KR102298640B1 - Car 유전자가 도입된 nk 세포의 제조방법 및 그의 용도 - Google Patents

Car 유전자가 도입된 nk 세포의 제조방법 및 그의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR102298640B1
KR102298640B1 KR1020200037719A KR20200037719A KR102298640B1 KR 102298640 B1 KR102298640 B1 KR 102298640B1 KR 1020200037719 A KR1020200037719 A KR 1020200037719A KR 20200037719 A KR20200037719 A KR 20200037719A KR 102298640 B1 KR102298640 B1 KR 102298640B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
cancer
car
ink
cell
Prior art date
Application number
KR1020200037719A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20200115358A (ko
Inventor
조이숙
김한섭
김재윤
설빛나
Original Assignee
한국생명공학연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국생명공학연구원 filed Critical 한국생명공학연구원
Publication of KR20200115358A publication Critical patent/KR20200115358A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102298640B1 publication Critical patent/KR102298640B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4613—Natural-killer cells [NK or NK-T]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464403—Receptors for growth factors
    • A61K39/464406—Her-2/neu/ErbB2, Her-3/ErbB3 or Her 4/ ErbB4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464411—Immunoglobulin superfamily
    • A61K39/464412—CD19 or B4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464466—Adhesion molecules, e.g. NRCAM, EpCAM or cadherins
    • A61K39/464468—Mesothelin [MSLN]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70517—CD8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/27—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by targeting or presenting multiple antigens
    • A61K2239/28—Expressing multiple CARs, TCRs or antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/54—Pancreas
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/125—Stem cell factor [SCF], c-kit ligand [KL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2303—Interleukin-3 (IL-3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2306—Interleukin-6 (IL-6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2307—Interleukin-7 (IL-7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2312—Interleukin-12 (IL-12)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2315—Interleukin-15 (IL-15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2318—Interleukin-18 (IL-18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2321—Interleukin-21 (IL-21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/26—Flt-3 ligand (CD135L, flk-2 ligand)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/602—Sox-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/603—Oct-3/4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/604—Klf-4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/606—Transcription factors c-Myc
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases (EC 2.)
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/11—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from blood or immune system cells
    • C12N2506/115—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from blood or immune system cells from monocytes, from macrophages
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18811—Sendai virus
    • C12N2760/18841—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2760/18843—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 키메라 항원 수용체(Chimeric Antigen Receptor; CAR)를 코딩하는 CAR 유전자가 도입된 iNK(induced Natural Killer) 세포의 제조방법, 상기 방법으로 제조된 iNK 세포, 상기 iNK 세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물 및 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 방법은 초기 세포의 제한 없이 분리된 세포로부터 CAR 유전자가 도입된 iNK 세포를 직접 리프로그래밍을 통해 높은 효율로 생산할 수 있으며, 분화 공정과정 없이 직접 생산할 수 있음으로 인해 생산 공정이 간소화됨으로써 비용 및 시간이 절감하는 효과가 있다. 종래 리프로그래밍 기술을 통해 생산되는 유도만능 줄기세포를 경유하지 않고, 확보가 용이한 인간 체세포로부터 직접 NK 세포를 생산함으로써 안전성 측면에서 개선된 우수한 NK 세포를 생산하는 효과가 있다. 또한, 상기 방법으로 제조된, CAR 유전자가 도입된 iNK 세포는 암세포 살상능이 우수한 바, 암 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물 혹은 약학 조성물로서 유용하게 활용될 수 있다.

Description

CAR 유전자가 도입된 NK 세포의 제조방법 및 그의 용도{A method for producing CAR gene introduced NK cells and uses thereof}
본 발명은 키메라 항원 수용체(Chimeric Antigen Receptor; CAR)를 코딩하는 CAR 유전자가 도입된 iNK(induced Natural Killer) 세포의 제조방법, 상기 방법으로 제조된 iNK 세포, 상기 iNK 세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물 및 약학 조성물에 관한 것이다.
