KR102311547B1

KR102311547B1 - 지혈 및 상처치유용 창상피복재 및 이의 제조 방법

Info

Publication number: KR102311547B1
Application number: KR1020190151554A
Authority: KR
Inventors: 유정희; 박기환; 선명주; 조이; 황철주; 김기훈
Original assignee: (주)메디팁
Priority date: 2019-11-22
Filing date: 2019-11-22
Publication date: 2021-10-13
Also published as: WO2021101311A1; CN114728093A; CN114728093B; KR20210063076A

Abstract

본 발명은 지혈 및 상처치유용 창상피복재 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 창상피복재 제조시 히알루론산 및 콜라겐의 배합비, 및 동결건조 조건을 조절하는 것에 의해 최적의 창상치유 촉진 효과 및 유착방지 효과뿐만 아니라 경제성 및 상업성이 우수한 창상피복재의 제조방법에 관한 것이다.

Description

지혈 및 상처치유용 창상피복재 및 이의 제조 방법 {wound dressing material for hemostasis and wound treatment, and method for preparing same}

본 발명은 지혈, 유착방지 및 상처치유용 창상피복재 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 창상피복재 제조시 히알루론산 및 콜라겐의 배합비, 및 동결건조 조건을 조절하는 것에 의해 최적의 창상치유 촉진 효과 및 유착방지 효과뿐만 아니라 경제성 및 상업성이 우수한 창상피복재의 제조방법에 관한 것이다.

창상(wound)이란 외부의 압력에 의하여 조직의 연속성이 파괴되는 상태를 의미한다. 창상의 치유 과정은 일반적으로 염증단계, 증식단계 및 성숙단계의 3 단계로 구분되는데, 창상 치료를 위해서는 이상적인 피복재(드레싱)로 창상 부위가 외부 환경에 노출되는 것을 차단하여 감염을 예방하고, 염증 반응을 억제하여야 한다. 창상 치료를 위한 생물학적 드레싱 재료로 인체 피부의 구성물에 해당하는 진피내의 콜라겐, 엘라스틴 등의 물질을 원료로 하는 드레싱 재료가 많이 개발되고 있다. 콜라겐의 경우 인체의 뼈와 피부 등의 조직을 구성하는 주요 단백질로서 중요한 역할을 하고 있으며, 피부의 70%가 콜라겐으로 구성되어 있는데 이는 조직 리모델링 (remodeling)과 창상 치유에 있어서 중요한 생리적 역할을 하고 있다. 또한, 여러 연구에서 콜라겐이 창상 치유에 효과가 있음을 보여주고 있다. 이러한 생물학적 드레싱 재료의 예로, 대한민국 특허출원 공개번호 제10-2010-0009305호에서는 키토산에 소수성 지방산기를 결합시켜 세포부착 단백질의 부착능이 증대된 키토산 스폰지와 이를 이용한 창상 도포재를 개시하고 있다.

또한, 히알루론산(hyaluronic acid, HA)은 N-아세틸-D-글루코사민과 D-글루쿠론산으로 구성되어 있고 상기 반복단위가 선형으로 연결되어 있는 생체고분자 물질로서, 안구의 유리액, 관절의 활액 및 닭벼슬 등에 많이 존재한다. 히알루론산은 우수한 생체적합성과 점탄성으로 인해 수술 후의 유착 방지제, 주름살 개선제, 성형 보조물, 관절기능 개선제, 약물 전달체 및 세포배양 지지체(Scaffold) 등 다양한 용도로 개발되고 있다 (F. Manna, M. Dentini, P. Desider, O. De Pita, E. Mortilla, B. Maras, Journal of European Academy of Dermatology and Venereology, 13(1999) 183-192).

한편, 콜라겐과 히알루론산을 이용한 창상피복재와 관련하여 대한민국 공개특허 제2013-0009651은 콜라겐, 히알루론산 유도체 및 포유류의 탯줄 유래 줄기세포를 포함하는 연골세포치료제를 개시하고 있으나, 콜라겐과 히알루론산을 단순 혼합한 방식으로 화학가교물질을 사용하지 않고서는 목적을 달성하기 위한 제형화를 하지 못한다는 문제점이 있다. 또한, 사용되는 제형도 건조상의 제형만으로 사용될 수밖에 없는 단점이 있어, 사용분야 및 사용방법에 있어 다양한 방법을 제공하지 못하는 한계가 존재한다.

