KR102361993B1 - 핵산 복합체 페어를 포함하는 pcr용 키트 및 이의 용도 - Google Patents

핵산 복합체 페어를 포함하는 pcr용 키트 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 샘플 내 타겟 핵산을 검출하기 위한 핵산 복합체 페어에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 샘플 내에 타겟 핵산 서열이 포함되었는지 여부를 확인하기 위해 이용되는 핵산 복합체 페어에 있어서, 상기 핵산 복합체 페어는, 제1 결정부, 제1 페어링부 및 제1 검출부를 포함하는 제1 핵산 복합체; 및 제2 결정부, 제2 페어링부 및 제2 검출부를 포함하는 제2 핵산 복합체;를 포함하고, 상기 제1 결정부는 제1 타겟핵산서열과 상보적으로 결합하는 적어도 일부 영역을 포함하고, 상기 제2 결정부는 제2 타겟핵산서열과 상보적으로 결합하는 적어도 일부 영역을 포함하고, 상기 제1 페어링부 및 상기 제2 페어링부는 서로 상보적으로 결합하는 영역을 포함하고, 상기 제1 검출부 또는 상기 제2 검출부는 신호를 발생시키는 신호 물질을 포함하는, 핵산 복합체 페어에 관한 것이다.

Description

핵산 복합체 페어를 포함하는 PCR용 키트 및 이의 용도 {PCR Kit Comprising Nucleic Acid Complex Pair and Uses thereof}
본 발명은 핵산 복합체 페어를 포함하는 PCR용 키트 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 서로 상보적으로 결합하여 프라이머와 프로브의 기능을 동시에 수행할 수 있는 핵산 복합체 페어(pair)를 포함하는 PCR용 키트 및 이의 용도에 관한 것이다.
분자 진단은 유전자를 분석하여 질병을 진단하는 분야로, 현재 체외진단 분야 중 가장 높은 성장세를 보이고 있는 실정이다. 실제로, 급속한 환경 오염과 기후변화에 인한 것으로 추정되는 신종 바이러스가 크게 확산되면서, 체외진단 분야 중 가장 높은 진단의 정확도가 확보되고, 신종 바이러스가 출현하는 경우 신속하게 감염 여부를 확인할 수 있다는 이점이 있는 분자 진단에 대한 많은 연구가 계속되고 있다.
분자 진단 분야에서는 DNA 시퀀싱 및 핵산서열증폭반응(polymerase chain reaction, 이하, PCR)이 주로 이용되고 있다. 아직까지 DNA시퀀싱을 수행하기 위한 장비의 비용이 상당하고, PCR검사에 비해 신속하게 타겟을 검출할 수 있는 것도 아니어서, 대다수의 중소병원, 대형병원 및 건강검진센터에서는 현재 환자의 혈액등과 같은 샘플에 대한 PCR 검사법을 진행하여, 환자의 질병을 진단하고 있는 실정이다.
종래의 PCR 진단 방법에 따르면, 하나의 PCR 튜브에서 1종의 타겟을 검출하거나, 프로브를 이용하여 복수개의 형광 채널이 각각 다른 타겟의 유무에 따라 발광되도록 설계하고, 이러한 프로브를 이용하여 하나의 PCR튜브에서 형광 채널의 개수에 대응되는 종류만큼의 타겟 검출을 동시에 진행할 수 있었다.
다만, 하나의 PCR 튜브에서 1종의 타겟을 검출하는 PCR 방법은, 시약의 낭비가 심하고, 소요되는 시간 및 수반되는 인건비가 상당한 문제가 있었다. 또한, 복수개의 형광 채널이 각각 다른 타겟의 유무에 따라 발광되도록 설계된 프로브를 이용하는 PCR 방법은, 프로브의 설계가 까다롭고, 반응성이 떨어지는 문제가 있었다(SA Bustin, J. Mol. Endoorinol, Vol. 29, pp. 23-39, 2002).
이에 따라, 하나의 PCR 튜브에서 복수 종류의 타겟을 한번에 검출할 수 있는 수단이 요구되고 있는 실정이다.
이에 본 발명자들은 프라이머와 프로브의 기능을 동시에 수행할 수 있는 핵산 복합체를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 프라이머로 작동하는 핵산 구조체페어(pair)에 서로 상보적으로 결합할 수 있으나, 증폭에는 영향을 미치지 않는 핵산 구조체를 결합하여 핵산 복합체 페어를 제작할 경우, 상기 핵산 복합체 페어는 프라이머로서 타겟 핵산을 증폭할 수 있을 뿐만 아니라, 프로브로서 타겟 핵산의 존재 유무를 검출할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 목적은 하나의 형광 채널당 복수 종류의 타겟 검출이 가능한 핵산 복합체 페어를 포함하는 PCR용 키트를 제공하는 것이다.
본 출원이 해결하고자 하는 과제가 상술한 과제로 제한되는 것은 아니며, 언급되지 아니한 과제들은 본 명세서 및 첨부된 도면으로부터 본 출원이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 포워드 프라이머를 포함하는 제1 핵산 복합체 및 리버스 프라이머를 포함하는 제2 핵산 복합체로 구성되는 핵산 복합체 페어; 및 상기 포워드 프라이머 또는 상기 리버스 프라이머가 결합하는 제1 타겟핵산서열과는 다른 제2 타겟핵산서열에 상보적으로 결합하는 프로브 복합체;
를 포함하는, PCR 용 키트에 있어서,
상기 제1 핵산 복합체는 상기 포워드 프라이머와는 다른 제1 페어링부를 포함하고, 상기 제2 핵산 복합체는 상기 리버스 프라이머와는 다른 제2 페어링부를 포함하고, 상기 제1 페어링부 및 상기 제2 페어링부는 서로 상보적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 PCR 용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 PCR 키트는 태그(tag)의 해리 온도를 상이하게 설계한 복수 종류의 핵산 복합체 페어를 포함하여, 하나의 형광 채널당 복수 종류의 타겟 검출을 수행하는데 이용될 수 있다.
본 출원의 효과가 상술한 효과들로 제한되는 것은 아니며, 언급되지 아니한 효과들은 본 명세서 및 첨부된 도면으로부터 본 출원이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 본 출원의 일 실시예에 따른 핵산 복합체(100)를 설명하기 위한 도면이다.
도 2는 본 출원의 일 실시예에 따르는 핵산 복합체 페어를 설명하기 위한 도면이다.
도 3은 본 출원의 일 실시예에 따른 제1 핵산 복합체(110) 및/또는 제2 핵산 복합체(120)의 타겟 물질(TM)과의 결합을 설명하기 위한 도면이다.
도 4는 본 출원의 일 실시예에 따른 제1 핵산 복합체(110)와 제2 핵산 복합체(120)가 결합되는 방향을 설명하기 위한 도면이다.
도 5는 본 출원의 일 실시예에 따른 제1 검출부(113)와 제2 검출부(123) 사이의 상호 작용을 설명하기 위한 도면이다.
도 6은 본 출원의 일 실시예에 따라 샘플내의 타겟핵산서열의 유무를 확인하는 순서를 설명하기 위한 도면이다.
도 7및 도 8은 본 출원의 일 실시예에 따른 핵산 서열 증폭 반응 단계에서의 핵산 복합체 페어의 결합 관계의 변화를 설명하기 위한 도면이다.
도 9는 본 출원의 일 실시예에 따른 핵산 복합체 페어를 포함하는 핵산 구조체의 형상을 설명하기 위한 도면이다.
도 10은 본 출원의 일 실시예에 따른 융해 곡선 검출 단계에서 획득되는 그래프를 설명하기 위한 도면이다.
도 11은 본 출원의 일 실시예에 따른 해리피크값을 확인 하는 단계에서 확인되는 해리피크값을 설명하기 위한 도면이다.
도 12는 본 출원의 일 실시예에 따른 하나의 형광 채널에 대한 미분 융해 곡선 그래프를 설명하기 위한 도면이다.
도 13은 본 출원의 일 실시예에 따른 핵산 복합체 페어를 디지털 PCR에서 이용하는 경우 수행되는 단계에 대해서 설명하기 위한 도면이다.
도 14는 본 출원의 일 실시예에 따른 디지털 PCR에서의 단위셀(UC)을 설명하기 위한 도면이다.
도15는 본 출원의 일 실시예에 따른 단위셀(UC)에의 분배 단계 이전에 제1 페어링부(112) 및 제2 페어링부(122)의 상보적 결합의 형성을 설명하기 위한 도면이다.
도 16은 본 출원의 일 실시예에 따른 디지털 PCR에서의 융해곡선검출단계를 수행하는 방법을 설명하기 위한 도면이다.
도 17은 본 출원의 일 실시예에 따른 타겟 물질(TM)에의 잉여 영역을 설명하기 위한 도면이다.
도 18은 제1 표지법 및 제2 표지법에 관련된 해리피크값을 설명하기 위한 도면이다.
도 19는 본 출원의 일 실시예에 따른 핵산 복합체 페어 및/또는 프로브 복합체(200)와 타겟 물질(TM)의 결합을 설명하기 위한 도면이다.
도 20은 본 출원의 제1 실시예에 따른 프로브 복합체(210)를 설명하기 위한 도면이다.
도 21 및 도 22는 본 출원의 일 실시예에 따른 프로브 복합체(210) 및 핵산 복합체 페어를 포함하는 혼합 용액의 핵산서열증폭반응을 설명하기 위한 도면이다.
도 23은 본 출원의 일 실시예에 따른 프로브 복합체(210) 및 핵산 복합체 페어를 포함하는 혼합 용액의 해리피크값을 확인 하는 단계에서 확인되는 해리피크값을 설명하기 위한 도면이다.
도24는 본 출원의 제2 실시예에 따른 프로브 복합체(220)를 설명하기 위한 도면이다.
도 25 및 도 26은 본 출원의 일 실시예에 따른 프로브 복합체(220) 및 핵산 복합체 페어를 포함하는 혼합 용액의 핵산서열증폭반응을 설명하기 위한 도면이다.
도 27은 본 출원의 일 실시예에 따른 프로브 복합체(220) 및 핵산 복합체 페어를 포함하는 혼합 용액의 해리피크값을 확인 하는 단계에서 확인되는 해리피크값을 설명하기 위한 도면이다.
도 28은 본 출원의 일 실시예에 따른 통상적인 프로브/프라이머 기반 타겟 검출 방법을 실시하기 위한 PCR 및 융해 온도 분석 방법을 위한 온도 변화 조건 및 PCR 조건을 개시한 도면이다.
도 29는 본 출원의 일 실시예에 따른 한 샘플에서 3종류의 타겟을 검출한 해리피크 값을 측정한 결과이다.
도 30은 본 출원의 일 실시예에 따른 핵산 복합체를 이용한 타겟 검출 방법을 실시하기 위한 PCR 및 융해 온도 분석 방법을 위한 온도 변화 조건 및 PCR 조건을 개시한 도면이다.
도 31은 본 출원의 일 실시예에 따른 한 샘플에서 다양한 샘플 검출을 위한 해리피크값을 측정한 결과이다.
본 명세서에 기재된 실시예는 본 출원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 출원의 사상을 명확히 설명하기 위한 것이므로, 본 출원이 본 명세서에 기재된 실시예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 출원의 범위는 본 출원의 사상을 벗어나지 아니하는 수정예 또는 변형예를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 본 출원에서의 기능을 고려하여 가능한 현재 널리 사용되고 있는 일반적인 용어를 선택하였으나 이는 본 출원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자의 의도, 관례 또는 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 다만, 이와 달리 특정한 용어를 임의의 의미로 정의하여 사용하는 경우에는 그 용어의 의미에 관하여 별도로 기재할 것이다. 따라서 본 명세서에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌 그 용어가 가진 실질적인 의미와 본 명세서의 전반에 걸친 내용을 토대로 해석되어야 한다.
본 명세서에 첨부된 도면은 본 출원을 용이하게 설명하기 위한 것으로 도면에 도시된 형상은 본 출원의 이해를 돕기 위하여 필요에 따라 과장되어 표시된 것일 수 있으므로 본 출원이 도면에 의해 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 본 출원에 관련된 공지의 구성 또는 기능에 대한 구체적인 설명이 본 출원의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에 이에 관한 자세한 설명은 필요에 따라 생략하기로 한다.
본 출원의 일 실시예에 따르면, 샘플내에 타겟핵산서열이 포함되었는지 여부를 확인하기 위해 이용되는 핵산 복합체 페어에 있어서, 상기 핵산 복합체 페어는, 제1 결정부, 제1 페어링부 및 제1 검출부를 포함하는 제1 핵산 복합체; 및 제2 결정부, 제2 페어링부 및 제2 검출부를 포함하는 제2 핵산 복합체;를 포함하고, 상기 제1 결정부는 제1 타겟핵산서열과 상보적으로 결합하는 적어도 일부 영역을 포함하고, 상기 제2 결정부는 제2 타겟핵산서열과 상보적으로 결합하는 적어도 일부 영역을 포함하고, 상기 제1 페어링부 및 상기 제2 페어링부는 서로 상보적으로 결합하는 영역을 포함하고, 상기 제1 검출부 또는 상기 제2 검출부는 신호를 발생시키는 신호 물질을 포함하는, 핵산 복합체 페어가 제공될 수 있다.
상기 제1 타겟핵산서열을 포함하는 제1 타겟 물질과 상기 제2 타겟핵산서열을 포함하는 제2 타겟 물질은 서로 상보적으로 결합하여 더블스트랜드(double-strand)를 형성하는 핵산 복합체 페어가 제공될 수 있다.
상기 제1 결정부는 상기 제1 타겟 물질에 대한 포워드 프라이머를 포함하고, 상기 제2 결정부는 상기 제2 타겟 물질에 대한 리버스 프라이머를 포함하는, 핵산 복합체 페어가 제공될 수 있다.
상기 포워드 프라이머 및 상기 리버스 프라이머는, DNA(deoxyribonucleic acid), LNA(Locked nucleic acid), PNA(Peptide nucleic acid), HNA(Hexose nucleic acid), RNA(Ribonucleic acid), 다양한 핵산(nucleic acid)의 유사체들 또는 이들의 조합으로 이루어진, 핵산 복합체 페어가 제공될 수 있다.
상기 제1 타겟핵산서열을 포함하는 제1 타겟 물질과 상기 제2 타겟핵산서열을 포함하는 제2 타겟 물질은 동일 물질인, 핵산 복합체 페어가 제공될 수 있다.
상기 제1 결정부가 상기 신호 물질을 포함하는 경우, 상기 제2 결정부는 상기 제1 결정부로부터 발생되는 신호를 변경하는데 관여하는 ??칭 물질을 포함하는, 핵산 복합체 페어가 제공될 수 있다.
상기 제1 페어링부와 상기 제2 페어링부의 결합 여부에 기초하여, 상기 제1 결정부 및 상기 제2 결정부로부터 출력되는 신호의 성질이 변경되는, 핵산 복합체 페어가 제공될 수 있다.
상기 제1 핵산 복합체는 상기 제1 페어링부에 대한 증폭산물의 생성을 방지하기 위한 제1 블록킹부를 포함하고, 상기 제2 핵산 복합체는 상기 제2 페어링부에 대한 증폭산물의 생성을 방지하기 위한 제2 블록킹부를 포함하는, 핵산 복합체 페어가 제공될 수 있다.
상기 제1 블록킹부는, 상기 제1 결정부와 상기 제1 검출부의 사이에 배치되고, 상기 제2 블록킹부는, 상기 제2 결정부와 상기 제2 검출부의 사이에 배치되는, 핵산 복합체 페어가 제공될 수 있다.
상기 핵산 복합체 페어는, 상기 제1 타겟핵산서열 및 상기 제2타겟핵산서열을 증폭시키기 위한 핵산증폭반응을 수행하는데 이용되는, 핵산 복합체 페어가 제공될 수 있다.
상기 핵산 복합체 페어는, 상기 제1 페어링부 및 상기 제2 페어링부가 상보적으로 결합되어 있는, 핵산 복합체 페어가 제공될 수 있다.
제1 항의 핵산 복합체 페어 및 핵산서열증폭반응에 관여하는 효소를 포함하는 PCR용 키트가 제공될 수 있다.
본 출원의 일 실시예에 따르면, 샘플내의 타겟핵산서열의 존재 또는 부존재를 검출하기 위한 방법에 있어서, a. 타겟핵산서열을 포함하는 것으로 의심되는 샘플 및 적어도 하나의 종류의 핵산 복합체 페어를 포함하는 혼합 용액이 제공되는 단계 - 상기 핵산 복합체 페어는 제1 핵산 복합체 및 제2 핵산 복합체를 포함하고, 상기 제1 핵산 복합체는 증폭이 개시되는 제1 타겟핵산서열과 결합하는 제1 결정부를 포함하고, 상기 제2 핵산 복합체는 증폭이 개시되는 제2 타겟핵산서열과 결합하는 제2 결정부를 포함하고, 상기 제1 핵산 복합체의 제1 페어링부와 상기 제2 핵산 복합체의 제2 페어링부는 서로 상보적으로 결합하는 영역을 포함하며, 상기 제1 핵산 복합체의 제1 검출부 및 상기 제2 핵산 복합체의 제2 검출부로부터 검출되는 신호는, 상기 제1 페어링부와 상기 제2 페어링부 사이의 결합 여부에 기초하여 변경됨 -; b. 상기 혼합 용액의 온도를 조절하여, 적어도 상기 타겟핵산서열을 포함하는 타겟 물질의 일부를 증폭시키는 단계; c. 증폭된 타겟 물질의 일부를 포함하는 혼합 용액으로부터 광학적 성질에 기초한 신호를 검출하는 단계; 및 d. 상기 샘플에 상기 타겟핵산서열이 포함되어 있는지 여부를 확인하기 위해, 검출된 신호에 기초하여 상기 핵산 복합체 페어의 제1 페어링부 및 제2 페어링부의 해리 온도와 관련된 해리피크값을 확인하는 단계;를 포함하는, 샘플내의 타겟핵산서열의 존재 또는 부존재를 검출하기 위한 방법가 제공될 수 있다.
상기 제1 핵산 복합체는, 상기 제1 결정부 및 상기 제1 페어링부 사이에 위치하도록 배치되어, 상기 제1 페어링부에 대한 증폭산물의 생성을 방지하는 제1 블록킹부를 더 포함하고, 상기 제2 핵산 복합체는, 상기 제2 결정부 및 상기 제2 페어링부 사이에 위치하도록 배치되어, 상기 제2 페어링부에 대한 증폭산물의 생성을 방지하는 제2 블록킹부를 더 포함하는, 샘플 내의 타겟핵산서열의 존재 또는 부존재를 검출하기 위한 방법가 제공될 수 있다.
상기 증폭시키는 단계에 이어서, 상기 혼합 용액의 온도를 적어도 40도 이하로 낮춰 상기 혼합 용액에 포함된 적어도 하나의 제1 페어링부 및 제2 페어링부간의 결합을 유도하는 안정화 단계;를 더 포함하는, 샘플 내의 타겟핵산서열의 존재 또는 부존재를 검출하기 위한 방법가 제공될 수 있다.
상기 적어도 하나의 종류의 핵산 복합체 페어를 포함하는 혼합용액이 제공되는 단계는, 상기 신호를 검출하는 단계에서 동일 신호로 검출되는 동일신호검출물질을 포함하는 제1 핵산 복합체 페어 및 제2 핵산 복합체 페어가 제공되는 단계를 포함하는, 샘플 내의 타겟핵산서열의 존재 또는 부존재를 검출하기 위한 방법가 제공될 수 있다.
상기 해리피크값을 확인하는 단계는, 상기 제1 핵산 복합체 페어의 제1 페어링부 및 제2 페어링부와 관련된 제1 해리피크값 및 상기 제2 핵산 복합체 페어의 제1 페어링부 및 제2 페어링부와 관련된 제2 해리피크값을 확인하는 단계를 포함하고, 상기 제1 피크값은 상기 제2 피크값과 다른, 샘플내의 타겟핵산서열의 존재 또는 부존재를 검출하기 위한 방법가 제공될 수 있다.
상기 혼합용액이 제공되는 단계에서, 상기 핵산 복합체 페어의 상기 제1 페어링부 및 상기 제2 페어링부가 상보적으로 결합되어 있는, 샘플내의 타겟핵산서열의 존재 또는 부존재를 검출하기 위한 방법가 제공될 수 있다.
상기 타겟 물질의 일부를 증폭시키는 단계는, 상기 타겟 물질을 싱글 스트랜드(single strand)로 열변성 하는 단계, 상기 타겟핵산서열에 상기 결정부가 결합되는 단계, 및 상기 결정부를 개시점으로하여 상기 타겟 물질에 대한 증폭산물이 생성되는 단계를 포함하는, 샘플내의 타겟핵산서열의 존재 또는 부존재를 검출하기 위한 방법가 제공될 수 있다.
상기 타겟 물질의 일부를 증폭시키는 단계는, 상기 열변성 하는 단계, 상기 결합되는 단계, 상기 증폭산물이 생성되는 단계가 순차적으로 적어도 2회이상 수행되는, 샘플내의 타겟핵산서열의 존재 또는 부존재를 검출하기 위한 방법가 제공될 수 있다.
본 출원의 일 실시예에 따르면, 포워드 프라이머를 포함하는 제1 핵산 복합체 및 리버스 프라이머를 포함하는 제2 핵산 복합체로 구성되는 핵산 복합체 페어- 상기 제1 핵산 복합체는 상기 포워드 프라이머와는 다른 제1 페어링부를 포함하고, 상기 제2 핵산 복합체는 상기 리버스 프라이머와는 다른 제2 페어링부를 포함하고, 상기 제1 페어링부 및 상기 제2 페어링부는 서로 상보적으로 결합함 -; 및 상기 포워드 프라이머 또는 상기 리버스 프라이머가 결합하는 제1 타겟핵산서열과는 다른 제2 타겟핵산서열에 상보적으로 결합하는 프로브 복합체;를 포함하는, PCR 용 키트가 제공될 수 있다.
상기 제1 페어링부는 제1 검출부와 연결되어 있고, 상기 제2 페어링부는 제2 검출부와 연결되어 있고, 상기 제1 검출부 또는 상기 제2 검출부는 신호를 발생시키는 신호 물질을 포함하는, PCR 용 키트가 제공될 수 있다.
상기 제1 검출부 및 상기 제2 검출부로부터 검출되는 신호의 성질은 상기 제1 페어링부 및 상기 제2 페어링부 사이의 결합 여부에 기초하여 변경되는, PCR 용 키트가 제공될 수 있다.
상기 제1 핵산 복합체는 상기 제1 페어링부에 대한 증폭산물의 생성을 방지하기 위한 제1 블록커부를 포함하고, 상기 제2 핵산 복합체는 상기 제2 페어링부에 대한 증폭산물의 생성을 방지하기 위한 제2 블록커부를 포함하는, PCR 용 키트가 제공될 수 있다.
