KR101216113B1 - 항여드름 효능 및 주름개선 효능을 가지며 향취가 개선된 프로폴리스 가용 분획물 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항여드름 효능 및 주름개선 효능을 가지며 향취가 개선된 프로폴리스 가용 분획물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
상기한 바와 같은 목적을 갖는 본 발명의, 항여드름 효능 및 주름개선 효능을 가지며 향취가 적합한 프로폴리스 가용 분획물의 제조방법은, 헥산과 클로로포름(혹은 에틸아세테이트)의 혼합액을 용매로 하여 1차 추출하고 에탄올을 용매로 하여 2차 추출하는 것을 특징으로 한다.
프로폴리스는 특히 향취 때문에 제품화에 어려움이 있었는바, 본 발명에 따른 분획물은 여드름과 주름에 효과를 가지면서도 독특한 향취가 거의 제거되어 프로폴리스의 활용성을 극대화할 수 있다.

Description

항여드름 효능 및 주름개선 효능을 가지며 향취가 개선된 프로폴리스 가용 분획물 및 그 제조방법{The solvent fractions of propolis with suitable smell for inhibiting acne and lifting wrinkles}

본 발명은 항여드름 효능 및 주름개선 효능을 가지며 향취가 개선된 프로폴리스 가용 분획물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 항여드름 효능 및 주름개선 효능을 가질 뿐 아니라 2단계 추출을 통해 종래 특유의 향취로 인해 제품화가 어려웠던 단점까지 제거한, 프로폴리스의 가용 분획물에 관한 것이다.

프로폴리스는 특히 향취 때문에 제품화에 어려움이 있었는바, 본 발명에 따른 분획물은 여드름과 주름 개선에 효과를 가지면서도 독특한 향취가 거의 제거되어 프로폴리스의 활용성을 극대화할 수 있다.

본 발명에 따른 프로폴리스 가용 분획물은 화장품의 원료로 사용 가능하다.

세계 각국에서 프로폴리스의 항균, 항바이러스 효과, 항염 효과, 항암, 항산화 작용 등의 연구가 진보됨에 따라 이 물질에 대한 관심이 높아지고 있다. 1985년 나고야에서 개최된 제30회 국제양봉회의에서는 프로폴리스의 치료효과가 발표되면서 특히 의료 면에서 주목을 받게 되었다.

2002년 일본의 Shigemi Tazawa는 다양한 프로폴리스의 여러 성분들을 가지고 티로시나아제 저해 활성을 측정하여 결과를 발표하였다. 티로시나제는 티로신을 산화하여 밤색의 멜라닌 색소를 생성케 하는 효소로서 그 저해하는 활성이 높을수록 피부 미백에 도움을 주는 기능을 가지게 되는데, 다양한 프로폴리스의 성분들을 이용하여 기존의 화장품 미백 원료로 사용되는 kojic acid, ascorbic acid, arbutin 등과 비교하였을 때 우수한 효과를 나타냄을 확인하였다.

또한 프로폴리스의 항암 효과는 가장 최근에 밝혀진 중요한 효능 중 하나이다. 특히 현재 세계 프로폴리스 연구와 시장을 주도하고 있는 일본의 경우, 1985년부터 동경 의대, 치과 대학 및 국립대 의과대와 인터페론(interferon) 관계의 연구소 등에서 연구가 본격적으로 전개되고 있으며, 1991년 제50회 일본 암학회 및 1992년 제51회 일본 암학회에서 위암, 간장암, 폐암 등 치료에 효과가 있음을 밝혔다. 현재까지 프로폴리스가 함유하고 있는 것으로 밝혀진 항암 성분은 케르세틴, 카페인산, 클레로단 디터펜도이드, 아테필린 C 등으로, 부작용을 수반하는 기존의 항암제와는 달리 건강한 세포에는 작용하지 않고 암세포에만 효능을 나타냄으로써 부작용이 전혀 없는 것이 특징이다.

이처럼 국내외에서 프로폴리스에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으나 프로폴리스의 화장품 소재 개발과 피부 재생에 대한 효능 평가 부분에 대한 연구는 미비한 실정이다.

더욱이 프로폴리스는 기능성에도 불구하고 그 특유의 향취로 인해 화장품이나 피부 외용제로 활용하는 데 제약이 매우 컸다.

본 발명은 상기한 배경에서 안출된 것으로, 여드름과 주름에 효과를 가지면서 별도의 첨가물 없이도 특유의 향이 최소화된 프로폴리스의 유용물질 추출방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.

