KR102322130B1 - 원산지가 다른 수용성 프로폴리스 추출물을 혼합 사용한 피지분비 조절과 여드름 개선 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 원산지가 다른 수용성 프로폴리스 추출물을 혼합 사용한 피지분비 조절 및 여드름 개선 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 본 발명의 피지분비 조절 및 여드름 개선 조성물은 뛰어난 피지분비 조절 효과와 여드름 개선 효과를 나타낸다.
본 발명의 원산지가 다른 수용성 프로폴리스 추출물을 혼합 사용한 피지분비 조절 및 여드름 개선 조성물의 제조방법은 (a) 브라질산 프로폴리스, 한국산 프로폴리스와 중국산 프로폴리스 또는 호주산 프로폴리스를 준비하는 단계, (b) 상기 (a)단계에서 준비된 브라질산 프로폴리스 100 중량부에 중국산 프로폴리스 115 내지 125 중량부, 한국산 프로폴리스 75 내지 85 중량부 또는 브라질산 프로폴리스 추출물 100 중량부에 호주산 프로폴리스 추출물 95 내지 105 중량부, 한국산 프로폴리스 추출물 115 내지 125 중량부를 중량비율로 혼합하는 단계, (c) 상기 (b)단계에서 혼합된 원산지가 다른 프로폴리스를 70 내지 80% 에탄올로 추출하고 여과하는 단계, (d) 상기 (c)단계에서 여과된 프로폴리스 추출물을 농축시키며 에탄올을 회수하는 단계, (e) 상기 (d)단계에서 에탄올이 회수된 프로폴리스 추출물을 유화제인 폴리소르베이트와 유화보조제로 수용화시켜 피지분비 조절 및 여드름 개선 조성물을 제조한다.

Description

원산지가 다른 수용성 프로폴리스 추출물을 혼합 사용한 피지분비 조절과 여드름 개선 조성물 및 그 제조방법 {A method of using propolis mixed with other origins and a composition for reducing acne containing propolis}

본 발명은 원산지가 다른 수용성 프로폴리스 추출물을 혼합 사용한 피지분비 조절 및 여드름 개선 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 브라질산 프로폴리스 100 중량부에 중국산 프로폴리스 115 내지 125 중량부, 한국산 프로폴리스 75 내지 85 중량부 또는 브라질산 프로폴리스 추출물 100 중량부에 호주산 프로폴리스 추출물 95 내지 105 중량부, 한국산 프로폴리스 추출물 115 내지 125 중량부를 중량비율로 혼합하고, 70 내지 80% 에탄올로 추출하고 여과한 다음 농축 및 에탄올을 회수하고 수용화시켜 피지분비 조절 및 여드름 개선 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

프로폴리스(propolis)는 러시안 페니실린 또는 천연페니실린 이라고도 불리는데 벌이 수목류로부터 생장점 보호 물질, 진액 등의 수지(resin)를 수집하여 자신이 분비한 타액과 혼합하여 만든 천연 왁스상 혼합물질로서 식물성수지, 왁스, 정유, 화분, 플라보노이드 및 기타 유기물과 미네랄 등 300가지 이상의 물질로 구성되어 있다.

꿀벌은 상기의 프로폴리스를 벌집의 틈이 난 곳에 발라서 병균이나 바이러스로부터 스스로를 보호하고, 말벌이나 쥐와 같은 적의 침입을 막는다. 또한, 새끼벌의 산란과 성장, 꿀의 숙성과 보관 등에 알맞은 서식처를 유지하도록 하고 있다. 특히 여왕벌의 산란시에는 벌방에 프로폴리스를 얇게 코팅하여 무균실을 만들기도 한다.

이러한 프로폴리스는 기원전 약 3000년에 이집트에서 사용했다는 기록이 있을 정도로 오래전부터 인류가 화농방지제로서 사용해 왔다. 남미를 비롯한 여러 나라에서는 민간요법으로도 널리 사용되어 오고 있으며, 최근에는 1965년 프랑스의 의사 레미쇼방이 꿀벌의 몸에 박테리아가 없음을 연구하던 중 프로폴리스가 천연항생물질 이라는 사실을 밝혀내기도 했다.

프로폴리스의 주요한 효능으로는 항염, 항산화, 항암 및 면역증강 등이 있다. 항염 효과를 내는 것은 사람의 몸에 염증을 일으키는 프로스타글란딘을 만들어 내는 효소를 절반까지 줄여 프로스타글란딘 합성을 억제해 염증성질환을 완화하는 데 도움을 주기 때문이며, 항산화 효과는 주요성분인 플라보노이드가 활성산소를 없애기 때문이고, 항암효과는 케르세틴 등의 성분이 있어서 암세포의 유전자가 복제되기 전에 차단하는 역할을 하기 때문으로 알려져 있다.

근래에는 프로폴리스 중에 포함된 성분인 플라보노이드(flavonoids)와 테르페노이드(terpenoids)가 나타내는 항산화작용에 기인한 다양한 약리작용에 대하여 많은 연구와 관심이 모아지고 있다. 특별히 피부, 점막 및 구강감염에 대한 치료효과는 프로폴리스에서 분리동정된 다양한 물질에 기인한 것으로 적어도 150여개의 테르펜(terpene)류나, 카페인산 에스테르(caffeic acid ester)류, 플라보노이드(flavonoids) 및 아미노산 등과 같은 페닐프로판(phenylpropane) 유도체들이 관여하는 것으로 연구되어 있으며, 이러한 염증성 질환 완화에 프로폴리스를 사용하고자 하는 연구들이 점차 늘어남에 따라 프로폴리스를 활용한 다양한 제품들도 개발되고 있다.

이러한 프로폴리스는 지역별로 서식하고 있는 식물의 종류와 분포에 따라 활성성분, 색깔, 맛 등에서 차이가 나는데, 이는 일벌들이 나무 수종이나 수지를 수집해 오는 종류에 따라 성분이 달라지기 때문이다. 프로폴리스의 색은 다양한 종류가 있으며, 색의 차이에 따라 유효성분에서도 차이가 있다. 녹색 프로폴리스의 유효성분은 클로로필이고, 빨간색 프로폴리스의 유효성분은 안토시안이며, 노란색 프로폴리스의 유효성분은 플라본과 플라보놀이고, 흑색 프로폴리스의 유효성분은 플라보노이드라고 알려져 있다.

수집되는 지역에 따라 프로폴리스의 구성성분의 차이는 일본 공개특허공보 제2004-159563에 개시되어 있으며, 브라질산 프로폴리스에는 아르테피린 C 및 p-쿠마르산이 더 많이 함유되어 있고, 중국산 프로폴리스에는 카페인산 페네틸 에스테르나 크리신, 가란긴이 더 많이 함유되어 있는 것이 나타나있다.

현재 프로폴리스는 세계적으로 뉴질랜드산, 영국산, 브라질산, 중국산 등이 주로 알려져 있는데, 대부분의 제품은 단일 프로폴리스만을 사용하여 만들어 지고 있으며, 국가 및 지역별 프로폴리스를 혼합하여 주요 효능을 극대화한 피지분비 조절 및 여드름 개선용 제품은 찾아보기가 어렵다.

국내 등록특허공보 제10-1216113호 (2012. 12. 20.) 국내 등록특허공보 제10-1713304호 (2017. 02. 28.) 일본 공개특허공보 제2004-159563호 (2004. 06. 10.)

본 발명은 뛰어난 피지분비 조절 효과와 여드름 개선 효과를 가지는 원산지가 다른 수용성 프로폴리스 추출물을 혼합 사용한 조성물의 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있는 것이다.

본 발명은 단시간에 추출이 가능하며 추출효율 측면에서 탁월한 효과가 있는 마이크로웨이브를 조사하여 프로폴리스 추출의 최적화 조건을 제공하는데 그 목적이 있는 것이다.

또 다른 목적으로는 원산지가 다른 프로폴리스를 항산화, 항염증 효과가 극대화되도록 특정 비율로 혼합한 피지분비 조절 및 여드름 개선 조성물을 제공하기 위함이다.

