우스 세포 시스템 둘다에서 세포 분산을 자극하는 것으로 확인되었으며, 이들 2종의 종들에서 실질적으로 중첩되는 결과가 수득되었다. 71D6 및 71G2는 HGF와 매우 동일한 활성을 나타내었으며; 71G3 및 71A3는 HGF 보다 약간 낮은 활성을 나타내었으며; 71C3 및 74C8은 HGF의 활성을 매칭시키기 위해 실질적으로 더 높은 농도가 필요하였으며; 71D4, 76G7, 71G12 및 72F8은 본 분석에서 포화에 도달하지 않았다.
표 15: 세포 기반의 스캐터 분석에서 측정한 인간/마우스에 동등한 항-MET 항체의 생물학적 활성. HPAF-II 인간 췌장 선암종 세포와 MLP29 마우스 간 전구 세포를 농도를 증가시키는 방식으로 여러가지 농도의 인간/마우스에 동등한 항-MET 항체로 자극한 다음 본원에 언급된 점수 체계를 이용해 24시간 후에 측정하였다 (0, 세포 분산 없음; 4, 최고 수준의 세포 분산).
HPAF-II 인간 췌장 선암종 세포
Figure 112019009348154-pct00019
MLP29 마우스 간 전구 세포
Figure 112019009348154-pct00020
실시예 8: 약물-유발성 세포자살로부터의 보호
여러가지 실험 증거는, HGF가 MET-발현성 세포에 강력한 항-세포자살 효과를 나타냄을, 보여준다 (Nakamura et al., J Gastroenterol Hepatol. 26 Suppl 1, 188-202, 2011). 인간/마우스에 동등한 항-MET 항체의 잠재적인 항-세포자살 활성을 조사하기 위해, 세포-기재의 약물-유발성 생존성 분석을 수행하였다. MCF10A 인간 유방 상피 세포 (American Type Culture Collection)와 MLP29 마우스 간 전구 세포를 스타우로스포린과 (Sigma Aldrich) 함께 농도를 증가시키는 방식으로 여러가지 농도로 사용해 인큐베이션하였다. 48시간 후, 세포 생존성을 Cell Titer Glo 키트 (Promega)와 Victor X4 멀티라벨 플레이트 리더 (Perkin Elmer)를 사용해 총 ATP 농도를 측정함으로써 확인하였다. 이러한 예비 분석에서, 약 50%의 세포 사멸을 유발하는 약물 농도가 MCF10A 세포의 경우 60 nM이고, MLP29 세포의 경우 100 nM인 것이 확인되었다. 다음으로, 농도를 증가시키는 방식으로 여러가지 농도 (0-32 nM)의 anti-MET mAb 또는 재조합 HGF (인간 또는 마우스; 둘다 R&D Systems)의 존재 하에, MCF10A 세포 및 MLP29 세포를 상기에서 결정된 약물 농도로 처리하여 인큐베이션하였다. 48시간 후에 상기한 바와 같이 세포 생존성을 확인하였다. 표 16에 나타낸 분석 결과, 인간/마우스에 동등한 항체는 인간 및 마우스 세포를 스타우로스포린-유발성 세포 사멸로부터 비슷한 수준으로 보호하는 것으로 확인된다. 일부 mAb (71G3, 71D6, 71G2)는 HGF와 비슷하거나 또는 이보다 우수한 보호 활성을 나타내는 반면, 일부 분자 (76H10, 71C3, 71D4, 71A3, 76G7, 71G12, 74C8, 72F8)는 인간 또는 마우스 세포 시스템에서 부분적인 보호만 나타내었다.
표 16: 세포-기반의 약물-유발성 세포자살 분석에 의해 측정된 인간/마우스에 동등한 항-MET 항체의 생물학적 활성. MCF10A 인간 유방 상피 세포 및 MLP29 마우스 간 전구 세포를, 농도를 증가시키는 방식으로 여러가지 농도의 anti-MET mAb 또는 재조합 HGF (인간 또는 마우스)의 존재 하에, 고정된 농도의 스타우로스포린과 함께 인큐베이션하고, 48시간 후 총 ATP 함량을 측정하였다. 세포 생존성을 스타우로스포린 또는 항체 처리되지 않은 세포와 비교해 총 ATP 함량%로서 계산하였으며, EC50 및 EMAX로 표시하였다.
Figure 112019009348154-pct00021
실시예 9: 분지 형태형성 분석
배경기술에서 언급한 바와 같이, HGF는 세포 증식, 이동, 침입, 분화 및 생존 등의 독립적인 생물학적 활성의 조화로운 조절을 촉진하는 다면발현성 사이토카인이다. 이러한 전체 활성을 더 잘 나타내는 세포-기반의 분석이 분지 형태형성 분석으로, 이는 배아 발생 중에 관상 장기와 샘 (gland)의 형성을 모방한다 (Rosario and Birchmeier, Trends Cell Biol. 13, 328-335, 2003). 이 분석에서, 상피 세포로 된 구체를 3D 콜라겐 매트릭스 안에 접종하고, HGF로 자극함으로써, 관상 구조를 형성시키고, 궁극적으로 분지형 구조가 형성된다. 이러한 분지형 관상 구조 (branched tubules)는, 극성을 가진 세포 (polarized cell)로 둘러싸인 내강을 나타낸다는 점에서, 상피 샘의 중공 구조, 예를 들어 유선의 중공 구조와 비슷하다. 이 분석은 시험관내에서 수행할 수 있는 가장 완벽한 HGF 분석이다.
본 분석에서 인간/마우스에 동등한 항-MET 항체가 작용제 활성을 나타내는 지를 테스트하기 위해, 공지된 바와 같이 콜라겐 층 내에 LOC 인간 신장 상피 세포 (Michieli et al. Nat Biotechnol. 20, 488-495, 2002)와 MLP29 마우스 간 전구 세포를 접종 (Hultberg et al., Cancer Res. 75, 3373-3383, 2015)한 다음 농도를 증가시키는 방식으로 여러가지 농도의 재조합 HGF (인간 또는 마우스, 둘다 R&D Systems)에 노출시켰다. 분지 형태형성을 현미경으로 시간 경과에 따라 추적하였으며, 5일 후 콜로니의 사진을 촬영하였다. 대표적인 사진을 도 5에 나타낸다. 분지 형태형성의 정량 결과는, 각 구체에서 분지의 수를 계수하여, 구하였다. 표 17에 나타낸 바와 같이, 테스트한 항체 모두 농도 의존적인 분지형 관상 구조 형성을 유도하였다. 그러나, MET 자가-인산화 분석 및 세포 분산 분석에서 수득한 데이타와 일관되게, 71D6, 71A3 및 71G2는 재조합 HGF와 비슷하거나 또는 보다 우수한 가장 강력한 작용제 활성을 나타내었다.
표 17: 분지 형태형성 분석. LOC 인간 신장 상피 세포 또는 MLP29 마우스 간 전구 세포의 세포 구체 제조물을 콜라겐 층 내에 접종한 다음 농도를 증가시키는 방식으로 여러가지 농도 (0, 0.5, 2.5 및 12.5 nM)의 mAb 또는 재조합 HGF (LOC, 인간 HGF; MLP29, 마우스 HGF)에 노출시켰다. 분지 형태형성을 현미경으로 경시적으로 추적하였으며, 5일 후 콜로니의 사진을 촬영하였다. 각 구체의 분지 개수를 계수하여 분지의 정량 값을 구하였다 (1차 분지 수 + 2차 분지 수).
LOC 세포
Figure 112019009348154-pct00022
MLP29 세포
Figure 112019009348154-pct00023
실시예 10: 인간/마우스에 동등한 작용제성 anti-MET 항체는 MET 활성을 조절하기 위한 충분한 기회를 제공한다
지금까지 언급된 생화학적 및 생물학적 분석에 기초하여, 항체 기능을 비교하기 위한 목적으로 포괄적인 분석을 수행하였다. 수행한 분석에서 측정한 다양한 mAb의 효과를 표 18에 요약 개시한다. 표를 분석한 바, 인간/마우스에 동등한 작용제성 항-MET 항체가 광범위한 생화학적 및 생물학적 활성을 나타내어, 사용자 지정 방식 (in a custom fashion)으로 MET 활성을 조절하기 위한 충분한 기회를 제공해준다는 것이 드러났다. 선택적인 변환 또는 임상적인 용도에 따라, HGF와 완전히 또는 부분적으로 경쟁하는 항체, MET 활성화를 강력하게 또는 약하게 유발하는 항체, 세포 침입을 강하게 또는 약하게 촉진하는 항체, 또는 세포 자살을 왕성하게 또는 온화하게 길항하는 항체를 선별할 수 있다. 이러한 관점에서, 작용제 항체는, HGF의 온 또는 오프 특성과 비교해 보다 점진적인 반응을 유도할 수 있다는 점에서, HGF와 비교해 훨씬 더 다목적이고, 가소성이 우수하다.
약학적 관점에서, MET 하류의 선택적인 생물학적 활성을 발휘할 수 있다는 가능성은 매우 유용할 수 있다. 예를 들어, 종양 분야에서 임의 적용에서는 HGF의 영양 특성을 침입-촉진 활성 (pro-invasive activity)과 분리시키는 리간드가 유용하다 (Michieli et al., Nat Biotechnol. 20, 488-495, 2002). 간 분야에서의 또 다른 용도에서는 이상적으로는 세포 침입은 촉진하지 않고 간 세포를 세포자살로부터 보호하는 인자가 요구된다 (Takahara et al., Hepatology, 47, 2010-2025, 2008). 근위축증 분야에서의 또 다른 용도로, 근모세포에서 근세포로의 분화시 HGF-유발성 증식의 샷-다운과 다른 한편으로 분화-관련 세포자살로부터의 보호가 필요하다 (Cassano et al., PLoS One 3, e3223, 2008). 이러한 모든 용도들과 그외 유사한 사례에서, 내인성 HGF를 대체하는 부분 작용제성 mAb를 사용하고, 온화한 MET 활성화를 유도할 수 있으므로, HGF의 특정 생물학적 활성은 강화하고 다른 활성은 낮출 수 있다.
반대로, 재생 의학 분야에서 다양한 적용에서는 비가역적인 세포 손상 또는 변성을 방지하기 위한 강력한 생존 촉진 신호와 빠른 조직 재생이 요구된다. 예를 들어, 이러한 상황은 갑작스러운 간 부전, 급성 신장 손상 또는 중증 췌장염 사례에서 발생한다 (Nakamura et al., J Gastroenterol Hepatol. 26 Suppl 1, 188-202, 2011). 이러한 모든 적용 및 그외 유사 사례들에서, 조직 치유 및 재생을 가능한 강력하게 추진하는 완전 작용제 mAb를 채택하는 것이 바람직할 것이다. 완전 작용제 mAb는 HGF 보다 강력하고 - 강력하지 않더라도 - 내인성 리간드가 발현되는 생리학적 수준 보다 높은 약리학적 농도 로그에 도달할 수 있기 때문에, HGF 경쟁은 이 경우에 실제로 중요한 역할을 하지 않는다.
면역계 (염증성 질환, 자가 면역 질환, 이식-관련 합병증), 조혈계 (줄기 세포 가동성, 조혈) 및 신경계 (신경 성장, 뉴론 변형)에서 발생하는 병리학적 상황 등의, HGF의 비-정규적이고 규정되지 않은 기능을 수반하는, 또 다른 병리학적 상황에서, HGF/MET 경로의 역할은 연구가 여전히 부족한 실정이다. 몇가지 실험 증거는 재조합 HGF 또는 HGF 유전자 테라피가 전임상 모델에서 이러한 장애를 개선한다고 시사하지만 (Nakamura et al., J Gastroenterol Hepatol. 26 Suppl 1, 188-202, 2011), HGF의 모든 기능 또는 이의 일부만 유익한지를 결정하기 위한 정보는 충분하지 않다. 물론 이러한 치료학적 용도로, 매우 다양한 MET 작용제성 항체 패널을 사용해 MET 활성을 정교하게 조정할 수 있는 가능성은 HGF와 비교해 잠재적으로 유용하다 (본 발명의 내용에서 언급된 약물과 같이 재조합 HGF의 사용에 암시된 수많은 약리학적 문제는 언급하지 않음).
결론적으로, 동정한 모든 인간/마우스에 동등한 항-MET 항체는, HGF와 완전 또는 부분 경쟁인자인 지, MET 수용체를 완전히 또는 부분적으로 활성화하는 지 상관없이, 치료학적 용도에 잠재적으로 유용할 수 있을 것으로, 보인다.
표 18: 인간/마우스에 동등한 항-MET 항체의 주요 생화학적 및 생물학적 특징. 이 표는 정제된 MET ECD (ELISA)에 결합하고, MET-발현성 세포에서 천연 MET를 인지하고 (FACS), MET 결합에 대해 HGF와 경쟁하고 (HGF 경쟁), 수용체 자가-인산화 분석에서 MER를 활성화하고 (MET 활성화), 세포 분산을 촉진하고 (스캐터 분석), 약물-유발성 세포자살로부터 세포를 보호하고 (생존성 분석), 상피 세포 구체의 분지 형태형성을 촉진하는 (분지 형태형성) 능력을 요약 개시한다. 각각의 분석에서, 점수는 다른 항체에 대한 임의의 소정의 mAb의 상대적인 활성으로 기초로 한다 (+, 50% 이하; ++, 50% 이상). 항체들 모두 인간 및 마우스 시스템에서 비슷한 활성을 나타내었으며, 분석 당 점수 하나만 나타낸다.
Figure 112019009348154-pct00024
실시예 11: 불변부 스와핑은 인간/마우스에 동등한 항체의 생화학적 및 생물학적 특징을 변형시키지 않는다.
본 발명의 목적은 인간 및 마우스 시스템에서 동등하게 잘 작동하는 작용제성 anti-MET 항체를 제조 및 식별하고자 하는 것이므로, 인간 중쇄 및 경쇄 불변부를 대응되는 마우스 불변부로 스와핑하는 것이 항체 패널의 주요 생화학적 및 생물학적 활성에 영향을 미치는 지를 확인하고자 하였다. 이를 위해, 인간/마우스에 동등한 항체 패널에서 3종의 대표 분자 (71G3, 생물학적 분석에서 HGF의 부분 경쟁인자 및 부분 작용제; 71D6 및 71G2, 생물학적 분석에서 HGF의 완전 경쟁인자 및 완전 작용제)를 선택하였다. 71G3, 71D6 및 71G2의 VH 영역과 VL 영역을 마우스 IgG1/λ 항체 프래임 상에 탑재하였다. 모든 마우스 면역글로불린 변이체들의 서열은 ImMunoGeneTics information system (www.imgt.org)과 같은 공공 데이타베이스에서 입수가능하다. 원하는 가변부를 가진 융합체는 표준 유전자 조작 공정으로 수득할 수 있다. 제조된 라마-마우스 키메라 항체의 중쇄 및 경쇄의 전체 아미노산 서열은 표 19에 나타낸다.
표 19: 마우스 및 인간 MET 둘다에 결합하는 라마-마우스 키메라 mAb의 전체 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열.
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재조합 면역글로불린의 제조 및 정제는 잘 확립된 프로토콜에 따라 각각 포유류 세포에서의 일시적인 형질감염 및 친화성 크로마토그래피에 의해 달성할 수 있다. 이후, 마우스 포멧에서 71G3, 71D6 및 71G2의 생화학적 및 생물학적 활성을 인간 포멧에서의 동일 항체의 활성과 비교하였다.