상기 제1 타겟핵산서열을 포함하는 타겟 물질은 상기 제2 타겟핵산서열을 포함하는 타겟 물질과 동일한 싱글 스트랜드인, PCR용 키트가 제공될 수 있다.
상기 PCR용 키트는 상기핵산서열증폭반응에 관여하는 효소를 더 포함하는, PCR용 키트가 제공될 수 있다.
상기 효소는 제2 타겟핵산서열과 관련된 올리고 뉴클레오타이드의 적어도 일부에 대한 증폭 산물의 생성에 관여하는 DNA 폴리머레이즈(Polymerase)이고, 상기 DNA 폴리머라제의 핵산말단가수분해효소활성이 결여되어 있는, PCR용 키트가 제공될 수 있다.
상기 프로브 복합체는, 상기 제2 타겟핵산서열에 결합되는 결정부, 및 상기 프로브 복합체가 단일 가닥의 헤어핀 구조를 형성하는데 관여하고, 제2 타겟핵산서열과는 결합하지 않는 페어부를 포함하는, PCR용 키트가 제공될 수 있다.
상기 결정부는, DNA(deoxyribonucleic acid), LNA(Locked nucleic acid), PNA(Peptide nucleic acid), HNA(Hexose nucleic acid), RNA(Ribonucleic acid) 또는, 다양한 핵산(nucleic acid)의 유사체들 또는 이들의 조합으로 이루어진 PCR용 키트가 제공될 수 있다.
*상기 제1 페어링부와 상기 제2 페어링부 사이의 결합력은, 상기 프로브 복합체 및 상기 제2 타겟핵산서열 사이의 결합력과 다른, PCR용 키트가 제공될 수 있다.
상기 프로브 복합체는, 상기 제2 타겟핵산서열과 결합하는 제1 프로브 및 상기 제1 프로브와 상기 제2 타겟핵산서열과 결합하지 않는 제2 프로브를 포함하는, PCR 용 키트가 제공될 수 있다.
상기 제1 프로브에 포함된 핵산 서열 중 적어도 일부는, 핵산서열증폭과정에서 상기 제1 프로브로부터 분리되어, 상기 제2 프로브의 적어도 일부에 결합되는, PCR 용 키트가 제공될 수 있다.
상기 제2 프로브와 상기 제1 프로브로부터 분리된 핵산 서열 사이의 결합력은, 상기 제1 페어링부 및 제2 페어링부 사이의 결합력과 다른, PCR용 키트가 제공될 수 있다.
상기 PCR용 키트에 포함된 상기 포워드 프라이머와 상기 리버스 프라이머의 비율은 1:1이 아닌, PCR용 키트가 제공될 수 있다.
<핵산 복합체(100)>
도 1은 본 출원의 일 실시예에 따른 핵산 복합체(100)를 설명하기 위한 도면이다.
본 출원의 일 실시예에 따른 핵산 복합체(100)는, 결정부(101), 페어링부(102), 검출부(103) 및/또는 블록킹부(104)를 포함할 수 있다. 일 예로, 핵산 복합체(100)는, 결정부(101), 페어링부(102), 검출부(103) 및 블록킹부(104)를 포함할 수 있다. 다른 예로, 핵산 복합체(100)는 결정부(101), 페어링부(102) 및 검출부(103)를 포함할 수 있다. 또 다른 예로, 핵산 복합체(100)는 결정부(101), 페어링부(102) 및 블록킹부(104)를 포함할 수 있다. 또 다른 예로, 핵산 복합체(100)는 결정부(101) 및 페어링부(102)를 포함할 수 있다.
본 출원의 일 실시예에 따른 핵산 복합체(100)는 전술한 구성요소의 조합에 한정되는 것이 아니고, 전술한 구성요소 중 적어도 하나의 구성요소가 생략되거나, 다른 구성요소가 추가적으로 더 포함될 수도 있다.
핵산 복합체(100)는 결정부(101)를 포함할 수 있다. 결정부(101)는 다른 핵산 서열과 상보적으로 결합하는 영역을 포함할 수 있다. 결정부(101)는 다른 핵산 서열과 특이적으로 결합하는 영역을 포함할 수 있다. 상기 결정부(101)가 다른 핵산 서열과 상보적으로 결합하는 영역을 포함하는 것의 의미는, 상기 결정부(101)의 일부 영역이 다른 핵산 서열과 전기적, 화학적, 또는 물리적 성질 중 적어도 하나의 성질이 대응되어, 다른 핵산 서열과 연관되는 것을 의미할 수 있다.
일 예로, 결정부(101)는 다른 핵산 서열과의 화학적 결합력이 발생할 수 있는 영역을 포함 할 수 있다. 다시 말해, 결정부(101)는 다른 핵산 서열과 공유 결합, 수소 결합, 이온 결합, 소수성 결합 중 적어도 하나의 결합을 수행할 수 있는 영역을 포함할 수 있다.
결정부(101)는 적어도 하나 이상의 핵산 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 결정부(101)는 5~50mer의 핵산 서열을 포함할 수 있다. 더 바람직 하게는, 결정부(101)는 10~25mer의 핵산 서열을 포함할 수 있다.
상기 적어도 하나 이상의 핵산 서열은 DNA(deoxyribonucleic acid), LNA(Locked nucleic acid), PNA(Peptide nucleic acid), HNA(Hexose nucleic acid), RNA(Ribonucleic acid) 또는, 다양한 핵산(nucleic acid)의 유사체들 또는 이들의 조합으로 이루어질 수 있다.
핵산 복합체(100)는 페어링부(102)를 포함할 수 있다. 페어링부(102)는 다른 핵산 서열과 상보적인 결합을 하는 영역을 포함할 수 있다. 페어링부(102)는 다른 핵산 서열과 특이적으로 결합하는 영역을 포함할 수 있다. 상기 페어링부(102)가 다른 핵산 서열과 상보적으로 결합하는 영역을 포함하는 것의 의미는, 상기 페어링부(102)의 일부 영역이 다른 핵산 서열과 전기적, 화학적, 또는 물리적 성질 적어도 하나의 성질이 대응되어, 다른 핵산 서열과 연관되는 것을 의미할 수 있다.
일 예로, 페어링부(102)는 다른 핵산 서열과의 화학적 결합력이 발생할 수 있는 영역을 포함 할 수 있다. 다시 말해, 페어링부(102)는 다른 핵산 서열과 공유 결합, 수소 결합, 이온 결합, 소수성 결합 중 적어도 하나의 결합을 수행할 수 있는 영역을 포함할 수 있다.
페어링부(102)는 다른 핵산 복합체(100)와 상보적인 결합을 하는 영역을 포함할 수 있다. 페어링부(102)는 다른 핵산 복합체(100)의 페어링부(102)와 상보적인 결합을 하는 영역을 포함할 수 있다. 일 예로, 페어링부(102)는 다른 핵산 복합체(100)의 페어링부(102)와 상보적인 염기 배열을 갖도록 구현되는 영역을 포함할 수 있다.
페어링부(102)는 적어도 하나 이상의 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일 예로바람직하게는, 페어링부(102)는 2~15mer의 핵산 서열을 포함할 수 있다. 다른 예로더 바람직 하게는, 페어링부(102)는 5~10mer의 핵산 서열을 포함할 수 있다.
상기 적어도 하나 이상의 핵산 서열은 DNA(deoxyribonucleic acid), LNA(Locked nucleic acid), PNA(Peptide nucleic acid), HNA(Hexose nucleic acid), RNA(Ribonucleic acid), 또는 다양한 핵산(nucleic acid)의 유사체들 또는 이들의 조합으로 이루어질 수 있다.
핵산 복합체(100)는 검출부(103)를 포함할 수 있다. 상기 검출부(103)는 에너지를 방출할 수 있는 영역을 포함할 수 있다.
검출부(103)는 에너지를 교환하는 영역을 포함할 수 있다. 또는, 검출부(103)는 에너지를 제공하는 영역을 포함할 수 있다. 또는, 검출부는 에너지를 제공받는 영역을 포함할 수 있다. 검출부(103)는
검출부(103)에서 방출되는 에너지는, 화학적 에너지, 전기적 에너지, 발광 에너지, 자계 에너지 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 일 예로, 검출부(103)는 형광 물질을 포함할 수 있다. 다른 예로, 검출부(103)는 전기음성도가 상대적으로 큰 영역을 포함할 수 있다. 또 다른 예로, 검출부(103)는 다른 영역과 수소 결합하는 영역을 포함할 수 있다.
핵산 복합체(100)는 블록킹부(104)를 포함할 수 있다. 블록킹부(104)는 블록킹부(104)와 연결된 어느 일 영역의 정보를 다른 물질이 획득할 수 없도록 차단할 수 있다.
본 출원의 일 실시예에 따른 핵산 복합체(100)가 핵산서열증폭반응(PCR)에서 이용되는 경우, 블록킹부(104)는 중합 효소가 블록킹부(104)와 연결된 적어도 일부의 핵산 서열을 획득할 수 없도록 할 수 있다. 블록킹부(104)는 중합 효소가 블록킹부(104)와 연결된 페어링부(102)의 적어도 일부의 핵산 서열을 획득할 수 없도록 할 수 있다. 블록킹부(104)는 중합 효소에 의해 블록킹부(104)와 연결된 페어링부(102)에 대한 증폭산물이 생성되는 것을 방지할 수 있다.
여기서, "증폭산물"이라 함은, 적어도 1주기의 핵산 서열 증폭 반응의 결과로 생성된 물질일 수 있다. 여기서, "증폭산물"이라 함은, 핵산 서열 증폭 반응을 수행함에 따라 단위 염기 조각이 공유결합을 통해 연장되어 생성된 물질일 수 있다.
여기서, "페어링부(102)에 대한 증폭산물"이라 함은, 페어링부(102)의 염기 서열에 상보적으로 대응되도록 단위 염기 조각이 공유결합을 통해 연장되어 생성된 물질을 의미할 수 있다.
블록킹부(104)는 핵산 가닥을 구성하는 당-인산 골격의 연결을 방해하는 인자를 포함할 수 있다. 일 예로, 블록킹부(104)는 염기를 제거한 당-인산 골격을 포함할 수 있다. 다른 예로, 블록킹부(104)는 염기를 변형시킨 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또 다른 예로, 블록킹부(104)는 PEG(polyethyleneglycol)를 포함할 수 있다.
본 출원의 일 실시예예 따른 핵산 복합체(100)의 결정부(101), 페어링부(102), 검출부(103) 및/또는 블록킹부(104)는 소정의 위치 관계를 가질 수 있다.
본 출원의 일 실시예에 따르면, 결정부(101)와 페어링부(102)는 연결되어 있을 수 있다. 결정부(101)와 페어링부(102)는 직접적으로 결합되어 있는 형태로 연결될 수 있다. 일 예로, 결정부(101)와 페어링부(102)는 화학적 결합력에 기초하여 연결될 수 있다. 결정부(101)와 페어링부(102)는 공유 결합, 수소 결합, 이온 결합, 소수성 결합 중 적어도 하나의 결합에 기초하여 연결될 수 있다. 또는, 결정부(101)와 페어링부(102)는 별도의 물질을 매개로하여 연결될 수 있다. 일 예로, 결정부(101)와 페어링부(102)의 연결을 매개하는 별도의 물질은, 화학적 링커(예를 들어, PCR blocker), 형광 물질, DNA 단편 등일 수 있다.
본 출원의 일 실시예에 따르면, 페어링부(102)와 검출부(103)는 연결되어 있을 수 있다. 검출부(103)는 페어링부(102)의 일단에 배치될 수 있다. 검출부(103)가 페어링부(102)의 일단에 배치되는 경우, 검출부(103)와 페어링부(102)는 화학적 결합력에 의해 연결될 수 있다. 또는, 검출부(103)는 페어링부(102)의 중간에 삽입되는 형태로 배치될 수 있다. 다시 말해, 검출부(103)는 페어링부(102)의 적어도 일 영역에 결합되는 형태로 연결될 수 있다. 또는, 검출부(103)는 페어링부(102)와 이격되어 배치될 수 있다. 예를 들어, 검출부(103)는 페어링부(102)와 연결된 블록킹부(104)에 결합된 형태로 연결될 수 있다.
본 출원의 일 실시예에 따르면, 결정부(101)와 검출부(103)는 연결되어 있을 수 있다. 검출부(103)는 결정부(101)의 일단에 배치될 수 있다. 검출부(103)가 결정부(101)의 일단에 배치되는 경우, 검출부(103)와 결정부(101)는 화학적 결합력에 의해 연결될 수 있다. 또는, 검출부(103)는 결정부(101)의 중간에 삽입되는 형태로 배치될 수 있다. 다시 말해, 검출부(103)는 결정부(101)의 적어도 일 영역에 결합되는 형태로 연결될 수 있다. 또는, 검출부(103)는 결정부(101)와 이격되어 배치될 수 있다. 예를 들어, 검출부(103)는 결정부(101)와 연결된 블록킹부(104)에 결합된 형태로 연결될 수 있다.
본 출원의 일 실시예예 따르면, 블록킹부(104)는 결정부(101)와 페어링부(102) 사이에 배치될 수 있다. 결정부(101)는 페어링부(102)에 비해 블록킹부(104)와 상대적으로 더 인접하도록 배치될 수 있다. 페어링부(102)는 결정부(101)에 비해 블록킹부(104)와 상대적으로 더 인접하도록 배치될 수 있다.
본 출원의 일 실시예에 따르면, 검출부(103)가 결정부(101)와 페어링부(102)의 사이에 배치되는 경우, 블록킹부(104)는 검출부(103)와 연결되어 있을 수 있다. 다시 말해, 본 출원의 일 실시예에 따른 핵산 복합체(100)의 결정부(101), 검출부(103), 블록킹부(104) 및 페어링부(102) 순으로 연결되도록 구현되거나, 결정부(101), 블록킹부(104), 검출부(103) 및 페어링부(102) 순으로 연결되도록 구현될 수 있다.
지금까지, 본 출원의 일 실시예에 따르는 핵산 복합체(100)의 구성요소 및 구성요소간의 위치 관계에 대해서 자세하게 개시하였다. 이하에서는, 핵산이 활용되는 분야에서 이용될 수 있는 본 출원에 따르는 핵산 복합체 페어에 대해서 상세히 개시한다.
*
<핵산 복합체 페어>
본 출원의 일 실시예에 따르는 핵산 복합체 페어는, 제1 핵산 복합체(110) 및 제2 핵산 복합체(120)를 포함할 수 있다. 핵산 복합체 페어는, 제1 핵산 복합체(110) 및 제2 핵산 복합체(120)로 구성될 수 있다. 핵산 복합체 페어는, 제1 핵산 복합체(110) 및 제2 핵산 복합체(120)로 페어를 이루며 제공될 수 있다.
도 2는 본 출원의 일 실시예에 따르는 핵산 복합체 페어를 설명하기 위한 도면이다.
본 출원의 일 실시예에 따르는 핵산 복합체 페어는, 제1 핵산 복합체(110) 및 제2 핵산 복합체(120)를 포함할 수 있다.
제1 핵산 복합체(110)는 제1 결정부(111), 제1 페어링부(112), 제1 검출부(113) 및/또는 제1 블록킹부(114)를 포함할 수 있다. 일 예로, 제1 핵산 복합체(110)는, 제1 결정부(111), 제1 페어링부(112), 제1 검출부(113) 및 제1 블록킹부(114)를 포함할 수 있다. 다른 예로, 제1 핵산 복합체(110)는 제1 결정부(111), 제1 페어링부(112) 및 제1 검출부(113)를 포함할 수 있다. 또 다른 예로, 제1 핵산 복합체(110)는 제1 결정부(111), 제1 페어링부(112) 및 제1 블록킹부(114)를 포함할 수 있다. 또 다른 예로, 제1 핵산 복합체(110)는 제1 결정부(111) 및 제1 페어링부(112)를 포함할 수 있다.
제2 핵산 복합체(120)는 제2 결정부(121), 제2 페어링부(122), 제2 검출부(123) 및/또는 제2 블록킹부(124)를 포함할 수 있다. 일 예로, 제2 핵산 복합체(120)는, 제2 결정부(121), 제2 페어링부(122), 제2 검출부(123) 및 제2 블록킹부(124)를 포함할 수 있다. 다른 예로, 제2 핵산 복합체(120)는 제2 결정부(121), 제2 페어링부(122) 및 제2 검출부(123)를 포함할 수 있다. 또 다른 예로, 제2 핵산 복합체(120)는 제2 결정부(121), 제2 페어링부(122) 및 제2 블록킹부(124)를 포함할 수 있다. 또 다른 예로, 제2 핵산 복합체(120)는 제2 결정부(121) 및 제2 페어링부(122)를 포함할 수 있다.
본 출원의 일 실시예에 따른 핵산 복합체(100)는 전술한 구성요소의 조합에 한정되는 것이 아니고, 적어도 하나의 구성요소가 생략되거나, 다른 구성요소가 추가적으로 더 포함될 수도 있다.
본 출원의 일 실시예에 따르는 핵산 복합체 페어의 제1 핵산 복합체(110)와 제2 핵산 복합체(120)는 구성이 동일할 수 있다. 일 예로, 제1 핵산 복합체(110)는 제1 결정부(111), 제1 페어링부(112), 제1 검출부(113) 및 제1 블록킹부(114)를 포함하고, 제2 핵산 복합체(120)는 제2 결정부(121), 제2 페어링부(122), 제2 검출부(123) 및 제2 블록킹부(124)를 포함할 수 있다.
본 출원의 다른 실시예에 따르는 핵산 복합체 페어의 제1 핵산 복합체(110)와 제2 핵산 복합체(120)는 구성이 서로 상이할 수 있다. 일 예로, 제1 핵산 복합체(110)는 제1 결정부(111), 제1 페어링부(112), 제1 검출부(113)를 포함하고, 제2 핵산 복합체(120)는 제2 결정부(121), 제2 페어링부(122), 제2 블록킹부를 포함할 수 있다.
상기 제1 결정부(111)는, 제1 타겟핵산서열(TS1)에 상보적으로 결합할 수 있다. 상기 제1 결정부(111)는 상기 제1 타겟핵산서열(TS1)에 특이적으로 결합할 수 있다. 여기서, "제1 타겟핵산서열(TS1)"이라 함은, 상기 제1 결정부(111)와 상보적으로 결합할 수 있는 염기 배열을 갖는 특정 핵산 서열을 의미할 수 있다.
상기 제1 결정부(111)와 상기 제1 타겟핵산서열(TS1)간의 상보적 결합은, 전기적, 화학적 또는 물리적 성질 중 적어도 하나의 성질이 대응되어 연관되는 것을 의미할 수 있다. 일 예로, 상기 제1 결정부(111)는 화학적 결합력이 있는 일 영역을 포함하고, 상기 제1 결정부(111)는 상기 제1 타겟핵산서열(TS1)과 수소결합할 수 있다.
상기 제1 결정부(111)와 상기 제1 타겟핵산서열(TS1)간의 결합력은 단위핵산의 종류, 단위핵산의 염기의 종류, 상보적 결합에 관여하는 염기의 수 중 적어도 하나에 연관되어 결정될 수 있다. 일 예로, 상기 제1 타겟핵산서열(TS1)과 결합하는 제1 결정부(111)의 적어도 하나의 단위핵산이 PNA인 경우, 제1 타겟핵산서열(TS1)과 결합하는 제1 결정부(111)의 단위 핵산이 DNA인 경우에 비해 상대적으로 강한 결합력을 가진 상기 제1 결정부(111)와 상기 제1 타겟핵산서열(TS1)간의 결합이 구현될 수 있다. 다른 예로, 제1 타겟핵산서열(TS1)과 제1결정부(101) 사이의 결합력은 제1 타겟핵산서열(TS1)과 제1 결정부(111)의 상보적 결합에 관여하는 염기의 종류에 기초하여 결정될 수 있다. 제1 타겟핵산서열(TS1)과 제1결정부(101)의 상보적 결합에 관여하는 염기의 C(시토신)-G(구아닌)의 함량이 높을수록, 제1 타겟핵산서열(TS1)과 제1 결정부(111) 사이의 결합력이 증가될 수 있다.
상기 제1 결정부(111)는 제1 타겟핵산서열(TS1)을 포함하는 타겟 물질(TM)에 상보적으로 결합하는 기능을 수행할 수 있다. 상기 타겟 물질(TM)은 상기 타겟핵산서열을 포함하는 싱글 스트랜드(single strand)일 수 있고, 또는, 상기 타겟핵산서열을 포함하는 더블 스트랜드(double strand)일 수 있다. 상기 타겟 물질(TM)은 타겟핵산서열과 연결되어 있는 올리고 뉴클레오타이드, 형광물질, 단백질, 또는 세포 등일 수 있다.
상기 제2 결정부(121)는, 제2 타겟핵산서열(TS2)에 상보적으로 결합할 수 있다. 상기 제2 결정부(121)는 상기 제2 타겟핵산서열(TS2)에 특이적으로 결합할 수 있다. 여기서, "제2 타겟핵산서열(TS2)"이라 함은, 상기 제2 결정부(121)와 상보적으로 결합할 수 있는 염기 배열을 갖는 특정 핵산 서열을 의미할 수 있다.
상기 제2 결정부(121)와 상기 제2 타겟핵산서열(TS2)간의 상보적 결합은, 전기적, 화학적 또는 물리적 성질 중 적어도 하나의 성질이 대응되어 연관되는 것을 의미할 수 있다. 일 예로, 상기 제2 결정부(121)는 화학적 결합력이 있는 일 영역을 포함하고, 상기 제2 결정부(121)는 상기 제2 타겟핵산서열(TS2)과 수소결합할 수 있다.
상기 제2 결정부(121)와 상기 제2 타겟핵산서열(TS2)간의 결합력은 단위핵산의 종류, 단위핵산의 염기의 종류, 상보적 결합에 관여하는 염기의 수 중 적어도 하나에 연관되어 결정될 수 있다. 일 예로, 상기 제2 타겟핵산서열(TS2)과 결합하는 제2 결정부(121)의 적어도 하나의 단위핵산이 PNA인 경우, 제2 타겟핵산서열(TS2)과 결합하는 제2 결정부(121)의 단위 핵산이 DNA인 경우에 비해 상대적으로 강한 결합력을 가진 상기 제2 결정부(121)와 상기 제2 타겟핵산서열(TS2)간의 결합이 구현될 수 있다. 다른 예로, 제2 타겟핵산서열(TS2)과 제2결정부(101) 사이의 결합력은 제2 타겟핵산서열(TS2)과 제2 결정부(121)의 상보적 결합에 관여하는 염기의 종류에 기초하여 결정될 수 있다. 제2 타겟핵산서열(TS2)과 제2결정부(101)의 상보적 결합에 관여하는 염기의 C(시토신)-G(구아닌)의 함량이 높을수록, 제2 타겟핵산서열(TS2)과 제2 결정부(121) 사이의 결합력이 증가될 수 있다.