본 발명은 원산지가 다른 수용성 프로폴리스 추출물을 혼합 사용한 피지분비 조절과 여드름 개선 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 (a) 브라질산 프로폴리스, 중국산 프로폴리스, 한국산 프로폴리스를 준비하는 단계, (b) 상기 (a)단계에서 준비된 브라질산 프로폴리스 100 중량부에 중국산 프로폴리스 115 내지 125 중량부, 한국산 프로폴리스 75 내지 85 중량부를 중량비율로 혼합하는 단계, (c) 상기 (b)단계에서 혼합된 원산지가 다른 프로폴리스를 70 내지 80% 에탄올로 추출하고 여과하는 단계, (d) 상기 (c)단계에서 여과된 프로폴리스 추출물을 농축시키며 에탄올을 회수하는 단계, (e) 상기 (d)단계에서 에탄올이 회수된 프로폴리스 추출물을 유화제인 폴리소르베이트와 유화보조제로 수용화시켜 피지분비 조절 및 여드름 개선 조성물이 제조된다.

또한, 상기 피지분비 조절 및 여드름 개선 조성물의 제조방법은 (a) 브라질산 프로폴리스, 호주산 프로폴리스, 한국산 프로폴리스를 준비하는 단계, (b) 상기 (a)단계에서 준비된 브라질산 프로폴리스 추출물 100 중량부에 호주산 프로폴리스 추출물 95 내지 105 중량부, 한국산 프로폴리스 추출물 115 내지 125 중량부를 중량비율로 혼합하는 단계, (c) 상기 (b)단계에서 혼합된 원산지가 다른 프로폴리스를 70 내지 80% 에탄올로 추출하고 여과하는 단계, (d) 상기 (c)단계에서 여과된 프로폴리스 추출물을 농축시키며 에탄올을 회수하는 단계, (e) 상기 (d)단계에서 에탄올이 회수된 프로폴리스 추출물을 유화제인 폴리소르베이트와 유화보조제로 수용화시켜 피지분비 조절 및 여드름 개선 조성물이 제조된다.

또한, 상기 유화제인 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 80 (Polysorbate 80, Polyoxyethylene (20) sorbitan monooleate)을 사용하고, 상기 유화보조제는 글리세린, 탄산칼륨, 염화나트륨으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 사용하되, 상기 첨가되는 유화제와 유화보조제는 여과된 프로폴리스 추출물 100 중량부에 유화제와 유화보조제의 합이 5 내지 15 중량부가 되도록 첨가될 수 있다.

또한, 본 발명의 원산지가 다른 수용성 프로폴리스 추출물을 혼합 사용한 피지분비 조절 및 여드름 개선용 화장료 조성물의 제조방법은 (a) 브라질산 프로폴리스, 중국산 프로폴리스, 한국산 프로폴리스를 준비하는 단계, (b) 상기 (a)단계에서 준비된 브라질산 프로폴리스 100 중량부에 중국산 프로폴리스 115 내지 125 중량부, 한국산 프로폴리스 75 내지 85 중량부를 중량비율로 혼합하는 단계, (c) 상기 (b)단계에서 혼합된 원산지가 다른 프로폴리스를 70 내지 80% 에탄올로 추출하고 여과하는 단계, (d) 상기 (c)단계에서 여과된 프로폴리스 추출물을 농축시키며 에탄올을 회수하는 단계, (e) 상기 (d)단계에서 에탄올이 회수된 프로폴리스 추출물에 폴리소르베이트를 350 내지 450 중량부를 첨가하여 수용화시켜 피지분비 조절 및 여드름 개선용 화장료 조성물이 제조된다.

또한, 본 발명의 원산지가 다른 수용성 프로폴리스 추출물을 혼합 사용한 피지분비 조절 및 여드름 개선용 화장료 조성물의 제조방법은 (a) 브라질산 프로폴리스, 호주산 프로폴리스, 한국산 프로폴리스를 준비하는 단계, (b) 상기 (a)단계에서 준비된 브라질산 프로폴리스 추출물 100 중량부에 호주산 프로폴리스 추출물 95 내지 105 중량부, 한국산 프로폴리스 추출물 115 내지 125 중량부를 중량비율로 혼합하는 단계, (c) 상기 (b)단계에서 혼합된 원산지가 다른 프로폴리스를 70 내지 80% 에탄올로 추출하고 여과하는 단계, (d) 상기 (c)단계에서 여과된 프로폴리스 추출물을 농축시키며 에탄올을 회수하는 단계, (e) 상기 (d)단계에서 에탄올이 회수된 프로폴리스 추출물에 폴리소르베이트를 350 내지 450 중량부를 첨가하여 수용화시켜 피지분비 조절 및 여드름 개선용 화장료 조성물이 제조된다.

본 발명은 원산지가 다른 프로폴리스를 특정 비율로 혼합한 피지분비 조절 및 여드름 개선 조성물을 제조하는 것으로, 뛰어난 항산화, 항염증 효과를 나타내는 것으로 나타났다.

또한, 본 발명은 마이크로웨이브를 조사하여 프로폴리스 추출의 최적화 조건을 제공하여 단시간에 추출이 가능하고 추출효율 측면에서 탁월한 효과가 있는 것으로 나타났다.

또한, 본 발명의 원산지가 다른 수용성 프로폴리스 추출물을 혼합 사용한 조성물은 T존 부위의 활성화된 피지선의 수와 유분 합성량을 감소시키며, 염증성 병변 수와 ASI(Acne Severity Index) 수치를 감소시키고, 피부 보습 지속력을 증대시키고 수분 손실량을 개선시키는 효과가 있는 것으로 나타났다.

도 1은 브라질산, 중국산, 한국산 프로폴리스 혼합 추출물의 Average of IL-6를 나타낸 그래프이다.
도 2는 브라질산, 호주산, 한국산 프로폴리스 혼합 추출물의 Average of IL-6를 나타낸 그래프이다.
도 3은 다양한 유화제 및 유화보조제를 사용한 프로폴리스 혼합 추출물의 Average of IL-6를 나타낸 그래프이다.
도 4는 원산지별 프로폴리스 혼합 추출물의 마이크로웨이브 추출 시 총 폴리페놀 함량(106.5, 107, 107.5 mg GAE/g)을 나타낸 그래프이다.
도 5는 원산지별 프로폴리스 혼합 추출물의 마이크로웨이브 추출 시 총 플라보노이드 함량(76, 77, 78 mg QE/g)을 나타낸 그래프이다.
도 6은 원산지별 프로폴리스 혼합 추출물의 마이크로웨이브 추출 시 총 DPPH 라디칼 소거능(92, 93, 94 %)을 나타낸 그래프이다.
도 7은 원산지별 프로폴리스 혼합 추출물의 마이크로웨이브 추출 시 총 ABTS 라디칼 소거활성(88, 89, 90 %)을 나타낸 그래프이다.
도 8은 원산지별 프로폴리스 혼합 추출물의 마이크로웨이브 추출 시 총 폴리페놀 함량(107.5 mg GAE/g), 총 플라보노이드 함량(78 mg QE/g), DPPH 라디칼 소거능(93 %), ABTS radical capacity(90 %)의 contour maps를 superimposing하여 나타낸 그래프이다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예를 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라, 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다. 또한, 본 발명이 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시 태양을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

이하 도면을 이용하여 본 발명에 대하여 상세하게 설명하도록 한다. 도 1은 원산지별 프로폴리스 혼합 추출물의 Average of IL-6를 나타낸 그래프이고, 도 2는 도 2는 브라질산, 호주산, 한국산 프로폴리스 혼합 추출물의 Average of IL-6를 나타낸 그래프이고, 도 3은 다양한 유화제 및 유화보조제를 사용한 프로폴리스 혼합 추출물의 Average of IL-6를 나타낸 그래프이고, 도4는 원산지별 프로폴리스 혼합 추출물의 마이크로웨이브 추출 시 총 폴리페놀 함량을 나타낸 그래프이고, 도 5는 원산지별 프로폴리스 혼합 추출물의 마이크로웨이브 추출 시 총 플라보노이드 함량을 나타낸 그래프이고, 도 6는 원산지별 프로폴리스 혼합 추출물의 마이크로웨이브 추출 시 총 DPPH 라디칼 소거능을 나타낸 그래프이고, 도 7은 원산지별 프로폴리스 혼합 추출물의 마이크로웨이브 추출 시 총 ABTS 라디칼 소거활성을 나타낸 그래프이고, 도 8은 원산지별 프로폴리스 혼합 추출물의 마이크로웨이브 추출 시 총 폴리페놀 함량, 총 플라보노이드 함량, DPPH 라디칼 소거능, ABTS radical capacity의 contour maps를 superimposing하여 나타낸 그래프이다.