ELISA에 의한 정제된 인간 또는 마우스 MET ECD의 결합력, FACS에 의한 인간 또는 마우스 세포 상의 천연 MET를 인지하는 인지력, 인간 및 마우스 상피 세포의 분산을 유도하는 유도력, 및 콜라겐 내에서 분지 형태형성을 촉진하는 능력을 평가하였다. 표 20에 요약 개시한 분석 결과, 인간과 마우스 불변부의 스와핑은 분석한 어떠한 특성에도 실질적인 영향이 없는 것으로 확인되었다.
표 20: 불변부 스와핑은 인간/마우스에 동등한 항체의 생화학적 및 생물학적 특성을 변형시키지 않는다. 마우스 또는 인간 포멧의 대표적인 작용제 항체 3종 (71G3, 71D6 및 71G2)에 대해 몇가지 시험관내 분석을 수행하여 이의 주요 생화학적 및 생물학적 특성을 규명하고자 하였다.
Figure 112019009348154-pct00026
실시예 12: 종래 항체와의 비교: 인간-마우스 교차 반응성
배경기술에서 상세히 언급한 바와 같이, HGF 활성을 적어도 일부 모방하는 작용제성 anti-MET 항체가 이미 소수의 다른 실험들에서 개시된 바 있다. 작성 시점에, 이러한 것으로는, (i) 3D6 마우스 항-인간 MET 항체 (미국 특허 제 6,099,841); (ii) 5D5 마우스 항-인간 MET 항체 (미국 특허 제 5,686,292); (iii) NO-23 마우스 항-인간 MET 항체 (미국 특허 제 7,556,804 B2); (iv) B7 인간 나이브 anti-인간 MET 항체 (미국 특허 출원번호 2014/0193431 A1); (v) DO-24 마우스 항-인간 MET 항체 (Prat et al., Mol Cell Biol. 11, 5954-5962, 1991; Prat et al., J Cell Sci. 111, 237-247, 1998); 및 (vi) DN-30 마우스 항-인간 MET 항체 (Prat et al., Mol Cell Biol. 11, 5954-5962, 1991; Prat et al., J Cell Sci. 111, 237-247, 1998) 등이 있다.
다음과 같이 기존의 작용제성 anti-MET 항체들을 모두 입수하였다. 3D6 하이브리도마를 American Type Culture Collection (Cat. No. ATCC-HB-12093)에서 입수하였다. 표준 친화성 크로마토그래피 프로토콜에 의해 하이브리도마 컨디셔닝화된 매질로부터 3D6 항체를 정제하였다.
길항제성 anti-MET 항체 오나르투주맵의 2가 전구체인 5D5 항체의 가변부를 코딩하는 cDNA (Merchant et al., Proc Natl Acad Sci USA 110, E2987-2996, 2013)를 미국 특허 7,476,724 B2에 공개된 VH 및 VL 서열에 기초하여 합성하였다. 수득한 DNA 단편을 마우스 IgG1/λ 불변 도메인과 융합하고, 표준 단백질 조작 프로토콜에 의해 2가 단일클론 항체로서 제조하였다.
NO-23 항체는 이탈리아 노바라 대학의 Maria Prat 교수 (NO-23의 발명자; 미국 특허 제 7,556,804 B2)로부터 제공받았다. 또한, NO-23 항체는 이탈리아 제노바 ABC (Advanced Biotechnology Center)의 ICLC (international depositary authority Interlab Cell Line Collection)에 해당 하이브리도마 (클론 No. ICLC 03001)를 요청하여 입수할 수 있다.
B7 항체의 가변부를 코딩하는 cDNA를 미국 특허 출원번호 2014/0193431 A1에 공개된 VH 및 VL 서열을 기초로 합성하였다. 수득한 DNA 단편을 마우스 IgG1/λ 불변 도메인과 융합하고, 상기와 같이 2가 단일클론 항체로서 제조하였다.
DO-24 및 DN-30 항체는 이탈리아 노바라 대학의 Maria Prat 교수 (DO-24와 DN-30를 최초로 동정 및 규명하였음; Prat et al., Mol Cell Biol. 11, 5954-5962, 1991; Prat et al., J Cell Sci. 111, 237-247, 1998)로부터 제공받았다. DO-24 항체는 현재 중단된 상태이며, 수년간 Upstate Biotechnology로부터 상업적으로 구입가능하였다. 또한, DN-30 항체는 이탈리아 제노바 ABC (Advanced Biotechnology Center)의 ICLC (international depositary authority Interlab Cell Line Collection)에 해당 하이브리도마 (클론 No. ICLC PD 05006)를 요청하여 입수할 수 있다.
인간 질환에 대한 대다수의 동물 모델이 숙주로서 마우스를 이용하기 때문에, 마우스 항원과의 교차 반응성은 생물학적 활성이 전-임상 시스템에서 검증되어야 하는 항체의 필수 요소이다. 종래 기술의 항체들 모두 마우스에서 제조되었으므로 (인간 나이브 파지 라이브러리에서 동정된 B7 제외), 이들 분자들은 마우스 MET와 교차 반응성을 나타내진 않을 것이다. 자기-항원과의 최소한의 교차 반응성이 원칙적으로 가능하더라도, 이러한 상호 작용은 일반적으로 매우 낮은 친화성을 가진다.
미국 특허 제 6,099,841에 상세히 기술된 바와 같이, 3D6 항체는 마우스 MET에 결합하지 않아, 발명자들은 이 항체가 생체내 활성을 가진다는 것을 입증하기 위해 패럿과 밍크를 이용해야 했다. 이들 동물 모델은 인간 질병을 모델링하기 위한 이상적인 시스템도 아니고 전-임상 의학에서의 사용도 확립되어 있지 않다는 것은 분명한 사실이다. 또한, 발명자들은 인간 시스템과 페럿 또는 밍크 시스템 간의 항체 친화성 및 활성 차이에 대한 어떠한 정량적인 데이타를 제공하지 않는다.
5D5 항체 및 그 유도체는 마우스 MET에 결합하지 않는 것으로 명확하게 입증되었다 (Merchant et al., Proc Natl Acad Sci USA 110, E2987-2996, 2013). 다른 전-임상 종에서의 교차-반응성에 대한 정보는 이용가능하지 않다.
마찬가지로, 미국 특허 출원번호 2014/0193431 A1은 마우스 MET 또는 다른 종과의 B7 항체의 교차-반응성에 관한 어떠한 정보도 제공하지 않는다.
미국 특허 제 7,556,804 B2는 NO-23 항체가 마우스, 랫 및 개 MET와 교차 반응한다고 주장하고 있지만, 이러한 내용을 뒷받침하는 정량적인 실험 증거는 제시되어 있지 않다. 본 발명자들은 마우스, 랫, 인간 또는 개 세포의 세포용해물로부터 MET를 면역-침강시킨 다음 면역-침강된 단백질을 방사성 32P-ATP와 함께 인큐베이션하기 위해 NO-23를 단일 포화 투여량 (single saturating dose)으로 사용한다. 방사성 표지 후, 삽입된 32P-ATP를 오토라디오그래피 (autoradiography)로 시각화한다. 이 방법은 매우 민감하며, 정량적인 수단이 아닙니다. 겔 상의 밴드가 어느 정도의 교차 반응성을 나타낸다고 말하기 어렵다.
마찬가지로, DO-24-함유성 Matrigel 펠릿은 마우스의 복강 내에 이식되었을 때 혈관 보충을 촉진하기 때문에 DO-24 항체가 마우스 MET과 교차-반응하는 것으로 제시되어 있다 (Prat et al., J Cell Sci. 111, 237-247, 1998). 그러나, 이는 또한 염증 증가로 인한 것일 수 있으며, DO-24가 마우스 MET와 상호작용한다는 직접적인 증거는 없다. 다른 연구에서, DO-24 (20 nM)의 단일 포화 투여량이 랫 심근 세포주 H9c2 및 마우스 심근 세포주 HL-5에서 MET의 자가-인산화를 유발하는 것으로 확인되었다 (Pietronave et al., Am J Physiol Heart Circ Physiol. 298, H1155-65, 2010; 도 1). 동일한 실험에서, 훨씬 적은 양의 재조합 HGF (0.5 nM)가 MET 인산화를 비슷한 수준으로 유발하는 것으로 나타났다. 저자 자신이 논의 섹션에서 인정한 바와 같이, 이러한 결과는 DO-24가 이들 설치류 세포주에서 HGF보다 현저하게 덜 강력하다는 것을 의미한다. 동일 저자는 DO-24가 인간 세포 모델에서 HGF 활성과 일치하는 완전 작용제 mAb 항체라고 주장하지만 (Prat et al., J Cell Sci., 111, 237-247, 1998), 이후 DO-24가 인간 및 마우스 세포에서 동일한 효과 또는 효능을 도출하지 못한다고 결론내려야 했다. 또한, Pietronave et al.에 공개된 실험은 정량적이지 않으며, DO-24와 마우스 또는 랫 MET 간에 발생하는 교차-반응성 정도에 대한 정보를 입수하는데 유용하지 않으며, 이의 측정에는 본원에서 수행된 바 (하기 참조)와 같이 일대일 (head-to-head) 용량-반응 실험이 필요하다는 것에 유념하여야 한다. 세 번째 연구에서는 DO-24와 DN-30 항체의 혼합물을 이용해 마우스 간엽 줄기 세포 세포용해물에서 MET를 면역-침강시킨다 (Forte et al., Stem Cells. 24, 23-33, 2006). DN-30의 존재와 분석 유형 (세포용해물로부터의 면역-침강) 둘다 DO-24가 천연 마우스 MET과 상호작용하는 능력에 대한 정확한 정보를 얻는데 적절하지 않다. 결론적으로, DO-24 항체가 인간 및 마우스 세포에서 비슷한 생물학적 반응을 유도한다는 실험적 증거는 없다.
마지막으로, DN-30 항체는 마우스 MET와 상호작용하지 않는 것으로 명확하게 입증되었다 (Prat et al., J Cell Sci. 111, 237-247, 1998; suppl. material of Petrelli et al., Proc Natl Acad Sci USA 103, 5090-9095, 2006).
종래의 작용제성 anti-MET 항체가 마우스 MET와 교차-반응하는 지 그리고 반응 정도를 직접 측정하고, 이를 본 발명의 인간/마우스에 동등한 항-MET 항체와 비교하기 위해, ELISA 분석을 수행하였다. 종래의 항체 모두 마우스 IgG/λ 포멧으로 수득 또는 조작되었기 때문에, 본 발명에서는 71G3, 71D6 및 71G2의 마우스 IgG/λ 버전을 사용하였다. 인간 또는 마우스 MET ECD를 고상 (100 ng/웰, 96-웰 플레이트)에 고정하고, 증가하는 방식의 여러가지 농도의 항체 (0-40 nM)에 용액 중에 노출시켰다. 결합을 HRP-접합된 항-마우스 Fc 항체 (Jackson Immuno Research Laboratories)를 사용해 확인하였다. 표 21에 나타낸 바와 같이, 이러한 분석에서, 종래 항체는 인간 MET에 0.059 nM (B7) - 4.935 nM (3D6) 범위의 KD로 결합하고, 40 nM의 높은 농도에서도 어느 것도 마우스 MET에 어떠한 친화성을 나타내지 않는다는 것이 확인되었다. 테스트한 항체들 중, 71G3, 71D6 및 71G2만 인간 및 마우스 MET 둘다에 결합하였으며, 구별하기 어려운 친화성 및 결합력을 나타내었다. 전체 항체의 전체 결합 프로파일을 도 6에 나타낸다.
표 21: ELISA에 의해 측정한 인간 및 마우스 MET에 대한 anti-MET 항체의 결합 친화성 및 결합력. 친화성은 EC50 (nMol/L)으로 표시한다. 결합력은 EMAX (450 nm에서의 광학 밀도; n.c., 수렴하지 않음)로 표시한다. 전체 결합 프로파일은 도 6을 참조한다.
Figure 112019009348154-pct00027
실시예 13: 종래 항체와의 비교: MET 자가-인산화
종래 항체의 작용제 활성을 인간/마우스에 동등한 항-MET 항체의 활성과 비교하기 위해, 인간 및 마우스 세포를 이용한 MET 자가-인산화 실험을 수행하였다. A549 인간 폐암 세포 및 MLP29 마우스 간 전구 세포를 48시간 동안 혈청 성장인자에 대해 고갈시킨 다음 농도를 증가시키는 방식으로 여러가지 농도의 항체 (0-25 nM)로 자극하였다. 15분 자극 후, 세포를 빙랭한 포스페이트 완충화된 염수 (PBS)로 2번 헹구고, 공지된 바와 같이 세포용해 처리하였다 (Longati et al., Oncogene 9, 49-57, 1994). 포스포-MET 수준을 공지된 바와 같이 포획용 anti-MET 항체 (R&D Systems)와 확인용 anti-포스포 티로신 (R&D Systems)을 이용해 ELISA로 측정하였다 (Basilico et al., J Clin Invest. 124, 3172-3186, 2014).
이러한 분석에서 종래 항체와 본원에 언급된 인간/마우스에 동등한 항-MET 항체 간에 중요한 2가지 차이가 드러났다. 첫째, 결합 실험에서 수득한 결과와 일치되게, 71G3, 71D6 및 71G2만 인간 및 마우스 세포에서 MET 자가-인산화를 촉진할 수 있었다. DO-24 및 NO-23 등의 종래 항체는 인간 세포에서만 MET 활성화를 유도하였으며; 마우스 세포에 대한 활성은 분석한 시스템에서 검출할 수 없었다. 두번째로, 종래 항체들 모두 71G3, 71D6 및 71G2와 비교해 낮은 작용제 활성을 나타내었다. 가장 강력한 작용제인 종래 mAb는 5D5 및 B7이었으며, 이들 항체의 활성은 71G3, 71D6 및 71G2 보다 약간 낮았다. 가장 활성이 낮은 종래 mAb는 3D6였다. 다른 분자들은 중간 수준의 활성을 나타내었다. 본 분석의 결과는 도 7에 나타낸다.
실시예 14: 종래 항체와의 비교: 분지 형태형성
종래 항체의 생물학적 활성을 인간/마우스에 동등한 항-MET 항체와 비교하기 위해, 분지 형태형성 분석을 수행하였다. 이 분석은 세포 증식, 분산, 분화 및 생존 등의 HGF와 관련된 생물학적 활성을 전부 평가한다. LOC 인간 신장 상피 세포와 MLP29 마우스 간 전구 세포를 전술한 바와 같이 콜라겐 내에 접종한 다음 증가시키는 방식으로 여러가지 농도의 mAb 또는 재조합 HGF (인간 또는 마우스, 둘다 R&D Systems)와 함께 인큐베이션하였다. 분지 형태형성을 현미경으로 시간 경과에 따라 추적하였으며, 5일 후 콜로니의 사진을 촬영하였다. 분지 형태형성의 활성을 각 구체에서 자라난 분지형 관상 구조의 수를 계수하여 정량 결과를 취하였으며, 이를 표 22에 나타낸다. 대표적인 구체의 사진은 도 8 (LOC 세포) 및 도 9 (MLP29 세포)에 도시한다.