상기 제2 결정부(121)는 제2 타겟핵산서열(TS2)을 포함하는 타겟 물질(TM)에 상보적으로 결합하는 기능을 수행할 수 있다. 상기 타겟 물질(TM)은 상기 타겟핵산서열을 포함하는 싱글 스트랜드(single strand)일 수 있고, 또는, 상기 타겟핵산서열을 포함하는 더블 스트랜드(double strand)일 수 있다. 상기 타겟 물질(TM)은 타겟핵산서열과 연결되어 있는 올리고 뉴클레오타이드, 형광물질, 단백질, 또는 세포 등일 수 있다.
상기 제1 핵산 복합체(110)의 제1 결정부(111)와 결합하는 제1 타겟핵산서열(TS1)과 상기 제2 핵산 복합체(120)의 제2 결정부(121)와 결합하는 제2 타겟핵산서열(TS2)은 동일한 타겟 물질(TM)에 포함될 수 있다. 일 예로, 제1 결정부(111) 및 제2 결정부(121)는 상기 제1 타겟핵산서열(TS1)을 포함하는 싱글 스트랜드(single strand)의 타 영역에 제2타겟핵산서열이 포함되어 있는 타겟 물질(TM)에 결합될 수 있다(도 3(a) 참고). 또는, 상기 제1 타겟핵산서열(TS1)을 포함하는 싱글 스트랜드와 결합되어 있는 다른 싱글 스트랜드의 일 영역에 제2 타겟핵산서열(TS2)이 포함되어 있을 수 있다. 일 예로, 제1 결정부(111) 및 제2 결정부(121)는 상기 제1 타겟핵산서열(TS1)을 포함하는 싱글 스트랜드 및 제2 타겟핵산서열(TS2)을 포함하는 싱글 스트랜드가 이중가닥을 형성한 타겟 물질(TM)에 결합될 수 있다(도 3(b) 참고),
본 출원의 일 실시예에 따른 핵산 복합체 페어가 핵산서열증폭반응(PCR)에서 이용되는 경우, 상기 제1 핵산 복합체(110) 및 상기 제2 핵산 복합체(120)는 프라이머로써 이용될 수 있다. 상기 제1 결정부(111)는 포워드 프라이머 또는 리버스 프라이머로써 기능할 수 있다. 상기 제2 결정부(121)는 포워드 프라이머 또는 리버스 프라이머로써 기능할 수 있다. 일 예로, 제1 결정부(111)가 포워드 프라이머로써 기능하는 경우 상기 제2 결정부(121)는 리버스 프라이머로써 기능할 수 있다.
상기 제1 페어링부(112)는, 다른 페어링부(102)에 상보적으로 결합할 수 있다. 본 출원의 일 실시예에 따른 핵산 복합체 페어는, 상기 제1 페어링부(112)와 제2 페어링부(122)가 서로 상보적으로 결합하도록 구현될 수 있다. 제1 페어링부(112)는 제2 페어링부(122)와 상보적인 염기 배열을 포함할 수 있다. 제2 페어링부(122)는 제1 페어링부(112)와 상보적인 염기 배열을 포함할 수 있다.
본 출원의 일 실시예에 따르면, 제1 페어링부(112)와 제2 페어링부(122)의 염기 배열에 따라, 제1 페어링부(112) 및 제2 페어링부(122) 사이의 결합에 따른 핵산 복합체 페어의 형상이 변경될 수 있다. 본 출원의 일 실시예에 따르면, 제1 페어링부(112)와 제2 페어링부(122)의 결합 방향에 따라, 제1 페어링부(112) 및 제2 페어링부(122) 사이의 결합에 따른 핵산 복합체 페어의 구조체의 형상이 변경될 수 있다.
도 4는 본 출원의 일 실시예에 따른 제1 핵산 복합체(110)와 제2 핵산 복합체(120)가 결합되는 방향을 설명하기 위한 도면이다.
본 출원의 일 실시예에 따르면, 제1 페어링부(112)의 제1 결정부(111)에 인접한 영역이 제2 페어링부(122)의 제2 결정부(121)에 인접한 영역과 상보적으로 결합되도록 핵산 복합체 페어가 구현되는 경우, 제1 결정부(111)와 제2 결정부(121)가 제1 페어링부(112) 및 제2 페어링부(122)를 기준으로 동일한 측에 위치되는 핵산 복합체 페어의 구조체가 생성될 수 있다.
본 출원의 일 실시예에 따르면, 제1 페어링부(112)의 제1 블록킹부(114)에 인접한 영역이 제2 페어링부(122)의 제2 블록킹부(124)에 인접한 영역과 상보적으로 결합되도록 핵산 복합체 페어가 구현되는 경우, 제1 결정부(111)와 제2 결정부(121)가 제1 페어링부(112) 및 제2 페어링부(122)를 기준으로 동일한 측에 위치되는 핵산 복합체 페어의 구조체가 생성될 수 있다. (도4(a) 참고)
본 출원의 일 실시예에 따르면, 제1 페어링부(112)의 제1 결정부(111)에 인접한 영역이 제2 페어링부(122)의 제2 결정부(121)에 이격된 영역과 상보적으로 결합되도록 핵산 복합체 페어가 구현되는 경우, 제1 결정부(111)와 제2 결정부(121)가 제1 페어링부(112) 및 제2 페어링부(122)를 기준으로 상이한 측에 위치되는 핵산 복합체 페어의 구조체가 생성될 수 있다.
본 출원의 일 실시예에 따르면, 제1 페어링부(112)의 제1 블록킹부(114)에 인접한 영역이 제2 페어링부(122)의 제2 블록킹부(124)에 이격된 영역과 상보적으로 결합되도록 핵산 복합체 페어가 구현되는 경우, 제1 결정부(111)와 제2 결정부(121)가 제1 페어링부(112) 및 제2 페어링부(122)를 기준으로 상이한 측에 위치되는 핵산 복합체 페어의 구조체가 생성될 수 있다. (도4(b) 참고)
이미 설명한바와 같이, 본 출원의 일 실시예에 따르면, 제1 페어링부(112) 및 제2 페어링부(122)의 염기 배열에 따라 제1 페어링부(112)와 제2 페어링부(122)간의 결합에 따른 핵산 복합체 페어의 형상이 다를 수 있고, 핵산 복합체 페어가 핵산서열증폭반응에서 이용되는 경우, 제1 페어링부(112) 및 제2 페어링부(122)의 제1 타겟핵산서열(TS1) 또는 제2 타겟핵산서열(TS2)과의 결합에 기초하여 핵산 복합체 페어의 형상이 유사 원형 구조, 유사 헤어핀 구조등 다양한 형태로 구현될 수 있다. 이와 관련하여서는, 이하에서 보다 상세하게 설명하기로 한다.
제1 페어링부(112)와 제2 페어링부(122)간의 상보적 결합은, 전기적, 화학적 또는 물리적 성질 중 적어도 하나의 성질이 대응되어 연관되는 것을 의미할 수 있다. 일 예로, 상기 제1 페어링부(112)는 화학적 결합력이 있는 일 영역을 포함하고, 상기 제1 페어링부(112)는 상기 제2 페어링부(122)와 수소결합할 수 있다. 상기 제2 페어링부(122)는 화학적 결합력이 있는 일 영역을 포함하고, 상기 제2 페어링부(122)는 상기 제1 페어링부(112)와 수소결합할 수 있다.
제1 페어링부(112)와 제2 페어링부(122) 사이의 결합력은, 제1 페어링부(112) 및 제2 페어링부(122)의 단위 핵산의 종류, 단위핵산의 염기의 종류, 상보적 결합에 관여하는 염기의 수, 미스매치서열의 개수 중 적어도 하나에 연관되어 결정될 수 있다. 일 예로, 제1 페어링부(112)와 제2 페어링부(122) 사이의 결합력은 제1 페어링부(112)와 제2 페어링부(122)의 상보적 결합에 관여하는 염기의 수에 기초하여 결정될 수 있다. 제1 페어링부(112)와 제2 페어링부(122)의 상보적 결합에 관여하는 염기의 수가 많을수록, 제1 페어링부(112)와 제2 페어링부(122) 사이의 결합력이 증가될 수 있다. 다른 예로, 제1 페어링부(112)와 제2 페어링부(122) 사이의 결합력은 제1 페어링부(112)와 제2 페어링부(122)의 상보적 결합에 관여하는 염기의 종류에 기초하여 결정될 수 있다. 제1 페어링부(112)와 제2 페어링부(122)의 상보적 결합에 관여하는 염기의 C(시토신)-G(구아닌)의 함량이 높을수록, 제1 페어링부(112)와 제2 페어링부(122) 사이의 결합력이 증가될 수 있다.
제1 페어링부(112)와 제2 페어링부(122)은 분리될 수 있다. 제1 페어링부(112) 및 제2 페어링부(122)는 결합이 해리되는 영역을 포함할 수 있다. 일 예로, 상기 결합이 해리되는 영역은 제1 페어링부(112)와 제2 페어링부(122)가 상보적으로 결합되는 영역과 일치할 수 있다. 다시 말해, 제1 페어링부(112)와 제2 페어링부(122)가 상보적으로 결합하는 영역은, 제1 페어링부(112)와 제2 페어링부(122)의 상보적 결합에 의해 결합되었다가, 제1 페어링부(112)와 제2 페어링부(122)의 상보적 결합이 해리됨에 따라 제1 페어링부(112)와 제2 페어링부(122)가 분리되는 영역과 일치할 수 있다.
본 출원의 일 실시예에 따르면, 제1 검출부(113) 및 제2 검출부(123)는 상호작용할 수 있다. 제1 검출부(113)와 제2 검출부(123)는 서로 에너지를 교환할 수 있다. 일 예로, 제1 검출부(113)는 제2 검출부(123)에 에너지를 제공할 수 있다. 제2 검출부(123)는 제1 검출부(113)로부터 에너지를 제공받을 수 있다. 다른 예로, 제1 검출부(113)는 제2 검출부(123)로부터 에너지를 제공받을 수 있다. 제2 검출부(123)는 제1 검출부(113)에 에너지를 제공할 수 있다. 또 다른 예로, 제1 검출부(113)는 제2 검출부(123)에 에너지를 제공하고, 제2 검출부(123)로부터 에너지를 제공받을 수 있다. 제2 검출부(123)는 제1 검출부(113)에 에너지를 제공하고, 제1검출부(103)로부터 에너지를 제공 받을 수 있다.
제1 검출부(113)와 제2 검출부(123)는 서로 상이한 성질을 가질 수 있다. 제1 검출부(113)와 제2 검출부(123)가 광학적 성질을 가지는 경우, 제1 검출부(113)가 가지는 광학적 성질과 제2 검출부(123)가 가지는 광학적 성질은 상이할 수 있다. 일 예로, 제1 검출부(113)에서 출사되는 광의 파장대와 제2 검출부(123)에서 출사되는 광의 파장대는 다를 수 있다. 다른 예로, 제1 검출부(113)에서 출사되는 광의 세기와 제2 검출부(123)에서 출사되는 광의 세기는 다를 수 있다. 또 다른 예로, 제1 검출부(113)는 특정 파장대의 빛을 출사하고, 제2 검출부(123)는 제1 검출부(113)로부터 출사되는 빛의 광학적 성질을 변경하여 출사할 수 있다.
도 5는 본 출원의 일 실시예에 따른 제1 검출부(113)와 제2 검출부(123) 사이의 상호 작용을 설명하기 위한 도면이다.
본 출원의 일 실시예에 따른 핵산 복합체 페어는, 제1 검출부(113)와 제2 검출부(123)사이의 상호작용유효거리(ID)가 정의될 수 있다. 여기서, "상호작용유효거리(ID)"라 함은, 제1 검출부(113)와 제2 검출부(123)의 상호작용이 수행될 수 있는 제1 검출부(113) 또는 제2 검출부(123)로부터의 기준 이격 거리를 의미할 수 있다.
상호작용유효거리(ID)는, 제1 검출부(113)와 제2 검출부(123)의 성질에 기초하여 결정될 수 있다. 본 출원의 일 실시예에 따른 핵산 복합체 페어에 있어서, 제1 검출부(113)는 형광 물질을 포함하고, 제2 검출부(123)는 형광 물질에 작용하는 ??칭 물질(예; ??처)를 포함하는 경우, 상호작용유효거리(ID)는 형광 물질과 ??칭 물질의 특성에 따라 변경될 수 있다. 일예로, ??처가 형광 물질로부터 100Å(옴스트롱)의 범위 이내에 있을 때, 형광 물질 및 ??처로부터 출력되는 광학적 성질이 변경되는 경우, 상호작용유효거리(ID)는 100Å일 수 있다.
제1 검출부(113)와 제2 검출부(123)사이의 거리는, 제1 페어링부(112)와 제2 페어링부(122)의 결합에 기초하여 변경될 수 있다. 제1 페어링부(112)와 제2 페어링부(122)의 상보적인 결합이 수행되는 경우, 제1 검출부(113)와 제2 검출부(123)는 인접하게 배치될 수 있다. 본 출원의 일 실시예에 따른 핵산 복합체 페어는, 제1 페어링부(112)와 제2 페어링부(122)의 결합에 기초하여, 제1 검출부(113)와 제2 검출부(123)의 상호 작용 여부가 결정될 수 있다.
제1 페어링부(112)와 제2 페어링부(122)의 결합으로 제1 검출부(113)의 상호작용유효거리(ID) 이내에 제2 검출부(123)가 위치하는 경우, 제1 검출부(113) 및/또는 제2 검출부(123)에 포함된 신호발생물질에 기인한 검출 신호는 변경될 수 있다. 일 예로, 신호의 변경은 제1 검출부(113) 및 제2검출부(123)로부터 검출되는 신호의 파장대(예; 빛의 파장대)를 변경하는 것을 의미할 수 있다. 다른 예로, 신호의 변경은 제1 검출부(113) 및 제2 검출부(123)로부터 검출되는 신호의 세기(예; 빛의 세기)를 변경하는 것을 의미할 수 있다. 또 다른 예로, 신호의 변경은 핵산 복합체 페어를 포함하는 용액의 광학적 성질을 검출하는 디바이스가 검출하도록 설정된 파장대의 범위를 초과하는 변경일 수 있다. 이로 인해, 제1 검출부(113) 및 제2 검출부(123)로부터 검출되는 신호의 변경은 디바이스적 한계로 인해 신호의 온(On)/ 오프(Off)가 변경되는 것으로 확인될 수 있다. 이와 관련하여서는, 이하에서 보다 자세하게 설명하기로 한다.
본 출원에 따르는 핵산 복합체 페어가 핵산서열증폭반응에 이용되는 경우, 제1 블록킹부(114) 및 제2 블록킹부(124)에 의해 제1 페어링부(112) 및 제2 페어링부(122)에 대한 증폭산물의 생성을 방지할 수 있다. 결론적으로, 핵산서열증폭반응이 종료된 이후에도, 제1 페어링부(112) 및 제2 페어링부(122)는 싱글스트랜드(single strand)로 유지될 수 있다.
본 출원의 일 실시예에 따른 핵산 복합체 페어에 있어서, 제1 타겟핵산서열(TS1) 및 제2 타겟핵산서열(TS2)을 포함하는 증폭산물의 길이는 일정하게 구현될 수 있다. 다시 말해, 제1 블록킹부(114) 및 제2 블록킹부(124)는 제1 타겟핵산서열(TS1) 및 제2 타겟핵산서열(TS2)을 포함하는 증폭산물을 일정한 길이로 생성되도록 하는데에 관여할 수 있다.
지금까지 본 출원에서 개시하는 핵산 복합체(100) 및 핵산 복합체 페어의 구성요소, 및 위치적 관계에 대해서 구체적으로 기재하였다.
본 출원의 일 실시예에 따른 핵산 복합체 페어는 핵산이 이용되는 다양한 분야에서 이용될 수 있다.
예를 들어, 본 출원의 일 실시예에 따른 핵산 복합체 페어는 플라스미드의 합성, DNA 칩의 제작, DNA 시퀀싱을 위한 프라이머로써 활용될 수 있다. 다른 예를 들어, 본 출원의 일 실시예에 따른 핵산 복합체 페어는 샘플내의 타겟핵산서열의 유무를 확인하기 위해 활용될 수 있다.
이하에서는, 샘플내 타겟핵산서열의 유무를 확인하기 위해 핵산 복합체 페어가 이용되는 다양한 실시예에 대해서 구체적으로 개시한다.
<핵산 복합체 페어의 이용>
1. 샘플내 타겟핵산서열의 유무 확인
유전자 분석을 위해 샘플내 타겟핵산서열의 유무를 확인할 수 있다. 일 예로, 피검자의 바이러스성 질병 감염 여부를 확인하기 위해, 샘플내 타겟핵산서열의 유무를 확인할 수 있다. 다른 예로, 특정 샘플의 유래 종을 식별하기 위해, 샘플내 타겟핵산서열의 유무를 확인할 수 있다. 또 다른 예로, 피검자에 표적 치료제가 유효하게 작용될 수 있을지 여부를 확인하기 위해, 샘플내 타겟핵산서열의 유무를 확인할 수 있다. 또 다른 예로, 유전자 변형 식품, 오염 식품 등을 확인하기 위해, 샘플내 타겟 핵산의 유무를 확인할 수 있다.
1.1 핵산서열증폭반응을 이용한 타겟 서열의 유무 확인
1.1.1 일반적인 PCR에서의 이용
본 출원의 일 실시예에 따른 핵산 복합체 페어는 샘플내 타겟핵산서열의 유무를 확인하기 위해 이용될 수 있다. 핵산 복합체 페어는 핵산서열증폭반응에 이용될 수 있다. 핵산 복합체 페어는 타겟핵산서열에 대한 증폭산물의 생성에 관여할 수 있다. 핵산 복합체 페어는 핵산 복합체 페어가 포함되어 있는 혼합 용액으로부터 신호가 검출되는 과정에 관여할 수 있다. 핵산 복합체 페어는 핵산 복합체 페어가 포함되어 있는 혼합 용액으로부터의 검출 신호의 변화에 관여할 수 있다.
도 6은 본 출원의 일 실시예에 따라 샘플내의 타겟핵산서열의 유무를 확인하는 순서를 설명하기 위한 도면이다.
샘플내의 타겟핵산서열의 유무를 확인하기 위해서는, 혼합용액이 제공되는 단계(S1000), 핵산서열증폭반응 단계(S2000), 안정화 단계(S3000), 융해곡선 검출 단계(S4000) 및 피크검출값 확인 단계(S5000)가 수행될 수 있다.
구체적으로, 본 출원의 일 실시예에 따르면, 샘플내의 타겟핵산서열의 존재 또는 부존재를 검출하기 위해, 샘플 및 적어도 하나의 종류의 핵산 복합체 페어를 포함하는 혼합 용액이 제공(S1000)될 수 있다.
일 예로, 상기 핵산 복합체 페어는 제1 핵산 복합체(110) 및 제2 핵산 복합체(120)를 포함할 수 있다. 제1 핵산 복합체(110)는 제1 결정부(111), 제1 페어링부(112), 제1 검출부(113), 및 제1 블록킹부(114)를 포함할 수 있다. 제2 핵산 복합체(120)는 제2 결정부(121), 제2 검출부(123), 제2 페어링부(122) 및 제2 블록킹부(124)를 포함할 수 있다.
상기 제1 결정부(111)는 타겟하는 핵산 서열(즉, 제1 타겟핵산서열(TS1))과 상보적으로 결합하는 기능을 수행할 수 있다. 상기 제2 결정부(121)는 타겟하는 핵산 서열(즉, 제2 타겟핵산서열(TS2))과 상보적으로 결합하는 기능을 수행할 수 있다. 일 예로, 제1 타겟핵산서열(TS1) 및 제2 타겟핵산서열(TS2)은 검출하고자 하는 질병과 관련된 핵산 서열의 적어도 일부일 수 있다. 제1 타겟핵산서열(TS1) 및 제2 타겟핵산서열(TS2)은 하나의 더블스트랜드(double strand)에 포함되어 있을 수 있다.
상기 혼합 용액에는 샘플 및 핵산 복합체 페어 이외에도, 중합 반응을 수행하는데 관여하는 중합 효소(예; 폴리머레이즈), 염기 조각(예; 디옥시뉴클레오타이드 삼인산(dNTP)), 핵산서열증폭반응에 관여하는 조효소(예; MgCl2, MgSO4), 핵산서열증폭반응에 최적 pH 및/또는 염농도를 제공하기 위해 완충용액(buffer) 중 적어도 하나가 더 포함될 수 있다.
복수 종류의 핵산 복합체 페어를 이용하는 경우, 제1 핵산 복합체 페어는 제1 신호 물질을 포함할 수 있다. 제2 핵산 복합체 페어는 제2 신호 물질을 포함할 수 있다. 제1 신호 물질 및 제2 신호 물질은 동일한 신호로 검출되는 동일신호검출물질을 포함할 수 있다.
여기서, "동일신호검출물질"이라 함은, 동일한 종류의 물질일 수 있다. 일 예로, 제1 핵산 복합체 페어가 포함하는 제1 신호 물질이 JOE인 경우, 제2 핵산 복합체 페어가 포함하는 제2 신호 물질이 JOE일 수 있다.
여기서, "동일신호검출물질"이라 함은, 디바이스의 사양에 기초하여 동일한 신호(예를 들어, 미리 설정된 파장대에 대응되는 파장대 범위에 포함하는 신호)으로 검출되는 복수의 종류의 상이한 물질일 수 있다. 일 예로, 제1 핵산 복합체 페어가 포함하는 제1 신호 물질이 방출 파장이 548 lambda 인 TET인 경우, 디바이스의 사양에 따라 신호 물질 JOE 및 TET는 동일 파장대의 광으로 검출될 수 있고, 이 때, JOE와 TET는 동일신호검출물질일 수 있다.
또한, 제1 핵산 복합체 페어의 제1 타겟핵산서열(TS1)은 제2 핵산 복합체 페어의 제1타겟핵산서열 또는 제2타겟핵산서열과 상이할 수 있다. 제1 핵산 복합체 페어의 제2 타겟핵산서열(TS2)은 제2 핵산 복합체 페어의 제1타겟핵산서열 또는 제2타겟핵산서열과 상이할 수 있다.
또한, 제1 핵산 복합체 페어의 제1 페어링부(112) 및 제2 페어링부(122)의 상보적 결합의 결합력과 제2 핵산 복합체 페어의 제1 페어링부(112) 및 제2 페어링부(122)의 상보적 결합의 결합력이 상이할 수 있다. 구체적으로, 제1 핵산 복합체 페어의 제1 페어링부(112) 및 제2 페어링부(122)의 상보적 결합이 해리되는 온도와 제2 핵산 복합체 페어의 제1 페어링부(112) 및 제2 페어링부(122)의 상보적 결합이 해리되는 온도가 상이할 수 있다.