NK(Natural Killer) 세포는 바이러스, 박테리아 및 기생충의 감염과 비정상적인 자가세포(특히, 암세포)를 즉각적으로 인식하여 제거하는 체내 1차 방어(선천면역) 기능을 수행하는 핵심 선천면역세포이다. 항원-특이적인 수용체를 발현하여 표적세포를 인지하는 T 세포와는 달리 NK 세포는 항원에 대한 특이성 및 인간 백혈구 항원(HLA) 매칭 없이 킬러 면역 글로불린 수용체(Killer Immunoglobulin Receptors; KIR), 자연 세포 독성 수용체(Natural Cytotoxicity Receptors; NCR), DNAM-1(DNAX Accessory Molecule-1) 및 NKG2D(NK Group 2 Member D)와 같은 억제 수용체 또는 활성화 수용체의 균형, 표면 MHC(Major Histocompatibility Complex) 클래스(Class) I 항원의 소실 등 타겟 세포(특히, 암세포)의 비정상적인 변화를 인지하며, 접촉 의존성(Contact-dependent) 세포독성을 가진다.
구체적으로, NK 세포는 퍼포린(Perforin; Prf1), 그랜자임 B(Granzyme B; GzmB), 인터페론-감마(Interferon-γ; IFN-γ), 인터루킨(종양 괴사인자-알파(Tumor Necrosis Factor-α; TNF-α) 등의 사이토카인 분비 및 세포사멸 유도 수용체(Fas, Tumour Necrosis Factor-related Apoptosis-inducing Ligand; TRAIL)의 활성화를 통해 직접적으로 표적 암세포 사멸(Apoptosis)를 매개함으로써 암세포를 살상할 수 있다. 또한, Fc 수용체-FcRγIIIa(CD16)를 발현하는 NK 세포는 항체-의존성 세포 독성(Antibody-dependent Cellular Cytotoxicity; ADCC)을 매개하는 등 선천면역뿐만 아니라 후천면역을 유도하여 직간접적으로 암세포를 효과적으로 제거할 수 있다고 알려져 있다. 특히, T 세포와는 달리 NK 세포는 이식편대 숙주병(Graft-versus-host Disease, GVHD) 등의 부작용을 일으키지 않아 자가뿐만이 아니라 동종 항암면역세포치료제 개발에 이용 가능한 안전한 세포원으로 부각되고 있다.
현재, 인간 NK 세포는 인체[말초 혈액(Peripheral Blood), 골수(Bone Marrow), 제대혈(Umbilical Cord Blood) 등)에 존재하는 소량의 세포를 일차 배양 방법을 통해 분리, 증식하여 생산하거나, NK 세포로의 분화능을 가진 줄기세포[조혈줄기세포(Hematopoietic Stem Cells, HSCs), 배아줄기세포(Embryonic Stem Cells, ESCs) 및 유도만능줄기세포(induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs)]로부터 분화 유도 배양을 통해 NK 세포를 생산하는 방법 등을 통해 다차원적으로 확보 가능하다.
최근, 타겟 암세포에 대한 특이성과 활성화를 촉진하고 결과적으로 항암 치료 효용성을 증진하기 위한 방법으로 암세포 표적 키메라 항원 수용체(Chimeric Antigen Receptor; CAR) 유전자를 도입하여 생산된 T 세포(CAR-T 세포)가 혈액암 치료에서 개선된 항암 효과가 입증되면서 CAR-면역세포치료제 개발에 대한 관심이 대두되고 있다. 하지만, CAR-T 세포에 의해 분비되는 인터페론(IFN)-γ, 종양괴사인자(TNF)-α, 인터루킨(IL)-1 및 IL-6 인자에 의해 유도되는 사이토카인 방출 증후군(Cytokine Release Syndrome, CRS) 등은 극복해야 할 심각한 문제점으로 제시되고 있다. 또한, CAR-T 세포는 고형암 종양미세환경(Tumor Microenvironment, TME)에서 면역관문단백질 PD(Programmed Death Ligand)-1 등에 의해 암세포 독성 작용이 억제되는 것으로 알려져 고형암 치료 효능을 개선하기 위한 기술 개발이 필요하다.