상기 원산지가 다른 수용성 프로폴리스 추출물을 혼합 사용한 피지분비 조절 및 여드름 개선 조성물의 제조방법은 (a) 브라질산 프로폴리스, 중국산 프로폴리스, 한국산 프로폴리스를 준비하는 단계, (b) 상기 (a)단계에서 준비된 브라질산 프로폴리스 100 중량부에 중국산 프로폴리스 115 내지 125 중량부, 한국산 프로폴리스 75 내지 85 중량부를 중량비율로 혼합하는 단계, (c) 상기 (b)단계에서 혼합된 원산지가 다른 프로폴리스를 70 내지 80% 에탄올로 추출하고 여과하는 단계, (d) 상기 (c)단계에서 여과된 프로폴리스 추출물을 농축시키며 에탄올을 회수하는 단계, (e) 상기 (d)단계에서 에탄올이 회수된 프로폴리스 추출물을 유화제인 폴리소르베이트와 유화보조제로 수용화시켜 피지분비 조절 및 여드름 개선 조성물이 제조된다.

이하에서는 위 각 단계에 관하여 구체적으로 설명한다.

1. 원산지가 다른 프로폴리스를 준비하고 혼합하는 단계

원산지가 다른 프로폴리스는 브라질산 프로폴리스, 한국산 프로폴리스와 중국산 프로폴리스 또는 호주산 프로폴리스를 준비하되, 혼합하기 전 천연 프로폴리스(프로폴리스 원괴)의 이물질 및 왁스를 제거하고 동결건조를 한 뒤 30 내지 50 mesh로 분쇄하여 원산지가 다른 프로폴리스 분말을 준비하는 것이 바람직할 수 있다.

본 발명에서는 다양한 산지에 따른 특성 확인을 통해 다양한 원산지의 프로폴리스를 사용하면서도 유효성을 일정하게 유지한다.

상기 준비한 원산지가 다른 프로폴리스 분말을 혼합하는 단계에서는 브라질산 프로폴리스 100 중량부에 중국산 프로폴리스 115 내지 125 중량부, 한국산 프로폴리스 75 내지 85 중량부를 중량비율로 혼합할 수 있으며, 보다 바람직하게는 브라질산 프로폴리스 100 중량부에 중국산 프로폴리스 118 내지 122 중량부, 한국산 프로폴리스 78 내지 82 중량부를 중량비율로 혼합하는 것이 항산화, 항염증 효과를 극대화시키기 위해 가장 바람직할 수 있다.

또한, 다른 실시예에서 상기 준비한 원산지가 다른 프로폴리스 분말을 혼합하는 단계에서는 브라질산 프로폴리스 추출물 100 중량부에 호주산 프로폴리스 추출물 95 내지 105 중량부, 한국산 프로폴리스 추출물 115 내지 125 중량부를 중량비율로 혼합할 수 있으며, 보다 바람직하게는 브라질산 프로폴리스 추출물 100 중량부에 호주산 프로폴리스 추출물 98 내지 102 중량부, 한국산 프로폴리스 추출물 118 내지 122 중량부를 중량비율로 혼합하는 것이 항산화, 항염증 효과를 극대화시키기 위해 가장 바람직할 수 있다.

또한, 프로폴리스의 추출효율을 더 증대시키기 위해 프로폴리스를 동결건조하기 전 단계에서 프로폴리스를 초고압으로 처리하는 과정을 추가로 실행할 수 있다.

초고압처리는 프로폴리스 원괴를 460 내지 540MPa의 압력에서 50초 내지 90초 동안 초고압처리할 수 있고, 보다 바람직하게는 490 내지 510MPa의 압력에서 70초 내지 80초 동안 초고압처리하여 프로폴리스 원괴의 세포들을 파괴하여 추후 추출 공정시 유효성분의 추출 효율을 가장 극대화시킬 수 있다.

또한, 상기 준비한 원산지가 다른 프로폴리스 분말을 혼합하는 단계에서 피지분비 조절 및 여드름 개선을 더 극대화시키기 위하여 첨가물을 더 첨가하여 혼합할 수 있다. 상기 첨가물은 초장초와 천련자를 각각 27 내지 42 중량부를 더 첨가하여 혼합하는 것이 피지분비 조절 및 여드름 개선을 극대화하기 위해 가장 바람직할 수 있다.

초장초는 쌍떡잎식물 쥐손이풀목 괭이밥과의 여러해살이풀로 한글로는 괭이밥, 시금초, 괴싱이라고도 하며, 영어로는 Oxalis martina 또는 Oxalis obtriangulata 라고 불린다. 국내에서는 예전부터 한방이나 민방에서 다양하게 이용되어 왔으며 효능으로는 해열, 해독, 피부질환, 소화장애 치료 등이 있다고 알려져 있다. 초장초는 달이거나 생으로 복용을 할 수 있으며, 즙을 내거나 짓찧어서 환부에 직접 바르기도 한다. 초장초는 옥살산(oxalic acid)이 다량 함유되어 있어 신맛이 나며, acetate, malc acid 및 trataric 등이 함유되어 있어 항염, 해독 등이 필요한 여러 가지 질환에 효과적으로 사용할 수 있는 식물이다.

천련자는 우리나라에서 멀구슬나무과의 멀구슬나무(Melia azedarach L. var. japonica Makino)의 열매를 말하며, 예로부터 탕제로 만들어 달여 먹거나 가루를 내어 기초(약)제에 개어 발라 다양한 증상의 치료제로 사용해오고 있다. 국내 논문(마우스 대식세포에서의 천련자의 항산화 및 항염증 효과;대한본초학회지;제23권 4호)에 따르면 천련자 추출물이 세포 내 산화와 전염증에 두드러지는 효과를 보여, 만성 염증성 질환 치료제로서의 잠재력이 알려져있다.

2. 프로폴리스를 추출하는 단계

상기 혼합된 원산지가 다른 프로폴리스 분말을 이용하여 추출하는 단계에서는 70 내지 80% 에탄올로 추출한다.

상기 혼합된 원산지가 다른 프로폴리스 분말 100 중량부에 70 내지 80% 에탄올을 250 내지 350 중량부를 혼합한 다음 500rpm(풍림 PL-SS200)에서 4 내지 8시간 동안 상온에서 교반하면서 추출하고 추출된 프로폴리스를 여과지(Advantec No.2)를 이용하여 여과할 수 있다.

프로폴리스 추출시간을 단축시키고 유효성분의 추출량을 늘리기 위해서는 마이크로웨이브를 조사하여 추출하는 방법으로 대체하여 실시할 수도 있으며, 마이크로웨이브 조사는 에탄올 농도 52 내지 67%, 추출시간 6.8 내지 7.6분, 마이크로웨이브 전력은 237 내지 246W의 조건으로 마이크로웨이브 추출할 수 있다.

보다 바람직한 마이크로웨이브 추출 조건은 에탄올 농도 58 내지 61%, 추출시간 7.1 내지 7.3분, 마이크로웨이브 전력은 241 내지 243W인 것으로 나타났으며, 상기 조건을 추출 시 총 플라보노이드 함량, 폴리페놀 함량, ABTS 라디칼 소거능, DPPH 라디칼 소거능을 최적으로 나타낼 수 있는 것을 반응표면분석법을 이용하여 확인하였다.

마이크로웨이브 추출법(microwave-assisted extraction, MAE)은 시료와 용매를 섞은 혼합물에 집중적으로 마이크로웨이브 파장을 이용하여 용매와 시료간의 마찰로 열이 발생하는 원리를 활용하며 시료의 기저에 이르기까지 단시간에 가열하여 시료 내 유용성분을 효과적으로 추출할 수 있다. 마이크로웨이브 추출법은 유효성분의 손실을 줄일 수 있으며 다른 추출법보다 매우 단시간에 추출이 가능하며 추출효율면에서 탁월한 효과가 검증된 방법이다.

3. 프로폴리스 추출물을 수용화시키는 단계

상기 추출된 프로폴리스 추출물을 농축시킨 후, 에탄올을 회수하고 수용화시켜 피지분비 조절 및 여드름 개선 조성물을 제조할 수 있다.

상기 추출된 프로폴리스 추출물은 rotary vacuum evaporator (Sanyo, Japan)를 사용하여 40 내지 50℃에서 6 내지 8시간 동안 감압농축하여 에탄올을 회수하고 수용화시켜 원산지가 다른 수용성 프로폴리스 추출물을 혼합 사용한 피지분비 조절 및 여드름 개선 조성물을 제조할 수 있다.

상기 프로폴리스 추출물을 에탄올을 회수하고 수용화시키는 이유는 에탄올을 이용하여 추출한 프로폴리스 추출물은 물에 잘 녹지 않고 끈적거림이 심해서 용이하게 사용하기 어려운 문제점이 있어, 에탄올을 회수하고 물에 쉽게 녹을 수 있도록 수용화시켜 피지분비 조절 및 여드름 개선 조성물을 제조한다.