혼합 용액이 제공되면, 혼합 용액에 대한 핵산 서열 증폭 반응 단계(S2000)가 수행될 수 있다.
핵산 서열 증폭 반응 단계는, 일반적으로, 1) 열을 이용하여 이중나선구조로 이루어진 핵산 구조체를 분리하는 열변성 단계(denaturation step), 2) 프라이머(primer)가 타겟핵산서열에 결합하도록 하는 어닐링 단계(annealing step), 3) 프라이머가 결합된 타겟핵산서열을 포함하는 타겟 물질(TM)에 대한 증폭산물을 생성하는 중합 반응 단계(extension step)를 포함할 수 있다. 상술한 열변성 단계, 어닐링 단계, 및 중합 반응 단계는 순차적으로 반복하여 수행될 수 있다. 이러한 과정을 통해 혼합 용액 내의 타겟핵산서열의 양은 증가될 수 있다.
도 7및 도 8은 본 출원의 일 실시예에 따른 핵산 서열 증폭 반응 단계에서의 핵산 복합체 페어의 결합 관계의 변화를 설명하기 위한 도면이다.
열변성 단계에서는, 샘플 및 핵산 복합체 페어가 포함된 혼합 용액의 온도를 상승시켜, 샘플 내의 이중 가닥의 핵산 구조체의 염기 사이에 형성된 상보적인 수소 결합이 분리될 수 있다. 열변성 단계에서는 샘플내의 이중 가닥의 핵산 구조체는 단일 가닥의 핵산 구조체로 분리될 수 있다. 이 때, 분리되는 이중 가닥의 핵산 구조체는 제1 타겟핵산서열(TS1) 및/또는 제2 타겟핵산서열(TS2)을 포함할 수 있다.
어닐링 단계에서는, 단일 가닥의 핵산 구조체 중 적어도 일부 영역에 제1 결정부(111) 또는 제2 결정부(121)가 결합될 수 있다. 다시 말해, 단일 가닥의 핵산 구조체 중 적어도 하나의 제1 타겟핵산서열(TS1) 또는 제2 타겟핵산서열(TS2)에 대응되는 영역에 제1 결정부(111) 또는 제2 결정부(121)가 결합될 수 있다.
어닐링 단계에서의 적절한 온도(이하, 어닐링온도)를 설계하기 위해서는, 제1 결정부(111)의 프라이머 영역의 어닐링 온도 및 제2 결정부(121)의 프라이머 영역의 어닐링 온도가 고려될 수 있다. 제1 결정부(111)의 프라이머 영역의 어닐링 온도는 제1 결정부(111)의 프라이머 영역의 염기의 수, 염기의 종류 등에 기초하여 결정될 수 있다. 제2 결정부(121)의 프라이머 영역의 어닐링 온도는 제2 결정부(121)의 프라이머 영역의 염기의 수, 염기의 종류 등에 기초하여 결정될 수 있다.
본 출원의 일 실시예에 따르는 샘플 내의 타겟핵산서열의 존재 또는 부존재를 검출하는 방법에서, 복수 종류의 핵산 복합체 페어가 혼합 용액에 투입되는 경우, 복수 종류의 핵산 복합체 페어의 제1 결정부(111) 및 제2 결정부(121)의 어닐링 온도는 유사하게 설계될 수 있다. 바람직하게는, 제1 핵산 복합체 페어 및 제2 핵산 복합체 페어는 제1 페어링부(112) 및 제2 페어링부(122)간의 결합의 해리 온도는 서로 상이하게 설계되고, 제1 결정부(111) 및 제2 결정부(121)의 타겟핵산서열에의 결합 온도(즉, 어닐링 온도)는 동일하게 설계될 수 있다.
중합반응 단계에서는, 제1 결정부(111) 및/또는 제2 결정부(121)를 개시점으로 하여, 제1 타겟핵산서열(TS1) 또는 제2 타겟핵산서열(TS2)을 포함하는 타겟 물질(TM)에 대한 증폭산물이 생성될 수 있다. 한번의 싸이클의 핵산서열증폭반응을 통해, 제1 타겟핵산서열(TS1) 및/또는 제2 타겟핵산서열(TS2)을 포함하는 이중 가닥의 핵산 구조체가 적어도 하나의 제1 핵산 복합체(110) 또는 제2 핵산 복합체(120)를 포함할 수 있다.
1회의 싸이클 이후의 열변성 단계에서는, 혼합 용액 내의 이중 가닥의 핵산 구조체는 단일 가닥의 핵산 구조체로 분리될 수 있다. 이 때, 중합 반응 단계에서 형성되었던 적어도 하나의 핵산 복합체(100)를 포함하는 이중 가닥의 핵산 구조체도 단일 가닥의 핵산 구조체로 분리될 수 있다.
1회의 싸이클 이후의 어닐링 단계에서는, 혼합 용액 내의 단일 가닥 중 제1 타겟핵산서열(TS1) 및/또는 제2 타겟핵산서열(TS2)에는 제1 핵산 복합체(110) 또는 제2 핵산 복합체(120)가 결합될 수 있다. 이 때, 제1 핵산 복합체(110)가 포함된 단일 가닥의 핵산 구조체에는 제2 핵산 복합체(120)가 결합될 수 있다. 다시 말해, 핵산 복합체 페어의 제1 핵산 복합체(110)가 포함된 단일 가닥의 핵산 구조체에는 핵산 복합체 페어의 제2 핵산 복합체(120)가 결합될 수 있다. 핵산 복합체 페어의 제2 핵산 복합체(120)가 포함된 단일 가닥의 핵산 구조체에는 핵산 복합체 페어의 제1 핵산 복합체(110)가 결합될 수 있다.
1회의 싸이클 이후의 중합반응 단계에서는, 제1 결정부(111) 또는 제2 결정부(121)를 개시점으로 하여, 제1 타겟핵산서열(TS1) 또는 제2 타겟핵산서열(TS2)을 포함하는 타겟 물질(TM)에 대한 증폭산물이 생성될 수 있다.
적어도 2회의 싸이클의 핵산 서열 증폭 반응을 통해, 제1 타겟핵산서열(TS1) 및/또는 제2 타겟핵산서열(TS2)을 포함하는 이중 가닥의 핵산 구조체는 제1 핵산 복합체(110) 및/또는 제2 핵산 복합체(120)를 포함할 수 있다. 특히, 혼합 용액의 제1 타겟핵산서열(TS1) 및 제2타겟핵산서열을 포함하는 적어도 하나의 이중 가닥의 핵산구조체는 제1 핵산 복합체(110) 및 제2 핵산 복합체(120)를 포함할 수 있다.
중합반응 단계에서는, 제1 핵산 복합체(110)가 포함된 단일 가닥의 핵산 구조체에 제2 핵산 복합체(120)가 결합되는 경우, 제1 핵산 복합체(110)의 제1 블록킹부(114)에 의해 제1 페어링부(112)에 대한 증폭산물이 생성되는 것이 차단될 수 있다.
중합반응 단계에서는, 제2 핵산 복합체(120)가 포함된 단일 가닥의 핵산 구조체에 제1 핵산 복합체(110)가 결합되는 경우, 제2 핵산 복합체(120)의 제2 블록킹부(124)에 의해 제2 페어링부(122)에 대한 증폭산물이 생성되는 것이 차단될 수 있다.
제1 블록킹부(114) 및 제2 블록킹부(124)의 작용에 의해 제1 페어링부(112) 및 제2 페어링부(122)가 단일 가닥의 핵산 구조체로 유지될 수 있고, 제1 페어링부(112) 및 제2 페어링부(122) 사이의 상보적 결합이 핵산서열증폭반응 이후에도 가능해, 제1 페어링부(112) 및 제2 페어링부(122)를 샘플내 타겟핵산서열의 유무를 확인하기 위한 표지로 활용할 수 있게 된다.
본 출원의 일 실시예에 따른 핵산서열증폭반응에 있어서, 제1 검출부(113) 및 제2 검출부(123) 사이의 상호 작용에 의해 제1 검출부(113) 및 제2 검출부(123)로부터 검출되는 신호가 소광되도록 설계되어 있는 경우, 열변성 단계, 어닐링 단계 및 중합반응 단계에서는 제1 검출부(113) 및 제2 검출부(123)에 의해 특정 파장대의 신호가 출사되고 있는 상태일 수 있다. 일예로, 제1 검출부(113)에는 형광 물질이 포함되어 있고, 제2 검출부(123)에는 상기 제1 검출부(113)에 포함된 형광 물질을 소광시키기 위한 ??칭 물질이 포함되어 있을 수 있다.
본 출원의 일 실시예에 따른 핵산서열증폭반응에 있어서, 제1 검출부(113) 및 제2 검출부(123) 사이의 상호 작용에 의해 제1 검출부(113) 및 제2 검출부(123)로부터 검출되는 신호가 발광되도록 설계되어 있는 경우, 열변성 단계, 어닐링 단계 및 중합반응 단계에서는 제1 검출부(113) 및 제2 검출부(123)에 의해 특정 파장대의 신호가 출사되고 있지 않은 상태일 수 있다. 일예로, 제1 검출부(113)에는 제1 파장대의 광학적 에너지를 제공(또는 발산)하는 형광 물질이 포함되어 있고, 제2 검출부(123)에는 상기 제1 검출부(113)로부터 제1 파장대의 광학적 에너지를 제공받아, 제2 파장대의 광학적 에너지를 제공(또는 발산)하는 형광물질이 포함되어 있을 수 있다.
적어도 2회 이상의 핵산서열증폭반응이 수행된 혼합 용액은, 제1 핵산 복합체(110) 및 제2 핵산 복합체(120)를 포함하는 핵산 구조체, 제1 핵산 복합체(110)를 포함하는 핵산 구조체, 제2 핵산 복합체(120)를 포함하는 핵산 구조체 및 제1 핵산 복합체(110) 및 제2 핵산 복합체(120)를 포함하지 않는 핵산 구조체를 포함할 수 있다.
핵산서열증폭반응에서 수행되는 싸이클(즉, 열변성단계, 어닐링단계 및 중합반응단계)의 수가 증가할수록, 혼합용액 내의 제1 핵산 복합체(110) 및 제2 핵산 복합체(120)를 포함하는 핵산 구조체의 비율은 증가할 수 있다. 핵산서열증폭반응을 수행하는 타겟 검출 방법은, 샘플내의 미량의 DNA 유무의 검출에 적합할 수 있다.
지금까지, 단일 종류의 핵산 복합체 페어와 핵산 복합체 페어에 대응되는 타겟핵산서열의 결합 관계에 대해서 구체적으로 설명하였다. 설명의 편의를 위해 단일 종류의 핵산 복합체 페어와 타겟핵산서열의 결합관계에 대해서 설명하였지만, 복수 종류의 핵산 복합체 페어와 타겟핵산서열의 결합 관계 역시 당업자에게 충분히 용이하게 이해될 수 있을 것이다.
도6에 이어서, 본 출원의 일 실시예에 따르면 핵산서열증폭반응이 완료된 혼합용액의 온도를 임의의 온도 이하로 낮춰 안정화 하는 단계(S3000)가 수행될 수 있다. 안정화 단계는, 혼합 용액의 온도를 적어도 40도 이하로 낮춰 일정 시간동안 유지하는 형태로 수행될 수 있다. 안정화 단계는, 핵산 복합체 페어의 제1 페어링부(112) 및 제2 페어링부(122)간의 상보적 결합이 수행될 수 있다.
안정화 단계에 의해, 핵산 복합체 페어의 제1 페어링부(112)와 제2 페어링부(122)는 서로 상보적인 결합을 수행할 수 있다. 핵산 복합체 페어의 제1 페어링부(112)와 제2 페어링부(122)의 상보적인 결합을 통해, 제1 페어링부(112)와 연결된 핵산 구조체 및 제2 페어링부(122)와 연결된 핵산 구조체의 형상이 변경될 수 있다. 핵산 복합체 페어의 제1 페어링부(112)와 제2 페어링부(122)의 상보적인 결합을 통해, 제1 결정부(111)와 결합된 핵산 구조체 및 제2 결정부(121)와 결합된 핵산 구조체의 형상이 변경될 수 있다.
도 9는 본 출원의 일 실시예에 따른 핵산 복합체 페어를 포함하는 핵산 구조체의 형상을 설명하기 위한 도면이다.
핵산 복합체 페어를 포함하는 핵산 구조체는 유사 헤어핀 구조를 형성할 수 있다. 여기서 "유사 헤어핀 구조"라 함은, 임의의 곡률을 가지도록 형성된 루프 구조의 적어도 일부 영역이 이중 가닥으로 이루어지고, 이중 가닥이 형성된 영역의 각 단일 가닥의 일단에 연결된 핵산 서열간의 결합으로 루프 구조와 연계된 스템 구조가 형성되는 것을 의미할 수 있다.
유사 헤어핀 구조는 제1 페어링부(112)의 제1 결정부(111)에 인접한 영역이 제2 페어링부(122)의 제2 결정부(121)에 인접한 영역과 상보적으로 결합되도록 핵산 복합체 페어가 구현되는 경우 생성될 수 있다. 유사 헤어핀 구조는 제1 페어링부(112)의 제1 블록킹부(114)에 인접한 영역이 제2 페어링부(122)의 제2 블록킹부(124)에 인접한 영역과 상보적으로 결합되도록 핵산 복합체 페어가 구현되는 경우 생성될 수 있다. 이 때, 제1 페어링부(112) 및 제2 페어링부(122)는 스템 구조를 구성하고, 제1 결정부(111), 제2 결정부(121) 및 제1 결정부(111) 및/또는 제2 결정부(121)와 결합된 증폭산물은 루프 구조를 구성할 수 있다.
핵산 복합체 페어를 포함하는 핵산 구조체는 유사 원형 구조를 형성할 수 있다. 여기서 "유사 원형 구조"라 함은, 임의의 곡률을 가지도록 형성된 루프 구조의 적어도 일부 영역이 이중 가닥으로 이루어지고, 루프 구조의 적어도 일부 영역이 개방되어 완전한 원형을 이루지 않도록 형성되는 것을 의미할 수 있다.
유사 원형 구조는 제1 페어링부(112)의 제1 결정부(111)에 인접한 영역이 제2 페어링부(122)의 제2 결정부(121)에 이격된 영역과 상보적으로 결합되도록 핵산 복합체 페어가 구현되는 경우 생성될 수 있다. 유사 원형 구조는 제1 페어링부(112)의 제1 블록킹부(114)에 인접한 영역이 제2 페어링부(122)의 제2 블록킹부(124)에 이격된 영역과 상보적으로 결합되도록 핵산 복합체 페어가 구현되는 경우 생성될 수 있다. 이 때, 제1 결정부(111), 제2 결정부(121), 제1 결정부(111) 및/또는 제2 결정부(121)와 결합된 증폭산물, 제1 페어링부(112), 제2 페어링부(122)는 루프 구조를 구성할 수 있다.
전술한 핵산 구조체의 형상은, 제1 페어링부(112) 및 제2 페어링부(122)의 염기 배열에 따라 변경될 수 있다. 핵산 구조체의 형상은 제1 블록킹부(114)로부터 제1 페어링부(112)의 염기 배열 및 제2 블록킹부(124)로부터 제2 페어링부(122)의 염기 배열에 따라 변경될 수 있다. 핵산 구조체의 형상은 제1 결정부(111)로부터 제1 페어링부(112)의 염기 배열 및 제2 결정부(121)로부터 제2 페어링부(122)의 염기 배열에 따라 변경될 수 있다.
도6에 이어서, 본 출원의 일 실시예에 따르면 핵산서열증폭반응이 완료된 혼합용액에 대한 융해 곡선 검출 단계(S4000)가 수행될 수 있다. 안정화 단계가 수행된 혼합용액에 대한 융해 곡선 검출 단계(S4000)가 수행될 수 있다.
여기서, "융해곡선"이라 함은, 상보적 결합을 이룬 적어도 2개의 핵산 구조체가 분리되는 온도를 포함하는 온도 범위 내에서, 온도에 대한 단위셀(UC)의 형광값을 그래프화 한 것을 의미한다. 또는, 여기서, "융해곡선"이라 함은, 상보적 결합을 이룬 제1 페어링부(112)와 제2 페어링부(122)간의 결합이 분리되는 온도를 포함하는 온도 범위 내에서, 온도에 대한 단위셀(UC)의 형광값을 그래프화 한 것을 의미한다.
여기서, "단위셀(UC)"이라 함은, 검출의 대상이 되는 단위를 의미한다. 일 예로, 하나의 튜브에 대한 핵산서열증폭반응 및 검출을 수행하는 리얼타임 PCR에서는, 하나의 튜브가 단위셀에 대응될 수 있다.
*융해 곡선 검출 단계에서는, 단위셀(UC)에 포함된 혼합 용액의 온도를 증가시키면서 단위셀(UC)에 포함된 혼합 용액의 형광값이 검출될 수 있다. 융해 곡선 검출 단계에서는 단위셀(UC)에 포함된 혼합 용액의 온도를 일정한 속도로 증가시키면서 단위셀(UC)에 포함된 혼합 용액의 형광값이 검출될 수 있다.
또는, 융해 곡선 검출 단계에서는, 단위셀(UC)에 포함된 혼합 용액의 온도를 감소시키면서 단위셀(UC)에 포함된 혼합 용액의 형광값이 검출될 수 있다. 융해 곡선 검출 단계에서는 단위셀(UC)에 포함된 혼합 용액의 온도를 일정한 속도로 감소시키면서 단위셀(UC)에 포함된 혼합 용액의 형광값이 검출될 수 있다.
융해 곡선 검출 단계에서는, 단위셀(UC)에 포함된 혼합 용액의 복수 파장대의 형광값이 검출될 수 있다. 융해 곡선 검출 단계에서는, 단위셀(UC)에 포함된 혼합 용액의 복수 파장대의 형광값 중 각각에 대한 형광값이 검출될 수 있다. 융해 곡선 검출 단계에서는, 단위셀(UC)에 포함된 혼합 용액의 복수 파장대의 형광값 중 미리 설정된 몇몇 파장대(또는 몇몇 파장대 그룹)에 대한 형광값이 검출될 수 있다.
본 출원의 일 실시예에 따른 핵산서열증폭반응에 있어서, 제1 검출부(113) 및 제2 검출부(123) 사이의 상호 작용에 의해 제1 검출부(113) 및 제2 검출부(123)로부터 검출되는 신호가 소광되도록 설계되어 있는 경우, 융해곡선검출단계에서는 온도가 증가함에 따라 형광값이 증가하는 그래프가 도시될 수 있다(도 10(a) 참고).
본 출원의 일 실시예에 따른 핵산서열증폭반응에 있어서, 제1 검출부(113) 및 제2 검출부(123) 사이의 상호 작용에 의해 제1 검출부(113) 및 제2 검출부(123)로부터 검출되는 신호가 발광되도록 설계되어 있는 경우, 융해곡선검출단계에서는 온도가 증가함에 따라 형광값이 감소하는 그래프가 도시될 수 있다 (도 10(b) 참고).
본 출원의 일 실시예에 따르면 융해 곡선 검출 단계(S4000)에서 획득된 정보에 기초하여 해리피크값을 확인하는 단계(S5000)가 수행될 수 있다.
여기서, "해리피크값"이라 함은 핵산 복합체 페어의 제1 페어링부(112) 및 제2 페어링부(122) 사이의 상보적인 결합이 해리되는 온도를 의미할 수 있다. 또는, 여기서, "해리피크값"이라 함은, 융해 곡선 검출 단계에서 획득된 형광값에 기초하여, 형광값의 변화량이 가장 크거나 가장 작은 지점의 온도값을 의미할 수 있다. 또는, 여기서, "해리피크값"이라 함은, 융해 곡선에 기초하여 온도에 대한 형광값의 변화량이 도시된 미분 융해 곡선 그래프에서, 극대점에 대응되는 온도값 또는 극소점에 대응되는 온도값을 의미할 수 있다(도 11(a), (b) 참고). 또는, 여기서, "해리피크값"이라 함은, 융해 곡선에 기초하여, 특정 온도 범위에서 기준치 이상의 형광량의 변화가 발생한 경우, 변화된 형광량 중1/2에 대응되는 형광량만큼 감소된 지점의 온도값을 의미할 수 있다. 또는, 여기서, "해리피크값"이라 함은, 한 종류의 핵산 복합체 페어에 대한 형광값이 미리 정해진 비율 이하로 감소되는 온도값을 의미할 수 있다.
본 출원의 일 실시예에 따른 핵산 복합체 페어를 이용한 샘플 내의 타겟핵산서열의 유무 확인에 따르면, 융해곡선에 기초하여 온도에 대한 형광값의 미분값을 그린 미분 융해 곡선 그래프에서 극대점(또는 극소점)이 도시된 온도에 대응되는 값이 제1 페어링부(112) 및 제2 페어링부(122)와 관련된 해리피크값일 수 있다. 다시 말해, 미분 융해 곡선 그래프에서 극대점(또는 극소점)이 도시된 온도에 대응되는 값이 핵산 복합체 페어에 관련된 해리피크값일 수 있다.
본 출원에 일 실시예에 따른 핵산 복합체(100)를 이용한 타겟 내의 타겟핵산서열의 유무 확인에 있어서, 융해 곡선 검출에서 획득된 정보에 기초하여 온도에 대한 확인되는 형광의 변화량이 임의의 기준치 이상을 초과하는 해리피크값이 있는 경우, 해리 피크값과 관련된 타겟핵산서열이 샘플내에 존재함을 확인할 수 있게 된다.
본 출원의 일 실시예에 따른 해리피크값은 제1 페어링부(112)와 제2 페어링부(122)의 결합 해리에 기초하여 결정될 수 있다. 다만, 실험적으로 확인되는 해리 피크값은 기존의 Tm값을 구하는 공식에 의해 계산되는 온도값 (즉, 제1 페어링부(112)와 제2 페어링부(122) 사이의 결합의 해리 온도) 에 비해 큰값일 수 있다.
구체적으로, 제1 페어링부(112) 및 제2 페어링부(122)가 7mer의 C-G를 포함하는 경우 Tm값은, Tm=4*(C-G의 개수)+2*(A-T의 개수)를 적용하여, 28℃로 계산될 수 있다. 계산된 Tm값에 실험 보정값을 적용한다고 하더라고, 제1 페어링부(112) 및 제2 페어링부(122)가 7mer의 C-G를 포함하는 경우 Tm값은 25℃~30℃ 정도로 산출될 수 있다.
다만, 본 출원의 일 실시예에 따른 핵산 복합체 페어를 이용하여 해리피크값을 측정해본 결과, 제1 페어링부(112) 및 제2 페어링부(122)가 7mer의 C-G를 포함하는 경우 해리피크값이 약 40도로 확인되었다.