그러나, NK 세포는 IL-3 및 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(Granulocyte-macrophage Colony-stimulating Factor)를 분비하므로, CRS를 유발할 가능성이 적고[K. Rezvani, R. Rouce, E. Liu et al, Engineering Natural Killer Cells for Cancer Immunotherapy, Mol. Ther., 25 (2017), pp. 1769-1781], NK 세포에 의해 분비되는 PD-1 수준은 실질적으로 낮고 면역 억제를 거의 유발하지 않으며, 수지상 세포를 종양으로 이동시킴으로써 항-PD-1 면역 요법을 향상시키는 것으로 알려져[K.C. Barry, J. Hsu, M.L. Broz, et al. A Natural Killer-dendritic Cell Axis Defines Checkpoint Therapy-responsive Tumor Microenvironments, Nat. Med., 24 (2018), pp. 1178-1191], CAR-NK 개발의 우수성이 입증되고 있다. 또한, CAR-NK 세포치료에 대한 전임상 및 임상시험 결과에서 혈액암 및 고형암 세포를 효과적으로 제거할 수 있음이 확인되어[E.L. Siegler, Y. Zhu, P. Wang, et al. Off-the-shelf CAR-NK Cells for Cancer Immunotherapy, Cell Stem Cell, 23 (2018), pp. 160-161], 고형암을 포함한 광범위한 범위에서 항암면역세포치료제로 개발될 수 있는 잠재력이 부각되고 있다.
상기 CAR-NK 세포를 제조하는 방법으로, 암 항원에 특이적인 CAR 유전자를 배양 증식이 비교적 용이한 단일 NK 세포주(NK-92, iPSC 등)에 도입하고, CRA-발현 NK 세포를 분리, 증폭하는 방법이 주로 이용되고 있다. 가장 많이 이용되고 있는 일차 배양 NK-92세포는 악성 비호지킨 림프종(Malignant non-Hodgkin's Lymphoma) 환자에서 유래한 세포로 주사후 이차 종양형성 및 EB(Epstein-Barr) Virus 감수성을 유발할 수 있는 잠재력이 있어 안전성을 확보하기 위해 임상 적용전 치사-조사(Lethal Irradiation) 과정이 필수적이나, 이 과정은 CAR-NK-92 세포의 생체내 생존시간을 단축함으로써 결과적으로 항암효과가 감소된다. 유도만능줄기세포(iPSCs)에 CAR 유전자를 도입하고 분화 유도하여 NK 세포를 생산하는 방법은 본질적으로 CAR-iPSCs 공정 및 분리 증폭 과정뿐만이 아니라 많은 시간과 비용이 소요되는 복잡한 분화 공정 과정을 추가적으로 거쳐야 한다는 문제점과 종양 형성 가능성으로 인해 안전성을 확보, 유지할 수 있는 기술 개발이 필수적이다.
최근, 체세포 리프로그래밍 기술을 이용하여 비교적 확보가 용이한 초기 인간 체세포로부터 이와 다른 계통의 특성을 가진 고부가가치 기능성 인간 조직-특이 표적 세포를 직접 생산하는 기술이 급발전하고 있다. 하지만, 아직까지 체세포 리프로그래밍을 통해 iPSCs를 경유하지 않고 직접 CAR-NK 세포를 생산하는 기술에 대해서는 보고된 바 없다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 CAR-NK 세포를 효율적으로 생산하는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, CAR-NK 세포 특이적인 리프로그래밍 배지 및 리로그래밍 배양조건을 개발하여, 이를 통해 초기세포자원의 제한이 없이 분화 공정 과정에 필요하지 않은 방법으로 인간 체세포로부터 CAR-NK 세포를 제작할 수 있으며, 생산된 CAR-NK 세포가 우수한 암세포 살상능을 나타내어 암 예방 또는 치료에 적용할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 리프로그래밍 인자(Reprogramming Factor) 및 CAR(Chimeric Antigen Receptor) 유전자가 도입된 분리된 세포를 a) 성장인자, 사이토카인 및 GSK3β(Glycogen Synthase Kinase 3 beta) 저해제(Inhibitor)를 포함하는 제 1 배지; b) 성장인자, 사이토카인 및 AHR(Aryl Hydrocarbon Receptor) 길항제(Antagonist)를 포함하는 제 2 배지; 및 c) 사이토카인, GSK3β 저해제 및 AHR 길항제를 포함하는 제 3 배지;에서 순차적으로 배양하여 NK 세포로 직접 리프로그래밍 시키는 단계를 포함하는, CAR-iNK(induced Natural Killer) 세포 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 따라 제조된 iNK 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 따라 제조된 iNK 세포를 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 따라 제조된 iNK 세포를 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 발명의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 리프로그래밍 인자(Reprogramming Factor) 및 CAR(Chimeric Antigen Receptor) 유전자가 도입된 분리된 세포를 a) 성장인자, 사이토카인 및 GSK3β(Glycogen Synthase Kinase 3 beta) 저해제(Inhibitor)를 포함하는 제 1 배지; b) 성장인자, 사이토카인 및 AHR(Aryl Hydrocarbon Receptor) 길항제(Antagonist)를 포함하는 제 2 배지; 및 c) 사이토카인, GSK3β 저해제 및 AHR 길항제를 포함하는 제 3 배지;에서 순차적으로 배양하여 NK 세포로 직접 리프로그래밍 시키는 단계를 포함하는, CAR-iNK(induced Natural Killer) 세포 제조방법을 제공한다.