표 22: 분지 형태형성 분석. LOC 인간 신장 상피 세포 또는 MLP29 마우스 간 전구 세포의 세포 구체 제조물을 콜라겐 층 내에 접종한 다음 증가시키는 방식으로 여러가지 농도 (0, 0.04, 0.2, 1, 및 5 nM)의 mAb 또는 재조합 인간 HGF (LOC) 또는 마우스 HGF (MLP29)와 함께 인큐베이션하였다. 분지 형태형성을 현미경으로 시간 경과에 따라 추적하였으며, 5일 후 콜로니의 사진을 촬영하였다. 분지 형태형성의 활성을 각 구체에서 분지의 개수를 계수하여 정량하였다 (1차 분지 + 2차 분지).
LOC 세포
Figure 112019009348154-pct00028
MLP29 세포
Figure 112019009348154-pct00029
제시된 데이타는 다음과 같은 결과를 도출한다. 인간 세포에서, 71D6, 71G2 및 5D5는 인간 HGF와 비슷한 활성을 나타내며; 71G3, 3D6, B7 및 DO-24는 부분 작용제로서 거동하며; NO-23 및 DN-30은 매우 낮은 작용제 활성을 나타낸다. 마우스 세포에서, 71G3, 71D6 및 71G2만 분지형 관상 구조의 형성을 효과적으로 유도하였으며; 다른 항체들 모두 - ELISA에서 마우스 MET에 결합하는 능력이 없다는 점에서 일관된 결과임 - 분지 형태형성을 전혀 유도하지 않았다.
종래 항체는, 인간/마우스에 동등한 항-MET 항체와는 대조적으로, 인간 및 마우스 시스템에서 다른 생물학적 활성을 유발하는 것으로, 판단되었다.
실시예 15: 인간/마우스에 동등한 항-MET 항체의 혈장 반감기
다음으로, 선택한 인간/마우스에 동등한 항-MET 항체에 대한 생체내 실험에 돌입하였다. 예비 분석으로, 마우스에서 최고 및 최저 수준을 측정하였다. 이를 위해, 친화성 정제된 71G3, 71D6 및 71G2 (마우스 IgG/λ 포멧)를 7주령의 BALB/c 암컷 마우스 (Charles River)에 i.p.로 주사하였다. 1회 볼루스로 1 mg/kg 또는 10 mg/kg을 주사하고, 혈액을 꼬리 정맥에서 주사 후 3, 6, 12 및 24시간에 채혈하였다. 혈액 샘플을 처리하고, 혈장내 항체 농도를 ELISA로 측정하였다. 표준 96-웰 플레이트를 실시예 1에 기술된 바와 같이 인간 MET ECD (100 ng/well)로 코팅한 다음 anti-MET 항체를 포획하기 위해 농도를 증가시킨 여러가지 마우스 혈장 희석물에 노출시켰다. PBS로 반복 세척한 다음 anti-MET 항체의 존재를 HRP-접합된 당나귀 항-마우스 항체 (Jackson Laboratories)를 사용해 확인하였다. 결합된 항체를 정량하기 위해, 동일 조건에서 정제된 71G3, 71D6 및 71G2의 표준 곡선을 확립하였다.
이러한 분석의 결과는 도 10에 나타낸다. 혈장 내 항체 농도는 테스트한 항체들 전체에서 비슷하였으며, 주사한 단백질의 양에 정비례하였다. 24시간 후, 혈장 내 항체 농도는 1 mg/kg 볼루스의 경우 대략 15 nM, 10 mg/kg 볼루스의 경우 250 nM이었다. 가장 까다로운 분석 (분지 형태형성 분석)에서 이들 항체의 작용제 활성이 5 nM 이하에서 포화에 도달하는 것을 감안하면, i.p. 주사에 의해 달성된 항체의 혈장 수준은, 1 mg/kg의 낮은 볼루스를 이용하는 생물학적 관점에서, 적절하다는 결론을 안전하게 내릴 수 있다.
아울러, 주사된 항체의 혈장 반감기를 계산하였다. 이는 항체 농도를 자연 로그 (Ln)로 변환하고, 데이타를 라인으로 피팅한 다음 라인의 기울기를 구하여, 달성하였다. 본 분석에서, 71G3, 71D6 및 71G2의 반감기들이 매우 비슷하며, 1 mg/kg 볼루스의 경우 약 3일, 10 mg/kg 볼루스의 경우 약 9일인 것으로, 추정되었다. 이는 설치류에서 반감기가 2.4분인 것으로 보고된 재조합 HGF의 반감기와 비교해 안정성이 현저하게 높다 (Ido et al., Hepatol Res. 30, 175-181, 2004). 혈장 안정성 데이타 전체 패널을 표 23에 요약 개시한다.
이러한 데이타는, 인간/마우스에 동등한 항-MET 항체가 HGF의 전신 투여가 필요한 모든 임상 적용에 재조합 HGF를 유리하게 대체할 수 있다는 것을, 시사해준다.
표 23. 인간/마우스에 동등한 항체의 혈장 안정성. 친화성 정제된 71G3, 71D6 및 71G2의 1회 볼루스 (1 mg/kg 또는 10 mg/kg)를 i.p.에 의해 7주령의 BALB/c 암컷 마우스에 주사하였다. 혈액 샘플을 꼬리 정맥에서 주사 후 3, 6, 12 및 24시간에 채혈하고, 혈장내 항체 농도를 ELISA로 측정하였다. 항체 농도의 자연 로그 변환값을 선형 피팅하여, 혈장 반감기를 계산하였다.
Figure 112019009348154-pct00030
실시예 16: 생체내 활성: 급성 간 손상 예방
간세포는, HGF의 주요 타겟으로서, 증식을 촉진하고, 세포자살로부터 보호하는, MET를 발현한다 (Nakamura et al., J Gastroenterol Hepatol. 1, 188-202, 2011). 이에, 인간/마우스에 동등한 작용제성 anti-MET 항체가 급성 간 부전 마우스 모델에서 보호 활성을 발휘하는 지를 테스트하였다. 이를 위해, 7주령의 BALB/c 암컷 마우스 (Charles River)의 피하 구획에 CCl4 (올리브 오일 중의 10% 용액, 0.2 ml; Sigma-Aldrich)를 1회 볼루스로 주사하였다. CCl4 주사 직후, 정제된 71G3, 71D6, 71G2 또는 비히클 단독 (PBS)를 1회 볼루스로 투여하는, 각각 6마리로 구성된 4개의 그룹으로 마우스를 랜덤 분류하였다. 항체는 5 mg/kg 투여량으로 i.p. 주사로 투여하였다. 주사 후 여러 시점 (0, 12, 24 및 48시간)에 혈액 샘플을 채혈하였다. 추가로, 5번째 대조군은 CCl4 또는 항체를 투여하지 않는 마우스 6마리로 구성되며, 실험 종료 시점에 희생시켰다. 부검에서, 혈액과 간을 분석하기 위해 채취하였다. 간 마커인 아스파르테이트 트랜스아미나제 (AST), 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT) 및 빌리루빈 (BIL)의 혈장 수준을 표준 임상 생화학적 방법으로 측정하였다. 간을 파라핀으로 포매하고, 표준 프로토콜을 이용한 조직학적 분석을 위해 가공 처리하였다.
도 11에 나타낸 바와 같이, 대조군 마우스에서 CCl4 주사는 분석한 3가지 혈액 파라미터 모두 신속하고 급격한 농도 증가를 유발하였으며, 중독 후 12-24시간에 최고 수준에 도달하였다. 대조군에서, CCl4 주사는 AST, ALT 및 빌리루빈의 수준을 각각 286, 761 및 13배 증가시켰다. 모든 항체 처리군에서는, 이러한 증가가 현저하게 감소되었다 (각각 71G3, 53%, 62%, 및 46%; 71D6, 37%, 34% 및 48%; 71G2, 50%, 39% 및 54%). 간 보호 측면에서 가장 강력한 항체는 71D6였다.
부검에서 간의 조직학적 검사 결과, CCl4는, 전형적인 간 세포 손상인 호산구 염색 및 거대 사이토플라즘을 특징으로 하는, 각 간 모듈의 중심 정맥 주변부에 현저한 조직 손상을 야기하였다. 세포-세포 상호작용은, 손상된 혈관으로부터 적혈구가 누출되어 침윤할 수 있도록, 느슨하게 보였다. 항체 처리군의 경우, 이러한 주변-중심 손상 면적이 작았으며, 약한 호산구 염색성, 정상적인 세포질 크기 및 혈액 세포 침윤 저하로 입증되는 바와 같이, 손상의 신호가 거의 없는 것으로 나타났다. 헤마톡실린과 에오신으로 염색한 간 조직의 대표적인 사진을 도 12에 도시한다.
이러한 결과는, 인간/마우스에 동등한 작용제성 anti-MET 항체가, 전형적으로, 비정상적인 간 생화학적 수치, 황달, 응고장애, 뇌부종 및 뇌병증을 유발하는, 급성 간 부전 발병을 특징으로 하는, 급성 간 장애를 치료하기 위해, 임상에서 사용될 수 있다는 것을 시사해준다. 이러한 병리학적 병태로는, 비-제한적으로, 파라세타몰 과다 복용, 약물 (예, 테트라사이클린)에 대한 특이 반응, 약물 남용 (엑스터시, 코카인), 바이러스 감염 (A형, B형 및 E형 간염) 등이 있다.
실시예 17: 생체내 활성: 만성 간 손상 예방
또한, 인간/마우스에 동등한 작용제성 anti-MET 항체가 만성 간 손상의 마우스 모델에서 치료학적 효과를 발휘하는 지를 테스트하였다. 실제, HGF는 간에서 항-섬유증 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다 (Matsumoto and Nakamura, Ciba Found Symp. 212, 198-211; discussion 211-214, 1997). 이를 위해, 7주령의 BALB/c 암컷 마우스 (Charles River)를 수주간 CCl4에 장기간 노출시켰다. 첫주에, 마우스의 피하에 올리브 오일 중의 CCl4 5% 용액 (Sigma-Aldrich) 1 ml을 1회 주사하였다. 다음주에, CCl4의 투여량을 증가시켰으며 (올리브 오일 중의 10% 용액 0.1 ml), 이때 주사 빈도는 변동없이 유지하였다 (주당 2회). 1차 주사 직후, 정제된 71G3, 71D6, 71G2 또는 비히클 단독 (PBS)을 각각 투여하는, 7마리로 구성된 4개의 그룹으로 마우스를 랜덤 분류하였다. 항체는 1 mg/kg 투여량으로 i.p. 주사로 주당 3번 투여하였다. 추가로, 5번째 대조군은 CCl4 또는 항체를 투여하지 않는 마우스 7마리로 구성되며, 이를 건강한 대조군으로 사용하였다. 마우스는 6주간 CCl4 만성 중독 후 희생시켰다. 부검에서, 혈액과 간을 분석하기 위해 채취하였다. 간 마커인 아스파르테이트 트랜스아미나제 (AST)와 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT)의 혈장 수준을 표준 임상 생화학적 방법으로 측정하였다. 간을 파라핀으로 포매하고, 표준 프로토콜을 이용한 조직학적 분석을 위해 가공 처리하였다.
도 13에 나타낸 바와 같이, 대조군 마우스에서 CCl4 만성 노출은 높은 AST 및 ALT 혈장 수준으로 확인되는 바와 같이 간 기능 손상을 유발하였다. 간 마커 수준의 급격하지만 일시적인 폭발을 유발하는 급성 모델과는 대조적으로, 만성 CCl4 중독은 AST 및 ALT 수준에 보다 적당한 수준의 증가를 유도하였으며, 이는 무처리 마우스의 약 5배였다. 특히, 항체 처리는 AST 농도 증가를 완전히 방지할 수 있었으며, 실제 이를 기저 수준으로 낮추었다. 또한, 항체는 AST에서 관찰되는 바와 같이 극적인 것은 아니더라도 ALT 수준의 폭발을 현저하게 방지할 수 있었다.
간 조직 단편을 섬유증 조직 검출을 목적으로 하는 메이슨 트리크롬, Picro Sirius 레드 및 anti-alpha 평활근 액틴 (α-SMA) 항체 등의 다양한 기법으로 염색하였다. 전체적인 조직 구조를 조사하기 위해 헤마톡실린 및 에오신을 이용한 염색도 수행하였다. 이러한 분석에서, 만성 CCl4 처리는, 특히 Picro Sirius 레드 및 anti-alpha 평활근 액틴 (α-SMA) 항체 염색에 양성인 것으로 특정되는, 소엽 사이 공간 내 다량의 섬유성 조직의 형성을 유도하는 것으로 드러났다. 섬유성 조직은 문맥 삼분지를 연결하는 일종의 '리본'을 형성하여, 간 유닛의 육각형 형태가 확인되었다. 특히, CCl4와 작용제성 anti-MET 항체 둘다 투여된 동물로부터 유래된 간 조직 단편에서는 염색 강도 측면에서 훨씬 약한 수준의 섬유증이 관찰되었으며, 섬유성 영역은 문맥 주변 공간으로 한정되어 나타났다. Picro Sirius 레드 및 anti-α-SMA 항체로 염색된 간 조직 단편의 대표적인 사진을 각각 도 14 및 도 15에 나타낸다.
이러한 데이타는, 인간/마우스에 동등한 작용제성 anti-MET 항체가, 간 실질의 점진적인 파괴 및 재생과 간경변 및 섬유증 유발을 특징으로 하는, 만성 간 손상과 관련된 병리학적 병태를 치료하기 위해, 임상에서 사용될 수 있다는 것을, 시사해준다. 작용제성 anti-MET 항체는 섬유증을 경감 또는 예방하여, 간 구조 및 기능을 회복하는데 이용할 수 있다. 또한, 이는 종종 만성 간 질환을 악화시키는 염증 및 면역 반응을 억제하기 위해 사용할 수 있다.
실시예 18: 생체내 활성: 급성 신장 손상 예방
신장 상피 세포는 MET를 현저한 수준으로 발현하며, HGF 자극에 매우 민감하다 (Mizuno et al. Front Biosci. 13, 7072-7086, 2008). 이에, 인간/마우스에 동등한 작용제성 anti-MET 항체가 급성 신장 부전 마우스 모델에서 예방 효과를 발휘하는 지를 테스트하였다. 이를 위해, 7주령의 BALB/c 암컷 마우스 (Charles River)에 HgCl2를 1회 볼루스 (3 mg/kg)로 i.p. 주사하여 관상 손상을 유도하였다. HgCl2 중독 직후에, 71G3, 71D6, 71G2 또는 비히클 단독 (PBS)을 처리하는, 4개의 그룹으로 마우스를 랜덤 분류하였다. 항체는 10 mg/kg 투여량으로 24시간 마다 i.p. 주사로 투여하였다. 각 처리군은 마우스 6마리로 구성되며, HgCl2 주사한 지 72시간 후에 희생시켰다. 부검시, 혈액과 신장을 분석하기 위해 채취하였다. 혈액요소질소 (BUN) 및 크레아티닌 (CRE) 혈장 수준을 표준 임상 생화학 방법으로 측정하였다. 신장은 표준 프로토콜을 이용한 조직학적 분석을 위해 처리하였다.
도 16에 나타낸 바와 같이, 대조군 마우스의 경우, HgCl2 주사는 BUN 및 CRE 수준의 급격한 증가를 유발하였다. 대조군에서, BUN 및 CRE는 각각 6배 및 12배 증가하였다. 전체 항체 처리군의 경우, 이러한 증가는 현저하게 감소하였다 (각각 71G3, 52% 및 54%; 71D6, 39% 및 30%; 71G2, 45% 및 44%). 신장 보호 측면에서 가장 강력한 항체는 71D6이었다.