이에 본 발명자들은 창상피복재의 품질과 신뢰성을 대폭 향상시킬 수 있는 제품을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 히알루론산나트륨 및 콜라겐의 배합비 및 동결건조 조건을 조절하는 것에 의해 최적의 창상치유 촉진 효과 및 유착 방지 효과뿐만 아니라 경제성 및 상업성이 우수할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명은 지혈 및 상처치유용 창상피복재의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "히알루론산"은 히알루론산 자체와 히알루론산 염을 모두 포함하는 의미로 사용된다. 따라서, 이하에서 사용된 용어 "히알루론산 수용액"은 히알루론산의 수용액, 히알루론산 염의 수용액, 및 히알루론산 과 히알루론산 염의 혼합 수용액을 모두 포함하는 개념이다. 상기 히알루론산 염은 히알루론산 나트륨, 히알루론산 칼륨, 히알루론산 칼슘, 히알루론산 마그네슘, 히알루론산 아연, 히알루론산 코발트 등의 무기염과, 히알루론산 테트라부틸암모늄 등의 유기염이 모두 포함된다. 경우에 따라서는, 그들의 둘 또는 그 이상이 조합되어 사용될 수도 있다.

본 발명은

(A) 0.4중량% 내지 1중량%의 히알루론산 또는 그의 염, 0.1중량% 내지 0.5중량%의 콜라겐 및 0.3중량% 내지 0.6중량%의 염화나트륨을 포함하는 수용액을 혼합하는 단계;

(B) 상기 수용액의 pH를 6 내지 8로 조절하는 단계;

(C) 상기 수용액을 동결 건조하여 패드 형태로 만드는 단계;

(D) 상기 동결건조 완료된 패드를 그대로 두거나 압착을 통해 두께를 조절하는 단계; 및

(D) 상기 동결건조 및 두께 조절이 완료된 패드에 대해 EO gas, 감마선 또는 전자빔 멸균하는 단계를 포함하는 창상피복재의 제조 방법을 제공하고자 한다.

본 발명에 따른 창상피복재에 있어서, 상기 창상피복재는 약제학적 조성물 또는 의약외품 조성물인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 창상피복재에 있어서, 상기 수용액은 탈이온수(deionized water: DW), 정제수, 주사용수 또는 인산염완충용액(PBS)인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 창상피복재에 있어서, 상기 히알루론산 또는 그의 염의 분자량은 50만 달톤 내지 1000만 달톤인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 창상피복재에 있어서, 상기 콜라겐은 돼지, 양, 소, 또는 생선 유래의 콜라겐인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 창상피복재에 있어서, 상기 단계 (A)에서 혼합은 18시간 내지 48시간 동안 100 내지 300 rpm의 교반 속도로 수행되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 창상피복재에 있어서, 상기 동결건조는:

(a) 5℃까지 도달하는데 60분, 5℃에서 120분, -5℃까지 도달하는데 600분, -5℃에서 60분, 및 -35℃까지 도달하는데 600분의 조건으로 동결시키는 단계; 및