본 발명에서 용어, "NK(Natural killer) 세포"는 바이러스, 박테리아 및 기생충의 감염과 비정상적인 자가세포(암세포 등)를 제거하는 체내 1차 방어(선천면역) 기능을 수행하는 핵심 선천면역세포이다. NK 세포는 혈액암뿐만이 아니라 및 고형암을 포함하는 다양한 암종에서 암의 발생, 증식, 전이 및 재발을 막는데 효과적임이 입증되어, 항암 치료제 및 재발 억제제의 유용한 세포 자원으로 주목 받고 있다. 인체에서 분리, 배양한 NK 세포 및 줄기세포로부터 분화된 NK 세포를 항암면역세포치료제로 개발하기 위한 노력이 급증하고 있으나 낮은 NK 생산 효율 및 항암 치료 효능은 여전히 극복해야 할 문제점으로 지적되고 있다.
암세포에 대한 특이성과 활성화를 촉진하기 위한 방안으로 다양한 암의 항원에 특이적인 키메라 항원 수용체(Chimeric Antigen Receptor; CAR)를 발현하는 NK(CAR-NK) 세포를 제작하고, 이에 따라 암세포 살해 활성 증진 및 그 치료 효용성을 규명하는 연구가 활발히 진행되고 있다. 상기 CAR-NK 세포를 제조하는 방법으로 배양 증식이 비교적 용이한 단일 NK 세포주(NK-92, iPSCs 등)에 도입하는 방법이 주로 이용되고 있으나 낮은 생산효율, 복잡한 공정 과정, 안전성 문제 (종양형성 가능성 등) 등은 극복되어야 할 문제점으로 부각되고 있다.
이에, 본 발명자들은 CAR-NK 세포를 생체외 배양 조건에서 수집이 용이한 다양한 인간 체세포에 적용 가능하면서 분화 공정 과정이 필요하지 않은 방법으로 제조하고자 하였으며, 그 결과 직접 리프로그래밍을 통해 분리된 인간 체세포로부터 CAR-NK 세포를 직접 유도 및 생산할 수 있는 방법을 최초로 규명하였다.
본 발명에서 용어, "CAR-iNK (CAR-induced Natural killer) 세포"는 본 발명의 방법에 따라 직접 리프로그래밍을 통해 유도되고(induced), CAR 유전자가 도입된 NK(Natural killer) 세포를 의미한다.
본 발명에서 용어, "리프로그래밍(Reprogramming)"은 특정 세포가 가지는 전체 유전자 발현 패턴(Global Gene Expression Pattern) 등을 조절하여, 전혀 다른 특성을 가지는 목적하는 세포로 계통을 전환시키는 방법을 의미한다. 리프로그래밍은 세포의 역분화(Dedifferentiation), 직접 리프로그래밍(Direct Reprogramming 또는 Direct Conversion), 또는 직접 교차분화(Trans-differentiation)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 있어서, 상기 리프로그래밍은 외래 유전자 혹은 DNA를 포함하는 벡터를 세포에 도입함으로써 수행되는 것일 수 있다. 상기 "전환"은 세포가 다른 상태로 바뀌는 것을 의미하고, 상기 "분화"는 세포가 분열하여 만들어진 딸 세포들이 원래의 모 세포와 다른 기능을 얻는 현상을 의미하며, 본 발명에서 상기 "전환"과 "분화"는 "유도"와 혼용될 수 있다.