본 출원의 일 실시예에 따른 해리피크값에는, 1) 제1 검출부(113) 또는 제2 검출부(123)의 위치, 2) 제1 페어링부(112) 및 제2 페어링부(122)간의 결합에 관여하는 단위 핵산의 종류, 3) 제1 페어링부(112) 및 제2 페어링부(122)간의 결합에 관여하는 단위 핵산의 염기의 종류, 4) 제1 페어링부(112) 및 제2 페어링부(122)간의 결합에 관여하는 염기의 수, 5) 제1 페어링부(112)와 제2 페어링부(122) 사이의 상대적인 염기 서열(예를 들어, 제1 페어링부(112)와 제2 페어링부(122) 사이의 결합 방향), 6) 제1 검출부(113) 및 제2 검출부(123)의 종류가 영향을 미칠 수 있다.
본 출원의 일 실시예에 따르면, 복수 종류의 핵산 복합체 페어를 이용하여, 하나의 단위셀(UC)에서 복수 종류의 타겟의 검출이 가능할 수 있다. 본 출원의 일 실시예에 따르면, 복수 종류의 핵산 복합체 페어를 이용하여, 하나의 단위셀(UC)에서 하나의 형광 채널당 복수 종류의 타겟의 검출이 가능할 수 있다. 본 출원의 일 실시예에 따르면, 복수 종류의 핵산 복합체 페어의 상이한 해리피크값을 이용하여, 하나의 단위셀(UC)에서 하나의 형광 채널당 복수 종류의 타겟의 검출이 가능할 수 있다.
하나의 형광 채널당 복수 종류의 타겟의 검출이 가능하기 위한 복수 종류의 핵산 복합체 페어는 전술한 요소등을 적절히 이용하여 각각 상이한 해리 피크값을 갖도록 설계될 수 있다.
일 예로, 핵산 복합체 페어에 포함된 적어도 하나의 형광 물질의 위치를 변경하여, 동일한 제1 페어링부(112) 및 제2 페어링부(122)를 포함하는 두종류의 핵산 복합체 페어와 관련된 각각의 해리피크값을 서로 상이하게 구현할 수 있다. 다른 예로, 제1 페어링부(112) 및 제2 페어링부(122)간의 상보적 결합에 관여하는 염기의 개수를 늘려, 제1 페어링부(112) 및 제2 페어링부(122)간의 상보적 결합에 관여하는 염기의 개수가 상대적으로 많은 핵산 복합체 페어와 관련된 해리피크값이 더 높은 온도가 되도록 구현할 수 있다. 또 다른 예로, 제1 페어링부(112) 및 제2 페어링부(122)간의 상보적 결합에 관여하는 염기의 C-G 함량을 증가시켜, 제1 페어링부(112) 및 제2 페어링부(122)간의 상보적 결합에 관여하는 염기의 C-G 함량을 증가시킨 핵산 복합체 페어와 관련된 해리피크값이 더 높은 온도가 되도록 구현할 수 있다. 또 다른 예로, 제1 페어링부(112) 및 제2 페어링부(122)간의 상보적 결합의 방향을 변경하여, 동일한 제1 페어링부(112) 및 제2 페어링부(122)를 포함하는 두종류의 핵산 복합체 페어와 관련된 각각의 해리피크값을 서로 상이하게 구현할 수 있다.
하나의 단위셀(UC)에서 하나의 형광 채널당 복수 종류의 타겟의 검출이 가능하도록 하기 위해, 복수의 해리피크값을 서로 다른 타겟핵산서열에 대응되는 핵산 복합체 페어에 할당할 수 있다.
제1 온도의 해리피크값을 갖도록 설계된 제1 핵산 복합체 페어 및 제2 온도의 해리피크값을 갖도록 설계된 제2 핵산 복합체 페어를 이용하여 핵산서열증폭 반응을 수행하는 경우, 제1 온도에서 해리피크값이 확인되는지 여부에 기초하여 제1 핵산 복합체 페어의 제1 타겟핵산서열(TS1) 및 제2 타겟핵산서열(TS2)의 유무를 확인할 수 있고, 제2 온도에서 해리피크값이 확인되는지 여부에 기초하여 제2 핵산 복합체 페어의 제1 타겟핵산서열(TS1) 및 제2 타겟핵산서열(TS2)이 유무를 확인할 수 있다.
도 12는 본 출원의 일 실시예에 따른 하나의 형광 채널에 대한 미분 융해 곡선 그래프를 설명하기 위한 도면이다.
샘플내에 제1 핵산 복합체 페어의 타겟 서열 및 제2 핵산 복합체 페어의 타겟 서열이 포함되어 있는 경우, 온도에 대한 형광의 변화량 그래프(즉, 미분 융해 곡선 그래프)의 제1 온도(즉, 제1 핵산 복합체 페어와 관련된 해리피크값) 및 제2 온도(즉, 제2 핵산 복합체 페어와 관련된 해리피크값)에 대응되는 지점에서 극대점 또는 극소점이 확인될 수 있다. 제1 온도 및 제2 온도에서 극대점 또는 극소점이 확인되는 경우, 제1 핵산 복합체 페어에 관련된 타겟 핵산 및 제2 핵산 복합체 페어에 관련된 타겟 핵산의 존재를 확인할 수 있다.
제1 온도와 제2 온도 사이의 온도차이는 디바이스를 통해 구분 가능한 범위 내에서 설계될 수 있다. 바람직하게는, 제1 온도와 제2 온도 사이의 온도차이는 1~10℃의 범위가 되도록 복수 종류의 핵산 복합체 페어가 설계될 수 있다.
본 출원의 일 실시예에 따른 핵산 복합체 페어를 이용한 샘플내 타겟핵산서열 유무 확인의 경우, 핵산 복합체 페어와 관련된 해리피크값의 검출에 기초하여 샘플내 핵산 복합체 페어와 관련된 타겟핵산서열의 유무를 확인할 수 있다.
해리피크값은 핵산 복합체 페어의 제1 페어링부(112) 및 제2 페어링부(122)의 염기 배열에 따라 조절될 수 있다. 이에 따라, 융해 곡선 분석을 수행하여 타겟핵산서열 유무 확인에 이용되는 타 프로브와 비교하여, 본 출원의 일 실시예에 따른 핵산 복합체 페어를 이용한 타겟핵산서열 유무 확인의 경우 타겟핵산서열에 결합할 필요성이 없는 제1 페어링부(112) 및 제2 페어링부(122)의 서열 설계를 조절하여 복수 종류의 타겟 검출을 수행할 수 있어, 보다 간단하고 유연한 설계가 가능하다는 이점이 도출된다.
또한, 본 출원의 일 실시예에 따른 핵산 복합체 페어를 이용한 샘플내의 타겟핵산서열의 유무 검출에 따르면, 타겟핵산서열 유무 확인에 이용되는 타 프로브를 이용할 필요성이 적어, Asymmetric 방식을 이용하여 핵산서열증폭반응을 진행하지 않아도 충분한 효율성을 가질 수 있으며, 그 결과 검출 민감도가 증가한다는 이점이 도출될 수 있다.
본 출원에 의해 개시되는 핵산 복합체(100)를 포함하는 PCR용 키트는 2이상의 핵산 복합체 페어를 포함할 수 있다. PCR용 키트는 적어도 2종류 이상의 핵산 복합체 페어를 포함할 수 있다. PCR용 키트는 중합 반응을 수행하는데 관여하는 효소, 염기 조각, 핵산서열증폭반응에 관여하는 조효소, 핵산서열증폭반응에 최적 pH 및/또는 염농도를 제공하기 위해 완충용액 중 적어도 하나가 더 포함될 수 있다.
PCR용 키트는 적어도 하나 이상의 물질(예; 핵산 복합체 페어)이 포함된 컴포지션의 형태로 용기에 담아, 복수의 용기를 하나의 포장 용기에 담아 판매하는 형태로 구현될 수 있다. PCR용 키트는 적어도 하나 이상의 물질이 포함된 컴포지션의 형태로 하나의 용기에 담아 판매하는 형태로 구현될 수 있다. PCR용 키트는 적어도 하나 이상의 물질이 건조된 상태로 용기에 담아 판매하는 형태로 구현될 수 있다.
PCR용 키트는 X종 이하의 핵산 복합체 페어를 포함할 수 있다. 상기 X값은 복수 종류의 핵산 복합체(100)의 제1 페어링부(112) 및 제2 페어링부(122)의 결합의 해리에 따른 서로 다른 해리피크값의 차이(ΔT) 및 신호를 검출할 수 있는 온도 구간에 의존할 수 있다. 상기 X값은 디바이스가 구분 가능한 파장대 그룹의 개수에 의존할 수 있다. 상기 X값은 핵산 복합체 페어에 포함된 신호 물질의 종류에 의존할 수 있다.
예를 들어, 신호를 측정할 수 있는 최소온도가 40℃이고, 최고온도가 55℃이며, 상기 ΔT가 3℃인 경우, (55-40)/3=5가 하나의 형광 채널에 의해 구분하여 검출가능한 타겟 종류의 수가 되고, 디바이스가 구분 가능한 파장대 그룹의 개수가 5개 인 경우, 상기 X값은 25가 될 수 있다. 즉, 본 출원의 일 실시예에 따른 핵산 복합체 페어를 포함하는 PCR용 컴포지션을 사용하게 되면, 한 튜브에서 25종의 서로 다른 타겟의 유무를 확인하는 것이 가능해질 수 있다.
본 출원의 일 실시예에 따른 상기 제1 검출부(113) 및 제2 검출부(123)는, 제1 검출부(113) 및 제2 검출부(123)가 상호작용하는 경우(즉, 제1 검출부(113)의 상호작용유효거리 이내에 제2 검출부(123)가 위치하는 경우), 제1 검출부(113) 및 제2 검출부(123)로부터 출사되는 신호가 소광되도록 설계(이하, 신호소광방식)될 수 있다. 또는, 본 출원의 일 실시예에 따른 상기 제1 검출부(113) 및 제2 검출부(123)는, 제1 검출부(113) 및 제2 검출부(123)가 상호작용하는 경우(즉, 제1 검출부(113)의 상호작용유효거리 이내에 제2 검출부(123)가 위치하는 경우), 제1 검출부(113) 및 제2 검출부(123)로부터 출사되는 신호가 발광되도록 설계(이하, 신호발광방식)될 수 있다.
복수 종류의 핵산 복합체 페어가 핵산서열증폭반응에 이용되는 경우, 적어도 제1 핵산 복합체 페어와 제2 핵산 복합체 페어는 동일 방식으로 설계되어 있거나, 상이한 방식으로 설계되어 있을 수 있다.
PCR용 키트는 X종 이하의 핵산 복합체 페어를 포함하는 경우, 신호소광방식으로 설계된 X/2개의 핵산 복합체 페어 및 신호발광방식으로 설계된 X/2개의 핵산 복합체 페어로 구성될 수 있다. 이 경우, 하나의 튜브에서 검출가능한 타겟 종류의 수가 증가될 수 있다. 핵산 복합페 페어가 신호소광방식 및 신호발광방식으로 총 2개의 타입으로 설계되는 경우, 동일한 조건에서(예를 들어, 신호를 측정할 수 있는 최소온도가 40℃이고, 최고온도가 55℃이며, 상기 ΔT가 3℃인 경우) 검출가능한 타겟 종류의 수와 관련된 X값은 25*2=50으로 2배 증가될 수 있다.
1.1.2 디지털 PCR 에서의 이용
핵산서열증폭반응이 이용되는 분야 중 하나는 디지털 PCR이 있다. 디지털 PCR 분야에서는, 신호를 검출하는 대상이 되는 단위셀(UC)의 크기가 작아, 민감도 높고 정밀한 타겟 검출이 가능할 수 있다. 일 예로, 미미한 함량을 가지는 병원균에 감염된 피검자의 핵산 가닥, 돌연변이로 분류되는 핵산 가닥 등을 검출하는데에 디지털 PCR이 이용될 수 있다.
도 13은 본 출원의 일 실시예에 따른 핵산 복합체 페어를 디지털 PCR에서 이용하는 경우 수행되는 단계에 대해서 설명하기 위한 도면이다.
디지털 PCR에 이용되는 적어도 하나의 종류의 핵산 복합체 페어는, 전술한 일반적인 PCR에 이용되는 적어도 하나의 종류의 핵산 복합체 페어와 유사할 수 있다. 다시 말해, 디지털 PCR 에 이용되는 적어도 하나의 종류의 핵산 복합체 페어는, 제1 핵산 복합체(110) 및 제2 핵산 복합체(120)를 포함할 수 있고, 제1 핵산 복합체(110)는 제1 결정부(111), 제1 페어링부(112), 제1 검출부(113) 및/또는 제1 블록킹부를 포함할 수 있고, 제2 핵산 복합체(120)는 제2 결정부(121), 제2 페어링부(122), 제2 검출부(123) 및/또는 제2 블록킹부를 포함할 수 있다.
핵산 복합체 페어의 각각의 구성요소의 특징이나 구체적인 동작에 대해서는 일반적인 PCR에서 적용되는 핵산 복합체 페어와 관련해서 이미 자세하게 설명한바 있어, 중복된 기재는 생략하기로 하고, 디지털 PCR에서 변경되는 구성이나 동작 및/또는 다른 실시예에 대해서 설명하기로 한다.
본 출원의 일 실시예에 따르면, 디지털 PCR에서 샘플내의 타겟핵산서열의 유무를 확인하기 위해서는, 단위셀(UC)에 대한 핵산서열증폭반응(S2000)을 수행하기 이전에, 단위셀(UC)(예를 들어, 한칸의 웰)에 샘플 및 핵산 복합체 페어를 분배(S1200)하는 단계가 수행될 수 있다.
단위셀(UC)에 샘플 및 핵산 복합체 페어를 포함하는 혼합 용액을 분배하는 구체적인 실시 태양은, 디지털 PCR의 웰방식 및 드롭렛 방식 중 어느 방식에 적용되는지에 따라 다를 수 있다.
첫째로, 디지털 PCR은 다수의 웰(well)이 형성된 플레이트에 샘플 등을 분배하고, 핵산 서열 증폭 반응을 진행한 이후 각 well을 단위셀(UC)로 하여 형광값을 검출하는 방식(이하, 웰방식, 도 14(a) 참고)에 따라 수행될 수 있다.
샘플 및 핵산 복합체 페어는 단위셀(UC)(즉, 웰)에 순차적으로 분배될 수 있다. 샘플이 단위셀(UC)에 분배된 이후에 핵산 복합체 페어가 단위셀(UC)에 분배될 수 있다. 샘플 및 핵산 복합체 페어는, 샘플 및 핵산 복합체 페어를 포함하는 혼합 용액을 분배하는 형태로, 단위셀(UC)에 분배될 수 있다.
샘플 등을 단위셀(UC)에 분배하는 방식은 다양할 수 있다. 일 예로, 샘플 등은 미세 유동 채널을 이용한 방식을 통해 단위셀(UC)에 분배될 수 있다. 다른 예로, 샘플 등은, 웰의 상부가 개방된 형태로 구현된 플레이트 상에 샘플 등을 도말하는 형태로, 단위셀(UC)에 분배될 수 있다.
둘째로, 디지털 PCR은 다수의 Droplet 형태로 샘플을 분배하고, 다수의 Droplet에 대한 핵산 서열 증폭 반응을 진행한 이후 각 droplet을 단위셀(UC)로 하여 형광값을 검출하는 방식(이하, 드랍렛방식, 도 14(b) 참고)에 따라 수행될 수 있다.
샘플 및 핵산 복합체 페어는, 각각 단위셀(UC)보다 작은 크기의 드랍렛 형태로 구현되어 핵산서열증폭반응 이전에 병합되는 형태로, 단위셀(UC)에 분배될 수 있다. 샘플 및 핵산 복합체 페어는, 샘플 및 핵산 복합체 페어를 포함하는 혼합 용액을 단위셀(UC) 크기로 분배하는 형태로, 단위셀(UC)에 분배될 수 있다.
본 출원의 일 실시예에 있어서, 핵산 복합체 페어를 단위셀(UC)에 분배하는 과정에서, 제1 핵산 복합체(110) 및 제2 핵산 복합체(120)가 균질하게 분배되지 않는 문제가 생길 수 있다. 구체적으로, 특정 단위셀(UC)에 제1 핵산 복합체(110)가 제2 핵산 복합체(120)에 비해 많이 분배되거나, 특정 단위셀(UC)에 제2 핵산 복합체(120)가 제1 핵산 복합체(110)에 비해 많이 분배되거나, 특정 단위셀(UC)에 제1 핵산 복합체(110) 또는 제2 핵산 복합체(120)가 아예 분배되지 않는 경우, 시약은 낭비되는데 반해 정확한 타겟핵산서열의 유무 확인이 수행되지 않는 문제가 생길 수 있다.
이를 해결하기 위해, 핵산 복합체 페어의 단위셀(UC)에의 분배 이전에 제1 페어링부(112) 및 제2 페어링부(122)의 상보적 결합이 형성되어 있는 핵산 복합체 페어를 디지털 PCR분야에서 이용할 수 있다.
도 15 는 본 출원의 일 실시예에 따른 단위셀(UC)에의 분배 단계 이전에 제1 페어링부(112) 및 제2 페어링부(122)의 상보적 결합의 형성을 설명하기 위한 도면이다.
샘플 및 핵산 복합체 페어를 단위셀(UC)에 분배(S1200)하기 이전에, 핵산 복합체 페어의 제1 페어링부(112) 및 제2 페어링부(122)의 결합을 유도하는 안정화 단계(S1100)가 수행될 수 있다. 안정화 단계는, 혼합 용액의 온도를 적어도 40도 이하로 낮춰 일정 시간동안 유지하는 형태로 수행될 수 있다.
본 출원의 일 실시예에 따르면, 제1 핵산 복합체(110)는 적어도 포워드 프라이머 및 제1 페어링부(112)를 포함할 수 있고, 제2 핵산 복합체(120)는 적어도 리버스 프라이머 및 제2 페어링부(122)를 포함할 수 있다. 핵산 복합체 페어는 단위셀(UC)에 분배되기 이전에 제1 페어링부(112)와 제2 페어링부(122)가 상보적으로 결합한 형태로 안정화될 수 있다. 안정화된 제1 페어링부(112) 및 제2 페어링부(122)를 포함하는 핵산 복합체 페어를 단위셀(UC)에 분배하는 경우, 단위셀(UC)에 포워드 프라이머 또는 리버스 프라이머 중 일측의 비중이 상대적으로 높게 분배되는 것을 방지할 수 있다. 궁극적으로, 안정화된 제1 페어링부(112) 및 제2 페어링부(122)를 포함하는 핵산 복합체 페어를 단위셀(UC)에 분배하는 경우, 단위셀(UC)당 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머의 비율이 1:1이 되도록 분배하는 것이 가능해질 수 있다.
본 출원의 일 실시예에 따른 핵산 복합체 페어가 디지털 PCR에 이용되는 경우, 단위셀(UC)에 포함된 샘플 및 핵산 복합체 페어를 포함하는 혼합 용액은 타겟핵산서열을 증폭하기 위한 핵산서열증폭반응(S2000) 및/또는 혼합용액의 온도를 임의의 온도 이하로 낮춰 안정화 하는 단계(S3000)가 수행될 수 있다. 단계 S2000 및 S3000은 일반적인 PCR에서와 유사하게 수행될 수 있다.
다만, 융해곡선검출단계(S4000)를 수행하는 구체적인 실시 태양은 일반적인 PCR에 핵산 복합체 페어가 이용되는 것과 비교하여 변경될 수 있다.
구체적으로, 웰방식에서는 다수의 웰이 형성된 플레이트의 온도를 조절하여 단위셀(UC)에 포함된 혼합 용액(적어도, 샘플 및 핵산 복합체 페어가 포함됨)의 온도를 조절할 수 있다. 플레이트의 온도는, 플레이트가 배치되는 영역에 구현되어 있는 써모사이클러(thermocycler)의 온도를 조절함으로써, 조절될 수 있다.
다만, 드롭렛방식의 디지털 PCR의 경우, 미세 유동 채널을 이동하는 단위셀(UC)의 형광값을 검출하는 현재 디바이스에서 융해곡선을 검출하는 것이 간단하지 않다는 문제가 있다. 이를 해결하기 위해, 드롭렛 형태를 띠는 단위셀(UC)을 미세 유동 레인(LN)이 형성되어 있는 플레이트를 이용하여, 플레이트 상의 형성된 미세 유동 레인(LN)에 다수개의 단위셀(UC)을 균분할 수 있다.
도 16은 본 출원의 일 실시예에 따른 디지털 PCR에서의 융해곡선검출단계를 수행하는 방법을 설명하기 위한 도면이다.
본 출원의 일 실시예에 따른 융해곡선검출용 플레이트는, 다수개의 미세 유동 레인(LN)이 형성되어 있을 수 있다(도 16(a) 참고). 다수개의 레인(LN)이 형성된 플레이트의 각각의 미세 유동 레인(LN)에는 다수개의 단위셀(UC)이 균분될 수 있다. 본 출원의 일 실시예예 따른 융해곡선검출용 플레이트는 하나의 미세 유동 레인(LN)이 형성되어 있을 수 있다(도 16(b) 참고). 하나의 미세 유동 레인(LN)이 형성된 플레이트에 다수개의 단위셀(UC)이 일렬로 배열될 수 있다.
본 출원의 일 실시예에 따른 융해곡선검출용 플레이트는, 일 단위셀(UC)의 드롭렛이 충분히 들어갈 수 있는 크기의 미세 유동 레인(LN)이 형성되어 있을 수 있다. 적어도 하나의 미세 유동 레인(LN)은 드롭렛의 반지름에 기초하여 가로*세로*깊이가 결정될 수 있다. 또한, 적어도 하나의 미세 유동 레인(LN)은 가로*세로*깊이를 결정하는 데에 드롭렛의 반지름이 부피, 온도 또는 압력에 따라 변경될 수 있음을 고려될 수 있다.
결과적으로, 본 출원의 일 실시예에 따르면, 웰방식 또는 드롭렛방식의 디지털 PCR에서는 단위셀(UC)마다의 융해곡선을 검출할 수 있고, 융해곡선에 대한 정보에 기초하여 해리피크값을 확인할 수 있다.
따라서, 본 출원에서 개시하는 핵산 복합체 페어를 이용하면, 디지털 PCR 방식에서도 샘플내의 타겟핵산서열의 유무에 대한 확인이 가능한 이점이 있다.
또한, 본 출원에서 개시하는 다수 종류의 핵산 복합체 페어를 이용하면, 디지털 PCR 방식에서도 샘플내의 복수 종류의 타겟핵산서열의 유무에 대한 확인이 가능한 이점이 있다. 다시 말해, 동일 형광으로 검출되는 표지를 포함하는 다수 종류의 핵산 복합체 페어를 이용하면, 디지털 PCR 방식에서도 한 형광 채널당 샘플내의 복수 종류의 타겟핵산서열의 유무에 대한 확인이 가능한 이점이 있다.