(b) -35℃ 및 진공도 200 mtorr에서 60분, -35℃ 및 진공도 150 mtorr에서 60분, 진공도 100 mtorr 이하에서 -5℃까지 도달하는데 1440분, 진공도 100 mtorr 이하의 조건 및 -5℃에서 1440분, 진공도 100 mtorr 이하에서 20℃까지 도달하는데 600분, 진공도 100 mtorr 이하의 조건 및 20℃에서 720분 조건으로 건조시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 창상피복재에 있어서, 상기 창상피복재는 EO gas 잔류량 시험법에 따라 시험할 때 25 mg/kg 미만의 ETO 잔류량 및 25 mg/kg 미만의 ECH 잔류량을 가지는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 창상피복재에 있어서, 상기 창상피복재는 흡수력시험법에 따라 시험할 때 500% 내지 2000%의 흡수력을 가지는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 창상피복재에 있어서, 상기 창상피복재는 건조감량 시험법에 따라 시험할 때 20% 이하의 건조감량을 가지는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 창상피복재에 있어서, 상기 창상피복재는 용출물 시험 중 pH 시험법에 따라 시험할 때 1.5 이하의 pH 차이를 가지는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 창상피복재에 있어서, 상기 창상피복재는 열분석 시험법에 따라 시험할 때 50℃ 이하에서 흡열 또는 발열 반응 피크가 나타나지 않는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 창상피복재에 있어서, 상기 창상피복재의 가로, 세로 및 두께의 치수는 각각 0.5 cm 내지 20 cm, 0.5 cm 내지 20 cm, 및 0.01 cm 내지 1 cm 인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 창상피복재에 있어서, 상기 창상피복재는 제곱센티미터 당 1.06 mg 내지 5.75 mg의 히알루론산 및 0.45 mg 내지 6.03 mg의 콜라겐을 함유하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 창상피복재에 있어서, 상기 창상피복재는 살균 소독제, 지혈제, 오피오이드계 진통제, 술파제 및 항생물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 약물을 추가로 포함할 수 있는 것을 특징으로 한다. 예를 들면, 상기 살균 소독제는 아크리놀, 염화 벤잘코늄, 염화 벤제토늄, 글루콘산 클로르헥시딘, 요드, 요드 팅크, 요도포름 또는 포비돈 요드를 포함한다. 상기 지혈제는 트롬빈, 알긴산나트륨, ε-아미노카프로인산, 올레인산 모노에탄올아민, 카르바조크롬 술폰산나트륨 또는 트라넥삼산을 포함할 수 있다. 상기 오피오이드계 진통약은 염산 모르핀 또는 황산 모르핀을 포함할 수 있다. 상기 술파제는 살라조술파피리딘, 술파디아진, 술파디아진실버, 술파디메톡신, 술파메티졸, 술파메톡사졸, 술파모노메톡신, 술피소미딘 또는 술피소미딘 나트륨을 포함할 수 있다. 상기 항생 물질은 염산 반코마이신, 염산 린코마이신, 클린다마이신, 테이코플라닌, 페네티실린 칼륨, 벤질페니실린칼륨, 벤질페니실린 벤자틴, 무피로신 칼슘 수화물, 황산 아르베카신, 아즈트레오남, 염산 스펙티노마이신, 염산 피브메시리남, 카르모남 나트륨, 코리스틴 메탄술폰산 나트륨, 세프술로딘 나트륨, 세프티부텐, 토브라마이신, 황산 아미카신, 황산 이세파마이신, 황산 카나마이신, 황산 프라디오마이신, 황산 폴리믹신 B, 아스폭시실린, 아목시실린, 앰피실린, 앰피실린 나트륨, 염산 세프타메트 피복실, 염산 세페핌, 염산 세포조프란, 염산 세포티암, 염산 세포티암헥세틸, 염산 세프카펜 피복실, 염산 세프메녹심, 염산 탈암피시린, 염산 바캄피시린, 염산 레남피시린, 시클라실린, 술베니실린나트륨, 세파크로르, 세파졸린 나트륨, 세파트리진프로필렌글리콜, 세파드록실, 세파피린 나트륨, 세파만돌 나트륨, 세팔렉신, 세팔로틴 나트륨, 세팔로리딘, 세픽심, 세폭시틴 나트륨, 세프타지딤 나트륨, 세포탁심 나트륨, 세포테탄 나트륨, 세포페라존 나트륨, 세프디토렌 피복실, 세후디니르, 세프타지딤, 세프티족심 나트륨, 세프테졸 나트륨, 세프테람 피복실, 세프트리아키손 나트륨, 세프피라미드 나트륨, 세프부페라존 나트륨, 세프포독심 프록세틸, 세프미녹스 나트륨, 세프메타졸 나트륨, 세프라진, 세프록사딘, 세프록심 악세틸, 세프록심 나트륨, 티카르시린 나트륨, 토실산 술타미시린, 피페라시린 나트륨, 파로페넴 나트륨, 플로목키세프나트륨, 포스포마이신, 메로페넴 삼수화물, 라타목세프 나트륨, 황산 아스트로마이신, 황산 겐타마이신, 황산 시소마이신, 황산 디베카신, 황산 세포셀리스, 황산 세프피롬, 황산 네틸마이신, 황산 베카나마이신, 황산 미크로노마이신, 황산 리보스타마이신, 아세틸키타사마이신, 아세틸스피라마이신, 에틸숙신간 에리스로마이신, 에리스로마이신, 에리스로마이신 에스톨레이트, 키타사마이신, 클라리스로마이신, 아세트산 미데카마이신, 타르타르산 키타사마이신, 조사마이신, 스테아린산 에리스로마이신, 프로피온산 조사마이신, 미데카마이신, 락트비온산 에리스로마이신, 록시스로마이신, 로키타마이신, 염산 테트라사이클린, 염산 데메틸클로르테트라사이크린, 염산 독시사이클린, 염산 미노사이클린, 클로람페니콜, 숙신산 클로람페니콜 나트륨, 팔미틴산 클로람페니콜, 사이클로세린, 리팜피신, 황산 엔비오마이신, 황산 스트렙토마이신, 염산 옥시테트라사이클린, 염산 그라미시딘 S, 테트라사이클린, 나디플록사신, 바시트라신, 푸시딘산 나트륨 또는 황산 컬리스틴을 포함할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 창상피복재의 in vitro 지혈효력시험 결과를 나타낸다.
도 2는 본 발명에 따른 창상피복재의 랫트를 이용한 in vivo 지혈효력시험 과정을 나타낸다.
도 3은 본 발명에 따른 창상피복재의 랫트를 이용한 in vivo 3분 지혈 성공율을 나타낸다.
도 4은 본 발명에 따른 창상피복재의 랫트를 이용한 in vivo 지혈효력시험에서 총 출혈시간을 나타낸다.
도 5은 본 발명에 따른 창상피복재의 유착방지 효과를 나타낸다.
도 6는 본 발명에 따른 창상피복재의 유착방지 효과에 대한 조직병리학적 관찰 결과를 나타낸다.
도 7은 본 발명에 따른 창상피복재의 제품 품질 평가 결과를 나타낸다.