본 발명에서 용어, "직접 리프로그래밍(Direct Reprogramming)"은 특정 세포를 리프로그래밍 배지에서 배양하여 목적하는 세포로의 직접 전환을 유도하는 방법을 의미한다. 종래의 리프로그래밍 기술을 이용하여 목적 세포인 NK 세포를 생산하기 위해서는 1) 분리된 체세포로부터 유도 만능 줄기세포를 생산하고, 2) 유도 만능 줄기세포로부터 중간체인 조혈 줄기(전구)세포를 일차 분화 생산한 후, 3) 분화된 줄기(전구)세포로부터 목적 세포인 NK 세포를 이차 분화 생산해야 했다. 이와 같이 종래 기술은 복잡한 배양 과정을 순차적으로 거쳐야 하기 때문에 생산 효율이 낮고 시간적, 비용적 소모가 크다는 단점이 있다. 또한, 전분화능을 가진 유도 만능 줄기세포를 경유하여 생산되기 때문에 미분화 세포의 잔류 여부는 종양형성 가능성이 있어 안전성 확보 여부가 검증되어야 할 중요한 쟁점이다. 이에 반해, 본 발명은 직접 리프로그래밍을 통해 분리된 체세포로부터 목적 세포인 NK 세포를 직접 생산함으로써 생산 시간이 짧고, 비용이 절감되며, 효율이 우수하고 안전성이 확보되는 바, 종래 기술과 차별화되며, 이의 문제점을 극복할 수 있는 대안을 제공할 수 있다. 상기 직접 리프로그래밍은 직접 역분화, 직접 분화, 직접 전환, 직접교차분화, 교차분화 등과 혼용될 수 있으며, 본 발명에 있어서, 상기 직접 리프로그래밍은 분리된 체세포로부터 NK 세포로의 직접 역분화 또는 교차 분화를 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "분화된 세포"는 구조나 기능이 특수화된 세포, 즉, 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어지는 역할을 수행하기 위해 적합한 형태 및 기능으로 변화된 상태를 의미한다. 예를 들어, 넓게는 배아줄기세포와 같은 전분화능 줄기세포로부터 유래된 외배엽, 중배엽 및 내배엽 세포가 분화된 세포이고, 좁게는 조혈모세포로부터 유래된 적혈구, 백혈구, 혈소판 등이 분화된 세포일 수 있다.
본 발명에서 용어, "계통이 전환된 세포"는 세포가 가지고 있던 고유의 계통 특성이 발생학적으로 또는 인위적인 방법(예를 들면, 리프로그래밍 등)으로 바뀌어 다른 계통 특성을 가진 세포 유형으로 전환된 세포로서, 전환되기 전의 세포 유형의 특성과는 전혀 다른 세포 유형의 특성을 가진다. 본 발명에 있어서, 상기 계통이 전환된 세포는 목적 세포일 수 있다. 예를 들면, 말초혈액 단핵세포내 비-NK 림프구 세포가 리프로그래밍 배지에서의 NK 세포로 전환되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 방법은 리프로그래밍 인자 및 CAR 유전자가 도입된 분리된 세포를 a) 성장인자, 사이토카인 및 GSK3β 저해제를 포함하는 제 1 배지; b) 성장인자, 사이토카인 및 AHR 길항제를 포함하는 제 2 배지; 및 c) 사이토카인, GSK3β 저해제 및 AHR 길항제를 포함하는 제 3 배지;에서 순차적으로 배양하여 NK 세포로 직접 리프로그래밍 시키는 것일 수 있다.
본 발명의 용어, "분리된 세포"는 특별한 제한은 없으나, 구체적으로는 생식세포, 체세포(Somatic Cell) 또는 전구세포(Progenitor Cell) 등 이미 계통(Lineage)이 특정된 세포일 수 있다. 상기 "체세포"는 생식세포를 제외한 동·식물을 구성하는 분화가 완결된 모든 세포를 뜻하며, 상기 "전구세포"는 자손에 해당하는 세포가 특정 분화 형질을 발현하는 것으로 밝혀진 경우, 분화 형질을 발현하지 않으나, 그 분화 운명(Fate)를 가지고 있는 모세포를 말한다. 예를 들면, 신경세포(뉴런)에 대해서는 신경아세포(뉴런간세포)가 전구세포에 해당하고, 근관세포에 대해서는 근아세포가 전구세포에 해당한다.