< 핵산 복합체 페어 및 프로브 복합체(200)를 활용한 타겟 핵산 유무의 검출>
1. 핵산 복합체 페어 및 프로브 복합체(200)를 활용한 타겟핵산서열의 검출
*도 17은 본 출원의 일 실시예에 따른 타겟 물질(TM)에의 잉여 영역을 설명하기 위한 도면이다.
본 출원의 일 실시예에 따른 핵산 복합체 페어를 핵산서열증폭반응에 이용하여 타겟핵산서열의 유무를 확인하는 경우, 핵산 복합체 페어는 타겟 물질(TM)의 제1 타겟핵산서열(TS1) 및 제2 타겟핵산서열(TS2)에 결합하게 된다. 따라서, 타겟핵산서열의 유무 확인을 위한 핵산서열증폭반응에서 이용되는 영역(예를 들어, 제1 타겟핵산서열(TS1)과 제2 타겟핵산서열(TS2)의 사이) 중 제1 타겟핵산서열(TS1) 및 제2 타겟핵산서열(TS2)을 제외한 나머지 영역이 잉여영역(SR)으로 남게된다. 따라서, 타겟 검출을 위해 이용되는 프로브 복합체(200)는 잉여영역(SR)의 적어도 일부에 결합할 수 있고, 결과적으로, 제1 표지법(예, 핵산 복합체 페어를 이용한 타겟 검출 방법) 및 제2 표지법(예, 프로브 복합체(200)를 이용한 타겟 검출 방법)에 따른 타겟 검출 방법이 동시에 적용될 수 있게 된다.
예를 들어, 제2 표지법은 Taqman 방식, 분자비콘 방식, TOCE 방식, PNA 프로브 방식 또는 이들의 조합일 수 있고, 또한, 제2 표지법으로 활용될 수 있는 방식이 전술한 예들에 한정되는 것도 아니다.
본 출원에서 개시하는 표지법에 의하면, 종래 방식에 비하여 2-20배에 가까운 종류의 타겟핵산서열을 하나의 PCR 튜브를 통해 확인할 수 있게 된다.
제1 표지법 및 제2 표지법을 이용한 샘플내 타겟핵산서열을 검출하기 위해서는, 제1 표지법에 관련된 해리피크값 및 제2 표지법에 관련된 해리피크값이 중첩되지 않도록 설계하는 과정이 요구될 수 있다. 여기서, "해리피크값"이라 함은, 융해 곡선에 기초하여 온도에 대한 형광값의 변화량이 도시된 미분 융해 곡선 그래프에서, 극대점에 대응되는 온도값 또는 극소점에 대응되는 온도값을 의미할 수 있다.
도 18은 제1 표지법 및 제2 표지법에 관련된 해리피크값을 설명하기 위한 도면이다.
본 출원의 일 실시예에 따르면, 제공된 혼합 용액의 형광값을 검출하고 해리피크값을 확인할 수 있는 디바이스의 검출 가능 해리피크값이 T1, T2, T3, T4로 총4개인 경우, 제1 온도 구간에 포함되는 해리피크값은 제1 표지법에 할당하고 제2 온도 구간에 포함되는 해리피크값은 제2 표지법에 할당하는 형태로, 핵산 복합체 페어 및 프로브 복합체(200)가 설계될 수 있다. 일 예로, T1, T2는 제1 표지법에 관련된 해리피크값으로 할당되고, T3, T4는 제2 표지법에 관련된 해리피크값으로 할당될 수 있다.
또는, 본 출원의 다른 실시예에 따르면, 제공된 혼합 용액의 형광값을 검출하고 해리피크값을 확인할 수 있는 디바이스의 검출 가능 해리피크값이 T1, T2, T3, T4로 총4개인 경우, 몇몇 온도에 대응되는 해리피크값은 제1 표지법에 할당하고 제1 표지법에 할당되지 않은 온도에 대응되는 해리피크값은 제2 표지법에 할당하는 형태로, 핵산 복합체 페어 및 프로브 복합체(200)가 설계될 수 있다. 일 예로, T1, T3는 제1 표지법에 관련된 해리피크값으로 할당되고, T2, T4는 제2 표지법에 관련된 해리피크값으로 할당될 수 있다.
보다 구체적인 예를 들어, 신호를 측정할 수 있는 최소온도가 35℃이고, 최고온도가 60℃이며, 상기 ΔT가 5℃인 경우, 하나의 형광 채널에 대하여 측정가능한 온도는 35, 40, 45, 50, 55, 60℃로 최대 6개의 온도구간에 대응되는 해리피크값이 검출가능할 수 있다.
이 때, 일 예로, 제1 표지법에 대응되는 해리피크값으로 35, 40, 45 ℃이 각각 할당되도록 핵산 복합체 페어가 설계되고, 제2 표지법에 대응되는 해리피크값으로 50, 55, 60℃이 각각 할당되도록 프로브 복합체(200)는 설계될 수 있다. 이러한 형태로 설계된 핵산 복합체 페어 및 프로브 복합체(200)를 이용하면, 프로브 복합체(200)의 프로브결합영역(PR)에의 결합이 핵산서열증폭반응에서 수행되어야 하는 경우, 핵산서열증폭반응에서의 어닐링 온도를 고려하여 프로브 복합체(200)와 관련된 해리피크값으로 50, 55, 60℃를 각각 할당하고, 핵산 복합체 페어와 관련된 해리피크값으로 나머지 35, 40, 45℃을 각각 할당할 수 있다는 이점이 도출된다.
다른 예로, 제1 표지법에 대응되는 해리피크값으로 35, 45, 55℃이 각각 할당되도록 핵산 복합체 페어가 설계되고, 제2 표지법에 대응되는 해리피크값으로 40, 50, 60℃이 각각 할당되도록 프로브 복합체(200)가 설계될 수 있다. 이러한 형태로 설계된 핵산 복합체 페어 및 프로브 복합체(200)를 이용하면, 복수 종류의 핵산 복합체 페어 및/또는 복수 종류의 프로브 복합체(200)를 설계함에 있어 5℃의 해리피크값이 차이나도록 설계하는데에 어려움이 있는 경우, 해리피크값이 10℃ 차이나는 복수 종류의 핵산 복합체 페어 및 복수 종류의 프로브 복합체(200)를 이용함으로써 상대적으로 많은 온도 구간을 활용할 수 있다는 이점이 도출된다.
도 19는 본 출원의 일 실시예에 따른 핵산 복합체 페어 및/또는 프로브 복합체(200)와 타겟 물질(TM)의 결합을 설명하기 위한 도면이다.
본 출원의 일 실시예에 따르면, 프로브 복합체(200)가 결합하는 프로브결합영역(PR)에 대한 증폭산물의 생성과 관련된 프라이머로 핵산 복합체 페어가 이용되는 경우, 핵산 복합체 페어 및 프로브 복합체(200)를 이용하여 타겟핵산서열 검출이 가능한 타겟 종류의 수는, 프로브 복합체(200)를 이용하여 타겟핵산서열 검출이 가능한 타겟 종류의 수(N1) * 핵산 복합체 페어를 이용하여 타겟핵산서열 검출이 가능한 타겟 종류의 수(N2)일 수 있다(도198(a) 참고).
보다 구체적인 예를 들어, 제1 표지법에 할당된 해리피크값의 온도가 40, 45, 50℃이고, 제2 표지법에 할당된 해리피크값의 온도가 55, 60, 65℃이며, 총 5개의 형광 파장대(또는 형광 물질)가 검출 가능한 경우, 프로브 복합체(200)가 결합하는 프로브결합영역(PR)에 대한 증폭산물의 생성과 관련된 프라이머로 핵산 복합체 페어가 이용되면, 핵산 복합체 페어와 본 프로브 복합체(200)를 이용하여 타겟핵산서열의 검출을 수행하여 총 3*5*3*5=225개의 타겟의 검출이 가능할 수 있다.
[표 1]
Figure 112018089888037-pat00001
Figure 112018089888037-pat00002
Figure 112018089888037-pat00003
Figure 112018089888037-pat00004
Figure 112018089888037-pat00005
본 출원의 다른 실시예에 따르면, 프로브 복합체(200)가 결합하는 프로브결합영역(PR)에 대한 증폭산물의 생성과 관련된 프라이머로 핵산 복합체 페어가 이용되지 않는 경우, 핵산 복합체 페어 및 프로브 복합체(200)를 이용하여 타겟핵산서열 검출이 가능한 타겟 종류의 수는, 프로브 복합체(200)를 이용하여 타겟핵산서열 검출이 가능한 타겟 종류의 수(N1) + 핵산 복합체 페어를 이용하여 타겟핵산서열 검출이 가능한 타겟 종류의 수(N2)일 수 있다(도189(b) 참고).
보다 구체적인 예를 들어, 제1 표지법에 할당된 해리피크값의 온도가 40, 45, 50℃이고, 제2 표지법에 할당된 해리피크값의 온도가 55, 60, 65℃이며, 총 5개의 형광 파장대(또는 형광 물질)가 검출 가능한 경우, 프로브 복합체(200)가 결합하는 프로브결합영역(PR)에 대한 증폭산물의 생성과 관련된 프라이머로 핵산 복합체 페어가 이용되지 않더라도, 핵산 복합체 페어와 본 프로브 복합체(200)를 이용하여 타겟핵산서열의 검출을 수행하면, 총 3*5+3*5=30개의 타겟의 검출이 가능할 수 있다.
[표 2]
Figure 112018089888037-pat00006
지금까지, 샘플내의 타겟핵산서열 검출을 위해 하나의 튜브(또는 단위셀)에서 이용되는 핵산 복합체 페어 및 프로브 복합체(200)의 설계 및 동작에 대해서 설명하였다.
이하에서는, 본 출원의 몇몇 실시예에 따르는 프로브 복합체(200), 및 핵산 복합체 페어 및 프로브 복합체(200)를 이용한 타겟핵산서열 검출 방법에 대해서 구체적으로 설명하기로 한다.
2. 제1 실시예에 따른 프로브 복합체(210)
2.1 제1 실시예에 따른 프로브 복합체(210)
도 20은 본 출원의 제1 실시예에 따른 프로브 복합체(210)를 설명하기 위한 도면이다.
본 출원의 제1 실시예에 따른 프로브 복합체(210)는 결정부(211), 제1 페어링부(212), 제2 페어링부(213), 제1 검출부(214) 및 제2 검출부(215)를 포함할 수 있다.
상기 결정부(211)는 제1 페어링부(212) 및 제2 페어링부(213)에 연결되어 있을 수 있다. 상기 결정부(211)의 일측에 제1 페어링부(212)가 연결되고, 상기 결정부(211)의 다른측에 제2 페어링부(213)가 연결될 수 있다. 상기 결정부(211)의 일측에 제1 페어링부(212)가 결합되고, 상기 결정부(211)의 다른측에 제2 페어링부(213)가 결합될 수 있다. 제1 페어링부(212)에는 제1 검출부(214)가 연결될 수 있다. 제1 페어링부(212)에는 제1 검출부(214)가 결합될 수 있다. 제2 페어링부(213)에는 제2 검출부(215)가 연결될 수 있다. 제2 페어링부(213)에는 제2 검출부(215)가 결합될 수 있다.
상기 결정부(211)는 다른 핵산 서열과 상보적으로 결합하는 영역을 포함할 수 있다. 상기 결정부(211)는 다른 핵산 서열과 특이적으로 결합하는 영역을 포함할 수 있다. 상기 결정부(211)가 다른 핵산 서열과 상보적으로 결합하는 영역을 포함한다는 것의 의미는, 상기 결정부(211)의 적어도 일부 영역이 다른 핵산 서열과 전기적, 화학적, 또는 물리적 성질 중 적어도 하나의 성질이 대응되어, 다른 핵산 서열과 연관되는 것을 의미할 수 있다.
상기 결정부(211)는 적어도 하나 이상의 핵산 서열을 포함할 수 있다. 상기 적어도 하나 이상의 핵산 서열은 DNA(deoxyribonucleic acid), LNA(Locked nucleic acid), PNA(Peptide nucleic acid), HNA(Hexose nucleic acid), RNA(Ribonucleic acid), 또는 다양한 핵산(nucleic acid)의 유사체들 또는 이들의 조합으로 이루어질 수 있다.
상기 결정부(211)는, 프로브결합영역(PR)에 상보적으로 결합할 수 있다. 상기 결정부(211)는 상기 프로브결합영역(PR)에 특이적으로 결합할 수 있다. 여기서, "프로브결합영역(PR)"이라 함은, 상기 결정부(211)와 상보적으로 결합할 수 있는 염기 배열을 갖는 특정 핵산 서열을 의미할 수 있다.
본 출원의 일 실시예에 따르면, 결정부(211)의 상기 프로브결합영역(PR)과의 결합이 해리되는 온도에 기초하여 해리피크값이 결정될 수 있다. 결정부(211)와 프로브결합영역(PR)의 결합에 이용되는 염기의 종류, 염기의 서열, 염기의 수 등에 기초하여 결정부(211)와 프로브결합영역(PR)사이의 결합력이 결정될 수 있고, 따라서, 결정부(211)와 프로브결합영역(PR)의 결합에 이용되는 염기의 종류, 염기의 서열, 염기의 수 등에 기초하여 해리피크값이 결정될 수 있다.
상기 제1 페어링부(212)는, 상기 제2 페어링부(213)와 결합할 수 있다. 본 출원의 일 실시예에 따른 프로브 복합체(210)는, 상기 제1 페어링부(212)와 제2 페어링부(213)가 서로 상보적으로 결합하도록 구현될 수 있다. 제1 페어링부(212)는 제2 페어링부(213)의 적어도 일부의 서열과 상보적인 염기 배열을 포함할 수 있다. 제2 페어링부(213)는 제1 페어링부(212)와 상보적인 염기 배열을 포함할 수 있다.
제1 페어링부(212) 및 제2 페어링부(213)는 적어도 하나 이상의 핵산 서열을 포함할 수 있다. 상기 적어도 하나 이상의 핵산 서열은 DNA(deoxyribonucleic acid), LNA(Locked nucleic acid), PNA(Peptide nucleic acid), HNA(Hexose nucleic acid), RNA(Ribonucleic acid), 또는 다양한 핵산(nucleic acid)의 유사체들 또는 이들의 조합으로 이루어질 수 있다.
상기 제1 검출부(214) 및 제2 검출부(215)는 상호작용하는 영역을 포함할 수 있다. 제1 검출부(214)와 제2 검출부(215)는 서로 에너지를 교환하는 영역을 포함할 수 있다. 일 예로, 제1 검출부(214)는 제2 검출부(215)에 에너지를 제공하는 영역을 포함하고, 제2 검출부(215)는 제1 검출부(214)로부터 에너지를 제공받는 영역을 포함할 수 있다.
제1 검출부(214)와 제2 검출부(215)는 서로 상이한 성질을 가질 수 있다. 제1 검출부(214)와 제2 검출부(215)가 광학적 성질을 가지는 경우, 제1 검출부(214)가 가지는 광학적 성질과 제2 검출부(215)가 가지는 광학적 성질은 상이할 수 있다. 일 예로, 제1 검출부(214)에서 출사되는 광의 파장대와 제2 검출부(215)에서 출사되는 광의 파장대는 다를 수 있다.
본 출원의 일 실시예에 따르면, 제1 페어링부(212) 및 제2 페어링부(213)간의 결합 여부에 기초하여, 제1 검출부(214) 및 제2 검출부(215)간의 상호작용 여부가 결정될 수 있다. 구체적으로, 제1 결정부(211)와 프로브결합영역(PR)사이의 결합이 해리되면, 프로브 복합체(210)의 자가응집(Self-aggregation)에 의해 제1 페어링부(212)와 제2 페어링부(213)가 상보적으로 결합할 수 있다. 제1 페어링부(212)와 제2 페어링부(213)가 결합하면, 제1 페어링부(212)와 연결된 제1 검출부(214)와 제2 페어링부(213)와 연결된 제2 검출부(215)사이의 거리가 인접해져 상호작용이 가능해질 수 있다.
제1 페어링부(212)와 제2 페어링부(213)의 결합으로 제1 검출부(214)의 상호작용유효거리(ID) 이내에 제2 검출부(215)가 위치하는 경우, 제1 검출부(214) 및/또는 제2 검출부(215)에 포함된 신호발생물질에 기인한 검출 신호는 변경될 수 있다. 일 예로, 신호의 변경은 제1 검출부(214) 및 제2검출부(215)로부터 검출되는 신호의 파장대(예; 빛의 파장대)를 변경하는 것을 의미할 수 있다.
2.2 제1 실시예에 따른 프로브 복합체(210)를 이용한 타겟 핵산 유무의 검출 방법
본 출원의 제1 실시예에 따른 프로브 복합체(210)는 핵산서열증폭반응에서 이용되어 타겟핵산서열을 검출하는데에 이용될 수 있다.
구체적으로, 제1 실시예에 따른 프로브 복합체(210)는 타겟핵산서열이 존재할 것으로 의심되는 샘플과 접촉할 수 있다. 프로브 복합체(210) 및 샘플이 포함된 혼합 용액이 제공될 수 있다. 혼합 용액의 온도를 적절히 조절하여, 혼합 용액 내의 타겟핵산서열과 관련된 올리고 뉴클레오타이드의 적어도 일부가 증폭될 수 있다. 상기 올리고 뉴클레오타이드는 타겟핵산서열을 포함하는 타겟 물질일 수 있다. 핵산서열증폭단계에서는, 열변성단계, 어닐링단계 및 중합반응단계가 순차적으로 진행될 수 있다. 핵산서열증폭단계에서는, 열변성단계, 어닐링단계 및 중합반응단계가 반복적으로 진행될 수 있다.
증폭이 완료된 혼합 용액에 대하여 융해 곡선을 검출하는 단계가 진행될 수 있다. 융해 곡선에 기초하여 해리피크값이 검출될 수 있다. 해리피크값은, 프로브 복합체(210)의 결정부(211)가 프로브결합영역(PR)으로부터 해리되는 온도와 관련되어 있을 수 있다. 극단적으로, 해리피크값은 프로브 복합체(210)의 결정부(211)가 프로브결합영역(PR)으로부터 해리되는 온도에 대응될 수 있다.
복수 종류의 프로브 복합체(210)를 이용한 복수 종류의 타겟핵산서열 검출에 있어서, 결정부(211)가 타겟하는 프로브결합영역(PR)의 서열 및 결정부(211)와 프로브결합영역(PR)사이의 결합력을 조절하여 복수 종류의 프로브 복합체(210)를 구현할 수 있다. 그 결과, 위와 같은 방법으로 확인된 해리피크값에 대응되는 프로브 복합체(210)의 종류를 확인하여, 샘플내에 타겟핵산서열의 종류를 확인할 수 있다. 타겟핵산서열은, 프로브결합영역(PR)에 대응되는 서열일 수 있다. 타겟핵산서열은 프로브결합영역(PR)에 대응되는 핵산 서열과 동일한 서열 수 있다.
본 출원의 제1 실시예에 따른 프로브 복합체(210)의 결정부(211)의 단위 핵산이 PNA인 경우, 중합 반응 단계에서 타겟핵산서열과 관련된 올리고 뉴클레오티드에 대한 증폭산물의 생산에 관여하는 효소(예, 폴리머레이즈)에 의한 결정부(211)의 분해가 일어나지 않을 수 있다. 이는, PNA의 상대적으로 강한 결합력에 기인한 것일 수 있다. 또는, PNA의 상이한 구조에 기인한 것일 수 있다.
다만, 본 출원의 제1 실시예에 따른 프로브 복합체(210)의 결정부(211)의 단위 핵산이 DNA인 경우, 중합 반응 단계에서 타겟핵산서열과 관련된 올리고 뉴클레오티드에 대한 증폭산물의 생산에 관여하는 효소(예, 폴리머레이즈)에 의해 결정부(211)가 분해될 수 있다. 따라서, 프로브 복합체(210)의 결정부(211)의 단위 핵산이 DNA인 경우, 전술한 타겟 검출 방법이 수행되지 않을 수 있다.
이를 해결하기 위해, 본 출원의 일 실시예에 따른 프로브 복합체(210)는, 상기 중합 반응 단계에서 타겟핵산서열과 관련된 올리고 뉴클레오티드에 대한 증폭산물의 생산에 관여하는 효소(예를 들어, 폴리머레이즈)가 프로브 복합체(210)의 결정부(211)의 절단하는 것을 저해하기위한 효소를 프로브 복합체(210)에 결합시킨 형태로, 구현될 수 있다.
또는, 중합 반응 단계에서 이용되는 효소의 특정 도메인의 활성을 결여시키는 형태로, 프로브 복합체(210)의 결정부(211)가 절단되는 것을 방지할 수 있다. 일 예로, 핵산말단가수분해효소활성이 결여된 DNA 폴리머제이즈를 이용하여 핵산서열증폭반응을 진행할 수 있다.
2.3 제1 실시예에 따른 프로브 복합체(210) 및 핵산 복합체 페어를 활용한 타겟핵산서열의 검출 방법
본 출원의 일 실시예에 따른 프로브 복합체(210) 및 핵산 복합체 페어를 이용한 타겟핵산서열의 검출을 위해서는, 도 6에서 설명한 바와 같이, 혼합용액이 제공되는 단계, 핵산서열증폭반응 단계, 안정화 단계, 융해곡선 검출 단계 및 피크검출값 확인 단계가 수행될 수 있다.
혼합 용액 제공 단계에서는, 적어도 하나의 종류의 프로브 복합체(210) 및 적어도 하나의 종류의 핵산 복합체 페어가 제공될 수 있다.
복수 종류의 프로브 복합체(210)가 혼합 용액에 제공되는 경우, 복수 종류의 프로브 복합체(210)는 각각의 프로브 복합체(210)의 결정부(211)와 프로브결합영역(PR)과의 결합력이 서로 상이하게 설계될 수 있다. 복수 종류의 프로브 복합체(210)가 혼합 용액에 제공되는 경우, 복수 종류의 프로브 복합체(210)는 각각의 프로브 복합체(210)의 결정부(211)의 염기의 수, 염기의 종류, 단위핵산의 종류 등에 기초한 해리피크값이 서로 상이하게 설계될 수 있다.
복수 종류의 핵산 복합체 페어가 혼합 용액에 제공되는 경우, 복수 종류의 핵산 복합체 페어는 제1 페어링부(112) 및 제2 페어링부(122)간의 결합력이 서로 상이하게 설계될 수 있다. 복수 종류의 핵산 복합체 페어가 혼합 용액에 제공되는 경우, 복수 종류의 핵산 복합체 페어는 제1 페어링부(112) 및 제2 페어링부(122)의 염기의 수, 염기의 종류, 단위핵산의 종류 등에 기초한 해리피크값이 서로 상이하게 설계될 수 있다.