상기 수용화하는 단계에서는 유화제 및/또는 유화보조제, 정제수를 첨가하여 수용화할 수 있으며, 상기 유화제는 폴리소르베이트 20(Polysorbate 20), 폴리소르베이트 40(Polysorbate 40), 폴리소르베이트 60(Polysorbate 60), 폴리소르베이트 80(Polysorbate 80), 지방산 또는 지방 알코올의 폴리에틸렌글리콜 에테르, 폴리에틸렌글리콜-7 올리베이트(PEG-7 olivate), 폴리에틸렌글리콜-8 라우레이트(PEG-8 laurate), 폴리에틸렌글리콜-60 알몬드 글리세라이드(PEG-60 almond glyceride), 폴리에틸렌글리콜-20 메틸글루코오스세스퀴스테아레이트(PEG-20 methyl glucose sesquistearate), 및 폴리에틸렌글리콜-100 스테아레이트으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이 사용될 수 있으며, 유화보조제는 글리세린, 탄산칼륨, 염화나트륨으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이 사용될 수 있으며, 보다 바람직하게는 유화제는 폴리소르베이트 80 (Polysorbate 80, Polyoxyethylene (20) sorbitan monooleate), 유화보조제는 글리세린, 탄산칼륨을 사용하는 것이 프로폴리스의 유효성분을 더 효과적으로 추출하고 수용화하는데 도움이 될 수 있어 바람직할 수 있다.

상기 폴리솔베이트는 폴리올과 솔비톨을 에틸렌 옥사이드와 반응시켜 생성되는 계면활성제로 다른 성분들이 일반적으로 용해되지 않는 용매에 잘 용해되도록 도와주며 또한 유화 물질의 표면 장력을 줄임으로써 유화액을 형성하는데 도움을 주는 친수성 계면활성제이다.

상기 유화제와 유화보조제를 혼합하여 첨가 시 상기 여과된 프로폴리스 추출물 100 중량부에 유화제와 유화보조제의 합이 5 내지 15 중량부가 되도록 첨가할 수 있으며, 보다 바람직하게는 유화제와 유화보조제의 합이 7 내지 12 중량부가 되도록 첨가하되, 상기 첨가되는 유화제와 유화보조제의 비율은 폴리소르베이트 80, 글리세린, 탄산칼륨이 1 : 4 : 1 내지 2 : 4: 1 의 중량비로 첨가하는 것이 프로폴리스 추출물의 유효성분의 효과를 극대화하며 소수성을 증가시키고 이온화를 방지하는데 도움이 되어 바람직할 수 있다.

상기 유화제만 혼합하여 첨가 시 상기 여과된 프로폴리스 추출물 100 중량부에 유화제 350 내지 450 중량부를 첨가할 수 있으며, 보다 바람직하게는 유화제 380 내지 420 중량부를 첨가하는 것이 프로폴리스 추출물의 유효성분의 효과를 극대화하며 소수성을 증가시키고 이온화를 방지하는데 도움이 되어 바람직할 수 있다.

상기 제조된 피지분비 조절 및 여드름 개선 조성물을 이용하여 피지분비 조절 및 여드름 개선용 화장품을 제조 시 상기 유효성분 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 상술한 유효성분들 이외에, 상기 유효성분들과 반응하여 피부보호 효과를 손상시키지 않는 한도에서 종래부터 사용되어오던 유기 자외선 차단제를 혼합하여 사용할 수도 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 본 발명의 화장료 조성물은 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디 에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

<시험예 1>- 혼합프로폴리스의 혼합 비율 선정

1) 브라질산, 중국산, 한국산 혼합프로폴리스의 혼합 비율 선정

최적의 브라질산, 중국산, 한국산 프로폴리스의 혼합 비율을 선정하기 위하여, 원산지별 프로폴리스 혼합물의 추출물을 수용화하여 얻어진 시료를 세포에 처리하여 Average of IL-6를 Interleukin -6 생성억제력 평가 (ELISA assay)로 측정하였다.

상기 시료는 원산지별 천연 프로폴리스(프로폴리스 원괴)의 이물질 및 왁스를 제거하고 동결건조를 한 뒤 40 mesh로 분쇄하고, 하기 표 1의 혼합 비율에 따라 혼합한 후, 75% 에탄올 300 중량부를 혼합한 다음 500rpm(풍림 PL-SS200)에서 6시간 동안 상온에서 교반하면서 추출하고 추출된 프로폴리스를 여과지(Advantec No.2)를 이용하여 여과한 다음 rotary vacuum evaporator (Sanyo, Japan)를 사용하여 45℃에서 7시간 동안 감압농축하여 에탄올을 회수하고 정제수로 수용화하여 준비하였다.

세포는 SV-KC(각질형성세포)에 처리하였으며 polyinosinic:polycytidylic acid로 30분간 전처리 후 24시간 동안 시료를 처리하여 R&D제조 kit를 이용하여 분석하였다.

에탄올 추출 프로폴리스 브라질산, 중국산, 한국산 혼합 비율

	브라질산	중국산	한국산
A	100	100	100
B	100	100	120
C	120	100	100
D	100	120	100
E	100	120	80
F	100	80	120
G	120	100	80
H	80	120	100
I	120	80	100

그 결과, 도 1에서 보듯이 E시료의 Average of IL-6가 가장 낮게 측정되어 브라질산 프로폴리스 100 : 중국산 프로폴리스 120 : 한국산 프로폴리스 80 의 비율로 혼합하여 추출 및 수용화한 시료가 항염증 효과가 가장 뛰어난 것으로 나타났다.

2) 브라질산, 호주산, 한국산 혼합프로폴리스의 혼합 비율 선정

최적의 브라질산, 호주산, 한국산 프로폴리스의 혼합 비율을 선정하기 위하여, 원산지별 프로폴리스 혼합물의 추출물을 수용화하여 얻어진 시료를 세포에 처리하여 Average of IL-6를 Interleukin -6 생성억제력 평가 (ELISA assay)로 측정하였다.

상기 시료는 원산지별 천연 프로폴리스(프로폴리스 원괴)의 이물질 및 왁스를 제거하고 동결건조를 한 뒤 40 mesh로 분쇄하고, 하기 표 2의 혼합 비율에 따라 혼합한 후, 75% 에탄올 300 중량부를 혼합한 다음 500rpm(풍림 PL-SS200)에서 6시간 동안 상온에서 교반하면서 추출하고 추출된 프로폴리스를 여과지(Advantec No.2)를 이용하여 여과한 다음 rotary vacuum evaporator (Sanyo, Japan)를 사용하여 45℃에서 7시간 동안 감압농축하여 에탄올을 회수하고 정제수로 수용화하여 준비하였다.

세포는 SV-KC(각질형성세포)에 처리하였으며 polyinosinic:polycytidylic acid로 30분간 전처리 후 24시간 동안 시료를 처리하여 R&D제조 kit를 이용하여 분석하였다.

에탄올 추출 프로폴리스 브라질산, 호주산, 한국산 혼합 비율

	브라질산	호주산	한국산
A'	100	100	100
B'	100	100	120
C'	120	100	100
D'	100	120	100
E'	100	120	80
F'	100	80	120
G'	120	100	80
H'	80	120	100
I'	120	80	100

그 결과, 도 2에서 보듯이 B'시료의 Average of IL-6가 가장 낮게 측정되어 브라질산 프로폴리스 100 : 호주산 프로폴리스 100 : 한국산 프로폴리스 120 의 비율로 혼합하여 추출 및 수용화한 시료가 항염증 효과가 가장 뛰어난 것으로 나타났다.

<시험예 2>- 유화제와 유효보조제의 첨가 비율 선정

최적의 유화제와 유화보조제 첨가 비율을 선정하기 위해, 브라질산 프로폴리스 100 : 호주산 프로폴리스 100 : 한국산 프로폴리스 120 중량부의 중량비율로 혼합된 혼합물의 추출물에서 에탄올을 회수하고 다양한 유화제와 유화보조제를 첨가하여 수용화한 시료를 세포에 처리하여 Average of IL-6를 Interleukin -6 생성억제력 평가 (ELISA assay)로 측정하였다.