이하, 발명의 이해를 돕기 위해 다양한 실시예를 제시한다. 하기 실시예는 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 발명의 보호범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예>

실시예 1. HA, 콜라겐 및 염화나트륨의 배합비에 따른 창상피복재의 제조

하기 표 1에 기재된 배합비에 따라 히알루론산나트륨, 아텔로 콜라겐(porcine type Ⅰ collagen) 및 염화나트륨을 교반하여 수용액을 제조하고, 각 수용액을 5X5 cm 몰드에 13.5 g ± 2% 로 분주하였다. 그 다음, 표 4에 기재된 단계에 따라 동결건조를 수행하고 생성된 창상피복재의 질감을 평가하였다.

순번	Product ID	HA 농도 (mg/ml)	Collagen 농도 (mg/ml)	NaCl (mg/ml)	실험 결과
1	처방 1	4	1	3	다소 손상되기 쉬운 질감
2	처방 2	4	2	3	기존 시판 창상피복재와 유사한 부드러운 질감
3	처방 3	4	3	3	기존 시판 창상피복재와 유사한 부드러운 질감
4	처방 4	4	5	3	기존 시판 창상피복재와 유사한 부드러운 질감
5	처방 5	10	1	3	기존 시판 창상피복재와 유사한 부드러운 질감
6	처방 6	10	2	3	기존 시판 창상피복재와 유사한 부드러운 질감
7	처방 7	10	3	3	기존 시판 창상피복재와 유사한 부드러운 질감
8	처방 8	10	5	3	다소 딱딱한 질감

순번	Product ID	Weight (mean±SD mg)	Width (mean±SD cm)	Length (mean±SD cm)	Area (mean±SD cm²)
1	처방 1	146.67±0.42	4.85±0.03	4.87±0.00	23.63±0.01
2	처방 2	174.80±0.17	4.85±0.06	4.84±0.06	23.49±0.43
3	처방 3	204.03±1.57	4.84±0.02	4.81±0.03	23.26±0.16
4	처방 4	248.60±3.08	4.85±0.05	4.86±0.04	23.59±0.43
5	처방 5	215.80±0.92	4.91±0.10	4.83±0.05	23.73±0.55
6	처방 6	238.63±1.50	4.88±0.05	4.84±0.02	23.58±0.21
7	처방 7	267.93±0.42	4.84±0.02	4.92±0.01	23.81±0.12
8	처방 8	324.53±0.31	4.82±0.01	4.85±0.02	23.38±0.08

그 결과, 처방 1의 창상피복재의 경우 물리적인 자극에 다소 손상되기 쉬운 질감을 가지는 것으로 나타났으며, 처방 8의 창상피복재의 경우 다소 딱딱한 질감으로 원하는 모양으로 변형이 어렵기 때문에 상품화가 어려운 것으로 나타났다. 반면, 처방 2 내지 7의 창상피복재의 경우 기존 시판 창상피복재와 유사한 부드러운 질감을 가져 상품화가 용이할 것으로 확인되었다.