혼합 용액에는 핵산서열증폭반응에 이용되는 효소, 염기 조각, 조효소, 완충 용액 등이 더 제공될 수 있다. 혼합 용액 제공 단계에서 이용될 수 있는 PCR 용 키트는, 제1 실시예에 따른 프로브 복합체(210), 핵산 복합체 페어, 핵산서열증폭반응에 이용되는 효소, 염기 조각, 조효소 및 완충 용액 중 적어도 하나가 포함될 수 있다.
PCR용 키트는 적어도 하나 이상의 물질(예; 핵산 복합체 페어)이 포함된 컴포지션의 형태로 용기에 담아, 복수의 용기를 하나의 포장 용기에 담아 판매하는 형태로 구현될 수 있다. PCR용 키트는 적어도 하나 이상의 물질이 포함된 컴포지션의 형태로 하나의 용기에 담아 판매하는 형태로 구현될 수 있다. PCR용 키트는 적어도 하나 이상의 물질이 건조된 상태로 용기에 담아 판매하는 형태로 구현될 수 있다.
도 21 및 도 22는 본 출원의 일 실시예에 따른 프로브 복합체(210) 및 핵산 복합체 페어를 포함하는 혼합 용액의 핵산서열증폭반응을 설명하기 위한 도면이다.
본 출원의 일 실시예에 따르면, 프로브 복합체(210) 및 핵산 복합체 페어를 이용한 핵산서열증폭반응을 진행함에 있어, 상기 핵산서열증폭반응은 Asymmetric PCR 방식에 따라서 진행될 수 있다. 이하에서는, Asymmetric PCR 방식에 따른 핵산서열증폭반응에 대해서 설명한다. Asymmetric PCR 방식에 따른 핵산서열증폭반응을 진행하기 위한 혼합 용액에는, 제2 핵산 복합체(120)에 비해 상대적으로 많은 비중의 제1 핵산 복합체(110)가 포함되어 있을 수 있다.
열변성 단계에서는, 샘플, 프로브 복합체(210) 및 핵산 복합체 페어가 포함된 혼합 용액의 온도를 상승시켜, 샘플 내의 이중 가닥의 핵산 구조체는 단일 가닥의 핵산 구조체로 분리될 수 있다. 이 때, 분리되는 이중 가닥의 핵산 구조체는 제1 타겟핵산서열(TS1), 제2 타겟핵산서열(TS2) 및/또는 프로브결합영역(PR)을 포함할 수 있다.
어닐링 단계에서는, 단일 가닥의 핵산 구조체 중 적어도 일부 영역에 제1 핵산 복합체(110), 제2 핵산 복합체(120) 및/또는 프로브 복합체(210)가 결합될 수 있다.
중합 반응 단계에서는, 제1 결정부(111) 및/또는 제2 결정부(121)를 개시점으로 하여, 제1 타겟핵산서열(TS1) 또는 제2 타겟핵산서열(TS2)을 포함하는 타겟 물질(TM)에 대한 증폭산물이 생성될 수 있다. 만약, 제1 결정부(111) 또는 제2 결정부(121)가 프로브 복합체(210)와 관련된 프라이머로써 활용되는 경우에는, 제1 결정부(111) 또는 제2 결정부(121)로부터의 증폭 산물의 생성에 의해서 프로브 복합체(210)가 프로브 결합 영역(PR)으로부터 분리될 수 있다. 다시 말해, 만약, 제1 결정부(111) 또는 제2 결정부(121)가 프로브 복합체(210)와 관련된 프라이머로써 활용되는 경우에는, 제1 결정부(111) 또는 제2 결정부(121)로부터의 증폭 산물의 생성의 개시된 이후, 프로브 복합체(210)가 결합된 영역에 인접한 핵산 서열에 대한 증폭 산물의 생성 시점에, 프로브 복합체(210)가 프로브 결합 영역(PR)으로부터 분리될 수 있다.
1회의 싸이클 이후의 열변성 단계에서는, 혼합 용액 내의 이중 가닥의 핵산 구조체는 단일 가닥의 핵산 구조체로 분리될 수 있다. 이 때, 중합 반응 단계에서 형성되었던 적어도 하나의 핵산 복합체(100)를 포함하는 이중 가닥의 핵산 구조체도 단일 가닥의 핵산 구조체로 분리될 수 있다.
1회의 싸이클 이후의 어닐링 단계에서는, 혼합 용액 내의 단일 가닥 중 제1 타겟핵산서열(TS1) 및/또는 제2 타겟핵산서열(TS2)에 제1 핵산 복합체(110) 또는 제2 핵산 복합체(120)가 결합될 수 있다. 이 때, 제1 핵산 복합체(110)가 포함된 단일 가닥의 핵산 구조체에는 제2 핵산 복합체(120)가 결합될 수 있다. 제2 핵산 복합체(120)가 포함된 단일 가닥의 핵산 구조체에는 핵산 복합체 페어의 제1 핵산 복합체(110)가 결합될 수 있다.
1회의 싸이클 이후의 중합반응 단계에서는, 제1 결정부(111) 또는 제2 결정부(121)를 개시점으로 하여, 제1 타겟핵산서열(TS1) 또는 제2 타겟핵산서열(TS2)을 포함하는 타겟 물질(TM)에 대한 증폭산물이 생성될 수 있다. 마찬가지로, 제1 결정부(111) 또는 제2 결정부(121)가 프로브 복합체(210)와 관련된 프라이머로써 활용되는 경우, 제1 결정부(111) 또는 제2 결정부(121)로부터의 증폭 산물의 생성에 의해서 프로브 복합체(210)가 프로브 결합 영역(PR)으로부터 분리될 수 있다.
적어도 2회 이상의 핵산서열증폭반응이 수행된 혼합 용액은, 제1 핵산 복합체(110) 및 제2 핵산 복합체(120)를 포함하는 핵산 구조체, 제1 핵산 복합체(110)를 포함하는 핵산 구조체, 제2 핵산 복합체(120)를 포함하는 핵산 구조체 및 제1 핵산 복합체(110) 및 제2 핵산 복합체(120)를 포함하지 않는 핵산 구조체를 포함할 수 있다.
다만, 혼합 용액에 포함된 제2 핵산 복합체(120)의 비율이 제1 핵산 복합체(110)에 비해 적어(Asymmetric PCR 방식), 제1 타겟핵산서열(TS1) 및/또는 제2 타겟핵산서열(TS2)을 포함하는 이중 가닥의 핵산 구조체 중 제2 핵산 복합체(120)가 결합되는 단일 가닥의 핵산 구조체가 이중 가닥의 핵산 구조체로 증폭되지 않고 단일 가닥의 핵산 구조체로 남게된다.
핵산서열증폭반응이 완료된 후, 핵산서열증폭반응이 완료된 혼합용액의 온도를 임의의 온도 이하로 낮춰 안정화 하는 단계가 수행될 수 있다. 안정화 단계에서는, 남겨진 적어도 제2 타겟핵산 서열(TS2)을 포함하는 단일 가닥의 핵산 구조체에는 프로브 복합체(210)가 결합될 수 있다. 안정화 단계에서는, 제1 핵산 복합체(110) 및 제2 핵산 복합체(120)를 포함하는 핵산 구조체의 제1 페어링부(112) 및 제2 페어링부(122)간의 상보적 결합이 수행될 수 있다.
안정화 단계 이후, 혼합 용액에 대한 융해 곡선 검출이 진행될 수 있다. 또한, 융해 곡선 검출에 기초한 해리피크값의 확인이 진행될 수 있다.
본 출원의 일 실시예에 따르면, 융해 곡선 검출에 기초한 미분 융해 곡선 그래프에는 T1 및 T2의 온도에서 극대점이 도시된 온도에 대한 형광의 변화량 그래프가 도시될 수 있다(미도시도 23 참고). 또는, 본 출원의 일 실시예에 따르면, 융해 곡선 검출에 기초한 미분 융해 곡선 그래프에는 T1 및 T2의 온도에서 극소점이 도시된 온도에 대한 형광의 변화량 그래프가 도시될 수 있다(도 23 참고미도시). 또는, 본 출원의 일 실시예에 따르면, 융해 곡선 검출에 기초한 미분 융해 곡선 그래프에는 T1 및 T2의 온도에서 극대점 및 극소점이 도시된 온도에 대한 형광의 변화량 그래프가 도시될 수 있다(미도시).
구체적인 예를 들어, 미분융해곡선에서 극대점이 도시된 T1은 핵산 복합체 페어에 관련된 해리피크값일 수 있다. 이 때의 핵산 복합체 페어는 신호소광방식의 상호작용을 수행하도록 설계되어 있을 수 있다. 미분융해곡선에서 극대점이 도시된 T2은 복합체 프로브(210) 에 관련된 해리피크값일 수 있다. 이 때의 복합체 프로브(220)는 신호발광방식의 상호작용을 수행하도록 설계되어 있을 수 있다.
보다 구체적인 예를 들어, 핵산 복합체 페어와 관련하여 해리피크값이 40, 45 또는 50℃로 할당되고, 총 5개의 형광 물질이 각각 표지된, 서로 다른 15 종류의 핵산 복합체 페어를 설계하고, 프로브 복합체(210)와 관련하여 해리피크값이 55, 60 또는 65℃로 할당되고, 총 5개의 형광 물질이 각각 표지된, 서로 다른 15 종류의 프로브 복합체(210)를 설계하여, 이를 포함하는 혼합 용액에 대한 핵산서열증폭반응을 진행한 경우의 미분 융해 곡선 그래프가 도 23의 그래프라면, T1이 FAM 45℃, T2가 FAM 60℃일 때 샘플내에는 표1의 Target ID 101에 대응되는 타겟핵산서열이 존재하는 것으로 확인할 수 있다.
3. 제2 실시예에 따른 프로브 복합체(220) 및 이를 이용한 타겟핵산서열 검출 방법
3.1 제2 실시예에 따른 프로브 복합체(220)
도 24는 본 출원의 제2 실시예에 따른 프로브 복합체(220)를 설명하기 위한 도면이다.
본 출원의 제2 실시예에 따른 프로브 복합체(220)는 물리적으로 구분된 제1 프로브유사체 및 제2 프로브유사체로 구성될 수 있다. 제1 프로브유사체는 결정부(221) 및 제1 페어링부(222)를 포함할 수 있다. 제1 프로브유사체는 결정부(221)에 제1페어링부(222)가 연결되어 있는 형태로 구현될 수 있다. 제1 프로브유사체는 결정부(221)에 제1 페어링부(222)가 결합되어 있는 형태로 구현될 수 있다. 제2 프로브유사체는 제2 페어링부(223), 제1 검출부 (224) 및 제2 검출부(225)를 포함할 수 있다. 제 2 프로브유사체는 제2 페어링부(223)에 제1 검출부(224) 및 제2 검출부(225)가 연결되어 있는 형태로 구현될 수 있다. 제2 프로브유사체는 제2 페어링부(223)에 제1 검출부(224) 및 제2 검출부(225)가 결합되어 있는 형태로 구현될 수 있다.
상기 결정부(221)는 다른 핵산 서열과 상보적으로 결합하는 영역을 포함할 수 있다. 상기 결정부(221)는 다른 핵산 서열과 특이적으로 결합하는 영역을 포함할 수 있다. 상기 결정부(221)가 다른 핵산 서열과 상보적으로 결합하는 영역을 포함한다는 것의 의미는 상기 결정부(221)의 적어도 일부 영역이 다른 핵산 서열과 전기적, 화학적, 또는 물리적 성질 중 적어도 하나의 성질이 대응되어, 다른 핵산 서열과 연관되는 것을 의미할 수 있다.
상기 결정부(221)는 적어도 하나 이상의 핵산 서열을 포함할 수 있다. 상기 적어도 하나 이상의 핵산 서열은 DNA(deoxyribonucleic acid), LNA(Locked nucleic acid), PNA(Peptide nucleic acid), HNA(Hexose nucleic acid), RNA(Ribonucleic acid), 또는 다양한 핵산(nucleic acid)의 유사체들 또는 이들의 조합으로 이루어질 수 있다.
상기 결정부(221)는, 프로브결합영역(PR)에 상보적으로 결합할 수 있다. 상기 결정부(221)는 상기 프로브결합영역(PR)에 특이적으로 결합할 수 있다. 여기서, "프로브결합영역(PR)"이라 함은, 상기 결정부(221)와 상보적으로 결합할 수 있는 염기 배열을 갖는 특정 핵산 서열을 의미할 수 있다.
상기 제1 페어링부(222)는, 상기 프로브결합영역(PR)을 포함하는 타겟 물질(TM)에 대한 증폭 산물이 생성되는 경우, 결정부(221)로부터 분리될 수 있다. 상기 제1 페어링부(222)는, 상기 프로브결합영역(PR)을 포함하는 타겟 물질(TM)에 대한 증폭 산물의 생성이 개시되어, 프로브결합영역(PR)에 인접한 영역까지 증폭이 진행된 경우, 결정부(221)로부터 분리될 수 있다.
상기 제1 페어링부(222)는, 중합 반응을 수행하는데 관여하는 중합 효소(예; 폴리머레이즈)의 작용으로, 결정부(221)로부터 분리될 수 있다. 상기 제1 페어링부(222)는, 중합 효소의 작용으로, 결정부(221)로부터 절단되어 분리될 수 있다. 일 예로, 상기 제1 페어링부(222)의 결정부(221)로부터의 분리는 폴리머레이즈의 핵산말단가수분해효소의 활성에 의한 것일 수 있다.
상기 제1 페어링부(222)는 상기 제2 페어링부(223)의 적어도 일부와 결합할 수 있다. 본 출원의 일 실시예에 따른 프로브 복합체(200)는, 상기 제1 페어링부(222)와 제2 페어링부(223)가 서로 상보적으로 결합하도록 구현될 수 있다. 제1 페어링부(222)는 제2 페어링부(223)와 상보적인 염기 배열을 포함할 수 있다. 제2 페어링부(223)는 제1 페어링부(222)와 상보적인 염기 배열을 포함할 수 있다.
제1 페어링부(222)는 제2 페어링부(223)에 결합되어 프라이머로써의 기능을 수행할 수 있다. 다시 말해, 제2 페어링부(223)의 적어도 일부 영역에 제1 페어링부(222)가 결합되는 경우, 제1 페어링부(222)를 개시점으로 하여 제2 페어링부(223)에 대한 증폭 산물이 생성될 수 있다.
제1 페어링부(222) 및 제2 페어링부(223)는 적어도 하나 이상의 핵산 서열을 포함할 수 있다. 상기 적어도 하나 이상의 핵산 서열은 DNA(deoxyribonucleic acid), LNA(Locked nucleic acid), PNA(Peptide nucleic acid), HNA(Hexose nucleic acid), RNA(Ribonucleic acid), 또는 다양한 핵산(nucleic acid)의 유사체들 또는 이들의 조합으로 이루어질 수 있다.
상기 제1 검출부(224) 및 제2 검출부(225)는 상호작용하는 영역을 포함할 수 있다. 제1 검출부(224)와 제2 검출부(225)는 서로 에너지를 교환하는 영역을 포함할 수 있다. 일 예로, 제1 검출부(224)는 제2 검출부(225)에 에너지를 제공하는 영역을 포함하고, 제2 검출부(225)는 제1 검출부(224)로부터 에너지를 제공받는 영역을 포함할 수 있다.
제1 검출부(224)와 제2 검출부(225)는 서로 상이한 성질을 가질 수 있다. 제1 검출부(224)와 제2 검출부(225)가 광학적 성질을 가지는 경우, 제1 검출부(224)가 가지는 광학적 성질과 제2 검출부(225)가 가지는 광학적 성질은 상이할 수 있다. 일 예로, 제1 검출부(224)에서 출사되는 광의 파장대와 제2 검출부(225)에서 출사되는 광의 파장대는 다를 수 있다.
본 출원의 일 실시예에 따르면, 제1 검출부(224) 및 제2 검출부(225)는, 제2 페어링부(223)가 자가응집(Self-aggregation)되지 않은 상태에서는 제1 검출부(224) 및 제2 검출부(225)의 상호작용이 수행되지 않는 거리만큼 이격되어, 제2 페어링부(233)에 결합될 수 있다.
따라서, 본 출원의 일 실시예에 따른 프로브 복합체(220)는, 제2 페어링부(223)에 대한 증폭 산물이 생성되었는지 여부에 기초하여, 제1 검출부(224) 및 제2 검출부(225)간의 상호작용 여부가 결정될 수 있다.
구체적으로, 제2 페어링부(223)가 단일 가닥의 올리고 뉴클레오타이드인 경우, 자가응집(Self-aggregation)되어 제1 검출부(224) 및 제2 검출부(225)간의 거리가 인접해질 수 있다. 제2 페어링부(223)에 제1 페어링부(222)가 결합되어 제2 페어링부(223)에 대한 증폭산물이 생성된 제2 페어링부(223)는 더블스트랜드로 형성될 수 있다. 그 결과, 제2 페어링부(223)의 자가응집이 해리되어 인접해졌던 제1 검출부(224) 및 제2 검출부(225)간의 거리가 이격될 수 있다.
제2 페어링부(223)에 대한 증폭산물이 생성되어 제1 검출부(224) 및 제2 검출부(225)가 상호작용유효거리(ID)이상으로 이격되는 경우, 제1 검출부(224) 및/또는 제2 검출부(225)에 포함된 신호발생물질에 기인한 검출 신호는 변경될 수 있다. 일 예로, 신호의 변경은 제1 검출부(224) 및 제2검출부(225)로부터 검출되는 신호의 파장대(예; 빛의 파장대)를 변경하는 것을 의미할 수 있다.
3.2 제2 실시예에 따른 프로브 복합체(220)를 이용한 타겟핵산서열 검출 방법
본 출원의 제2 실시예에 따른 프로브 복합체(220)는 핵산서열증폭반응에서 이용되어 타겟핵산서열을 검출하는데에 이용될 수 있다.
구체적으로, 제2 실시예에 따른 프로브 복합체(220)는 타겟핵산서열이 존재할 것으로 의심되는 샘플과 접촉할 수 있다. 프로브 복합체(220) 및 샘플이 포함된 혼합 용액이 제공될 수 있다. 혼합 용액의 온도를 적절히 조절하여, 혼합 용액 내의 타겟핵산서열과 관련된 올리고 뉴클레오타이드의 적어도 일부가 증폭될 수 있다. 상기 올리고 뉴클레오타이드는 타겟핵산서열을 포함하는 타겟 물질일 수 있다.
올리고 뉴클레오타이드가 증폭되는 단계에서, 프로브결합영역(PR)에 인접한 영역에 대한 증폭 산물의 생성 시점에 도달하는 경우, 프로브결합영역(PR)에 결합된 제1프로브유사체의 제1페어링부(222)가 분리될 수 있다.
이후 싸이클의 어닐링단계에서, 제1 페어링부(222)는 제2 페어링부(223)에 결합될 수 있고, 중합 반응 단계에서, 제2 페어링부(223)에 대한 증폭 산물이 생성될 수 있다. 핵산서열증폭단계에서는, 열변성단계, 어닐링단계 및 중합반응단계가 순차적으로 진행될 수 있다. 핵산서열증폭단계에서는, 열변성단계, 어닐링단계 및 중합반응단계가 반복적으로 진행될 수 있다.
증폭이 완료된 혼합 용액에 대하여 융해 곡선을 검출하는 단계가 진행될 수 있다. 융해 곡선에 기초하여 해리피크값이 검출될 수 있다. 해리피크값은, 프로브 복합체(220)의 제2 페어링부(223)와 제2 페어링부(223)에 대한 증폭 산물간의 결합이 해리되는 온도와 관련되어 있을 수 있다. 극단적으로, 해리피크값은 프로브 복합체(220)의 제2 페어링부(223)와 제2 페어링부(223)에 대한 증폭 산물의 결합이 해리되는 온도에 대응될 수 있다.
복수 종류의 프로브 복합체(220)를 이용한 복수 종류의 타겟핵산서열 검출에 있어서, 제2 페어링부(223)의 길이 및 염기 배열을 조절하여 복수 종류의 프로브 복합체(220)를 구현할 수 있다. 그 결과, 위와 같은 방법으로 확인된 해리피크값에 대응되는 프로브 복합체(220)의 종류를 확인하여, 샘플 내에 존재하는 타겟핵산서열의 종류를 확인할 수 있다. 타겟핵산서열은, 결정부(221)에 대응되는 서열일 수 있다. 타겟핵산서열은 프로브결합영역(PR)에 대응되는 서열일 수 있다. 타겟핵산서열은 프로브결합영역(PR)에 대응되는 핵산 서열과 동일한 서열 수 있다.
3.3 제2 실시예에 따른 프로브 복합체(220) 및 핵산 복합체 페어를 활용한 타겟핵산서열의 검출 방법
본 출원의 일 실시예에 따른 프로브 복합체(220) 및 핵산 복합체 페어를 이용한 타겟핵산서열의 검출을 위해서는, 도 6에서 설명한 바와 같이, 혼합용액이 제공되는 단계, 핵산서열증폭반응 단계, 안정화 단계, 융해곡선 검출 단계 및 피크검출값 확인 단계가 수행될 수 있다.
혼합 용액 제공 단계에서는, 적어도 하나의 종류의 프로브 복합체(220) 및 적어도 하나의 종류의 핵산 복합체 페어가 제공될 수 있다.
복수 종류의 프로브 복합체(220)가 혼합 용액에 제공되는 경우, 복수 종류의 프로브 복합체(220)는 각각의 제2 페어링부(223)와 제2 페어링부(223)에 대한 증폭 산물 및 제1 페어링부(221)를 포함하는 핵산 구조체 간의 결합력이 서로 상이하게 설계될 수 있다. 복수 종류의 프로브 복합체(220)가 혼합 용액에 제공되는 경우, 복수 종류의 프로브 복합체(220)는 각각의 프로브 복합체(220)의 제2 페어링부(223)의 염기의 수, 염기의 종류, 단위핵산의 종류 등에 기초한 해리피크값이 서로 상이하게 설계될 수 있다.
복수 종류의 핵산 복합체 페어가 혼합 용액에 제공되는 경우, 복수 종류의 핵산 복합체 페어는 제1 페어링부(112) 및 제2 페어링부(122)간의 결합력이 서로 상이하게 설계될 수 있다. 복수 종류의 핵산 복합체 페어가 혼합 용액에 제공되는 경우, 복수 종류의 핵산 복합체 페어는 제1 페어링부(112) 및 제2 페어링부(122)의 염기의 수, 염기의 종류, 단위핵산의 종류 등에 기초한 해리피크값이 서로 상이하게 설계될 수 있다.
혼합 용액에는 핵산서열증폭반응에 이용되는 효소, 염기 조각, 조효소, 완충 용액 등이 더 제공될 수 있다. 혼합 용액 제공 단계에서 이용될 수 있는 PCR 용 키트는, 제2 실시예에 따른 프로브 복합체(220), 핵산 복합체 페어, 핵산서열증폭반응에 이용되는 효소, 염기 조각, 조효소 및 완충 용액 중 적어도 하나가 포함될 수 있다.