신장에 대한 조직학적 검사 결과, HgCl2가 근위 세뇨관 이완, 위축 및 괴사를 특징으로 하는 광범위한 관상 손상을 유발하는 것으로 확인되었다. 사구체 구조가 파괴되었으며, 주변 기질로부터 분리되고, 실질적으로 사구체 주변 공간이 증가하였다. 항체 처리군의 경우, 근위 세뇨과 세포는 거의 괴사되지 않았으며, 사구체의 조직학적 구조도 손상되지 않은 것으로 관찰되었다. 헤마톡실린과 에오신으로 염색한 신장 조직 단편의 대표적인 사진을 도 17에 도시한다.
이에, 인간/마우스에 동등한 작용제성 anti-MET 항체는, 예를 들어 허혈성 또는 신독성 손상, 저혈량 쇼크, 뇨 수집 시스템의 폐쇄, 죽상동맥경화증, 패혈증, 진성 당뇨병, 자가면역 질환 또는 횡문근 융해증에 의해 유발될 수 있는, 급성 신장 부전과 관련된 병리학적 병태를 치료하기 위해 임상에서 사용될 수 있는 것으로 제안된다. 작용제성 anti-MET 항체는 급성 신부전을 예방 또는 회복시키고, 관상 상피 세포를 세포자살로부터 보호하고, 상피 세포의 재생을 가속화하고, 신장 기능을 회복시키는데 유용할 수 있다.
실시예 19: 생체내 활성: 궤양성 결장염 마우스 모델에서 급성 결장 손상 예방, 염증 감소 및 재생 촉진
장 상피 세포가 MET를 발현하고, HGF가 위장관의 항상성 및 재생에 중요한 역할을 담당한다는 것은 잘 확립되어 있다 (Nakamura et al., J Gastroenterol Hepatol. 1, 188-202, 2011). 이에, 인간/마우스에 동등한 작용제성 anti-MET 항체가 궤양성 결장염 마우스 모델에서 장 보호 및 재생을 촉진할 수 있는 지를 조사하였다. 이를 위해, 7주령의 BALB/c 암컷 마우스 (Charles River)를 음용수 중의 덱스트란 소듐 설페이트 (DSS)에 10일간 노출시켰다. 10일에, DSS 처리를 중단하였으며, 마우스에 다시 정상 식수를 제공하였다. 1일부터 시작해, 각각 71G3, 71D6, 71G2 (투여량 1 mg/kg 또는 5 mg/kg) 또는 비히클 단독 (PBS)을 처리하는, 마우스 7마리로 구성된 처리군 7개로 마우스를 무작위 분할하였다. 항체는 i.p. 주사로 주당 3회 투여하였다. 추가적으로 8번째 대조군으로 DSS 또는 항체를 투여하지 않는 마우스 7마리를 포함시켰으며, 이를 건강한 대조군으로 이용하였다. 마우스는 12일에, 즉 DSS 투여를 중단한 지 2일 후에 희생시켰으며, 장을 회수하여 잘 헤척한 다음 자로 길이를 측정하였다. 측정한 후, 장을 파라민 포매 처리하고, 조직학적 분석을 위해 처리하였다.
실험을 진행하는 내내, 마우스의 체중을 정기적으로 모니터링하였으며, 궤양성 결장염의 임상 증상을 혈변, 직장 출혈 및 변의 굳기를 측정하여 평가하였다. 전-임상 모델에서 사용한 표준 점수 시스템을 사용해 정량 평가하였다 (Kim et al., J Vis Exp. 60, pii: 3678, 2012): 각 파라미터를 0 (증상 없음)에서 3점 (증상의 최고 발현)까지 점수를 매겼다. 단일 파라미터에 대한 점수를 합하여 0-9 범위로 질병 활성도 지표 (DAI)를 구하였다.
도 18에 나타낸 바와 같이, PBS 대조군의 경우, DSS에의 노출은 체중 최대 25% 감소를 유발하였으며; DAI는 4점 이상으로 증가하였고; 장의 길이는 최대 40% 감소하였다. 놀랍게도, 분석한 전체 항체 처리군에서는 용량-의존적인 방식으로 이러한 효과가 반전되어, 테스트한 낮은 투여량에서도 이미 현저한 활성이 나타났다. 71D6이 가장 강력한 항체였으며; 체중은 PBS 군에서 관찰된 결과와 비교해, 일시적으로 감소된 후 정상 수준으로 회복되었으며; DAI 증가가 억제되었으며, 실질적으로 모든 임상적인 증상들이 억제되었고; 장 단축 (colon shortage)을 방지하여, 무시할 수 있는 수준의 변형으로 한정되었다.
결장 조직 절편을 헤마톡실린과 에어신으로 염색하고, 현미경으로 검경하였다. 도 19에 나타낸 바와 같이, DSS 투여는 결장 점막에 현저한 손상을 유발하였다. 상피 층은 침식되고, 림프구가 침윤한 것으로 관찰되었다. 결장 점막에는 농양 추정 부위 (cryptic abscess site)가 퍼져있었으며, 조직 파괴의 원인이 되는 포말상 대식세포로 심하게 잠식되어 있었다. 장기 주위 림프절이 커진 것으로 관찰되었다. 점액선은 위축 특징을 보였으며, 현저한 점액 고갈이 관찰되었고, 이는 포말상 대식세포, 림프구 및 호중구 등의 염증성 침윤물질로 대체되어 있었다. 몇몇 궤양에서는 가시적으로 과립구성 또는 대식세포 삼출물이 침투하여, 샘 요소 (glandular component)가 완전히 사라진 것으로 관찰되었다. 놀랍게도, DSS와 작용제성 항-MET 항체 둘다를 처리한 마우스에서는, 훨씬 경미한 퇴행 및 염증 증상이 나타났다. 특히, 대식세포 및 과립구 등의 급성 염증 성분들이 없었으며; 점막은 단지 일부 손상되어 드문 드문 샘 변형과 희박 (rarefaction) 부위가 관찰되었으며; 뮤신 분비가 회복되었으며, 침식 및 궤양은 전혀 없었다. 이러한 보호 효과는 전체 항체 그룹들에서 용량-의존적이었지만, 이미 1 mg/lg에서 명확하게 나타났으며, 이는 상기 용량으로 도달된 항체의 농도가 포화 수준에 매우 근접하다는 것을 의미한다 (실시예 15의 혈장 안정성 참조). 본 모델에서도 물론 가장 효과적인 항체는 71D6인 것으로 보인다.
실시예 20: 생체내 활성: 염증성 장 질환의 마우스 모델에서의 급성 결장 손상 보호, 염증 감소 및 면역 억제
상기한 결과에 고무하여, 본 발명자들은 작용제성 anti-MET 항체가 보다 구체적인 염증성 장 질환의 마우스 모델에서 치료학적 효과를 발휘하는 지를 시험하였다. 이를 위해, 7주령의 암컷 C57BL/6 마우스 (Charles River)에 에탄올에 용해한 2,4,6-트리니트로벤젠설폰산 (TNBS)을 직장내 주사하여, 급성 장 손상을 유도하였다. TNBS/에탄올 조합은 면역학적 및 침식 프로세스를 통해 결장직장 염증을 유도하는 것으로 알려져 있다 (Jones-Hall and Grisham, Pathophysiology 21, 267-288, 2014). 50% 에탄올에 용해한 TNBS는 5 mg/mouse의 용량으로 관장에 의해 투여하였다. TNBS 투여 직후, 정제된 71G3, 71D6, 71G2 또는 비히클 단독 (PBS)으로 각각 처리되는 마우스 6마리로 구성된 4개의 처리군으로 마우스를 무작위 분할하였였다. 항체는 투여량 1 mg/kg을 2일 간격으로 i.p. 주사로 투여하였다. 추가적으로, 5번째 대조군은 TNBS 또는 항체를 투여하지 않은 마우스 6마리를 포함하였으며, 이를 건강한 대조군으로 사용하였다. 마우스의 체중을 매일 모니터링하였다. TNBS 투여 후 5일에 마우스를 희생시켰다. 부검시, 결장을 채취하고, 전술한 바와 같이 측정하였다. 측정 후, 결장을 파라핀 포매 처리한 다음 조직학적 분석을 위해 가공 처리하였다.
도 20에 나타낸 바와 같이, TNBS 노출시, 체중이 약 15% 감소하였으며, 결장의 길이가 20% 이상 짧아졌다. 이러한 효과는, DSS에서 유발된 효과와 비교해 보다 완화되었음에도 불구하고, 전체 항체 처리군에서 관찰된 결과와는 유의한 차이가 있었다. 실제, 71G3, 71D6 및 71G2 처리시, TNBS-유발성 체중 감소 및 결장 단축이 거의 완전히 억제되어, 항처-처리 동물은 건강한 대조군 마우스와 거의 구분할 수 없었다.
결장 조직 절편을 헤마톡실린과 에오신으로 염색하고, 현미경으로 검경하였다. 도 21에 나타낸 바와 같이, TNBS 투여는, 장기 주변 림프절의 비대화, 점막하 및 점막내 림프구 응집 출현 및 림프구 침윤 증가로 특정되는, 전형적인 림프성 결장염 증상의 발병을 유발하였다. 기질 과증식 (stromal hyper-proliferation) 및 림프구와 호중구의 침윤과 관련있는, 몇몇 전층 궤양 (full-depth ulcer)도 관찰할 수 있었다. 이러한 모든 병리학적 프로세스는 작용제성 anti-MET 항체 처리군에서는 현저하게 억제되어, 림프구 침윤 감소 및 점막 손상 저하가 관찰되었다. 림프구가 존재하는 부위에서도 점액 분비 고갈 또는 상피 손상은 관련없었다.
이러한 결과들과 상기한 실시예에서 보고된 데이타는, 인간/마우스에 동등한 작용제성 anti-MET 항체가 궤양성 결장염 또는 보다 일반적으로 염증성 장 질환과 관련된 병리학적 병태를 치료하기 위해 임상에서 이용할 수 있다는 것을 보여준다. 작용제성 anti-MET 항체를 이용한 치료는, 장 병변을 감소시키고, 상피 세포 증식을 촉진하며, 염증성 세포 침윤을 감소시키며, 따라서 질병의 임상 진행을 개선시킬 수 있다.
실시예 21: 생체내 활성: 1형 당뇨병 마우스 모델에서 글루코스 흡수 및 인슐린과의 공동-작용 촉진
HGF는 배양한 마우스 골격근 세포에서 인슐린-의존적인 글루코스 흡수를 촉진하는 것으로 보고된 바 있다 (Perdomo et al., J Biol Chem. 283, 13700-13706, 2008). 이에, 본 발명자들은 작용제성 anti-MET 항체가 1형 당뇨병 마우스 모델에서 혈중 고 혈당을 낮출 수 있는 지를 조사하였다. 이를 위해, 7주령의 BALB/c 암컷 마우스 (Charles River)에 스트렙토조톡신 (STZ; Sigma Aldrich)을 i.p. 주사하여 췌장 베타-세포 변성을 유도하였다. STZ는 5일 연속하여 매일 40 mg/kg의 투여량으로 주사하였다. 마지막 주사하고 1주일 후, 공복 혈당 수준을 표준 글루코스 스트립 (GIMA)을 이용해 측정하였다. 이때, STZ-처리 마우스는 무처리 마우스와 비교해 2배 높은 수준의 평균 기저 혈당 (basal glycemy)를 나타내었다 (240 mg/dL vs. 120 mg/dL). 마우스를 기저 혈당을 토대로 각각 마우스 7마리로 구성된 4개의 처리군으로 무작위 분류하고, 각각에 정제된 71G3, 71D6, 71G2 또는 비히클 단독 (PBS)을 투여하였다. 항체는 1 mg/kg의 투여량으로 매주 2회로 i.p. 주사로 투여하였다. 추가로 5번째 대조군에는 STZ 또는 항체를 투여하지 않은 마우스 7마리를 포함시켰으며, 이를 건강한 대조군으로 사용하였다. 공복 혈당 농도를 5주간 경시적으로 모니터링하였다. 5주 후 종료시, 당 부하 검사 (GTT) 및 인슐린 부하 검사 (ITT)를 수행하였다. GTT는 공복 동물에 입을 통한 위관 영양법으로 글루코스를 투여한 다음 여러 시간대에 혈당을 측정하는 것으로 이루어진다. ITT는 부분 공복 동물에 인슐린을 i.p 또는 i.v. 주사에 의해 투여한 다음 여러 시간대에 혈당을 측정하는 것으로 이루어진다.
도 22A에 나타낸 바와 같이, STZ-처리 마우스에서는 기저 혈당이 실험 전 기간 동안 계속적으로 증가하였다. 이는 점진적으로 장기 손상을 악화시키는 만성 췌장 염증 때문이다. 대조적으로, 항체-처리 동물에서는 꾸준한 혈당 감소가 나타났으며, 궁극적으로 2주간의 처리 후 안정한 상태에 도달하였다. 항체 투여가 혈당을 완전히 정상화하진 않았지만, 최대 25%까지 감소시켰으며, 그래서 STZ-처리 마우스에서 관찰된 결과와 대조군 마우스의 결과 사이의 약 중간 수준에 도달하였다. 이 모델에서 고혈당은 베타-세포-유래 인슐린의 부재로 인한 것임을 감안하면, 항체 처리군에서 더 낮은 혈당치가 인슐린 농도 증가로 인한 것이었는 지에 대한 의문을 가지게 되었다. 그러나, 혈액 샘플에 대한 ELISA 분석에서, 그러한 경우에 해당하지 않는 것으로, 드러났다 (도시 안함). GTT에서, 항체 치료를 받은 마우스 - 더 낮은 혈당치에서 시작함 - 는 정상적인 글루코스 흡수 곡선을 나타내진 못하였다 (도 22B). 반면, 항체-처리 마우스는 ITT에서 보다 빠른 인슐린 반응을 나타내었다 (도 22C). 인슐린 주사한지 15분 후, 장기간 항체 처리를 받은 마우스에서 혈당치는 0 시간에 비해 약 30-40%까지 떨어졌으며, 이는 STZ-처리 마우스 및 대조군 동물에서 관찰된 혈당치 보다 현저하게 낮았다 (도 22D). 이러한 결과는, 작용제성 anti-MET 항체가 인슐린 부재시 글루코스 흡수를 촉진한다는 것을, 시사해준다. 또한, 이러한 결과는, 작용제성 anti-MET 항체와 인슐린이, 둘다 존재할 경우, 글루코스 흡수를 매개하는데 공동-작용함을, 시사해준다.
이러한 가설을 마우스 골격근 세포를 이용하여 세포성 분석으로 테스트하였다. C2C12 마우스 근모세포 (American Tissue Type Collection)를 제공자의 권고안에 따라 근세포로 분화되게 유도한 다음 인간/마우스에 동등한 작용제성 anti-MET 항체 (71G3, 71D6, 71G2)와 인큐베이션하였다. 24시간 후, 항체-처리 세포를 3개의 그룹으로 나누었으며, 각각에는 글루코스 형광 유사체 2-(N-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-다이아졸-4-일)아미노)-2-데옥시글루코스 (2-NBDG; Life Technologies)의 존재 하에 1시간 동안 0 nM, 100 nM 또는 1000 nM 인간 재조합 인슐린 (Sigma Aldrich)으로 급성 자극을 유도하였다. 2-NBDG 흡수를 유세포 측정으로 측정하였다.