실시예 2. HA, 콜라겐 및 염화나트륨의 배합비에 따른 창상피복재의 지혈효력 평가(in vitro)

상기 실시예 1 내지 3에 따른 창상피복재에 대하여 in vitro 지혈효력 평가를 하기의 실험 방법에 따라 수행하였다.

1) 실험 방법

① 시액 조제

Acid citrate dextrose: 20 mM citric acid, 110 mM sodium citrate 및 5 mM D-glucose in 3DW

200 mM CaCl₂: 200 mM CaCl₂

② anti-coagulated blood(citrated whole blood) 조제

실험용 토끼의 동맥에서 혈액을 채혈하였다. 채혈한 혈액과 Acid citrated dextrose를 9:1(v/v)의 비율로 희석하여 혈액의 응고를 억제하였다.

③ 실험 과정

각 검체를 1.0 X 1.0 cm(가로 X 세로) 크기로 잘라서 polypropylene tube(50 ml conical tube)에 넣고 37℃에서 10분간 방치하였다. 공시험을 제외한 각 튜브에 200 mM CaCl₂를 0.2 ml씩 분주 후 잘 섞어주고 37℃에서 5분간 방치하였다. 각 튜브에 증류수 25 ml을 첨가하여 응고되지 않은 적혈구를 용혈시켰다. 각 실험 물질에 대해 4회 반복시험을 실시하여 아래의 공식을 통해 분석하였다.

* 혈액응고지수(Blood Clotting Index, BCI, %) = 실험군의 흡광도 ÷ 공시험액의 평균 흡광도 × 100

④ 통계학적 분석

실험 결과 값이 정규분포를 따를 경우 One-way ANOVA test 중 Tukey 분석을 통해 통계적 유의성을 확인하였다.

- *p < 0.05 음성대조군과 비교, ‡p < 0.05 타사제품과 비교

2) 실험 결과

혈액 응고지수가 낮을수록 우수한 지혈효력을 가지는 것으로 평가하고, 그 결과를 하기의 표 3에 나타내었다.

순번	시험 군	Test No.	흡광도	혈액 응고지수(BCI)
				BCI	평균	표준편차	비고
1	공시험	1	0.288	.	.	.	흡광도 평균 0.290
		2	0.283	.
		3	0.285	.
		4	0.303	.
2	음성대조군	1	0.090	31.1	32.2	3.0
		2	0.086	29.7
		3	0.106	36.6
		4	0.091	31.4
3	처방 1	1	0.055	19.0	17.1	1.7
		2	0.043	14.8
		3	0.049	16.9
		4	0.051	17.6
4	처방 2	1	0.052	17.9	17.3	1.2
		2	0.053	18.3
		3	0.045	15.5
		4	0.050	17.3
5	처방 3	1	0.064	22.1	19.9	2.7
		2	0.048	16.6
		3	0.064	22.1
		4	0.055	19.0
6	처방 4	1	0.046	15.9	18.4	2.8
		2	0.048	16.6
		3	0.064	22.1
		4	0.055	19.0
7	처방 5	1	0.046	15.9	16.2	0.9
		2	0.048	16.6
		3	0.044	15.2
		4	0.050	17.3
8	처방 6	1	0.075	25.9	22.1	3.4
		2	0.068	23.5
		3	0.061	21.1
		4	0.052	17.9
9	처방 7	1	0.047	16.2	17.3	1.2
		2	0.049	16.9
		3	0.055	19.0
		4	0.049	16.9
10	처방 8	1	0.047	16.2	16.1	0.4
		2	0.045	15.5
		3	0.047	16.2
		4	0.048	16.6
11	타사제품	1	0.067	23.1	25.7	2.9
		2	0.068	23.5
		3	0.079	27.3
		4	0.084	29.0

그 결과, 음성대조군과 비교하여 처방 1 내지 8에 따른 창상피복재 및 타사제품에서 혈액응고지수가 유의적으로 낮았으며, 또한 타사제품에 비해서도 처방 6을 제외한 모든 처방 1 내지 5, 7 및 8에 따른 창상피복재의 혈액응고지수가 유의적으로 낮은 것으로 확인되었다(도 1).