상기 분리된 세포는 인간에게서 유래한 세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 다양한 개체에서 유래된 세포 역시 본 발명의 범위 내에 속할 수 있다. 또한, 본 발명의 분리된 세포에는 생체내 또는 생체외의 세포가 모두 포함될 수 있다. 구체적으로, 상기 분리된 세포는 체세포일 수 있고, 보다 구체적으로 NK 세포를 제외한 체세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "리프로그래밍 인자(Reprogramming Factor)"는 세포에 도입되어 리프로그래밍을 유도할 수 있는 유전자(혹은 폴리뉴클레오티드), 또는 이로부터 코딩되는 단백질을 의미한다. 상기 리프로그래밍 인자는 리프로그래밍을 통해 얻고자 하는 목적 세포에 따라, 그리고 리프로그래밍되기 전의 세포의 종류에 따라 달라질 수 있다. 예를 들면, 분리된 체세포를 NK 세포로 유도하고자 할 경우, 상기 분리된 체세포에 도입되는 리프로그래밍 인자는 Lin28, Asc11, Pitx3, Nurr1, Lmx1a, Nanog, Oct4, Oct3, Sox2, Klf4, Myc 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것일 수 있고, 구체적으로 Oct4, Sox2, Klf4 및 Myc일 수 있으나, 이에 제한되지 않고 분리된 체세포를 NK 세포로 유도할 수 있는 리프로그래밍 인자라면 당업계에 공지된 모든 인자를 포함할 수 있다. 상기 리프로그래밍 인자를 이용한 리프로그래밍은 세포가 가지는 전체 유전자 발현 패턴을 조절하여 목적 세포로의 전환을 유도하는 것으로, 상기 리프로그래밍 인자를 세포에 도입하고 세포를 일정 기간 배양함으로써 목적하는 종류의 세포의 유전자 발현 패턴을 가지는 목적 세포로 세포를 리프로그래밍시킬 수 있다.
본 발명에서 용어, "리프로그래밍 인자의 도입"은 리프로그래밍 인자를 세포의 배양액에 투여하는 방법; 리프로그래밍 인자를 세포에 직접 주입하는 방법; 세포 내에 존재하는 리프로그래밍 인자의 발현 수준을 증가시키는 방법; 리프로그래밍 인자를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터를 세포에 형질전환시키는 방법; 리프로그래밍 인자를 코딩하는 유전자의 발현이 증가되도록 유전자 서열을 변형하는 방법; 리프로그래밍 인자를 코딩하는 외래 발현 유전자를 도입하는 방법, 리프로그래밍 인자의 발현 유도 효과를 가지는 물질을 처리하는 방법; 및 이들의 조합을 통하여 세포 내의 리프로그래밍 인자의 발현 수준을 증가시키는 방법일 수도 있으나, 리프로그래밍 인자의 발현 수준을 증가시킬 수 있는 한, 이에 제한되지 않는다. 특히, 리프로그래밍 인자의 도입은 원하는 시간 및 조건 하에서 리프로그래밍 인자의 발현을 유도하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 리프로그래밍 인자를 세포에 도입하는 방법은 리프로그래밍 인자를 세포의 배양액에 투여하는 방법, 리프로그래밍 인자를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터를 세포에 형질전환시키는 방법일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 리프로그래밍 인자를 세포에 직접 주입하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 선택하여 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 미세주입법(Microinjection), 전기천공법(Electroporation), 입자분사법(Particle bombardment), 직접근육주입법(Direct Muscle Injection), 인슐레이터(Insulator) 및 트랜스포존(Transposon)을 이용한 방법 중에서 적절하게 선택하여 적용할 수 있다.
본 발명에서 용어, "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질 또는 폴리펩티드를 발현시킬 수 있도록, 적합한 조절 서열 및 상기 목적 단백질 또는 폴리펩티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화시그널, 인핸서를 포함할 수 있다. 본 발명의 벡터는 조절 서열 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 상기 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 바이러스 벡터(Virus Vector), 에피솜 벡터(Episomal Vector), 플라스미드 벡터(Plasmid Vector), 코즈미드 벡터(Cosmid Vector) 등을 들 수 있다.