상기 시료는 브라질산, 호주산, 한국산 천연 프로폴리스(프로폴리스 원괴)의 이물질 및 왁스를 제거하고 동결건조를 한 뒤 40 mesh로 분쇄하고, 브라질산 프로폴리스 100 : 호주산 프로폴리스 100 : 한국산 프로폴리스 120 중량부의 중량비율로 혼합한 후, 75% 에탄올 300 중량부를 혼합한 다음 500rpm(풍림 PL-SS200)에서 6시간 동안 상온에서 교반하면서 추출하고 추출된 프로폴리스를 여과지(Advantec No.2)를 이용하여 여과한 다음 rotary vacuum evaporator (Sanyo, Japan)를 사용하여 45℃에서 7시간 동안 감압농축하여 에탄올을 회수하고 하기 표 3의 혼합 비율에 따라 유화제(polysorbate 80 (상품명 Tween80, Tokyo Chemical사), PEG-60 hydrogenated castor oil (상품명 HCO60, Nikkol사), octyldodeceth-16 (상품명 OD 16, Nihon Emulsion사), ceteareth-6 olivate (상품명 Olivem 800, B&T사)) 및/또는 유화보조제(glycerin, K2CO3) 를 첨가하여 수용화시켜 준비하였다.

세포는 SV-KC(각질형성세포)에 처리하였으며 polyinosinic:polycytidylic acid로 30분간 전처리 후 24시간 동안 시료를 처리하여 R&D제조 kit를 이용하여 분석하였다.

유화제 및 유화보조제의 첨가 비율

	E1	E2	E3	E4	E5	E6	E7	E8	E9
Tween80	2	-	-	-	2	2	2	2	-
HCO60	-	2	-	-	-	-	-	-	-
OD 16	-	-	2	-	-	-	-	-	-
Olivem 800	-	-	-	2	-	-	-	-	-
glycerin	-	-	-	-	1	4	8	12	-
K2CO3	-	-	-	-	1	1	2	2	-

그 결과, 도 3에서 보듯이 E6과 E7시료의 Average of IL-6가 가장 낮게 측정되어 Tween80 2 : glycerin 4 : K₂CO₃ 1 의 비율과 Tween80 1 : glycerin 4 : K₂CO₃ 1의 비율로 혼합하여 첨가한 시료가 항염증 효과가 가장 뛰어난 것으로 나타났다.

<시험예 3>- 최적의 마이크로웨이브 추출 조건 선정

최적의 마이크로웨이브 추출 조건을 선정하기 위해, 원산지별 천연 프로폴리스(프로폴리스 원괴)의 이물질 및 왁스를 제거하고 동결건조를 한 뒤 40 mesh로 분쇄하고, 브라질산 프로폴리스 100 : 중국산 프로폴리스 120 : 한국산 프로폴리스 80 의 비율로 혼합한 시료를 준비하였다. 추출관에 1 g의 시료와 에탄올 용매 50 mL를 넣은 후 조건에 따른 마이크로웨이브 추출을 하였다. 여과지(Whatmanfilter paper No.1)를 사용하여 여과한 후, 100 mL 메스플라스크로 용량을 맞춰 -5℃ 냉장고에 보관하여 사용하였다. 마이크로웨이브 추출은 2,450 MHz주파수의 상압형 마이크로웨이브 추출장치(Soxwave 100, Prolab, Fontenay, France)를 이용하였으며, 시간 제어가 가능하며 환류냉각관이 장착된 추출장치(programmable- power, 60-300 W)를 사용하였다.

최적 추출 건의 예측과 추출조건에 따른 추출물의 기능성 성분 함량을 모니터링하기 위해 반응표면분석법(RSM)을 사용하였고, 추출 조건은 중심합성계획법을 적용하였으며, 용매는 식품에 많이 사용되는 에탄올을 사용하였다. 에탄올 농도(0, 25, 50, 75, 100%), 마이크로웨이브 전력(180, 210, 240, 270, 300 W), 추출시간(1, 4, 7, 10, 13분)을 다르게 하여 중심합성계획의 조건을 설정하였다. 추출공정의 독립변수(Xi)는 용액 농도(X₁), 추출시간(X₂), 마이크로웨이브 전력(X₃)으로 종속변수는(Y_n)은 총 리페놀 함량(total polyphenol contents, TPC, Y₁), 총 플라보노이드 함량(total flavonoid contents, TFC, Y₂), DPPH 라디칼 소거능(DPPH radical scavenging activity, Y₃), ABTS 라디칼 소거능(ABTS radical capacity, Y₄)으로 설정하였다. 중심합성계획법을 이용하여 나눈 16개의 임의구간을 설정하여 3회 측정 후, 평균값의 회귀 분석을 실시하였다. 독립변수와 종속변수에 대한 2차 회귀 모형식은 하기 수학식 1과 같다.

[수학식 1]

상기 수학식 1의 Y는 종속 변수, X₁, X₂, X₃는 독립 변수, b₀는 절편, b_n은 회귀계수이다. 회귀분석의 결과를 통한 최적조건범위 예측은 SAS program(Version 9.2, SAS Institute lnc., Cary, NC, USA)을 사용하였으며, mathematica program(Wolfram, Champaign, IL, USA)을 이용하여 그래프를 통해 최적의 추출 범위를 분석하였다.

1) 총 폴리페놀 함량 측정

추출물의 총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis법을 변형시켜 비색 정량하였다. 추출한 혼합 프로폴리스 추출물 100 μL에 Folin-Ciocalteu reagent 50 μL를 가한 뒤 2% Na₂CO₃ 300μL를 넣고 실온에 15분간 방치했다. 그런 다음 1 mL의 증류수를 넣고 725 nm에서 UV-spectrophotometer(UV-2550, Shimazdu Co., Tokyo, Japan)를 이용해 흡광도 값을 측정하였다. 표준물질로는 gallic acid(Sigma-Aldrich)를 검량선으로 사용하였으며, 그 결과는 mg GAE/g, 즉 1 g의 gallic acid에 해당하는 시료의 mg으로 나타내었다.

2) 총 플라보노이드 함량 측정

추출물의 총 플라보노이드 함량 측정은 추출한 혼합 프로폴리스 추출물 시료 70 μL에 증류수 430 μL를 가한 뒤 5% NaNO₂ 50 μL를 넣은 다음 10% Al(NO₃)₃9H₂O를 가한 뒤 상온에서 6분간 놔둔다. 그런 다음 1 N NaOH 500 μL를 넣어 반응액의 흡광도를 UV-spectrophotometer(UV-2550, Shimazdu Co., Tokyo, Japan)를 이용해 510 nm에서 측정하였다. 표준물질로는 quercetin을 검량선으로 사용하였으며, 그 결과는 mg QE/g, 즉 1 g의 rutin에 해당하는 시료의 mg으로 나타내었다.

3) DPPH 라디칼 소거능 측정

추출물의 DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 라디칼 소거능 측정을 위해 0.0039 g DPPH powder에 에탄올 100 mL를 첨가한 후, magnetic stirrer(PC-420D, Corning Co., NY, USA)를 이용하여 240 rpm으로 2시간 동안 용액을 안정화 시키고, 94% 에탄올로 흡광도가 1.0에 가까워지도록 희석한 후 사용하였다. 혼합 프로폴리스 추출물 시료 100 μL에 DPPH 용액 900 μL을 가한 뒤 30분 동안 빛을 차단시키고 반응 후 반응액의 흡광도를 UV-spectrophotometer(UV-2550, Shimazdu Co., Tokyo, Japan)를 사용하여 517nm에서 측정하였다. 이때, control용액은 추출물 100 μL 대신 94% 에탄올을 100 μL를 사용하였다. 측정한 값은 하기 수학식 2를 이용해 DPPH radical scavenging ability(%) 값으로 산출하였다.

[수학식 2]

4) ABTS 라디칼 소거활성 측정

ABTS radical assay는 Arts 등의 방법을 응용하여 측정하였다. 혼합 프로폴리스 추출물 시료 30 μL에 ABTS radical 용액 3 mL를 첨가하여 734 nm(UV-1650PC, Shimadzu)에서 측정하였으며 대조구로는 BHT를 사용하였다. ABTS radical 용액은 7mM ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate) diammonium salt)에 2.45 mM potassium persulfate를 첨가하여 최종농도가 2.45 mM ABTS radical cation(ABTS??+) 용액을 만들어 어두운 곳에서 12시간 이상 실온에서 보관하고 5 mM PBS(phosphate buffer saline, pH 7.4)를 이용하여 734 nm에서 흡광도가 0.70ㅁ0.02가 되도록 희석한 후 측정 시 사용하였다. 측정한 값은 하기 수학식 3을 이용해 ABTS radical capacity(%) 값으로 산출하였다.