본 출원의 일 실시예에 따르는 PCR 용 키트는, 제1 실시예에 따른 프로브 복합체(210), 제2 실시예에 따른 프로브 복합체(220), 핵산 복합체 페어, 핵산서열증폭반응에 이용되는 효소, 염기 조각, 조효소 및 완충 용액 중 적어도 하나가 포함될 수 있다. 일 예로, 디바이스를 통해 측정할 수 있는 해리피크값이 총6개인 경우, PCR키트는 2개의 해리피크값이 각각 대응되는 두 종류의 제1 실시예에 따른 프로브 복합체(210), 2개의 해리피크값이 각각 대응되는 두 종류의 제2 실시예에 따른 프로브 복합체(220), 2개의 해리피크값이 각각 대응되는 두 종류의 핵산 복합체 페어를 포함할 수 있다.
도 25 및 도 26은 본 출원의 일 실시예에 따른 프로브 복합체(220) 및 핵산 복합체 페어를 포함하는 혼합 용액의 핵산서열증폭반응을 설명하기 위한 도면이다.
본 출원의 일 실시예에 따르면, 프로브 복합체(220) 및 핵산 복합체 페어를 이용한 핵산서열증폭반응을 진행함에 있어, 상기 핵산서열증폭반응은 Asymmetric PCR 방식에 따라서 진행될 수 있다. 또는, 상기 핵산서열증폭반응은 Symmetric PCR 방식에 따라서 진행될 수 있다. 이하에서는, Symmetric PCR 방식에 따른 핵산서열증폭반응에 대해서 설명한다. Symetric PCR 방식에 따른 핵산서열증폭반응을 진행하기 위한 혼합 용액에는, 제1 핵산 복합체(110)와 제2 핵산 복합체(120)가 거의 동일한 양으로 포함되어 있을 수 있다. 바람직하게는, Symetric PCR 방식에 따른 핵산서열증폭반응을 진행하기 위한 혼합 용액에는, 제1 핵산 복합체(110)와 제2 핵산 복합체(120)의 비율이 1:1일 수 있다.
열변성 단계에서는, 샘플, 프로브 복합체(220) 및 핵산 복합체 페어가 포함된 혼합 용액의 온도를 상승시켜, 샘플 내의 이중 가닥의 핵산 구조체는 단일 가닥의 핵산 구조체로 분리될 수 있다. 이 때, 분리되는 이중 가닥의 핵산 구조체는 제1 타겟핵산서열(TS1), 제2 타겟핵산서열(TS2) 및/또는 프로브결합영역(PR)을 포함할 수 있다.
어닐링 단계에서는, 단일 가닥의 핵산 구조체 중 적어도 일부 영역에 제1 핵산 복합체(110), 제2 핵산 복합체(120) 및/또는 프로브 복합체(220)가 결합될 수 있다. 어닐링 단계에서는, 단일 가닥의 핵산 구조체 중 적어도 일부 영역에 제1 핵산 복합체(110), 제2 핵산 복합체(120) 및/또는 프로브 복합체(220)의 제1 프로브유사체가 결합될 수 있다.
중합 반응 단계에서는, 제1 결정부(111) 및/또는 제2 결정부(121)를 개시점으로 하여, 제1 타겟핵산서열(TS1) 또는 제2 타겟핵산서열(TS2)을 포함하는 타겟 물질(TM)에 대한 증폭산물이 생성될 수 있다. 만약, 제1 결정부(111) 또는 제2 결정부(121)가 프로브 복합체(220)와 관련된 프라이머로써 활용되는 경우에는, 제1 결정부(111) 또는 제2 결정부(121)로부터의 증폭 산물의 생성에 의해서 프로브 복합체(220)의 일부가 프로브 결합 영역(PR)으로부터 이격될 수 있다. 다시 말해, 만약, 제1 결정부(111) 또는 제2 결정부(121)가 프로브 복합체(220)와 관련된 프라이머로써 활용되는 경우에는, 제1 결정부(111) 또는 제2 결정부(121)로부터의 증폭 산물의 생성의 개시된 이후, 프로브 복합체(220)의 제1프로브가 결합된 영역에 인접한 핵산 서열에 대한 증폭 산물의 생성 시점에, 프로브 복합체(220)의 일부가 프로브 결합 영역(PR)으로부터 이격될 수 있다.
제1 결정부(111) 또는 제2 결정부(121)로부터의 증폭 산물의 생성과 관련하여 프로브 복합체(220)의 제1 프로브유사체의 일부가 프로브 결합 영역(PR)으로부터 이격될 수 있다. 제1 결정부(111) 또는 제2 결정부(121)로부터의 증폭 산물의 생성과 관련하여 프로브 복합체(220)의 제1 프로브유사체의 제1 페어링부(222)가 결정부(221)로부터 분리될 수 있다. 제1 결정부(111) 또는 제2 결정부(121)로부터의 증폭 산물의 생성과 관련하여 프로브 복합체(220)의 제1 프로브유사체의 제1 페어링부(222)가 절단되어 결정부(221)로부터 분리될 수 있다.
1회의 싸이클 이후의 열변성 단계에서는, 혼합 용액 내의 이중 가닥의 핵산 구조체는 단일 가닥의 핵산 구조체로 분리될 수 있다. 이 때, 중합 반응 단계에서 형성되었던 적어도 하나의 핵산 복합체(100)를 포함하는 이중 가닥의 핵산 구조체도 단일 가닥의 핵산 구조체로 분리될 수 있다.
제1 페어링부(222)는 혼합 용액 내에서 유동할 수 있다. 결정부(221)로부터 분리된 제1 페어링부(222)는 혼합 용액 내에서 유동할 수 있다.
1회의 싸이클 이후의 어닐링 단계에서는, 혼합 용액 내의 단일 가닥 중 제1 타겟핵산서열(TS1) 및/또는 제2 타겟핵산서열(TS2)에 제1 핵산 복합체(110) 또는 제2 핵산 복합체(120)가 결합될 수 있다. 이 때, 제1 핵산 복합체(110)가 포함된 단일 가닥의 핵산 구조체에는 제2 핵산 복합체(120)가 결합될 수 있다. 제2 핵산 복합체(120)가 포함된 단일 가닥의 핵산 구조체에는 핵산 복합체 페어의 제1 핵산 복합체(110)가 결합될 수 있다.
제1 페어링부(222)는 혼합 용액 내의 프로브 복합체(220)의 제2 프로브유사체와 결합할 수 있다. 혼합 용액 내에서 유동하던 제1 페어링부(222)는 프로브 복합체(220)의 제2 프로브유사체의 제2 페어링부(223)와 결합할 수 있다. 제1 페어링부(222)가 제2 페어링부(223)에 결합되면, 제1 페어링부(222)는 프라이머로써의 기능을 수행할 수 있다.
1회의 싸이클 이후의 중합반응 단계에서는, 제1 결정부(111) 또는 제2 결정부(121)를 개시점으로 하여, 제1 타겟핵산서열(TS1) 또는 제2 타겟핵산서열(TS2)을 포함하는 타겟 물질(TM)에 대한 증폭산물이 생성될 수 있다. 또한, 1회의 싸이클 이후의 중합반응 단계에서는, 제1 페어링부(222)와 결합된 제2 페어링부(223)는 증폭될 수 있다. 다시 말해, 제1 페어링부(222)와 결합된 제2 페어링부(223)에 대한 증폭 산물이 생성될 수 있다.
적어도 2회 이상의 핵산서열증폭반응이 수행된 혼합 용액은, 제1 핵산 복합체(110) 및 제2 핵산 복합체(120)를 포함하는 핵산 구조체, 제1 핵산 복합체(110)를 포함하는 핵산 구조체, 제2 핵산 복합체(120)를 포함하는 핵산 구조체 및 제1 핵산 복합체(110), 제2 핵산 복합체(120)를 포함하지 않는 핵산 구조체 및 제1 페어링부(222) 및 제2 페어링부(223)을 포함하는 핵산 구조체를 포함할 수 있다.
핵산서열증폭반응이 완료된 후, 핵산서열증폭반응이 완료된 혼합용액의 온도를 임의의 온도 이하로 낮춰 안정화 하는 단계가 수행될 수 있다. 안정화 단계에서는, 제1 핵산 복합체(110) 및 제2 핵산 복합체(120)를 포함하는 핵산 구조체의 제1 페어링부(112) 및 제2 페어링부(122)간의 상보적 결합이 수행될 수 있다.
안정화 단계 이후, 혼합 용액에 대한 융해 곡선 검출이 진행될 수 있다. 또한, 융해 곡선 검출에 기초한 해리피크값의 확인이 진행될 수 있다.
본 출원의 일 실시예에 따르면, 융해 곡선 검출에 기초한 미분 융해 곡선 그래프에는 T1 및 T2의 온도에서 극대점이 도시된 온도에 대한 형광의 변화량 그래프가 도시될 수 있다(미도시). 또는, 본 출원의 일 실시예에 따르면, 융해 곡선 검출에 기초한 미분 융해 곡선 그래프에는 T1 및 T2의 온도에서 극소점이 도시된 온도에 대한 형광의 변화량 그래프가 도시될 수 있다(미도시). 또는, 본 출원의 일 실시예에 따르면, 융해 곡선 검출에 기초한 미분 융해 곡선 그래프에는 T1 및 T2 중 하나의 온도에서는 극대점이 도시되고, 나머지 하나의 온도에서는 극소점이 도시된 온도에 대한 형광의 변화량 그래프가 도시될 수 있다(도 27).
보다 구체적인 예를 들어, 도 27을 참조하면, 미분융해곡선에서 극대점이 도시된 T1은 핵산 복합체 페어에 관련된 해리피크값일 수 있다. 이 때의 핵산 복합체 페어는 신호소광방식의 상호작용을 수행하도록 설계되어 있을 수 있다. 미분융해곡선에서 극소점이 도시된 T2은 복합체 프로브(220) 에 관련된 해리피크값일 수 있다. 이 때의 복합체 프로브(220)는 신호소광방식의 상호작용을 수행하도록 설계되어 있을 수 있다.
이상에서 설명한 본 발명은, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능하므로 상술한 실시예 및 첨부된 도면에 의해 한정되는 것이 아니다. 또한 본 문서에서 설명된 실시예들은 한정되게 적용될 수 있는 것이 아니라, 다양한 변형이 이루어질 수 있도록 각 실시예들의 전부 또는 일부가 선택적으로 조합되어 구성될 수도 있다. 나아가, 각 실시예를 구성하는 단계들은 다른 실시예를 구성하는 단계들과 개별적으로 또는 조합되어 이용될 수 있다.
이하, 실험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<실험예 1> 통상의 프로브 및 프라이머를 이용한 멀티 타겟 디텍션
통상적인 방법으로 프라이머를 이용하여 타겟 유전자를 증폭한 다음, 타겟 특이적 프로브를 이용하여 융해 온도 분석법에 기반한 멀티 타겟 검출방법을 수행하였다. 하기 표 3과 같은 프라이머와 프로브를 바탕으로 도 28에 개시된 바와 같은 PCR 반응 수행 후, 융해 온도 분석법을 수행하였다.
그 결과, 도 29에 개시된 바와 같이, 융해 온도가 원하는 지점에서 나타나는 것을 확인하였다.
[표 3]
Figure 112018089888037-pat00007
<실험예 2> 본 발명의 핵산 복합체를 이용한 멀티 타겟 디텍션
본 발명에 따른 핵산 복합체에서, 페이링부의 염기서열 구성에 따른 Melting통상적Temperature 효과 차이를 확인하기 위하여, HPV16 검출용 핵산 프라이머에, 본 발명의 기술을 적용하여 페어링부의 염기서열 구성을 달리한, 핵산 복합체를 표 4의 구성으로 제작하였다.
상기 핵산 복합체 페어를 이용하여 도 30의 방법으로 타겟 샘플과 섞은 다음, PCR을 진행하고, 융해 온도 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 31에 개시된 바와 같이, 페어링부의 염기서열을 조성을 조절함으로써, 다양한 온도에서 타겟을 검출할 수 있음을 확인하였다.
따라서, 실험예 1과 실험예 2에서 사용한 프라이머, 프로브의 융해 온도는 모두 상이하기 때문에, 이 핵산 복합체들을 동시에 샘플 검출에 사용할 수 있으며, 이는 하나의 튜브에서 하나의 형광염료로 총 7종류의 샘플을 검출할 수 있음을 의미한다.
[표 4]
Figure 112018089888037-pat00008
상기 표에서 iSP18은 블록킹부를 의미한다.
100: 핵산 복합체
101: 결정부
102: 페어링부
103: 검출부
104: 블록킹부
ID: 상호작용유효거리
TM: 타겟물질
<110> Nbiotech, Ltd. <120> PCR Kit Comprising Nucleic Acid Complex Pair and Uses thereof <130> P18-B027 <150> US 62/536,898 <151> 2017-07-25 <150> US 62/580,335 <151> 2017-11-01 <160> 17 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MH_F <400> 1 agctcctatt gccaacgta 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MH_R <400> 2 gtgtggagca tcttgtaatc 20 <210> 3 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MH_probe <400> 3 cactcatata cagc 14 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UU_F <400> 4 tgaagttgaa gcaaatgcac g 21 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UU_R <400> 5 tctgaagttt taccatcaac tgc 23 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UU_probe <400> 6 actacgcaat catcagccaa agc 23 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UP_F <400> 7 gaaactctgc gactccaaat tta 23 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UP_R <400> 8 agaagctgat tgttctagtc aat 23 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UP_probe <400> 9 ttctaaatca ttaaaatcaa cagc 24 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GC_100%51 <400> 10 cccgcgcgtg gagatacacc tacattg 27 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GC_100%56 <400> 11 cgcgcggggc tggaccatct atttcatc 28 <210> 12 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AT_100%_8_51 <400> 12 aaaaaaaast ggagatacac ctacattg 28 <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AT_100%_8_56 <400> 13 ttttttttgc tggaccatct atttcatc 28 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AT_100%_10_51 <400> 14 aaaaaaaaaa tggagataca cctacattg 29 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AT_100%_10_56 <400> 15 tttttttttt gctggaccat ctatttcatc 30 <210> 16 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GC_50%_10_51 <400> 16 aaccttggga tggagataca cctacattg 29 <210> 17 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GC_50%_10_56 <400> 17 tcccaaggtt gctggaccat ctatttcatc tcccaaggtt sgctggacca tctatttcat 60 c 61

Claims (13)

  1. 다음을 포함하는 핵산 복합체 페어:
    (a) 제1 핵산 복합체,
    이때, 상기 제1 핵산 복합체는 제1 핵산, 제2 핵산, 제1 신호물질, 및 제1 링커를 포함하고,
    이때, 상기 제1 핵산은 타겟에 대한 포워드 프라이머를 포함하고,
    이때, 상기 제1 핵산의 5' 말단은 상기 제2 핵산의 3' 말단과 상기 제1 링커를 통해 연결되고,
    이때, 상기 제2 핵산의 5' 말단은 상기 제1 신호물질과 연결되며,
    이때, 상기 제1 핵산은 올리고뉴클레오타이드로 구성되고,
    이때, 상기 제2 핵산은 올리고뉴클레오타이드로 구성되며; 및
    (b) 제2 핵산 복합체,
    이때, 상기 제2 핵산 복합체는 제3 핵산, 제4 핵산, 제2 신호물질, 및 제2 링커를 포함하고,
    이때, 상기 제3 핵산은 상기 타겟에 대한 리버스 프라이머를 포함하고,
    이때, 상기 제3 핵산의 5'말단과 상기 제4 핵산의 3' 말단은 상기 제2 링커를 통해 연결되고,
    이때, 상기 제4 핵산의 5' 말단은 상기 제2 신호물질과 연결되며,
    이때, 상기 제3 핵산은 올리고뉴클레오타이드로 구성되고,
    이때, 상기 제4 핵산은 올리고뉴클레오타이드로 구성되며,
    이때, 상기 제2 핵산은 6 내지 20의 뉴클레오타이드로 이루어진 올리고뉴클레오타이드로 구성되고,
    이때, 상기 제4 핵산은 6 내지 20의 뉴클레오타이드로 이루어진 올리고뉴클레오타이드로 구성되며,
    이때, 상기 제2 핵산은 상기 제4 핵산의 서열과 상보적인 서열을 가짐.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1 신호물질은 형광물질 또는 ??쳐이고, 상기 제2 신호물질은 상기 형광물질 또는 상기 ??쳐이며,
    이때, 상기 제1 신호물질이 상기 형광물질 및 상기 ??쳐 중 어느 하나인 경우, 상기 제2 신호물질은 상기 형광물질 및 상기 ??쳐 중 다른 하나인 것을 특징으로 하는,
    핵산 복합체 페어.

  3. 제1 항에 있어서,
    상기 제1 링커는 제1 PCR 블로커를 포함하고,
    상기 제2 링커는 제2 PCR 블로커를 포함하는 것을 특징으로 하는,
    핵산 복합체 페어.

  4. 다음을 포함하는 핵산 복합체 페어의 세트:
    (a) 제1 핵산 복합체 페어,
    이때, 상기 제1 핵산 복합체 페어는 제1 핵산 복합체 및 제2 핵산 복합체를 포함하고,
    이때, 상기 제1 핵산 복합체는 제1 핵산, 제2 핵산, 제1 신호물질, 및 제1 링커를 포함하고,
    이때, 상기 제1 핵산은 제1 타겟에 대한 포워드 프라이머를 포함하고,
    이때, 상기 제1 핵산의 5' 말단은 상기 제2 핵산의 3' 말단과 상기 제1 링커를 통해 연결되고,
    이때, 상기 제2 핵산의 5' 말단은 상기 제1 신호물질과 연결되며,
    이때, 상기 제1 핵산은 올리고뉴클레오타이드로 구성되고,
    이때, 상기 제2 핵산은 올리고뉴클레오타이드로 구성되며,
    이때, 상기 제2 핵산 복합체는 제3 핵산, 제4 핵산, 제2 신호물질, 및 제2 링커를 포함하고,
    이때, 상기 제3 핵산은 상기 제1 타겟에 대한 리버스 프라이머를 포함하고,
    이때, 상기 제3 핵산의 5' 말단과 상기 제4 핵산의 3' 말단은 상기 제2 링커를 통해 연결되고,
    이때, 상기 제4 핵산의 5' 말단은 상기 제2 신호물질과 연결되며,
    이때, 상기 제3 핵산은 올리고뉴클레오타이드로 구성되고,
    이때, 상기 제4 핵산은 올리고뉴클레오타이드로 구성되며,
    이때, 상기 제2 핵산은 6 내지 20개의 뉴클레오타이드로 이루어진 올리고뉴클레오타이드로 구성되고,
    이때, 상기 제4 핵산은 6 내지 20의 뉴클레오타이드로 이루어진 올리고뉴클레오타이드로 구성되며,
    이때, 상기 제2 핵산은 상기 제4 핵산의 서열과 상보적인 서열을 가지고; 및
    (b) 제2 핵산 복합체 페어,
    이때, 상기 제2 핵산 복합체 페어는 제3 핵산 복합체 및 제4 핵산 복합체를 포함하고,
    이때, 상기 제3 핵산 복합체는 제5 핵산, 제6 핵산, 제3 신호물질, 및 제3 링커를 포함하고,
    이때, 상기 제5 핵산은 제2 타겟에 대한 포워드 프라이머를 포함하고,
    이때, 상기 제5 핵산의 5' 말단은 상기 제6 핵산의 3' 말단과 상기 제3 링커를 통해 연결되고,
    이때, 상기 제6 핵산의 5' 말단은 상기 제3 신호물질과 연결되며,
    이때, 상기 제5 핵산은 올리고뉴클레오타이드로 구성되고,
    이때, 상기 제6 핵산은 올리고뉴클레오타이드로 구성되고,
    이때, 상기 제4 핵산 복합체는 제7 핵산, 제8 핵산, 제4 신호물질, 및 제4 링커를 포함하고,
    이때, 상기 제7 핵산은 상기 제2 타겟에 대한 리버스 프라이머를 포함하고,
    이때, 상기 제7 핵산의 5' 말단과 상기 제8 핵산의 3' 말단은 상기 제4 링커를 통해 연결되고,
    이때, 상기 제8 핵산의 5' 말단은 상기 제4 신호물질과 연결되며,
    이때, 상기 제7 핵산은 올리고뉴클레오타이드로 구성되고,
    이때, 상기 제8 핵산은 올리고뉴클레오타이드로 구성되며,
    이때, 상기 제6 핵산은 6 내지 20개의 뉴클레오타이드로 이루어진 올리고뉴클레오타이드로 구성되고,
    이때, 상기 제8 핵산은 6 내지 20의 뉴클레오타이드로 이루어진 올리고뉴클레오타이드로 구성되며,
    이때, 상기 제6 핵산은 상기 제8 핵산의 서열과 상보적인 서열을 가짐.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 제1 신호물질은 형광물질 또는 ??쳐이고, 상기 제2 신호물질은 상기 형광물질 또는 상기 ??쳐이고,
    상기 제3 신호물질은 상기 형광물질 또는 상기 ??쳐이고, 상기 제4 신호물질은 상기 형광물질 또는 상기 ??쳐이며,
    이때, 상기 제1 신호물질이 상기 형광물질 및 ??쳐 중 어느 하나인 경우, 상기 제2 신호물질은 상기 형광물질 및 상기 ??쳐 중 다른 하나이고,
    이때, 상기 제3 신호물질이 상기 형광물질 및 ??쳐 중 어느 하나인 경우, 상기 제4 신호물질은 상기 형광물질 및 상기 ??쳐 중 다른 하나인 것을 특징으로 하는,
    핵산 복합체 페어의 세트.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 제1 신호물질은 제1 형광물질 또는 제1 ??쳐이고, 상기 제2 신호물질은 상기 제1 형광물질 또는 상기 제1 ??쳐이며,
    이때, 상기 제1 신호물질이 상기 제1 형광물질 및 상기 제1 ??쳐 중 어느 하나인 경우, 상기 제2 신호물질은 상기 제1 형광물질 및 상기 제1 ??쳐 중 다른 하나이고,
    상기 제3 신호물질은 제2 형광물질 또는 제2 ??쳐이고, 상기 제4 신호물질은 상기 제2 형광물질 또는 상기 제2 ??쳐이며,
    이때, 상기 제3 신호물질이 상기 제2 형광물질 및 상기 제2 ??쳐 중 어느 하나인 경우, 상기 제4 신호물질은 상기 제2 형광물질 및 상기 제2 ??쳐 중 다른 하나이며,
    이때, 상기 제1 형광물질에서 방출되는 빛은 상기 제2 형광물질에서 방출되는 빛과 다른 파장을 갖는 것을 특징으로 하는,
    핵산 복합체 페어의 세트.
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