구체적으로, 상기 바이러스 벡터는 센다이바이러스(Sendai Virus), 렌티바이러스(Lentivirus), HIV(Human Immunodeficiency Virus), MLV(Murineleukemia Virus), ASLV(Avian Sarcoma/Leukosis), SNV(Spleen Necrosis Virus), RSV(Rous Sarcoma Virus), MMTV(Mouse Mammary Tumor Virus) 등의 레트로바이러스(Retrovirus), 아데노바이러스(Adenovirus), 아데노 관련 바이러스(Adeno-associated Virus), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes Simplex Virus) 등에서 유래한 벡터를 포함할 수 있고, 보다 구체적으로, RNA 기반 바이러스 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 에피솜 벡터는 비바이러스성 비삽입성 벡터로서, 염색체 내에 삽입되지 않고 벡터에 포함된 유전자를 발현시킬 수 있는 특성을 가지는 것으로 알려져 있다. 따라서, 상기 에피솜 벡터를 포함하는 세포는, 에피솜 벡터가 유전체 내에 삽입되거나, 또는 유전체 내에 삽입되지 않은 상태로 세포 내 존재하는 경우를 모두 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "작동가능하게 연결된(Operably Linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(Functional Linkage)되어 있는 것을 말한다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.
본 발명에서 용어, "CAR 유전자"는 항체 도메인(scFv)을 포함하는 세포 바깥 도메인, 세포막 관통 도메인 및 세포내 도메인을 코딩하는 유전자를 포함하여, 상기 세포 바깥 도메인, 세포막 관통 도메인 및 세포내 도메인으로 이루어지는 키메라 항원 수용체(Chimeric Antigen Receptor)를 코딩하는 유전자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 CAR 유전자는 CD19 scFv을 포함하는 CD19-CAR1 유전자 또는 CD19-CAR2 유전자, MSLN(Mesothelin) scFv를 포함하는 MSLN-CAR 유전자 및 HER2(Human Epidermal Growth Factor Receptor 2) scFv를 포함하는 HER2-CAR 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
고형 종양에 대한 CAR의 표적 인자로는 EGFRvIII(Morgan RA, Hum Gene Ther. 2012;23:1043-1053), MUC-1(Wilkie S, J Immunol. 2008;180:4901-4909), MAGE(Willemsen RA, Gene Ther. 2001;8:1601-1608), CEA(Emtage PC, Clin Cancer Res. 2008;14:8112-8122), PSMA, GD2, CA125, Her2 및 MSLN, FAP, VEGFR(Kakarla S, Cancer J. 2014;20:151-155) 등을 이용할 수 있다고 알려져 있다.
또한, 상기 CD19는 세포표면항원무리(Cluster of Differentiation; CD)로서 면역표현형에 따라 세포 표면 분자를 식별하는 번호 19를 할당한 것으로, 상기 CD19는 B 림프구의 표지자를 의미한다. 상기 CD19는 대부분의 B-세포 악성 종양 암세포에서 발현하여 이들 암종에 대한 이상적인 표적을 제공하는 것으로 알려져 있다.
구체적으로, 상기 CAR 유전자는 i) CD8 리더(Leader), CD19 scFv, CD8 힌지(Hinge), CD8 막 관통 도메인 및 Fc-γ(Gamma) 수용체를 포함하는 CAR 유전자(CD19-CAR1 유전자); ii) CD8 리더, CD19 scFv, CD8 힌지, CD8 막 관통 도메인, CD28 세포내 도메인, CD3ζ 및 IRES(Internal Ribosome Rntry Site)를 포함하는 CAR 유전자(CD19-CAR2 유전자); iii) CD8 리더, MSLN(Mesothelin) scFv, CD8 힌지, CD8 막 관통 도메인, CD28 세포내 도메인, CD3ζ 및 IRES를 포함하는 CAR 유전자(MSLN-CAR 유전자); 및 iV) CD8 리더, HER2(Human Epidermal Growth Factor Receptor 2) scFv, CD8 힌지, CD8 막 관통 도메인, CD28 세포내 도메인, CD3ζ 및 IRES를 포함하는 CAR 유전자(HER2-CAR 유전자);로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다
상기 CD8 리더는 서열번호 1, CD19 scFv는 서열번호 2, MSLN scFv는 서열번호 3, HER2 scFv는 서열번호 4, CD8 힌지는 서열번호 5, CD8 막 관통 도메인은 서열번호 6, Fc-γ 수용체는 서열번호 7, CD28 세포내 도메인은 서열번호 8, CD3ζ은 서열번호 9, 상기 CAR 유전자를 이중 시스트론을 구성하는 벡터에 클로닝하기 위해 삽입하는 IRES는 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 CAR 유전자는 GFP(Green Fluorescent Protein)를 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 GFP는 서열번호 11의 염기서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 서열번호 1 내지 서열번호 11의 염기서열은 공지의 데이터 베이스인 NCBI Genbank에서 그 서열을 확인할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 1 내지 서열번호 11의 염기서열은 상기 서열번호 1 내지 서열번호 11과 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성(Homology) 또는 동일성(Identity)을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 서열번호 1 내지 서열번호 11의 염기서열과 상응하는 기능을 나타내는 염기서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 염기서열을 갖는 서열도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
본 발명의 용어 "상동성(Homology) 및 동일성(Identity)"은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된(Conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(Homologous) 또는 동일한(Identical) 서열은 중간 또는 높은 엄격한 조건(Stringent Condition)에서 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상으로 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.