도 23에 나타낸 바와 같이, 71G3, 71D6 및 71G2는 용량-의존적인 방식으로 글루코스 흡수를 촉진하였다. 인슐린과 작용제성 anti-MET 항체의 조합시 공동-작용 효과가 발휘되었으며, 인슐린 단독 및 항체 단독 둘다와 비교해 우수한 수준으로 글루코스 흡수를 촉진하였다. 이러한 데이타는 HGF 및 인슐린이 배양된 세포에서 글루코스 대사 조절에 공동-작용한다는 사실과 일치하며 (Fafalios et al. Nat Med. 17, 1577-1584, 2011), 작용제성 anti-MET 항체가 인슐린-독립적인 및 인슐린-의존적인 글루코스 흡수 둘다를 강화할 수 있다는 가설을 검증해준다.
실시예 22: 생체내 활성: 2형 당뇨병 마우스 모델에서 혈당치 정상화 및 인슐린 내성 극복
인간/마우스에 동등한 작용제성 anti-MET 항체가 글루코스 흡수를 촉진하는데 인슐린과 공동-작용할 수 있다는 발견 사실에 힘입어, 2형 당뇨병 마우스 모델에서 이의 치료학적 잠재성을 테스트하였다. 2형 당뇨병은 높은 혈당치, 고인슐린 혈증 및 인슐린 내성을 특징으로 한다. 가장 잘 확립된 2형 당뇨병 마우스 모델들 중 하나는 db/db 마우스로, 이는 렙틴 수용체 유전자 lepr에 점 돌연변이를 가지고 있는 C57BLKS/J 품종이다. 이 돌연변이로 인해 포만감이 없어지고, 그래서 무한정 먹게 되어 비만과 상기한 2형 당뇨병 임상 특징을 나타내게 된다 (Wang et al. Curr Diabetes Rev. 10, 131-145, 2014).
db/db 암컷 마우스를 7주령의 것으로 Charles River (JAXTM Mice Strain BKS.Cg-Dock7 m +/+Lepr db J)에서 입수하였다. 1주일 후, 동물을 각각 마우스 5마리로 구성된 4개의 처리군으로 무작위 분류하고, 각각에 정제된 71G3, 71D6, 71G2 또는 비히클 단독 (PBS)을 투여하였다. 항체는 1 mg/kg의 투여량으로 매주 2회로 i.p. 주사로 투여하였다. 공복 혈당 농도를 8주간 14일마다 모니터링하였다. 7주간 처리 후, 즉 마우스가 15주령이 되었을 때, 당 부하 검사 (GTT)와 인슐린 부하 검사 (ITT)를 수행하였다.
도 24에 나타낸 바와 같이, 무작위 분류할 시점의 PBS 처리군의 평균 기저 혈당 농도는 대략 230 mg/dL이었으며, 이는 명확하게 당뇨병 수준에 해당한다. 이 수치는 시간 경과에 따라 실험 종료시까지 증가하는 경향을 나타내었으며, 즉 8주 후 PBS 처리군의 평균 혈당 농도는 대략 330 mg/dL이었다. 반면, 항체 처리군의 경우, 공복 기저 혈당은 시간 경과에 따라 일정하게 감소하였다. 실험 종료 시점에 71G3, 71D6 및 71G2 처리군의 평균 혈당 농도는 각각 173 mg/dL, 138 mg/dL 및 165 mg/dL이었다.
7주간 처리 후, 즉 마우스가 15주령이 되었을 때, 글루코스 및 인슐린 챌린지에 대한 급성 반응을 테스트하였다. 이들 마우스는, STZ 처리 마우스 (실시예 21 참조)와 대조적으로, 인슐린-내성이기 때문에, 고인슐린혈증이고 높은 혈당치를 나타냄에 명심하여야 한다. 실제, GTT에서 글루코스로 챌린지하였을 경우, PBS 처리군의 마우스는 정상적인 글루코스 흡수 프로파일을 나타내지 못하였다. 모든 마우스가 급격한 혈당 증가를 나타냈으며, 이는 검사 전 기간 동안 증가된 상태로 유지되었다. 대칭적으로, ITT 수행에서, 동일한 마우스는 인슐린에 대해 역설적인 반응을 나타내었는데, 글루코스 수치가 약간 일시적으로 증가하였다. 이러한 역설적인 반응이 적어도 전-임상 모델에서 인슐린 내성의 특징이다.
항체 처리군 마우스는, 더 낮은 기저 수준에서 시작하여, GTT에서 정상적인 글루코스 흡수 프로파일을 나타내지 못하였는데, 이는 작용제성 anti-MET 항체가 혈당치의 돌발적인 폭발을 중화시킬 수 없다는 것을, 시사한다. 그러나, 놀랍게도, 항체 처리는 ITT에서 인슐린에 대한 반응을 현저하게 향상시켜, PBS 처리군에서 관찰된 역설적인 효과를 반전시키고, 비-당뇨병 마우스 (C57BLKS/J; Charles River)에서 나타낸 ITT 프로파일에 더 가까운 ITT 프로파일을 나타내었다. 본 발명자들은, 작용제성 anti-MET 항체의 장기 처리가 db/db 마우스에서 2형 당뇨병을 개선하고, 인슐린 내성을 부분적으로 극복한다고, 결론내렸다.
이러한 결과와 상기 실시예에서 나타난 결과에 기초하여, 인간/마우스에 동등한 작용제성 anti-MET 항체는 높은 혈당치와 관련된 병리학적 병태를 치료하기 위해 임상에서 사용할 수 있는 것으로, 보인다. 이러한 것으로는 높은 글루코스 및/또는 인슐린 내성을 특징으로 하는 1형 당뇨병, 2형 당뇨병 또는 그외 당뇨병-유사 병태 (예, 대사증후군)를 포함할 수 있다.
실시예 23: 생체내 활성: 비-알코올성 지방간염의 마우스 모델에서 지방간 개선
간에서 MET의 타겟 유전자 결손이 마우스에서 중증의 비-알코올성 지방간염 (NASH) 발병을 유도하는 것으로 입증된 바 있다 (Kroy et al. J Hepatol. 61, 883-890, 2014). 독립적인 연구 (Kosone et al., Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 293, G204-210, 2007)에서, HGF는 미소좀 트리글리세라이드 수송 단백질 (MTP) 및 아포지단백질 B (ApoB)를 활성화하여 지방산 저장을 최소화함으로써 마우스에서 고지방 식이에 의해 유발된 지방간을 완화하는 것으로 확인된 바 있다.
고인슐린혈증 db/db 마우스는 또한 NASH 모델로서 널리 사용되고 있으며, 보다 일반적으로는 지방간 질환 모델로서 사용된다. 정상 식이시, 이 마우스는 간 세포에 지질을 상당량 축적하여 간 지방증, 섬유증 및 만성 간 부전을 유발한다. 이러한 상태는 마우스에 고 지방 식이를 제공할 경우 더 악화될 수 있다 (Anstee and Goldin, Int J Exp Pathol. 87, 1-16, 2006).
상기한 관찰 결과와 검토를 통해, 인간/마우스에 동등한 작용제성 anti-MET 항체가 정상 식이를 유지한 db/db 마우스에서 중등도의 간 지방증을 완화할 수 있는 지를 테스트하였다. 이를 위해, 상기와 같이 db/db 암컷 마우스를 입수하였다. 동물이 8주령이 되었을 때, 각각 마우스 6마리로 구성된 4개의 처리군으로 랜덤 분류하고, 각각에 정제된 71G3, 71D6, 71G2 또는 비히클 단독 (PBS)을 처리하였다. 항체는 투여량 1 mg/kg으로 매주 2회로 i.p. 주사로 투여하였다. 8주간 처리 후, 마우스를 희생시키고, 부검하였다. 간을 적출하여 파라핀으로 포매한 다음 조직학적 검사를 위해 가공 처리하였다. 간 기능 마커를 분석하기 위해 채혈하였다.
간 조직 단편을 헤마톡실린 및 에오신 또는 Picro Sirius 레드로 염색하여 섬유증을 부각시켰다. 도 25에 나타낸 바와 같이, PBS 처리군의 간에서는 전형적으로 중심 정맥 주변에 집중된 현저한 지방증이 관찰되었다. 간 세포는 상당히 커져 있으며 지질로 차있는 것으로 관찰되었다. 지방간 세포는 정상 간 세포와 혼재되어 있었으며, 지방이 중심 주위 공간을 최대 60% 점유하고 있었다. 이와는 대조적으로, 항체-처리 동물의 간에는 지방 세포가 현저하게 적게 함유되어 있었으며, 전체적으로 상당히 정상적으로 관찰되었다. 도 26에 나타낸 바와 같이, Picro Sirius 레드 염색 결과, PBS 처리군에서는 간삼조 (hepatic triad) (간문맥, 간동맥 및 담관)를 둘러싼 기질 층의 비후화가 특징인 문맥 주변에 중등도의 섬유증이 확인되었으며, 종종 간엽 공간으로 확대되었다. 놀랍게도, 모든 항체 처리군의 간 조직 절편은 있다하더라도 훨씬 적은 섬유증을 나타내었다. 혈장에서의 간 기능 마커 AST 및 ALT에 대한 분석으로 이러한 결과들이 검증되었다 (도 27). 실제, 작용제성 anti-MET 항체가 처리된 동물은, 정상 마우스의 평균 AST 및 ALT 수준과 비교해 2배 낮고, PBS 처리군과 비교해 약 2.5배 낮은, 이례적으로 낮은 혈장내 AST 및 ALT 수준을 나타내었다.
이들 데이타는, 인간/마우스에 동등한 작용제성 anti-MET 항체가 지방간과 관련된 NASH 또는 기타 병리학적 병태를 치료하기 위해 임상에 사용할 수 있음을, 시사해준다. 작용제성 anti-MET 항체는, 간 세포 내 지질 축적을 저해하고, 간지방증을 예방 또는 역전시키고, 지방산 축적과 대식세포 침윤 사이에 발생하는 악순환을 억제하는데, 사용할 수 있다. 만성 염증은 변함없이 세포외 매트릭스의 침전을 발생시킨다. 따라서, 작용제성 anti-MET 항체는 지방증-관련 섬유증을 완화하는데에도 사용할 수 있다.
실시예 24: 생체내 활성: 당뇨병 마우스에서 상처 치유
당뇨병과 임상적으로 관련있는 합병증은 궤양 증가 및 상처 치유 장애이다. HGF가 상처 치유에 관여하므로 (Nakamura et al., J Gastroenterol Hepatol. 1, 188-202, 2011), 본 발명자들은 인간/마우스에 동등한 항-MET 항체가 당뇨병 백그라운드에서 상처 치유를 촉진할 수 있는 지를 확인하고자 하였다. 이를 위해, 전술한 바와 같이 db/db 당뇨병 마우스를 입수하였다. 8주령에, 동물을 마취시키고, 피부 바이옵시용 서클 펀치 블레이드 (GIMA)로 절개하여 우측 뒷쪽 옆구리에 0.8 cm-너비의 둥근 상처를 만들었다. 상피 전층을 제거하였다. 수술 다음날, 마우스를 정제된 71G3, 71D6, 71G2 또는 비히클 단독 (PBS)을 투여하는 4개의 군으로 무작위 분류하였다. 항체를 5 mg/kg 투여량으로 i.p. 주사에 의해 2일 마다 투여하였다. 상처의 직경을 캘리퍼를 사용해 매일 측정하였다.
도 28에 나타낸 바와 같이, 항체 처리는 상처 봉합 및 상피 재형성을 유의하게 가속화하였다. 대조군은 1일 5%의 평균 속도로 실험 상처가 회복되었지만, 71G3 처리군은 8%까지, 71D6 처리군으로 12%까지, 71G2 처리 군은 11%까지 증가하였다.
이에, 본 발명자는, 인간/마우스에 동등한 작용제성 anti-MET 항체가 전형적으로 치유 장애를 나타내는 당뇨병-관련 궤양 및 상처를 치료하기 위해 임상적으로 이용할 수 있음을, 제시한다. 당뇨병-관련 상처 (sore)는 의학적으로 해결되지 못한 필요성이 있다. 미국에서, 당뇨병은 비-외상성 하지 절단을 유발하는 주요 요인이다. 작용제성 anti-MET 항체는 치유를 가속화하고, 재-상피화를 개선시키고, 높은 혈당-유도성 상처의 혈관 형성을 촉진하기 위해 사용할 수 있다.
실시예 25: 라투스 노르베기쿠스 ( Rattus norvegicus ) 및 마카카 파시쿨라리스 ( Macaca fascicularis ) MET의 교차-반응성
인간 질병에 대한 대다수의 동물 모델들이 숙주로 마우스를 사용하므로, 마우스 항원과의 교차-반응성은 전-임상 시스템에서 검증되어야 하는 항체의 필수 요소이다. 이는 인간/마우스에 동등한 항-MET 항체를 동정하게 만드는 이유였다. 그러나, 일부 전-임상 절차들은 바람직하게는 좀더 큰 설치류 또는 영장류 (예, 장기 이식 및 그외 복잡한 외과적 개입이 필요한 실험 실무)에서 수행된다. 또한, 바람직하게는 약력학 및 약동학 실험이 고등 척추동물, 전형적으로 랫 및 원숭이에서 수행된다. 마지막으로, 가장 중요한 것은, 이상적으로는 치료 항체의 독성 평가가 원숭이에서 수행되거나, 또는 가능하지 않다면 대안으로 다른 종의 2가지 설치류에서 수행된다는 것이다. 따라서, 랫과 원숭이의 교차-반응성 역시 이상적으로 바람직하다.
이를 위해, 인간/마우스에 동등한 항-MET 항체가 랫 (Rattus norvegicus) 및 시노몰구스 원숭이 (Macaca fascicularis) 등의 다른 종의 MET와 교차-반응하는 지를 조사하였다. 랫 MET ECD (NCBI # NP_113705.1; aa 1-931) 및 원숭이 MET ECD (NCBI # XP_005550635.2; aa 1-948)를 표준 단백질 조작 기법으로 수득하였다. 인간 및 마우스 MET ECD를 대조군으로 사용하였다. SEMA 결합제 (71D6, 71C3, 71D4, 71A3, 71G2) 및 PSI 결합제 (76H10, 71G3)를 대표적인 한정된 항체 패널로 선택하였다. 5D5 종래 항체를 대조군으로 사용하였다. MET ECD 단백질을 고상으로 고정하고 (100 ng/well, 96-웰 플레이트), 농도를 증가시키는 방식으로 여러가지 농도 (0-40 nM)의 mAb (인간 불변부 포함)를 용액 중에 노출시켰다. HRP-접합된 항-인간 Fc 항체 (Jackson Immuno Research Laboratories)를 사용해 결합성을 확인하였다. 도 29에 나타낸 바와 같이, 테스트한 모든 인간/마우스에 동등한 항체들은 비슷한 친화성 및 결합력으로 인간, 마우스, 랫 및 유인원 MET에 결합하였지만, 5D5는 인간 및 유인원 MET에만 결합하였다. 이에, 본 발명에서는, 71D6, 71C3, 71D4, 71A3, 71G2, 76H10 및 71G3 항체가 적어도 ELISA에 의해 측정된 바에 따라 인간 MET, 마우스 MET, 랫 MET 및 유인원 MET에 비슷한 친화성 및 결합력으로 결합하는 것으로, 결정되었다.