[수학식 3]

5) 총 폴리페놀 함량 측정 결과

시료를 각각의 조건별로 MAE 추출하여 총 폴리페놀 함량을 측정하였다. 반응표면그래프는 도 4으로 나타났으며, 최대값은 107.41 mg GAE/g 으로 예측되었다. 에탄올 농도(%), 마이크로웨이브 전력(W), 추출시간(분)에 따른 총 폴리페놀 함량의 회귀식은 아래와 같다.

[수학식 4]

R²값은 0.9537로 나타났으며, ANOVA 분석 결과 5% 이내의 수준의 유의성을 가졌다. 총 폴리페놀 함량의 최적 추출 조건은 에탄올 농도 52.35%, 마이크로웨이브 전력 237.26 W, 추출시간은 6.87분으로 나타났다.

6) 총 플라보노이드 함량 측정 결과

시료를 각각의 조건별로 MAE 추출하여 총 플라보노이드 함량을 측정하였다. 반응표면그래프는 도 5의 형태로 나타났으며, 최대값은 78.98 mg QE/g 으로 예측되었다. 에탄올 농도(%), 마이크로웨이브 전력(W), 추출시간(분)에 따른 총 폴리페놀 함량의 회귀식은 아래와 같다.

[수학식 5]

R²값은 0.9682로 나타났으며, ANOVA 분석 결과 1% 이내의 수준의 유의성을 가졌다. 총 플라보노이드 함량의 최적 추출 조건은 에탄올 농도 67.56%, 마이크로웨이브 전력 246.13 W, 추출시간은 7.69분으로 나타났다.

7) DPPH 라디칼 소거능 측정 결과

시료를 각각의 조건별로 MAE 추출하여 DPPH 라디칼 소거능을 측정하였다. 반응표면그래프는 도 6의 형태로 나타났으며, 최대값은 94.04 %로 예측되었다. 에탄올 농도(%), 마이크로웨이브 전력(W), 추출시간(분)에 따른 총 폴리페놀 함량의 회귀식은 아래와 같다.

[수학식 6]

R²값은 0.9137로 나타났으며, ANOVA 분석 결과 5% 이내의 수준의 유의성을 가졌다. 총 DPPH 라디칼 소거능의 최적 추출 조건은 에탄올 농도 67.08%, 마이크로웨이브 전력 246.51 W, 추출시간은 7.62분으로 나타났다.

8) ABTS radical capacity 측정 결과

시료를 각각의 조건별로 MAE 추출하여 ABTS radical capacity를 측정하였다. 반응표면그래프는 도 7의 형태로 나타났으며, 최대값은 90.89 %로 예측되었다. 에탄올 농도(%), 마이크로웨이브 전력(W), 추출시간(분)에 따른 총 폴리페놀 함량의 회귀식은 아래와 같다.

[수학식 7]

R²값은 0.9631로 나타났으며, ANOVA 분석 결과 5% 이내의 수준의 유의성을 가졌다. 총 ABTS radical capacity의 최적 추출 조건은 에탄올 농도 52.54%, 마이크로웨이브 전력 237.32 W, 추출시간은 6.85분으로 나타났다.

9) 최적 마이크로웨이브 추출 조건 예측

혼합 프로폴리스의 최적 추출조건을 설정하기 위하여 각 조건별 추출물의 총 폴리페놀 함량, 총 플라보노이드 함량, DPPH 라디칼 소거능, ABTS radical capacity의 contour maps를 superimposing하여 도 8 형태의 그래프로 나타내어 최적 범위를 예측하였다. 원산지가 다른 혼합 프로폴리스의 최적 추출조건 범위는 에탄올 농도 52-67%, 추출시간 6.8-7.6 min, microwave power 237-246 W로 나타났다.

<실시예 1>

원산지별 천연 프로폴리스(프로폴리스 원괴)의 이물질 및 왁스를 제거하고 동결건조를 한 뒤 40 mesh로 분쇄하고, 브라질산 프로폴리스 100 : 중국산 프로폴리스 120 : 한국산 프로폴리스 80 의 비율로 혼합한 다음, 75% 에탄올 300 중량부를 혼합한 다음 500rpm(풍림 PL-SS200)에서 6시간 동안 상온에서 교반하면서 추출하고 추출된 프로폴리스를 여과지(Advantec No.2)를 이용하여 여과한 다음 rotary vacuum evaporator (Sanyo, Japan)를 이용하여 45℃에서 7시간 동안 감압농축하여 에탄올을 회수하고 폴리소르베이트, 글리세린, 탄산칼륨의 합 7 중량부를 첨가하여 수용화시킨 시료를 준비하였다. 준비된 시료 75ml에 천연발효유화제 5g, 올리브유화왁스 12.5g, 알로에워터 60.5g, 나이아신아드 10g, 나프리 5g을 혼합 및 교반하여 원산지가 다른 수용성 프로폴리스 추출물을 혼합 사용한 피지분비 조절 및 여드름 개선 조성물을 이용하여 임상시료를 제조하였다.

<실시예 2>

원산지별 천연 프로폴리스(프로폴리스 원괴)의 이물질 및 왁스를 제거하고 동결건조를 한 뒤 40 mesh로 분쇄하고, 브라질산 프로폴리스 100 : 호주산 프로폴리스 100 : 한국산 프로폴리스 120 의 비율로 혼합한 다음, 75% 에탄올 300 중량부를 혼합한 다음 500rpm(풍림 PL-SS200)에서 6시간 동안 상온에서 교반하면서 추출하고 추출된 프로폴리스를 여과지(Advantec No.2)를 이용하여 여과한 다음 rotary vacuum evaporator (Sanyo, Japan)를 이용하여 45℃에서 7시간 동안 감압농축하여 에탄올을 회수하고 폴리소르베이트, 글리세린, 탄산칼륨의 합 7 중량부를 첨가하여 수용화시킨 시료를 준비하였다. 준비된 시료 75ml에 천연발효유화제 5g, 올리브유화왁스 12.5g, 알로에워터 60.5g, 나이아신아드 10g, 나프리 5g을 혼합 및 교반하여 원산지가 다른 수용성 프로폴리스 추출물을 혼합 사용한 피지분비 조절 및 여드름 개선 조성물을 이용하여 임상시료를 제조하였다.

<실시예 3>

원산지별 천연 프로폴리스(프로폴리스 원괴)와 초장초, 천련자의 이물질을 제거하고 500MPa의 압력에서 75초 동안 초고압처리한 후, 동결건조를 거친 후 40 mesh로 분쇄하고, 브라질산 프로폴리스 100 : 중국산 프로폴리스 120 : 한국산 프로폴리스 80 : 초장초 분말 35 : 천련자 분말 35의 비율로 혼합한 다음, 추출관에 1 g의 시료와 에탄올 용매 50 mL를 넣은 후 조건에 따른 마이크로웨이브 추출을 하였다. 여과지(Whatmanfilter paper No.1)를 사용하여 여과한 후, 100 mL 메스플라스크로 용량을 맞춰 -5℃ 냉장고에 보관하여 사용하였다. 마이크로웨이브 추출은 2,450 MHz주파수의 상압형 마이크로웨이브 추출장치(Soxwave 100, Prolab, Fontenay, France)를 이용하였으며, 시간 제어가 가능하며 환류냉각관이 장착된 추출장치(programmable- power, 60-300 W)를 사용하여 에탄올 농도 59%, 추출시간 7.2 min, microwave power 242 W로 추출을 한 후, 추출된 프로폴리스 추출물은 rotary vacuum evaporator (Sanyo, Japan)를 사용하여 45℃에서 감압농축하여 에탄올이 잔류하지 않을 때까지 완전히 회수하고 폴리소르베이트, 글리세린, 탄산칼륨의 합 7 중량부를 첨가하여 수용화시킨 시료를 준비하였다. 준비된 시료 75ml에 천연발효유화제 5g, 올리브유화왁스 12.5g, 알로에워터 60.5g, 나이아신아드 10g, 나프리 5g을 혼합 및 교반하여 원산지가 다른 수용성 프로폴리스 추출물을 혼합 사용한 피지분비 조절 및 여드름 개선 조성물을 이용하여 임상시료를 제조하였다.