실시예 3. HA, 콜라겐 및 염화나트륨의 배합비에 따른 창상피복재의 지혈효력 평가(in vivo)

상기 실시예 1에 따른 창상피복재에 대하여 랫드의 간에 출혈을 유발하고 처방 1, 2 및 7에 따른 창상피복재와 타사제품을 적용해서 지혈 성능을 평가하였다.

1) 실험방법

① 시험 물질: 음성대조군(거즈), 처방 1, 2 및 7에 따른 창상피복재, 타사제품

② 마취: zoletil(30 mg/kg), rompun(20 mg/kg)를 근육 주사하여 마취를 유지한 후 실험을 진행하였다.

③ 적용방법: 간의 좌엽을 노출시키고, 3 mm biopsy punch를 이용하여 3~4 mm 깊이로 상처를 내고 해당 부위를 원기둥 모양으로 잘라내어 출혈을 유도하였다. 각 실험물질을 2 X 2 cm 로 잘라서 출혈부위에 적용하였다(도 2).

④ 평가 방법

지혈시간: 시험물질을 부착 후 3, 5, 6, 9분 간격으로 지혈여부를 확인하였으며, 각 실험군 별로 3분 지혈 성공률을 확인하였다.

⑤ 통계적 유의성 검증

결과 값이 정규 분포를 따를 경우 one-way ANOVA test 중 tukey법을 통해 통계적 유의성을 확인하였다.

- *p < 0.05 음성대조군과 비교, ‡p < 0.05 타사제품과 비교

2) 결과

음성대조군, 처방 1, 2 및 7에 따른 창상 피복재 및 타사제품에 대한 3분 지혈 성공률을 확인한 결과, 각각 0%, 40%, 60%, 70% 및 20%의 3분 지혈 성공률을 나타내었다 (도 3). 또한, 총 출혈 시간을 확인한 결과, 음성대조군, 처방 1, 2 및 7에 따른 창상 피복재 및 타사제품은 각각 7.8분, 4.2분, 3.8분, 3.8분 및 6분으로 나타났으며, 특히 처방 2 및 7에 따른 창상피복재의 경우 타사제품과 비교하였을 때 총 출혈 시간이 통계적으로 유의하게 짧은 것으로 확인되었다. (도 4).

실시예 4. HA, 콜라겐 및 염화나트륨의 배합비에 따른 창상피복재의 유착방지 평가

상기 실시예 1에 따른 창상피복재에 대하여 랫트의 복강내 적용해서 유착방지 성능을 평가하였다.

1) 실험방법

① 시험 물질: 음성대조군(거즈), 실시예 1에 따른 창상피복재 중 처방 2, 타사제품

② 마취: zoletil(30 mg/kg), rompun(10 mg/kg)를 근육 주사하여 마취를 유지한 후 실험을 진행하였다.

③ 적용방법: 맹장과 복벽 결손 부위의 결찰 유도 전, 실험물질을 무균 상태로 1.5 X 1.5 cm 로 잘라서 유착 유발 조직 사이에 적용함

④ 평가 방법

이산화탄소 챔버를 이용하여 래트를 안락사시키고, 복강 내에 적용된 실험물질을 확인하여 유착 유발 부위를 육안적으로 평가하였다. 유착 정도는 아래의 표와 같이 점수화하여 각 군별로 평균값을 계산하였다.