실시예 26: 정교한 에피토프 맵핑
인간/마우스에 동등한 항-MET 항체에 의해 인지되는 MET의 에피토프를 정교하게 맵핑하기 위해, 다음과 같은 전략을 취하였다. 라마에서 합성되고 인간 MET에 대한 항체가 마우스 MET와 교차 반응한다면, 이 항체는 호모 사피엔스 (H. sapiens)와 무스 무스쿨러스 (M. musculus) 간에 보존되어 있지만 호모 사피엔스, 무스 무스쿨러스 및 라마 글라마 (L. glama) 간에는 보존되지 않은 잔기 (또는 수개의 잔기)를 인지할 가능성이 있다고 추론하였다. 동일한 추론은 라투스 노르베기쿠스 (R. norvegicus) 및 마카카 파시쿨라리스 (M. fascicularis)에까지 확장될 수 있다.
이를 조사하기 위해, 인간 (UniProtKB # P08581; aa 1-932), 마우스 (UniProtKB # P16056.1; aa 1-931), 랫 (NCBI # NP_113705.1; aa 1-931), 시노몰구스 원숭이 (NCBI # XP_005550635.2; aa 1-948) 및 라마 MET (GenBank # KF042853.1; aa 1-931)의 아미노산 서열을 서로 정렬 및 비교하였다 (도 30). 표 12를 참조하여, 71D6, 71C3, 71D4, 71A3 및 71G2 항체에의 결합을 담당하는 MET 영역 (인간 MET의 aa 314-372)과 76H10 및 71G3 항체에의 결합을 담당하는 MET 영역 (인간 MET의 aa 546-562)에 주의를 집중하였다. 전자 인간 MET (aa 314-372) 영역에는, 인간 및 마우스 MET에는 보존되어 있지만 라마 MET에는 보존되지 않는 잔기가 5개 존재한다 (Ala 327, Ser 336, Phe 343, Ile 367, Asp 372). 이 아미노산은 도 30에 검정색 박스로 연속적인 번호 1-5로 표시된다. 이중 잔기 4개는 랫과 시노몰구스 원숭이 MET (Ala 327, Ser 336, Ile 367, Asp 372)에 보존되어 있다. 후자 인간 MET (aa 546-562)에는, 인간 및 마우스 MET에는 보존되어 있지만 라마 MET에는 보존되지 않는 잔기가 3개 존재한다 (Arg 547, Ser 553, Thr 555). 이 아미노산은 도 30에 검정색 박스로 연속적인 번호 6-8로 표시된다. 이중, 잔기 2개는 랫과 시노몰구스 원숭이 MET (Ser 553 및 Thr 555)에도 보존되어 있다.
인간 MET를 주형으로 사용해, 이들 각각의 잔기를 여러가지 순열로 돌연변이를 유발하여, 라마 유래인 특정 잔기를 제외하거는 모두 인간의 것인 일련의 MET 돌연변이를 제작하였다. 돌연변이들을 개략적으로 도 31에 도시한다. 다음으로, 이들 MET 돌연변이에 대한 선택한 SEMA-결합성 mAb (71D6, 71C3, 71D4, 71A3, 71G2) 및 PSI-결합성 mAb (76H10 및 71G3)의 친화성을 ELISA에 의해 테스트하였다. 이를 위해, 다양한 MET 단백질을 고상 (100 ng/well, 96-웰 플레이트)에 고정한 다음 증가되는 방식의 여러가지 농도의 항체 (0-50 nM) 용액에 노출시켰다. 사용한 항체는 인간 불변부 포멧을 사용하였기 때문에, 결합은 HRP-접합된 항-인간 Fc 2차 항체 (Jackson Immuno Research Laboratories)로 확인하였다. 야생형 인간 MET는 양성 대조군으로 사용하였다. 분석 결과는 표 24에 나타낸다.
표 24. 작용제성 항체 결합을 담당하는 MET 에피토프는 호모 사피엔스 ( H. sapiens ), 무스 무스쿨러스 ( M. musculus ), 라투스 노르베기쿠스 ( R. norvegicus ), 마카카 파시쿨라리스 ( M. fascicularis ) 간에는 보존되어 있지만 동일 종 및 라마 글라마 ( L. glama )에는 보존되어 있지 않은 잔기를 나타낸다. 인간, 마우스, 랫, 시노몰구스 원숭이에는 보존되어 있지만 라마 MET에는 보존되어 있지 않은 잔기의, 작용제성 mAb의 결합에의 관련성을 ELISA로 테스트하였다. 야생형 (WT) 또는 돌연변이 (MT) 인간 MET ECD를 고상에 고정하고, 증가시키는 방식으로 여러가지 농도의 mAb 용액에 노출시켰다. 결합은 항-인간 Fc 이차 항체를 사용해 확인하였다. 모들 결합 값은 WT 단백질에 대해 정규화하였으며, WT MET 대비 결합% (EMAX)로 표시하였다. 각 돌연변이 (A-L)는 도 31에 나타낸 돌연변이 (1-8) 중 적어도 2개를 포함한다.
Figure 112019009348154-pct00031
상기한 결과들은 본 발명의 작용제성 항체의 결합과 관련된 잔기에 대해 명확하고 확실한 윤곽을 제시해준다.
테스트한 SEMA 결합 항체 (71D6, 71C3, 71D4, 71A3, 71G2)들 모두, SEMA β-프로펠란의 블레이드 5 내부에 놓인, 인간, 마우스, 시노몰구스 및 랫 MET에 보존되어 있지만 라마 MET에 보존되어 있지 않은 핵심 아미노산 2개를 포함하는 동일 에피토프에 결합하는 것으로 보인다: Ile 367 및 Asp 372. 실제, 돌연변이 Ala 327, Ser 336 또는 Phe 343은 결합에 전혀 영향을 미치지 않았으며; 돌연변이 Ile 367은 부분적으로 결합을 손상시켰으며; 돌연변이 Ile 367과 Asp 372는 결합을 완전히 억제하였다. 이에, 인간 MET의 Ile 367과 Asp 372는 SEMA를 겨냥하는 항체에 결합하는데 결정적인 것으로 판단되었다. 이 2개의 잔기는 도 30에서 "S" (SEMA의 경우)로 표시된다.
또한, 테스트한 PSI 결합 항체 (76H10, 71G3) 역시 동일한 에피토프에 결합하는 것으로 보인다. 그러나, SEMA 에피토프와 대조적으로, PSI 에피토프는 인간, 마우스, 시노몰구스 및 랫 MET에는 보존되어 있지만 라마 MET에 보존되어 있지 않은 핵심 아미노산을 1개 포함한다: Thr 555. 실제, 돌연변이 Arg 547 또는 Ser 553은 결합에 전혀 영향을 미치지 않은 반면, 돌연변이 Thr 555는 결합을 완전히 억제하였다. 이에, Thr 555는 PSI를 겨냥하는 테스트 항체에 결합하는데 결정적인 것으로 판단되었다. 이 잔기는 도 30에서 "P" (PSI의 경우)로 표시된다.
실시예 27: 인간/마우스에 동등한 작용제성 항체의 고유성
실시예 26에 제시된 정교한 에피토프 맵핑 결과, 본 발명에 제시된 작용제성 항체가 종래의 어떠한 분자에서도 공유되지 않은 독특한 특징을 가진다는 것에 대한 구체적인 분자적인 입증이 제시되었다. 이러한 고유성은 다음의 분석을 수행함으로써 가장 잘 이해된다.
실시예 12-14에서 언급된 종래 항체들 대부분은, MET 상에서 인지되는 정확한 에피토프에 대한 정보를 이용할 수 없다. 그러나, 종래의 분자들은 모두 마우스 MET와 교차 반응하지 않기 때문에, 이들 에피토프는 본 발명의 항체에 의해 인지되는 것과 달라야 한다는 것을 본 발명자들은 인지하고 있다. 이러한 다양성에 대한 예는, MET와의 상호작용에 대한 구체적인 분자적 정보가 주석으로 달린 종래의 anti-MET 항체인 5D5/Onartuzumab에 의해 제시된다. 5D5/Onartuzumab은, 본 발명의 SEMA-결합성 항체와 상호작용하는 역할을 하는 아미노산과 매우 근접한, SEMA β-프로펠러의 블레이드 5에 놓인 4개의 서로 다른 잔기를 인지한다 (Merchant et al., Proc Natl Acad Sci USA 110, E2987-2996, 2013). 이 잔기는 도 30에서 "O" (Onartuzumab)로 표시되며, Gln 328, Arg 331, Leu 337 및 Asn 338에 해당한다.
흥미롭게도, 이들 잔기 모두 호모 사피엔스와 무스 무스쿨루스 간에 보존되어 있다. 이는 5D5/Onartuzumab이 마우스를 숙주로 사용해 제조되었으며, 마우스 MET와 교차-반응을 일으키지 않는 이유를 설명한 개념와 완전히 일치한다 (Merchant et al., vedi supra, 및 본 발명의 도 6 및 도 29에 제시된 데이터). 또한, 이들 잔기는 호모 사피엔스와 라투스 노르베기쿠스 간에서 전혀 보존되어 있지 않지만, 호모 사피엔스와 마카카 파시쿨라리스 간에는 모두 보존되어 있다. 이는, 5D5/Onartuzumab이 랫 MET에는 결합하지 않지만 시노몰구스 원숭이 MET에 결합하는 이유를 해명해준다 (도 29).
5D5/Onartuzumab 및 본원에 언급된 종래의 다른 모든 분자들과는 대조적으로, 본 발명의 인간/마우스에 동등한 항체는 라마를 숙주로 하여 제작되었으며, 인간 및 마우스 MET 둘다와의 교차-반응성에 대해 명백히 스크리닝되었다. 호모 사피엔스와 무스 무스쿨러스 간에는 보존적이지만 호모 사피엔스, 무스 무스쿨러스 및 라마 글라마 간에는 보존되어 있지 않은 수개의 아미노산 대부분 (도 30에 검정색 박스로 표시됨)이, 또한 라투스 노르베기쿠스와 마카카 파시쿨라리스에도 보존되어 있기 때문에, 선택한 항체가 랫 및 원숭이와도 교차-반응할 가능성이 있는 것으로 판단된다.
결론적으로, 면역화 전략 및 스크리닝 설계는 본 발명의 항체에 고유성을 부여한다. 한편, 면역화에 사용된 종 (라마 글라마)은, 다른 종의 MET와 비교해 라마 MET의 아미노산 서열에 충분한 미스매치가 존재한다고 보장할 만큼 호모 사피엔스, 무스 무스쿨러스, 라투스 노르베기쿠스 및 마카카 파시쿨라리스와 완전히 구분된다 (도 30). 면역화된 숙주는 "자기"로 인지하는 에피토프에 대해서는 항체를 만들 수 없기 때문에, 이러한 미스매치가 중요하다. 또 다른 한편으로, 인간/마우스 이중 스크리닝 프로토콜은 이들 2가지 종들에서 보존된 에피토프를 인지하는 항체가 선택될 수 있게 해준다. 또한, 이 단계는, 2개의 종에 대한 패닝 (panning) 없이도 친화성이 가장 높거나 또는 더 높지만 반드시 교차-반응성은 아닌 항체를 단순히 선택하는 것이므로, 필수적이다. 이러한 2가지 기준 (제5의 종과 '이중 디핑 (double dipping)' 프로토콜)을 도입하여 새롭고 고유한 특징을 가진 항체를 동정할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> AGOMAB THERAPEUTICS BVBA <120> ANTI-MET ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> BET18P4323 <140> PCT/EP2017/065599 <141> 2017-06-23 <150> GB1611123.9 <151> 2016-06-27 <160> 248 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 30 <212> PRT <213> Lama glama <400> 1 Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Val Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn 20 25 30 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Lama glama <400> 2 Thr Tyr Tyr Met Thr 1 5 <210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> Lama glama <400> 3 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 1 5 10 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Lama glama <400> 4 Asp Ile Asn Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 5 <211> 32 <212> PRT <213> Lama glama <400> 5 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Val Arg 20 25 30 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Lama glama <400> 6 Val Arg Ile Trp Pro 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58 Arg Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 59 <211> 14 <212> PRT <213> Lama glama <400> 59 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 1 5 10 <210> 60 <211> 17 <212> PRT <213> Lama glama <400> 60 Ser Ile Asp Ser Tyr Gly Tyr Ser Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 61 <211> 32 <212> PRT <213> Lama glama <400> 61 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 62 <211> 9 <212> PRT <213> Lama glama <400> 62 Ala Lys Thr Thr Trp Ser Tyr Asp Tyr 1 5 <210> 63 <211> 11 <212> PRT <213> Lama glama <400> 63 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 64 <211> 30 <212> PRT <213> Lama glama <400> 64 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg 20 25 30 <210> 65 <211> 5 <212> PRT <213> Lama glama <400> 65 Asn Tyr His Met Ser 1 5 <210> 66 <211> 14 <212> PRT <213> Lama glama <400> 66 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PRT <213> Lama glama <400> 74 Asp Thr Asn Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 75 <211> 32 <212> PRT <213> Lama glama <400> 75 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 76 <211> 8 <212> PRT <213> Lama glama <400> 76 Ser Phe Phe Tyr Gly Met Asn Tyr 1 5 <210> 77 <211> 11 <212> PRT <213> Lama glama <400> 77 Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 78 <211> 22 <212> PRT <213> Lama glama <400> 78 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys 20 <210> 79 <211> 14 <212> PRT <213> Lama glama <400> 79 Gly Leu Ser Ser Gly Ser Val Thr Thr Ser Asn Tyr Pro Gly 1 5 10 <210> 80 <211> 15 <212> PRT <213> Lama glama <400> 80 Trp Phe Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ala Pro Arg Thr Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 81 <211> 7 <212> PRT <213> Lama glama <400> 81 Asn Thr Asn Asn Arg His Ser 1 5 <210> 82 <211> 32 <212> PRT <213> Lama glama <400> 82 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Ile Ser Gly Asn Lys Ala Ala 1 5 10 15 Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 83 <211> 10 <212> PRT <213> Lama glama <400> 83 Ser Leu Tyr Thr Gly Ser Tyr Thr Thr Val 1 5 10 <210> 84 <211> 10 <212> PRT <213> Lama glama <400> 84 Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu 1 5 10 <210> 85 <211> 22 <212> PRT <213> Lama glama <400> 85 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys 20 <210> 86 <211> 14 <212> PRT <213> Lama glama <400> 86 Gly Leu Ser Ser Gly Ser Val Thr Thr Ser Asn Tyr Pro Gly 1 5 10 <210> 87 <211> 15 <212> PRT <213> Lama glama <400> 87 Trp Phe Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ala Pro Arg Thr Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 88 <211> 7 <212> PRT <213> Lama glama <400> 88 Asn Thr Asn Ser Arg His Ser 1 5 <210> 89 <211> 32 <212> PRT <213> Lama glama <400> 89 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Ile Ser Gly Asn Lys Ala Ala 1 5 10 15 Leu Thr Ile Met Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 90 <211> 9 <212> PRT <213> Lama glama <400> 90 Ser Leu Tyr Pro Gly Ser Thr Thr Val 1 5 <210> 91 <211> 10 <212> PRT <213> Lama glama <400> 91 Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu 1 5 10 <210> 92 <211> 22 <212> PRT <213> Lama glama <400> 92 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Ser Ala Leu Ser Val Thr Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Lys Ile Thr Cys 20 <210> 93 <211> 11 <212> PRT <213> Lama glama <400> 93 Gln Gly Gly Ser Leu Gly Ser Ser Tyr Ala His 1 5 10 <210> 94 <211> 15 <212> PRT <213> Lama glama <400> 94 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 95 <211> 7 <212> PRT <213> Lama glama <400> 95 Asp Asp Asp Ser Arg Pro Ser 1 5 <210> 96 <211> 32 <212> PRT <213> Lama glama <400> 96 Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Gly Thr Ala Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Gly Asp Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 97 <211> 11 <212> PRT <213> Lama glama <400> 97 Gln Ser Ala Asp Ser Ser Gly Asn Ala Ala Val 1 5 10 <210> 98 <211> 10 <212> PRT <213> Lama glama <400> 98 Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu 1 5 10 <210> 99 <211> 22 <212> PRT <213> Lama glama <400> 99 Ser Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ser Ala Leu Ser Val Thr Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Lys Ile Thr Cys 20 <210> 100 <211> 11 <212> PRT <213> Lama glama <400> 100 Gln Gly Gly Ser Leu Gly Ser Ser Tyr Ala His 1 5 10 <210> 101 <211> 15 <212> PRT <213> Lama glama <400> 101 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 102 <211> 7 <212> PRT <213> Lama glama <400> 102 Asp Asp Asp Ser Arg Pro Ser 1 5 <210> 103 <211> 32 <212> PRT <213> Lama glama <400> 103 Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Gly Thr Ala Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Gly Asp Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 104 <211> 11 <212> PRT <213> Lama glama <400> 104 Gln Ser Ala Asp Ser Ser Gly Asn Ala Ala Val 1 5 10 <210> 105 <211> 10 <212> PRT <213> Lama glama <400> 105 Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu 1 5 10 <210> 106 <211> 22 <212> PRT <213> Lama glama <400> 106 Gln Pro Val Leu Asn Gln Pro Ser Ala Leu Ser Val Thr Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Lys Ile Thr Cys 20 <210> 107 <211> 11 <212> PRT <213> Lama glama <400> 107 Gln Gly Gly Ser Leu Gly Ala Arg Tyr Ala His 1 5 10 <210> 108 <211> 15 <212> PRT <213> Lama glama <400> 108 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 109 <211> 7 <212> PRT <213> Lama glama <400> 109 Asp Asp Asp Ser Arg Pro Ser 1 5 <210> 110 <211> 32 <212> PRT <213> Lama glama <400> 110 Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Gly Thr Ala Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Gly Asp Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 111 <211> 9 <212> PRT <213> Lama glama <400> 111 Gln Ser Ala Asp Ser Ser Gly Ser Val 1 5 <210> 112 <211> 10 <212> PRT <213> Lama glama <400> 112 Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu 1 5 10 <210> 113 <211> 22 <212> PRT <213> Lama glama <400> 113 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Ser Ala Leu Ser Val Thr Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Lys Ile Thr Cys 20 <210> 114 <211> 11 <212> PRT <213> Lama glama <400> 114 Gln Gly Gly Ser Leu Gly Ser Ser Tyr Ala His 1 5 10 <210> 115 <211> 15 <212> PRT <213> Lama glama <400> 115 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 116 <211> 7 <212> PRT <213> Lama glama <400> 116 Asp Asp Asp Ser Arg Pro Ser 1 5 <210> 117 <211> 32 <212> PRT <213> Lama glama <400> 117 Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Gly Thr Ala Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Gly Asp Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 118 <211> 11 <212> PRT <213> Lama glama <400> 118 Gln Ser Ala Asp Ser Ser Gly Asn Ala Ala Val 1 5 10 <210> 119 <211> 10 <212> PRT <213> Lama glama <400> 119 Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu 1 5 10 <210> 120 <211> 22 <212> PRT <213> Lama glama <400> 120 Ser Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ser Ala Leu Ser Val Ser Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys 20 <210> 121 <211> 11 <212> PRT <213> Lama glama <400> 121 Gln Gly Gly Ser Leu Gly Ser Ser Tyr Ala His 1 5 10 <210> 122 <211> 15 <212> PRT <213> Lama glama <400> 122 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 123 <211> 7 <212> PRT <213> Lama glama <400> 123 Gly Asp Asp Ser Arg Pro Ser 1 5 <210> 124 <211> 32 <212> PRT <213> Lama glama <400> 124 Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Gly Thr