발명자들은 본 발명의 프로폴리스 가용 분획물이 Propionibacterium acnes의 성장 억제와 human fibroblast cell의 MMP-1(matrix metalloproteinase-1)의 발현을 억제함으로써 항여드름 효능 및 주름개선 효능을 갖는다는 점과 별도의 첨가물 없이도 프로폴리스 특유의 향을 최소화함을 확인하였다.

상기한 바와 같은 목적을 갖는 본 발명의, 항여드름 효능 및 주름개선 효능을 가지며 향취가 적합한 프로폴리스 가용분획물의 제조방법은, 헥산과, 클로로포름 및 에틸아세테이트 중의 어느 하나의 혼합액을 용매로 하여 1차 추출하고 에탄올을 용매로 하여 2차 추출하는 것을 특징으로 한다.

이때 헥산과, 클로로포름 및 에틸아세테이트 중의 어느 하나의 혼합비는 4~6 : 1의 중량비인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 프로폴리스 가용분획물 제조방법은 또한,

프로폴리스를 건조하여 분쇄하는 단계;

분쇄한 프로폴리스를 헥산과, 클로로포름 및 에틸아세테이트 중의 어느 하나를 혼합한 액에 침지하는 단계;

여과를 통해 상기 헥산과, 클로로포름 및 에틸아세테이트 중의 어느 하나의 혼합액의 용매 분획물을 제거하는 단계;

상기 용매 분획물을 제거하고 남은 잔여물을 에탄올에 침지하는 단계; 및

여과를 통해 상기 에탄올 용매의 분획물만 분리해낸 후 이를 감압농축하여 용매를 제거하는 단계;로 이루어지는 것을 특징으로 한다.

이때 헥산과, 클로로포름 및 에틸아세테이트 중의 어느 하나의 혼합비는 4~6 : 1의 중량비인 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 상기 방법들 중 어느 하나의 제조방법으로 제조되는 프로폴리스 가용분획물인 것을 특징으로 한다.

발명자들은 상기 프로폴리스 가용 분획물이 Propionibacterium acnes의 성장 억제를 통해 효과적으로 여드름을 치료한다는 점을 확인하였다.

또한, 상기 프로폴리스 가용 분획물이 human fibroblast cell의 MMP-1(matrix metalloproteinase-1)의 발현을 억제함을 통해 효과적으로 주름을 개선한다는 점을 확인하였다.

또한 상기 프로폴리스 가용 분획물은 별도의 인공 첨가제 없이도 프로폴리스 특유의 향이 최소화되어 있음을 확인하였다.

천연항생제로 불리는 프로폴리스는 피부 항산화효과, 항염증, 미백 등의 다양한 기능을 가지고 있으나 특유한 향취와 칼라 등으로 화장품 원료로 활용되지 못하였다. 본 발명에 따르면, 여드름과 주름에 효과를 가지면서 별도의 첨가물 없이도 특유의 향이 최소화된 프로폴리스의 유용물질을 획득할 수 있다.

따라서 화장품의 성분으로 투입하는 방법 등으로 프로폴리스의 기능 활용을 극대화할 수 있다.

도 1은 헥산, 클로로포름, 에탄올을 용매로 하는 프로폴리스 용매 가용 분획물을 제조하는 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 헥산과, 클로로포름 혹은 에틸아세테이트(중량비 5:1)를 1차 용매로 하고 에탄올을 2차 용매로 하여 프로폴리스 용매 가용 분획물을 제조하는 과정을 나타낸 것이다.
도 3은 가용 분획물의 Propionibacterium acnes KCT3314의 성장억제 실험 결과 사진이다. 상단은 프로폴리스 클로로포름 가용 분획물을, 중단은 프로폴리스 에탄올 가용 분획물을, 하단은 본 발명의 2단계 추출에 따른 가용 분획물(이하 'pro C'라고 칭함)을 의미한다.

이하, 본 명세서에서 사용되는 용어들을 정의한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "프로폴리스 용매 가용 분획물"은 여드름 치료 및 주름개선의 목적으로 프로폴리스를 용매에 분획할 때 각각의 효능이 있는 가용 분획물을 의미한다.

본 발명에 사용되는 용어 "가용 분획물"은 프로폴리스 원료를 헥산과 클로로포름 등 용매를 통해 얻은 분획물을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "여드름 치료"는 본 발명에 의해 여드름 원인균인 Propionibacterium acnes를 배양한 후 증식이 억제되는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "주름개선 효능"은 본 발명에 의해 콜라겐 분해효소인 MMP-1의 유도체인 TNF-α를 처리한 human fibroblast에서 MMP-1의 발현이 억제되는 것을 의미한다.