<비교예 1>

원산지별 천연 프로폴리스(프로폴리스 원괴)의 이물질 및 왁스를 제거하고 동결건조를 한 뒤 40 mesh로 분쇄하고, 브라질산 프로폴리스 100 : 중국산 프로폴리스 120 : 한국산 프로폴리스 80 의 비율로 혼합한 다음, 75% 에탄올 300 중량부를 혼합한 다음 500rpm(풍림 PL-SS200)에서 6시간 동안 상온에서 교반하면서 추출하고 추출된 프로폴리스를 여과지(Advantec No.2)를 이용하여 여과한 다음 rotary vacuum evaporator (Sanyo, Japan)를 이용하여 45℃에서 7시간 동안 감압농축하여 에탄올을 회수한 시료를 준비하였다. 준비된 시료 75ml에 천연발효유화제 5g, 올리브유화왁스 12.5g, 알로에워터 60.5g, 나이아신아드 10g, 나프리 5g을 혼합 및 교반한 추출물을 이용하여 임상시료를 제조하였다.

<비교예 2>

한국, 중국, 아르헨티나의 천연프로폴리스 각 50g을 95% 발효주정 70%와 정제수 25%의 혼합용액 150g 이용하여 500rpm(풍림 PL-SS200)에서 6시간 동안, 상온에서 교반하면서 추출하고 24시간 동안 방치한 후 추출된 프로폴리스를 여과지(Advantec No.2)를 이용하여 여과하였다. 50% 에탄올을 여과한 시료 중량의 5배 양을 가하여 100℃에서 4시간 동안 환류냉각 추출하여 상등액과 침전물을 분리하는 과정을 3회 반복하여 추출하였다. 얻어진 추출물들은 원심분리, 여과, 농축시켜 에탄올을 제거하고 이어서 정제수로 수용화시켜 시료를 제조하였다. 감초와 올리브 추출물은 감초와 올리브 각각 8kg에 50% 에탄올 수용액 48ℓ를 부가하여 90℃에서 4시간 동안 추출한 후, 1차 50% 에탄올 추출물을 확보하였다. 남아있는 감초와 올리브에 다시 50% 에탄올 수용액 28ℓ를 부가하여 90℃에서 4시간 동안 추출한 후 2차 50% 에탄올 추출물을 확보하였다. 1차 추출물과 2차 추출물을 합한 후 27.6ℓ로 농축하여 시료를 얻었다. 상기 아르헨티나, 중국, 한국산 프로폴리스 추출물을 35:30:35 중량비로 혼합한 프로폴리스 추출물 30 중량부에 상기 감초 추출물 10 중량부, 올리브잎 추출물 20 중량부를 혼합하여 시료를 제조하였고, 상기 제조된 시료 75ml에 천연발효유화제 5g, 올리브유화왁스 12.5g, 알로에워터 60.5g, 나이아신아드 10g, 나프리 5g을 혼합 및 교반한 추출물을 이용하여 임상시료를 제조하였다.

<비교예 3>

중국, 아르헨티나 및 브라질의 천연프로폴리스 각 50g을 95% 발효주정 70%와 정제수 25%의 혼합용액 150g 이용하여 500rpm(풍림 PL-SS200)에서 6시간 동안, 상온에서 교반하면서 추출하고 24시간 동안 방치한 후 추출된 프로폴리스를 여과지(Advantec No.2)를 이용하여 여과하였다. 50% 에탄올을 여과한 시료 중량의 5배 양을 가하여 100℃에서 4시간 동안 환류냉각 추출하여 상등액과 침전물을 분리하는 과정을 3회 반복하여 추출하였다. 얻어진 추출물들은 원심분리, 여과, 농축시켜 에탄올을 제거하고 이어서 정제수로 수용화시켜 시료를 제조하였다. 감초와 올리브 추출물은 감초와 올리브 각각 8kg에 50% 에탄올 수용액 48ℓ를 부가하여 90℃에서 4시간 동안 추출한 후, 1차 50% 에탄올 추출물을 확보하였다. 남아있는 감초와 올리브에 다시 50% 에탄올 수용액 28ℓ를 부가하여 90℃에서 4시간 동안 추출한 후 2차 50% 에탄올 추출물을 확보하였다. 1차 추출물과 2차 추출물을 합한 후 27.6ℓ로 농축하여 시료를 얻었다. 상기 아르헨티나, 중국, 브라질산 프로폴리스 추출물을 40:30:30 중량비로 혼합한 프로폴리스 추출물 30 중량부에 상기 감초 추출물 10 중량부, 올리브잎 추출물 20 중량부를 혼합하여 시료를 제조하였고, 상기 제조된 시료 75ml에 천연발효유화제 5g, 올리브유화왁스 12.5g, 알로에워터 60.5g, 나이아신아드 10g, 나프리 5g을 혼합 및 교반한 추출물을 이용하여 임상시료를 제조하였다.

<비교예 4>

등록특허 10-1216113의 방법으로 제조된 프로폴리스 가용 분획물을 시료로 이용하고 상기 제조된 시료 75ml에 천연발효유화제 5g, 올리브유화왁스 12.5g, 알로에워터 60.5g, 나이아신아드 10g, 나프리 5g을 혼합 및 교반한 추출물을 이용하여 임상시료를 제조하였다.

<시험예 4>- 피지분비 조절 및 여드름 개선 효과 측정

피지선은 여드름이 흔히 발생하는 얼굴, 등, 가슴 부위에 많이 존재한다. 피지선은 모낭이라 불리는 모발을 포함한 관과 연결되어 있으며, 이들 피지선에서 피지가 생성된다. 정상 상태에서 피지는 모낭의 열린 부분을 통해 피부 밖으로 배출되지만, 피지분비가 많아지면 피지가 모낭의 내벽을 자극하여 더 빨리 탈락하게 만들고, 이 탈락한 세포들은 엉겨서 모낭의 구멍을 막아 여드름의 기본 병변인 면포(comedone, 모낭 속에 고여 딱딱해진 피지)가 된다. 즉 여드름의 원인인 과다한 피지분비 조절을 하여 여드름 증상을 완화하는 효과가 있다고 알려져있다.

피지분비 조절 및 여드름 개선 효과 측정하기 위해, 실시예 1 내지 실시예 3과 비교예 1 내지 비교예 4의 방법으로 제조된 임상시료를 시료로 사용하였고, 만 14~40세의 여드름성 피부를 가진 청소년 및 성인남녀 20명에게 시험 참가 4주 전까지 여드름 치료 약제를 복용하거나 치료 연고를 도포 하지 않게 하고 최종 시험을 완료하였다. 임상시료 사용 전과 사용 2주 후를 비교하였고 피지분비 조절 및 여드름 개선효과를 측정하였다.

1) 활성화된 피지선

JANUS(JANUS1, PIE)를 이용하여 T존 부위(미간 부위와 콧등 부위)의 활성화된 피지선을 측정하였다. 활성화된 피지선은 측정 이미지에서 형광으로 발광하며, 발광된 피지선의 개수를 카운팅한 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

그 결과, 상기 표 4와 같이 실시예 1 내지 실시예 3의 임상시료 사용 전과 비교하여, 사용 2주 후에 활성화된 피지선(ea)이 유의확률 p<0.05로 유의하게 감소하였으며 실시예 3이 가장 탁월하게 감소하였다.

2) 유분합성량

Sebumeter(SM820, C&K electronic)를 이용하여 미간 사이의 유분합성량을 측정하였다. 유분합성량은 광학적 반사원리를 이용한다. 유분을 흡수한 테이프는 투명해지고 투명해진 테이프를 투과한 광이 유분합성량을 의미하며, 그 결과는 하기 표 5에 나타내었다.

그 결과, 상기 표 5와 같이 실시예 1 내지 실시예 3의 임상시료 사용 전과 비교하여, 사용 2주 후에 유분 합성량이 유의확률 p<0.05로 유의하게 감소하였으며 실시예 3이 가장 탁월하게 감소하였다.

3) 염증성 병변의 수치 및 변화율

염증성 병변(구진, 농포, 결절) 수를 카운팅하고, 기저치 대비 비율로 평가였으며, 그 결과는 하기 표 6에 나타내었다.

그 결과, 상기 표 6과 같이 실시예 1 내지 실시예 3의 임상시료 사용 전과 비교하여, 사용 2주 후에 염증성 병변 수치가 유의확률 p<0.05로 유의하게 감소하였으며 실시예 3이 가장 탁월하게 감소하였다.

4) Michaelson's Acne Severity Index(ASI)

각각의 병변의 수를 측정하여, 아래의 식에 따라 계산하여 수치의 변화폭으로 호전도를 반영 및 평가하였고 그 결과는 하기 표 7에 나타내었다.