Adhesion scoring scheme by Lauder et al.
Score	Description
0	No adhesions
1	Thin filmy adhesions
2	More than one thin adhesions
3	Thick adhesion with focal point
4	Thick adhesion with planar attachment
5	Very thick vascularized adhesions or more than one planar

⑤ 통계적 유의성 검증

⑥ 조직병리학적 관찰

유착 유발 부위 및 정상 조직을 포함하여 조직 샘플을 채취하고, 채취된 조직은 10% 포르말린에 고정시킨 후, 조직을 다듬어 조직전처리기를 이용하여 알코올에서 탈수시키고 파라핀침투가 용이하게 전처리하였다. 포매기에서 카셋트에 파라핀으로 고정하여 조직 블록을 제작한 다음 마이크로절삭기로 삭정하였다. 슬라이드를 제작하고 염색기에서 Haematoxylin & Eosin 염색을 하여 현미경으로 관찰하였다.

2) 결과

① 조직유착 평가

본 발명의 처방 2에 따른 창상치료제의 경우 유착율 20%를 나타냄으로써, 음성대조군 87% 및 시판제품 40%에 비해 현저히 개선된 유착방지 효과를 나타냄이 확인되었다 (도 5).

Group	Adhesion Score
Group	0	1	2	3	4	5	Total(마리)	Mean	S.E.	유착율(%)
공시험	3	0	0	0	0	0	3	0.0	0.0	0%
음성대조군	2	0	0	1	7	5	15	3.7	0.42	87%
시판제품	6	2	1	0	0	1	10	0.9	0.50	40%
처방 2	8	0	1	1	0	0	10	0.5	0.34	20%

② 조직병리학적 관찰 평가

음성 대조군의 경우 대부분 Granulation tissue의 형성으로 복막과 맹장사이에 유착이 발생되었으나, 본 발명의 처방 2에 따른 창상치료제의 경우 Granulation tissue가 관찰되지 않았으며, 유착의 흔적이 없는 것으로 확인되었다 (도 6).

실시예 5. 동결건조 조건에 따른 제품 성능 평가

실시예 1 내지 3에 따른 창상피복재의 경제성, 질감 및 지혈효력 결과를 종합하여 처방 2에 따른 창상피복재를 최종 선정하고, 하기의 표 6에 나타낸 동결건조 조건에 따른 제품 상태를 평가하였다.

No.	항목	Step 1	Step 2	Step 3	Step 4	Step 5	Step 6	Step 7	Step 8	비고
1	동결 조건									PET 몰드 이용
	선반 온도(℃)	10	5	0	-5	-10	-20	-35
	설정 시간 (분)	60	60	120	300	60	60	600
	선반 조건	감소	유지	감소	감소	감소	감소	감소
	건조 조건
	선반 온도(℃)	-35	-20	-20	-5	-5	0	0	25
	설정 시간 (분)	60	300	300	300	300	600	600	600
	선반 조건	유지	유지	증가	유지	증가	유지
	진공도 (mtorr)	0	0	0	0	0	0	0	0
2	동결 조건									PET 몰드 이용
	선반 온도(℃)	5	5	-5	-5	-35
	설정 시간 (분)	60	120	600	60	600
	선반 조건	감소	유지	감소	유지	감소
	건조 조건
	선반 온도(℃)	-35	-35	-5	-5	20	20
	설정 시간 (분)	60	60	1440	1440	600	720
	선반 조건	유지	유지	증가	유지	증가	유지
	진공도 (mtorr)	200	150	0	0	0	0
3	동결 조건									알루미늄 몰드 이용
	선반 온도(℃)	5	5	-5	-5	-35
	설정 시간 (분)	60	120	600	60	1
	선반 조건	감소	유지	감소	유지	감소
	건조 조건
	선반 온도(℃)	-35	-35	-5	-5	20	20
	설정 시간 (분)	60	60	1440	1440	600	720
	선반 조건	유지	유지	증가	유지	증가	유지
	진공도 (mtorr)	200	150	0	0	0	0

그 결과, NO. 1의 조건으로 동결건조를 수행하였을 때 동결건조 수율은 50% 미만으로 동결건조 수행간 동결불량(크랙)이 50% 이상이었으며, No. 2의 조건으로 동결건조를 수행하였을 때 동결건조 수율은 70% 미만으로 동결건조 수행간 동결불량(크랙)이 30% 이상으로 나타났다. 한편, No. 3의 조건으로 동결건조를 수행하였을 때 동결건조 수율은 90% 이상이며, 동결건조 수행 간 동결불량(크랙)은 10% 미만으로 확인되었다 (도 7).