본 발명은 항여드름 효능 및 주름개선 효능을 갖는 프로폴리스 용매 가용 분획물을 제공한다. 이 가용 분획물은 특히, 프로폴리스 특유의 향이 최소화된 것이다. 상기 프로폴리스는 무알콜?수용성인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 프로폴리스는 채집한 것 또는 시판되는 것에 제한 없이 사용할 수 있다.

본 발명의 프로폴리스 가용 분획물 제조방법에 있어서, 각 추출 용매는 프로폴리스 무게의 2배 내지 10배를 첨가하여 추출하는 것이 바람직하고, 3배 내지 5배를 첨가하여 추출하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

추출 온도는 30℃ 내지 100℃인 것이 바람직하며, 50℃ 내지 80℃인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

추출시간은 1일 내지 5일인 것이 바람직하며, 2일 내지 3일인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

추출 횟수는 2번 내지 5번 반복 추출하는 것이 바람직하며, 3번 내지 4번 반복 추출하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

감압농축은 회전식 감압농축기(Rotary Vacuum Evaporator)을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 35℃ 내지 55℃에서 감압 농축하는 것이 바람직하고 40℃ 내지 50℃에서 감압 농축하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

발명자들은 상기 프로폴리스 가용 분획물이 Propionibacterium acnes의 성장 억제를 통해 효과적으로 여드름을 치료한다는 점을 확인하였으며, 또한 human fibroblast cell의 MMP-1의 발현을 억제함을 통해 효과적으로 주름을 개선한다는 점을 확인하였다.

실시예 1. 프로폴리스 추출물의 제조

프로폴리스를 직사광선을 피한 서늘한 곳에서 완전히 건조하고, 믹서기로 곱게 분쇄한 후 시료 양의 5배 중량의 용매를 가하여 시료를 침지하고, 24시간 방치한 다음, 여과지를 이용하여 각 용매의 가용물 분획을 얻고, 감압농축기를 사용하여 용매를 제거하여(2회 반복) 각각의 용매분획물을 얻었다.

이 과정을 도 1과 도 2에 나타내었다.

도 1의 경우를 상세히 설명하면 다음과 같다.

1) 채집한 프로폴리스에 헥산을 가하여 추출

2) 단계 1)의 추출물을 용매에 24시간 방치한 후 여과지를 이용하여 가용물 분획을 얻은 후 감압하에 농축하여 프로폴리스 추출물을 수득(=헥산 가용분획물)

3) 단계 2)의 여과 후 잔여물을 건조한 후, 클로로포름을 가하여 24시간 방치한 후 여과지를 이용하여 가용물분획을 얻은 후 감압하에 농축하여 프로폴리스 추출물을 수득(=클로로포름 가용분획물)

4) 단계 3)의 여과 후 잔여물을 건조한 후, 에탄올을 가하여 24시간 방치한 후 여과지를 이용하여 가용물분획을 얻은 후 감압하에 농축하여 프로폴리스 추출물을 수득(=에탄올 가용분획물)

도 2의 경우를 자세히 설명하면 다음과 같다.

1) 채집한 프로폴리스에 비극성용매인 중량비 5:1의 헥산/클로로포름(또는 에틸아세테이트, 실제 실시예에서는 클로로포름을 사용함)을 가하여 추출

2) 단계 1)의 추출물을 용매에 24시간 방치한 후 여과지를 이용하여 가용물 분획을 얻음

3) 단계 2)의 여과후 잔여물을 건조한 후, 에탄올을 가하여 24시간 방치한 후 여과지를 이용하여 가용물 분획을 얻은 다음 감압농축(=본 발명에 따른 2단계 추출물 'pro C')

이를 통해 프로폴리스 30g을 이용하여 헥산 가용 분획물 2.5g, 클로로포름 가용 분획물 18.8g, 에탄올 가용 분획물 5.4g을 수득하였다. 또한 마찬가지로 프로폴리스 30g을 이용하여 pro C 14g을 수득하였다(표 1).

이들을 실험에 사용할 때까지 냉암소에 보관하였다.

실시예 2. 항여드름 효과

본 발명자들은 프로폴리스 용매 가용 분획물의 항여드름 효능을 알아보기 위해 여드름의 원인균인 Propionibacterium acnes KCTC3314를 사용하였다.

1.5 X 10⁸ cells/mL로 희석된 균주를 96-well plate에 각각 20mL/well로 분주한 후 RC 액체배지에 2배수씩 희석하고 클로로포름 가용 분획물과 에탄올 가용 분획물 및 2단 복합용매 가용 분획물을 최종 처리농도가 5000~2.5ppm이 되도록 처리하고 1일간 배양 후 MIC(minimum inhibitory concentration)를 확인하였다.