Ala Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Asp Asp Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 125 <211> 10 <212> PRT <213> Lama glama <400> 125 Gln Ser Thr Asp Ser Ser Gly Asn Thr Val 1 5 10 <210> 126 <211> 10 <212> PRT <213> Lama glama <400> 126 Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu 1 5 10 <210> 127 <211> 22 <212> PRT <213> Lama glama <400> 127 Gln Ala Gly Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Lys 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Ser Cys 20 <210> 128 <211> 14 <212> PRT <213> Lama glama <400> 128 Ala Gly Asn Ser Ser Asp Val Gly Tyr Gly Asn Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 129 <211> 15 <212> PRT <213> Lama glama <400> 129 Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Met Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 130 <211> 7 <212> PRT <213> Lama glama <400> 130 Leu Val Asn Lys Arg Ala Ser 1 5 <210> 131 <211> 32 <212> PRT <213> Lama glama <400> 131 Gly Ile Thr Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 132 <211> 10 <212> PRT <213> Lama glama <400> 132 Ala Ser Tyr Thr Gly Ser Asn Asn Ile Val 1 5 10 <210> 133 <211> 10 <212> PRT <213> Lama glama <400> 133 Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu 1 5 10 <210> 134 <211> 23 <212> PRT <213> Lama glama <400> 134 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Thr Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Gly Lys Val Thr Ile Asn Cys 20 <210> 135 <211> 17 <212> PRT <213> Lama glama <400> 135 Lys Ser Ser Gln Ser Val Phe Ile Ala Ser Asn Gln Lys Thr Tyr Leu 1 5 10 15 Asn <210> 136 <211> 15 <212> PRT <213> Lama glama <400> 136 Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Val Ile Ser 1 5 10 15 <210> 137 <211> 7 <212> PRT <213> Lama glama <400> 137 Tyr Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 138 <211> 32 <212> PRT <213> Lama glama <400> 138 Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Thr Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro Glu Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 139 <211> 8 <212> PRT <213> Lama glama <400> 139 Gln Gln Ala Tyr Ser His Pro Thr 1 5 <210> 140 <211> 10 <212> PRT <213> Lama glama <400> 140 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys 1 5 10 <210> 141 <211> 22 <212> PRT <213> Lama glama <400> 141 Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys 20 <210> 142 <211> 14 <212> PRT <213> Lama glama <400> 142 Gly Leu Ser Ser Gly Ser Val Thr Thr Ser Asn Tyr Pro Gly 1 5 10 <210> 143 <211> 15 <212> PRT <213> Lama glama <400> 143 Trp Phe Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ala Pro Arg Thr Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 144 <211> 7 <212> PRT <213> Lama glama <400> 144 Asn Thr Asn Ser Arg His Ser 1 5 <210> 145 <211> 32 <212> PRT <213> Lama glama <400> 145 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Ile Ser Gly Asn Lys Ala Ala 1 5 10 15 Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 146 <211> 10 <212> PRT <213> Lama glama <400> 146 Ser Leu Tyr Pro Gly Ser Tyr Thr Asn Val 1 5 10 <210> 147 <211> 10 <212> PRT <213> Lama glama <400> 147 Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu 1 5 10 <210> 148 <211> 22 <212> PRT <213> Lama glama <400> 148 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Arg Leu Thr Cys 20 <210> 149 <211> 14 <212> PRT <213> Lama glama <400> 149 Thr Leu Ser Ser Gly Asn Asn Ile Gly Ser Tyr Asp Ile Ser 1 5 10 <210> 150 <211> 15 <212> PRT <213> Lama glama <400> 150 Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Ser Pro Pro Arg Tyr Leu Leu Asn 1 5 10 15 <210> 151 <211> 11 <212> PRT <213> Lama glama <400> 151 Tyr Tyr Thr Asp Ser Arg Lys His Gln Asp Ser 1 5 10 <210> 152 <211> 34 <212> PRT <213> Lama glama <400> 152 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Asp Ala Ser Ala Asn Ala 1 5 10 15 Gly Leu Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 20 25 30 Tyr Cys <210> 153 <211> 11 <212> PRT <213> Lama glama <400> 153 Ser Ala Tyr Lys Ser Gly Ser Tyr Arg Trp Val 1 5 10 <210> 154 <211> 10 <212> PRT <213> Lama glama <400> 154 Phe Gly Gly Gly Thr His Val Thr Val Leu 1 5 10 <210> 155 <211> 118 <212> PRT <213> Lama glama <400> 155 Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Val Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Asp Ile Asn Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Val 85 90 95 Arg Val Arg Ile Trp Pro Val Gly Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Gln Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 156 <211> 110 <212> PRT <213> Lama glama <400> 156 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Leu Ser Ser Gly Ser Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Tyr Pro Gly Trp Phe Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ala Pro Arg Thr 35 40 45 Leu Ile Tyr Asn Thr Asn Asn Arg His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Ile Ser Gly Asn Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Leu Tyr Thr Gly Ser 85 90 95 Tyr Thr Thr Val Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 157 <211> 118 <212> PRT <213> Lama glama <400> 157 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Asp Ile Arg Thr Asp Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Met Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Thr Arg Ile Phe Pro Ser Gly Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Gln Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 158 <211> 109 <212> PRT <213> Lama glama <400> 158 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Leu Ser Ser Gly Ser Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Tyr Pro Gly Trp Phe Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ala Pro Arg Thr 35 40 45 Leu Ile Tyr Asn Thr Asn Ser Arg His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Ile Ser Gly Asn Lys Ala Ala Leu Thr Ile Met Gly Ala 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Leu Tyr Pro Gly Ser 85 90 95 Thr Thr Val Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 159 <211> 126 <212> PRT <213> Lama glama <400> 159 Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Asn Ser Gly Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly 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ggtctcatct attgatagtt atggttacag cacatactat 180 acagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggac acggccctgt attactgtgc aagagcgaaa 300 acgacttgga gttatgacta ctggggccag gggacccagg tcaccgtctc ctca 354 <210> 194 <211> 336 <212> DNA <213> Lama glama <400> 194 gaaattgtgt tgacgcagtc tcccagctcc gtgactgcat ctgtaggagg gaaggtcact 60 atcaactgta agtccagcca gagcgtcttc atagcttcta atcagaaaac ctacttaaac 120 tggtaccagc agagacctgg acagtctccg aggttggtca tcagctatgc gtccacccgt 180 gaatcgggga tccctgatcg attcagcggc agtgggtcca caacagattt cactctcacg 240 atcagcagtg tccagcctga agatgcggcc gtgtattact gtcagcaggc ttatagccat 300 ccaacgttcg gccaggggac caaggtggaa ctcaaa 336 <210> 195 <211> 351 <212> DNA <213> Lama glama <400> 195 gaggtgcagc tcgtggagtc tgggggaggc ttggtgcaac ctgggggttc tctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagg aattaccaca tgagttgggt ccgccaggtt 120 ccagggaagg ggttcgagtg gatctcagat attaatagtg caggtggtag cacatactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacgctgtat 240 ctggaaatga acagcctgaa acctgaggac acggccctgt attactgtgc aagagtcaac 300 gtctgggggg tgaactactg gggcaaaggg accctggtca gcgtctcctc a 351 <210> 196 <211> 330 <212> DNA <213> Lama glama <400> 196 cagactgtgg tgactcagga gccgtccctg tcagtgtctc caggagggac ggtcacactc 60 acctgcggcc tcagctctgg gtctgtcact accagtaact accctggttg gttccagcag 120 acaccaggcc aggctccacg cactcttatc tacaacacaa acagccgcca ctctggggtc 180 cccagtcgct tctccggatc catctctggg aacaaagccg ccctcaccat cacgggggcc 240 cagcccgagg acgaggccga ctattactgt tctctgtacc ctggtagtta cactaatgtg 300 ttcggcggag ggacccatct gaccgtcctg 330 <210> 197 <211> 348 <212> DNA <213> Lama glama <400> 197 gagttgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagc aactatgtca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccaggaaagg ggctcgagtg ggtctcagat actaatagtg gtggtagcac aagctatgca 180 gactccgtga agggccgatt caccatctct agagacaacg ccaagaacac gctgtatttg 240 caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacacg gcattgtatt actgtgcgag atcatttttc 300 tacggcatga actactgggg caaagggacc caggtcaccg tgtcctca 348 <210> 198 <211> 351 <212> DNA <213> Lama glama <400> 198 cagtctgccc tgactcagcc gccctccctc tctgcatctc cgggatcatc tgtcagactc 60 acctgcaccc tgagcagtgg aaacaatatt ggcagctatg acataagttg gtaccagcag 120 aaggcaggga gccctccccg gtacctcctg aactactaca ccgactcacg caagcaccag 180 gactccgggg tcccgagccg cttctctggg tccaaagatg cctcggccaa cgcagggctt 240 ctgctcatct ctgggcttca gcccgaggac gaggctgact attactgttc tgcatacaag 300 agtggttctt accgttgggt gttcggcgga gggacgcacg tgaccgtcct g 351 <210> 199 <211> 450 <212> PRT <213> Lama glama <400> 199 Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Val Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Asp Ile Asn Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys 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Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Ser Glu Val Phe Val Pro Gln Ser Arg Lys Val Ile 435 440 445 <210> 220 <211> 222 <212> PRT <213> Lama glama <400> 220 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Arg Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gly Asn Asn Ile Gly Ser 20 25 30 Tyr Asp Ile Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Ser Pro Pro Arg Tyr 35 40 45 Leu Leu Asn Tyr Tyr Thr Asp Ser Arg Lys His Gln Asp Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Asp Ala Ser Ala Asn Ala Gly Leu 65 70 75 80 Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Ala Tyr Lys Ser Gly Ser Tyr Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr 100 105 110 His Val Thr Val Leu Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe 115 120 125 Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys 130 135 140 Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala 145 150 155 160 Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys 165 170 175 Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro 180 185 190 Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu 195 200 205 Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 215 220 <210> 221 <211> 442 <212> PRT <213> Lama glama <400> 221 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Asp Ile Arg Thr Asp Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Met Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Thr Arg Ile Phe Pro Ser Gly Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Pro 180 185 190 Arg Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro 210 215 220 Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 225 230 235 240 Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys 245 250 255 Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp 260 265 270 Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu 275 280 285 Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met 290 295 300 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser 305 310 315 320 Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly 325 330 335 Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln 340 345 350 Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe 355 360 365 Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu 370 375 380 Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asn Thr Asn Gly Ser Tyr Phe 385 390 395 400 Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn 405 410 415 Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr 420 425 430 Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 222 <211> 219 <212> PRT <213> Lama glama <400> 222 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Leu Ser Ser Gly Ser Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Tyr Pro Gly Trp Phe Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ala Pro Arg Thr 35 40 45 Leu Ile Tyr Asn Thr Asn Ser Arg His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Ile Ser Gly Asn Lys Ala Ala Leu Thr Ile Met Gly Ala 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Leu Tyr Pro Gly Ser 85 90 95 Thr Thr Val Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro 100 105 110 Lys Ser Ser Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu 115 120 125 Glu Thr Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Thr Ile Thr Asp Phe Tyr Pro 130 135 140 Gly Val Val Thr Val Asp Trp Lys Val Asp Gly Thr Pro Val Thr Gln 145 150 155 160 Gly Met Glu Thr Glu Thr Thr Gln Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys 165 170 175 Tyr Met Glu Thr Ala Ser Ser Tyr Leu Thr Leu Thr Ala Arg Ala Trp 180 185 190 Glu Arg His Ser Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly His Thr 195 200 205 Val Glu Lys Ser Leu Ser Arg Ala Asp Cys Ser 210 215 <210> 223 <211> 450 <212> PRT <213> Lama glama <400> 223 Glu Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Asn Ser Tyr Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Glu Val Arg Ala Asp Leu Ser Arg Tyr Asn Asp Tyr Glu Ser 100 105 110 Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Lys 115 120 125 Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln 130 135 140 Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro 145 150 155 160 Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val 165 170 175 His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser 180 185 190 Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Pro Arg Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys 195 200 205 Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val 210 215 220 Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val 225 230 235 240 Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile 245 250 255 Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp 260 265 270 Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His 275 280 285 Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg 290 295 300 Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp 370 375 380 Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile 385 390 395 400 Met Asn Thr Asn Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln 405 410 415 Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His 420 425 430 Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 224 <211> 216 <212> PRT <213> Lama glama <400> 224 Gln Pro Val Leu Asn Gln Pro Ser Ala Leu Ser Val Thr Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Lys Ile Thr Cys Gln Gly Gly Ser Leu Gly Ala Arg Tyr Ala 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Asp Asp Asp Ser Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Gly Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Gly Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Ala Asp Ser Ser Gly Ser Val 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ser Ser 100 105 110 Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Glu Thr Asn 115 120 125 Lys Ala Thr Leu Val Cys Thr Ile Thr Asp Phe Tyr Pro Gly Val Val 130 135 140 Thr Val Asp Trp Lys Val Asp Gly Thr Pro Val Thr Gln Gly Met Glu 145 150 155 160 Thr Glu Thr Thr Gln Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Met Glu 165 170 175 Thr Ala Ser Ser Tyr Leu Thr Leu Thr Ala Arg Ala Trp Glu Arg His 180 185 190 Ser Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly His Thr Val Glu Lys 195 200 205 Ser Leu Ser Arg Ala Asp Cys Ser 210 215 <210> 225 <211> 450 <212> PRT <213> Lama glama <400> 225 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ile Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr Ser Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Val Tyr Gly Ser Thr Trp Asp Val Gly Pro Met Gly Tyr Gly 100 105 110 Met Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Lys 115 120 125 Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln 130 135 140 Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro 145 150 155 160 Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val 165 170 175 His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser 180 185 190 Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Pro Arg Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys 195 200 205 Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val 210 215 220 Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val 225 230 235 240 Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile 245 250 255 Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp 260 265 270 Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His 275 280 285 Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg 290 295 300 Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp 370 375 380 Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile 385 390 395 400 Met Asn Thr Asn Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln 405 410 415 Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His 420 425 430 Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 226 <211> 217 <212> PRT <213> Lama glama <400> 226 Ser Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ser Ala Leu Ser Val Ser Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gln Gly Gly Ser Leu Gly Ser Ser Tyr Ala 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Gly Asp Asp Ser Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Gly Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Asp Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Thr Asp Ser Ser Gly Asn Thr 85 90 95 Val Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ser 100 105 110 Ser Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Glu Thr 115 120 125 Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Thr Ile Thr Asp Phe Tyr Pro Gly Val 130 135 140 Val Thr Val Asp Trp Lys Val Asp Gly Thr Pro Val Thr Gln Gly Met 145 150 155 160 Glu Thr Glu Thr Thr Gln Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Met 165 170 175 Glu Thr Ala Ser Ser Tyr Leu Thr Leu Thr Ala Arg Ala Trp Glu Arg 180 185 190 His Ser Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly His Thr Val Glu 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Arg Ala Asp Cys Ser 210 215 <210> 227 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 227 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 1 5 10 <210> 228 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 228 Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 <210> 229 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 229 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 1 5 <210> 230 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 230 Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr 1 5 10 <210> 231 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 231 Cys Pro Arg Cys Pro 1 5 <210> 232 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 232 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 1 5 <210> 233 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 233 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro 1 5 <210> 234 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 234 Cys Pro Ser Cys Pro 1 5 <210> 235 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 235 Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro 1 5 <210> 236 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 236 Glu Arg Lys 1 <210> 237 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 237 Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 238 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 238 Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro 1 5 <210> 239 <211> 100 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 239 Arg Phe Cys Ser Ile Asn Ser Gly Leu His Ser Tyr Met Glu Met Pro 1 5 10 15 Leu Glu Cys Ile Leu Thr Glu Lys Arg Lys Lys Arg Ser Thr Lys Lys 20 25 30 Glu Val Phe Asn Ile Leu Gln Ala Ala Tyr Val Ser Lys Pro Gly Ala 35 40 45 Gln Leu Ala Arg Gln Ile Gly Ala Ser Leu Asn Asp Asp Ile Leu Phe 50 55 60 Gly Val Phe Ala Gln Ser Lys Pro Asp Ser Ala Glu Pro Met Asp Arg 65 70 75 80 Ser Ala Met Cys Ala Phe Pro Ile Lys Tyr Val Asn Asp Phe Phe Asn 85 90 95 Lys Ile Val Asn 100 <210> 240 <211> 100 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 240 Arg Phe Cys Ser Val Asp Ser Gly Leu His Ser Tyr Met Glu Met Pro 1 5 10 15 Leu Glu Cys Ile Leu Thr Glu Lys Arg Arg Lys Arg Ser Thr Arg Glu 20 25 30 Glu Val Phe Asn Ile Leu Gln Ala Ala Tyr Val Ser Lys Pro Gly Ala 35 40 45 Asn Leu Ala Lys Gln Ile Gly Ala Ser Pro Ser Asp Asp Ile Leu Phe 50 55 60 Gly Val Phe Ala Gln Ser Lys Pro Asp Ser Ala Glu Pro Val Asn Arg 65 70 75 80 Ser Ala Val Cys Ala Phe Pro Ile Lys Tyr Val Asn Asp Phe Phe Asn 85 90 95 Lys Ile Val Asn 100 <210> 241 <211> 100 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 241 Arg Phe Cys Ser Val Asp Ser Gly Leu His Ser Tyr Met Glu Met Pro 1 5 10 15 Leu Glu Cys Ile Leu Thr Glu Lys Arg Arg Lys Arg Ser Thr Arg Glu 20 25 30 Glu Val Phe Asn Ile Leu Gln Ala Ala Tyr Val Ser Lys Pro Gly Ala 35 40 45 Asn Leu Ala Lys Gln Ile Gly Ala Ser Pro Tyr Asp Asp Ile Leu Tyr 50 55 60 Gly Val Phe Ala Gln Ser Lys Pro Asp Ser Ala Glu Pro Met Asn Arg 65 70 75 80 Ser Ala Val Cys Ala Phe Pro Ile Lys Tyr Val Asn Asp Phe Phe Asn 85 90 95 Lys Ile Val Asn 100 <210> 242 <211> 100 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 242 Arg Phe Cys Ser Leu Asn Ser Gly Leu His Ser Tyr Met Glu Met Pro 1 5 10 15 Leu Glu Cys Ile Leu Thr Glu Lys Arg Lys Lys Arg Ser Thr Lys Lys 20 25 30 Glu Val Phe Asn Ile Leu Gln Ala Ala Tyr Val Ser Lys Pro Gly Ala 35 40 45 Gln Leu Ala Arg Gln Ile Gly Ala Ser Leu Asn Asp Asp Ile Leu Phe 50 55 60 Gly Val Phe Ala Gln Ser Lys Pro Asp Ser Ala Glu Pro Met Asp Arg 65 70 75 80 Ser Ala Met Cys Ala Phe Pro Ile Lys Tyr Val Asn Asp Phe Phe Asn 85 90 95 Lys Ile Val Asn 100 <210> 243 <211> 100 <212> PRT <213> Lama glama <400> 243 Arg Phe Cys Ser Val Asp Ser Gly Leu His Ser Tyr Met Glu Met Pro 1 5 10 15 Leu Glu Cys Ile Leu Thr Glu Lys Arg Arg Arg Arg Ser Thr Lys Glu 20 25 30 Glu Val Phe Asn Ile Leu Gln Ala Ala Tyr Val Ser Lys Pro Gly Ser 35 40 45 Gln Leu Ala Lys Gln Ile Gly Ala Asn Leu Asn Asp Asp Ile Leu Tyr 50 55 60 Gly Val Phe Ala Gln Ser Lys Pro Asp Ser Ala Glu Pro Met Asn Arg 65 70 75 80 Ser Ala Val Cys Ala Phe Pro Val Lys Tyr Val Asn Glu Phe Phe Asn 85 90 95 Lys Ile Val Asn 100 <210> 244 <211> 50 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 244 Leu Ser Ala Pro Pro Phe Val Gln Cys Gly Trp Cys His Asp Lys Cys 1 5 10 15 Val Arg Ser Glu Glu Cys Leu Ser Gly Thr Trp Thr Gln Gln Ile Cys 20 25 30 Leu Pro Ala Ile Tyr Lys Val Phe Pro Asn Ser Ala Pro Leu Glu Gly 35 40 45 Gly Thr 50 <210> 245 <211> 50 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 245 Leu Ser Ala Pro Tyr Phe Ile Gln Cys Gly Trp Cys His Asn Gln Cys 1 5 10 15 Val Arg Phe Asp Glu Cys Pro Ser Gly Thr Trp Thr Gln Glu Ile Cys 20 25 30 Leu Pro Ala Val Tyr Lys Val Phe Pro Thr Ser Ala Pro Leu Glu Gly 35 40 45 Gly Thr 50 <210> 246 <211> 50 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 246 Leu Ser Ala Pro Tyr Phe Ile Gln Cys Gly Trp Cys His Asn Arg Cys 1 5 10 15 Val His Ser Asn Glu Cys Pro Ser Gly Thr Trp Thr Gln Glu Ile Cys 20 25 30 Leu Pro Ala Val Tyr Lys Val Phe Pro Thr Ser Ala Pro Leu Glu Gly 35 40 45 Gly Thr 50 <210> 247 <211> 50 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 247 Leu Ser Ala Pro Pro Phe Val Gln Cys Gly Trp Cys His Asp Lys Cys 1 5 10 15 Val Arg Ser Glu Glu Cys Pro Ser Gly Thr Trp Thr Gln Gln Ile Cys 20 25 30 Leu Pro Ala Ile Tyr Lys Val Phe Pro Thr Ser Ala Pro Leu Glu Gly 35 40 45 Gly Thr 50 <210> 248 <211> 50 <212> PRT <213> Lama glama <400> 248 Leu Ser Ala Pro Ser Phe Val Gln Cys Gly Trp Cys His Asp Lys Cys 1 5 10 15 Val Gln Leu Glu Glu Cys Ser Gly Gly Ile Trp Thr Gln Glu Ile Cys 20 25 30 Leu Pro Thr Ile Tyr Lys Val Leu Pro Thr Ser Ala Pro Leu Glu Gly 35 40 45 Gly Thr 50

Claims (60)

  1. H-CDR1, H-CDR2 및 H-CDR3를 포함하는 중쇄 가변성 도메인, 및
    L-CDR1, L-CDR2 및 L-CDR3를 포함하는 경쇄 가변성 도메인을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
    상기 H-CDR1이 서열번호 30으로 나타낸 아미노산 서열을 포함하고;
    상기 H-CDR2가 서열번호 32로 나타낸 아미노산 서열을 포함하고;
    상기 H-CDR3가 서열번호 34로 나타낸 아미노산 서열을 포함하고;
    상기 L-CDR1이 서열번호 107로 나타낸 아미노산 서열을 포함하고;
    상기 L-CDR2가 서열번호 109로 나타낸 아미노산 서열을 포함하고; 및
    상기 L-CDR3가 서열번호 111로 나타낸 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 중쇄 가변성 도메인이 서열번호 163의 아미노산 서열 또는 서열번호 163과 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 동일한 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변성 도메인이 서열번호 164의 아미노산 서열 또는 서열번호 164와 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 동일한 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제1항에 있어서,
    전장 단일클론 항체 또는 F(ab')2 단편인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제1항에 있어서,
    IgG 클래스의 면역글로불린인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 하기 조건 중 한가지 이상을 충족시키는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    - 인간 IgG의 힌지부, CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함함;
    - 인간 IgG1의 힌지부, CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함함;
    - 인간 IgG와 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 동일한 서열을 가짐;
    - 인간 IgG1과 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 동일한 서열을 가짐;
    - 인간 IgG와 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 동일한 서열을 가지며, CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 CH2 도메인 및 CH 도메인이 하나 이상의 항체 작동자 기능을 감소시키거나 또는 실질적으로 없애도록 변형됨;
    - 인간 IgG1과 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 동일한 서열을 가지며, CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 CH2 도메인 및 CH 도메인이 하나 이상의 항체 작동자 기능을 감소시키거나 또는 실질적으로 없애도록 변형됨;
  6. 제1항에 있어서,
    완전히 인간 기원의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 상에 그래프팅된, 서열번호 30의 H-CDR1, 서열번호 32의 H-CDR2, 서열번호 34의 H-CDR3, 서열번호 107의 L-CDR1, 서열번호 109의 L-CDR2, 및 서열번호 111의 L-CDR3 을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제1항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  8. 발현 벡터로서,
    숙주 세포 또는 무세포 발현 시스템 (cell-free expression system)에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 발현을 허용하는 조절 서열과 작동가능하게 연결된 제7항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 발현 벡터.
  9. 제8항에 따른 발현 벡터를 포함하는 단리된 숙주 세포 또는 무세포 발현 시스템.
  10. 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조 방법으로서,
    제9항에 따른 단리된 숙주 세포 또는 무세포 발현 시스템을 항체 또는 항원 결합 단편의 발현을 허용하는 조건 하에 배양하는 단계; 및 발현된 항체 또는 항원 결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는, 방법.
  11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 테라피(therapy)에 사용하기 위한 것이며, 상기 테라피가
    - 인간 환자에서 간 손상, 급성 간 손상 또는 만성 간 손상의 치료 또는 예방을 위한 것이거나;
    - 인간 환자에서 신장 손상 또는 급성 신장 손상의 치료 또는 예방을 위한 것이거나;
    - 인간 환자에서 염증성 장 질환 또는 궤양성 결장염의 치료 또는 예방을 위한 것이거나;
    - 인간 환자에서 당뇨병, 1형 당뇨병 또는 2형 당뇨병의 치료 또는 예방을 위한 것이거나;
    - 인간 환자에서 비-알코올성 지방간염의 치료 또는 예방을 위한 것이거나; 또는
    - 인간 환자 또는 당뇨병 환자에서 상처의 치료 또는 상처 치유의 촉진을 위한 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  12. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 및 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는, 테라피(therapy)에 사용하기 위한 약학적 조성물로서,
    상기 테라피가
    - 인간 환자에서 간 손상, 급성 간 손상 또는 만성 간 손상의 치료 또는 예방을 위한 것이거나;
    - 인간 환자에서 신장 손상 또는 급성 신장 손상의 치료 또는 예방을 위한 것이거나;
    - 인간 환자에서 염증성 장 질환 또는 궤양성 결장염의 치료 또는 예방을 위한 것이거나;
    - 인간 환자에서 당뇨병, 1형 당뇨병 또는 2형 당뇨병의 치료 또는 예방을 위한 것이거나;
    - 인간 환자에서 비-알코올성 지방간염의 치료 또는 예방을 위한 것이거나; 또는
    - 인간 환자 또는 당뇨병 환자에서 상처의 치료 또는 상처 치유의 촉진을 위한 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 약학적 조성물.
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