실시예 6. 처방 2에 따른 창상피복재의 특성 평가

5-1. 실시예 1에 따라 제조된 처방 2에 따른 창상피복재의 ETO 및 ECH 잔류량을 평가를 실시하였으며, 그 결과, 처방 2에 따른 창상피복제는 25 mg/kg 미만의 ETO 잔류량 및 25 mg/kg 미만의 ECH 잔류량을 가지는 것으로 나타났다.

시험항목	단위	시험결과
ETO	mg/kg	불검출(검출한계 5)
ECH	mg/kg	불검출(검출한계 5)

5-2. 실시예 1에 따라 제조된 처방 2에 따른 창상피복재의 흡수력을 평가하였으며, 그 결과, 약 670%의 흡수력을 가지는 것으로 나타났다.

검사항목	단위	결과치
흡수력	%	672.5

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

(A) 0.4중량% 내지 1중량%의 히알루론산 또는 그의 염, 0.1중량% 내지 0.5중량%의 콜라겐 및 0.3중량% 내지 0.6중량%의 염화나트륨을 포함하는 수용액을 혼합하는 단계;
(B) 상기 수용액의 pH를 6 내지 8로 조절하는 단계;
(C) 상기 수용액을 동결 건조하여 패드 형태로 만드는 단계;
(D) 상기 동결건조 완료된 패드를 그대로 두거나 압착을 통해 두께를 조절하는 단계; 및
(D) 상기 동결건조 및 두께 조절이 완료된 패드에 대해 EO gas, 감마선 또는 전자빔 멸균하는 단계
를 포함하는 창상피복재의 제조 방법으로서,
상기 동결건조는:
(a) 5℃까지 도달하는데 60분, 5℃에서 120분, -5℃까지 도달하는데 600분, -5℃에서 60분, 및 -35℃까지 도달하는데 600분의 조건으로 동결시키는 단계; 및
(b) -35℃ 및 진공도 200 mtorr에서 60분, -35℃ 및 진공도 150 mtorr에서 60분, 진공도 100 mtorr 이하에서 -5℃까지 도달하는데 1440분, 진공도 100 mtorr 이하의 조건 및 -5℃에서 1440분, 진공도 100 mtorr 이하에서 20℃까지 도달하는데 600분, 진공도 100 mtorr 이하의 조건 및 20℃에서 720분 조건으로 건조시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 것인, 창상피복재의 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 창상피복재는 약제학적 조성물 또는 의약외품 조성물인 것을 특징으로 하는 것인, 창상피복재의 제조 방법.
삭제
제1항에 있어서,
상기 히알루론산 또는 그의 염의 분자량은 50만 달톤 내지 1000만 달톤인 것을 특징으로 하는 창상피복재의 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 콜라겐은 돼지, 양, 소, 또는 생선 유래의 콜라겐인 것을 특징으로 하는 창상피복재의 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 단계 (A)에서 혼합은 18시간 내지 48시간 동안 100 내지 300 rpm의 교반 속도로 수행되는 것을 특징으로 하는 것인, 창상피복재의 제조방법.
삭제
삭제
제1항에 있어서,
상기 창상피복재는 흡수력시험법에 따라 시험할 때 500% 내지 2000%의 흡수력을 가지는 것을 특징으로 하는 것인, 창상피복재의 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 창상피복재는 건조감량 시험법에 따라 시험할 때 20% 이하의 건조감량을 가지는 것을 특징으로 하는 것인, 창상피복재의 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 창상피복재는 용출물 시험 중 pH 시험법에 따라 시험할 때 1.5 이하의 pH 차이를 가지는 것을 특징으로 하는 것인, 창상피복재의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 창상피복재는 열분석 시험법에 따라 시험할 때 50℃ 이하에서 흡열 또는 발열 반응 피크가 나타나지 않는 것을 특징으로 하는 것인, 창상피복재의 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 창상피복재의 가로, 세로 및 두께의 치수는 각각 0.5 cm 내지 20 cm, 0.5 cm 내지 20 cm, 및 0.01 cm 내지 1 cm 인 것을 특징으로 하는 것인, 창상피복재의 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 창상피복재는 제곱센티미터 당 1.06 mg 내지 5.75 mg의 히알루론산 및 0.45 mg 내지 6.03 mg의 콜라겐을 함유하는 것을 특징으로 하는 것인, 창상피복재의 제조 방법.