각 분획을 제조하여 항여드름균에 대한 효능을 평가한 결과, 도 3과 같이 단순 용매분획을 통하여 수득한 클로로포름 가용분획물 및 에탄올 가용분획물의 경우 여드름 균의 농도 40ppm에서 원색이 진한 핑크색에서 남색으로 변한 것으로 나타나 최소저해농도(MIC, minimal inhibitory concentration)가 40ppm인 것으로 확인되었다. 반면, pro C의 경우 여드름균 농도가 2.5ppm에서 남색으로 변색되어 여드름균 증식의 최소저해농도는 2.5ppm으로 확인되었는바, 이로써 클로로포름 및 에탄올가용 분획물에 비해 여드름균 증식 저해 효능이 10배 이상 강화되었다는 점을 알 수 있다(이상 도 3 및 표 2 참조).

따라서, 본 발명에 따른 2단 추출을 이용하여 분획물을 제조할 경우 수율이 양호함은 물론 효능의 극대화까지 꾀할 수 있다고 하겠다.

실시예 3. 주름개선 효과

프로폴리스 용매 가용 분획물의 주름개선 효능을 알아보기 위해 3.0 X 10⁴ cells/mL로 희석된 human fibrobalst cell을 24-well plate에 분주한 후 24시간 배양하고 클로로포름 가용 분획물과 에탄올 가용 분획물, pro C를 1~0.01ppm이 되도록 처리한 후 25nM TNF-α (MMP-1 inducer)를 첨가하여 24시간 배양한 다음 MMP-1의 억제율을 확인하였다(이상 표 3).

그 결과 클로로포름 가용 분획물, 에탄올 가용 분획물, pro C에서 효과를 확인할 수 있었다. 특히 1ppm의 농도에서 클로로포름 가용 분획물 및 에탄올 가용 분획물이 MMP-1의 발현을 각각 28.2%, 36.6% 억제하는 것에 비해 pro C에서는 50.2% 억제하는 것으로 나타나 주름개선 효과가 탁월한 것을 알 수 있었다.

이상의 결과로써 본 발명에 따른 pro C가 Propionibacterium acnes의 성장 억제와 MMP-1의 발현 억제를 유발함을 통해서 여드름의 치료 및 주름 개선에 효과적이라는 것을 확인할 수 있다.

실시예 4. 향취 검사(관능 검사)

상기 각 프로폴리스 분획물에 대해 총 20명을 대상으로 관능검사를 실시하였다. 항목은 프로폴리스 향과 전반적인 선호도에 대해 5점법으로 실시하였으며, 기존 자사에서 생산되고 있는 프로폴리스 추출물을 기준으로 하여 평가하였다.

Claims (5)

1. 헥산과, 클로로포름 및 에틸아세테이트 중의 어느 하나의 혼합액을 용매로 하여 1차 추출하고 에탄올을 용매로 하여 2차 추출하는 것을 특징으로 하는,
   항여드름 효능 및 주름개선 효능을 가지며 향취가 개선된 프로폴리스 가용 분획물의 제조방법.
2. 제1항에 있어서,
   헥산과, 클로로포름 및 에틸아세테이트 중의 어느 하나의 혼합비는 4~6 : 1의 중량비인 것을 특징으로 하는,
   항여드름 효능 및 주름개선 효능을 가지며 향취가 개선된 프로폴리스 가용 분획물의 제조방법.
3. 프로폴리스를 건조하여 분쇄하는 단계;
   분쇄한 프로폴리스를 헥산과, 클로로포름 및 에틸아세테이트 중의 어느 하나를 혼합한 액에 침지하는 단계;
   여과를 통해 상기 헥산과, 클로로포름 및 에틸아세테이트 중의 어느 하나의 혼합액의 용매 분획물을 제거하는 단계;
   상기 용매 분획물을 제거하고 남은 잔여물을 에탄올에 침지하는 단계; 및
   여과를 통해 상기 에탄올 용매의 분획물만 분리해낸 후 이를 감압농축하여 용매를 제거하는 단계;로 이루어지는 것을 특징으로 하는,
   항여드름 효능 및 주름개선 효능을 가지며 향취가 개선된 프로폴리스 가용 분획물의 제조방법.
4. 제3항에 있어서,
   헥산과, 클로로포름 및 에틸아세테이트 중의 어느 하나의 혼합비는 4~6 : 1의 중량비인 것을 특징으로 하는,
   항여드름 효능 및 주름개선 효능을 가지며 향취가 개선된 프로폴리스 가용 분획물의 제조방법.
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