ASI = (면포수 * 0.5) + (구진수 * 1) + (농포수 * 2) +(결절수 * 3)

그 결과, 상기 표 7과 같이 실시예 1 내지 실시예 3의 임상시료 사용 전과 비교하여, 사용 2주 후에 ASI 수치가 유의확률 p<0.05로 유의하게 감소하였으며 실시예 3이 가장 탁월하게 감소하였다.

5) 시험대상자의 만족도 평가

임상 시료 사용 후 피지분비 조절과 여드름성 피부 사용 적합성 및 제품 기호도 평가를 실시하여 하기 표 8과 같은 결과를 얻었다. 이때 평가는 매우우수 10점, 우수 8점, 보통 6점, 나쁨 4점, 매우나쁨 2점의 기준에 따라 평가하였고 이에 따른 결과를 표 1에 나타냈다.

여드름성 피부염 증상 완화 효과 평가

	실시예 1	실시예 2	실시예 3	비교예 1	비교예 2	비교예 3	비교예 4
보습력 지속	8.5	8.7	9.2	7.0	6.8	6.8	6.5
수분손실개선	8.2	8.6	9.1	7.6	7.4	7.4	7.1
피지분비 조절	8.4	8.8	9.0	6.2	5.9	6.0	5.5
여드름성 피부염 증상 완화	8.3	8.9	9.4	5.8	5.3	5.6	5.0

상기 표 8에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 피지분비 조절 및 여드름 개선 조성물을 이용한 임상시료를 사용한 경우 비교예와 대비하여 보습력, 수분 손실 개선, 피지분비 조절, 여드름성 피부염 증상 완화 효과가 탁월하게 증대되는 것을 확인할 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (6)

1. 원산지가 다른 수용성 프로폴리스 추출물을 혼합 사용한 피지분비 조절 개선 조성물의 제조방법에 있어서,
   상기 피지분비 조절 개선 조성물의 제조방법은
   (a) 브라질산 프로폴리스, 중국산 프로폴리스과 한국산 프로폴리스를 혼합하기 전에 상기 각 천연프로폴리스의 이물질 및 왁스를 제거하고 동결건조 한 뒤 30 내지 50mesh로 분쇄하여 원산지가 다른 프로폴리스 분말을 준비하는 단계;
   
   (b) 상기 (a)단계에서 준비된 브라질산 프로폴리스 100 중량부에 중국산 프로폴리스 115 내지 125 중량부, 한국산 프로폴리스 75 내지 85 중량부를 혼합하되,
   피지분비 조절 및 여드름 개선 효과를 위하여 초장초와 천련자를 각각 22 내지 42중량부를 더 첨가하는 단계;
   (c) 상기 (b)단계의 원산지가 다른 프로폴리스 혼합분말 100중량부를 70 내지 80% 에탄올 250 내지 350 중량부와 혼합한 다음 500rpm으로 4 내지 8시간 동안 상온에서 교반하여 추출하고 여과하는 단계;
   (d) 상기 (c)단계에서 여과된 프로폴리스 추출물을 40 내지 50℃의 온도에서 6 내지 8시간 동안 감압농축하여 에탄올을 회수하는 단계;
   (e) 상기 (d)단계에서 에탄올이 회수된 프로폴리스 추출물을 유화제, 또는 유화제와 유화보조제로 수용화시켜 피지분비 조절 개선 조성물을 제조하되,
   상기 유화제는 지방산 또는 지방 알코올의 폴리에틸렌글리콜 에테르, 폴리에틸렌글리콜-7 올리베이트(PEG-7 olivate), 폴리에틸렌글리콜-8 라우레이트(PEG-8 laurate), 폴리에틸렌글리콜-60 알몬드 글리세라이드(PEG-60 almond glyceride), 폴리에틸렌글리콜-20 메틸글루코오스세스퀴스테아레이트(PEG-20 methyl glucose sesquistearate), 및 폴리에틸렌글리콜-100 스테아레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 사용하고,
   상기 유화보조제는 글리세린, 탄산칼륨, 염화나트륨으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 사용하는 것을 특징으로 하는 원산지가 다른 수용성 프로폴리스 추출물을 혼합 사용한 피지분비 조절 개선 조성물의 제조방법.
   
2. 제 1항에 있어서,
   상기 원산지가 다른 프로폴리스는 브라질산 프로폴리스, 호주산 프로폴리스, 한국산 프로폴리스를 대신 사용하되,
   상기 브라질산 프로폴리스, 호주산 프로폴리스, 한국산 프로폴리스를 혼합하기 전에 각 천연프로폴리스의 이물질 및 왁스를 제거하고 동결건조 한 뒤 30 내지 50mesh로 분쇄하여 원산지가 다른 프로폴리스 분말을 준비하고,
   상기 준비된 브라질산 프로폴리스 추출물 100 중량부에 호주산 프로폴리스 추출물 95 내지 105 중량부, 한국산 프로폴리스 추출물 115 내지 125 중량부를 중량비율로 혼합하며, 피지분비 조절 및 여드름 개선 효과를 위하여 초장초와 천련자를 각각 22 내지 42중량부를 더 첨가하는 것을 특징으로 하는 원산지가 다른 수용성 프로폴리스 추출물을 혼합 사용한 피지분비 조절 개선 조성물의 제조방법.
   
   
3. 삭제
4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
   상기 첨가되는 유화제와 유화보조제의 비율은 폴리소르베이트 80, 글리세린, 탄산칼륨이 1 : 4 : 1 내지 2 : 4: 1의 중량비율로 첨가되는 것을 특징으로 하는 원산지가 다른 수용성 프로폴리스 추출물을 혼합 사용한 피지분비 조절 개선 조성물의 제조방법.
   
5. 원산지가 다른 수용성 프로폴리스 추출물을 이용한 피지분비 조절 및 여드름 개선용 화장료 조성물의 제조방법에 있어서,
   상기 피지분비 조절 및 여드름 개선용 화장료 조성물의 제조방법은
   (a) 브라질산 프로폴리스, 중국산 프로폴리스과 한국산 프로폴리스를 혼합하기 전에 상기 각 천연프로폴리스의 이물질 및 왁스를 제거하고 동결건조 한 뒤 30 내지 50mesh로 분쇄하여 원산지가 다른 프로폴리스 분말을 준비하는 단계;
   
   (b) 상기 (a)단계에서 준비된 브라질산 프로폴리스 100 중량부에 중국산 프로폴리스 115 내지 125 중량부, 한국산 프로폴리스 75 내지 85 중량부를 혼합하되,
   피지분비 조절 및 여드름 개선 효과를 위하여 초장초와 천련자를 각각 22 내지 42중량부를 더 첨가하는 단계;
   (c) 상기 (b)단계의 원산지가 다른 프로폴리스 혼합분말 100중량부를 70 내지 80% 에탄올 250 내지 350 중량부와 혼합한 다음 500rpm으로 4 내지 8시간 동안 상온에서 교반하여 추출하고 여과하는 단계;
   (d) 상기 (c)단계에서 여과된 프로폴리스 추출물을 농축시키며 에탄올을 회수하는 단계;
   (e) 상기 (d)단계에서 에탄올이 회수된 프로폴리스 추출물에 폴리소르베이트를 350 내지 450 중량부를 첨가하여 수용화시켜 피지분비 조절 및 여드름 개선용 화장료 조성물을 제조하는 단계;를 포함하되,
   상기 화장료 조성물의 제형은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이인 것을 특징으로 하는 원산지가 다른 수용성 프로폴리스 추출물을 혼합 사용한 피지분비 조절 및 여드름 개선용 화장료 조성물의 제조방법.
   
6. 제 5항에 있어서,
   상기 원산지가 다른 프로폴리스는 브라질산 프로폴리스, 호주산 프로폴리스, 한국산 프로폴리스를 대신 사용하되,
   상기 브라질산 프로폴리스, 호주산 프로폴리스, 한국산 프로폴리스를 혼합하기 전에 각 천연프로폴리스의 이물질 및 왁스를 제거하고 동결건조 한 뒤 30 내지 50mesh로 분쇄하여 원산지가 다른 프로폴리스 분말을 준비하고,
   상기 준비된 브라질산 프로폴리스 추출물 100 중량부에 호주산 프로폴리스 추출물 95 내지 105 중량부, 한국산 프로폴리스 추출물 115 내지 125 중량부를 중량비율로 혼합하며, 피지분비 조절 및 여드름 개선 효과를 위하여 초장초와 천련자를 각각 22 내지 42중량부를 더 첨가하는 것을 특징으로 하는 원산지가 다른 수용성 프로폴리스 추출물을 혼합 사용한 피지분비 조절 및 여드름 개선용 화장료 조성물의 제조방법.

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