상기 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 상동성 또는 동일성은 예를 들면, 문헌에 의한 알고리즘 BLAST[참조: Karlin 및 Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)], 또는 Pearson에 의한 FASTA(참조: Methods Enzymol., 183, 63, 1990)을 사용하여 결정할 수 있다. 이러한 알고리즘 BLAST에 기초하여, BLASTN이나 BLASTX라고 불리는 프로그램이 개발되어 있다(참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov). 또한, 임의의 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려져 있다(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology).
본 발명에 있어서, 상기 CAR 유전자는 전술한 리프로그래밍 인자의 도입 방법과 동일한 방법으로 세포 내에 도입될 수 있으며, 특히, 리프로그래밍 인자와 CAR 유전자는 원하는 시간 및 조건 하에서 동시에 또는 순차적으로 도입될 수 있다.
구체적으로, 도 2의 파란색으로 표시된 바와 같이 CAR를 발현하는 렌티바이러스는 리프로그래밍 인자와 동시에, 리프로그래밍 인자 도입 후 CAR-iNK 제 1 배지에서 배양하는 단계, CAR-iNK 제 2 배지에서 배양하는 단계 또는 CAR-iNK 제 3 배지에서 배양하는 단계 중 선택하여 배양 배지에 접종함으로써 iNK로 전환되는 과정의 PBMC 또는 리포그래밍 유도 과정의 세포에 형질전환될 수 있다. 본 발명에 따른 방법은 NK 세포가 아닌 분리된 세포에 CAR 유전자를 리프로그래밍 인자와 도입하여 CAR를 발현하는 NK 세포를 생산할 수 있다는데 의의가 있다. 또한, CAR 유전자를 도입하는 시기를 리프로그래밍 배양 과정에서 당업자가 원하는 대로 정할 수 있는 것에 의의가 있다. 구체적으로, 상기 CAR 유전자의 도입 시기, 즉, CAR를 발현하는 렌티바이러스의 접종 시기는 리프로그래밍 인자와 동시에(Day 0), 리프로그래밍 인자 도입 후 CAR-iNK 제 2 배지에서 배양하는 단계(Day 14) 또는 CAR-iNK 제 3 배지에서 배양하는 단계(Day 24)에서 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다(도 2 및 도 6).
본 발명에서 용어, "배양"은 세포를 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미하며, 본 발명의 배양 과정은 당업계에 알려진 배지와 배양 조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 세포에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 본 발명의 목적상, 상기 배양은 리프로그래밍 인자 및/또는 CAR 유전자가 도입된 세포를 다른 계통의 목적 세포로 전환하는 과정이므로, 상기 유전자가 도입된 세포를 배양하는 제 1 배지, 제 2 배지 또는 제 3 배지의 조성은 목적 세포로 전환되기에 적합한 조성, 예를 들면, 성장인자, 사이토카인, GSK3β 저해제 또는 AHR 길항제 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 a)의 제 1 배지는 성장인자, 사이토카인 및 GSK3β 저해제를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서 용어, "성장인자"는 여러 세포의 분열, 성장 및 분화를 촉진하는 폴리펩티드를 의미한다. 상기 성장인자는 예를 들면, EGF(Epidermal Growth Factor), PDGF-AA(Platelet-derived Growth Factor-AA), IGF-1(Insulin-like Growth Factor 1), TGF-β(Transforming Growth Factor-β), FGF(Fibroblast Growth Factors), SCF(Stem Cell Factor) 및 FLT3L(FMS-related Tyrosine Kinase-3 Ligand) 등일 수 있고, 구체적으로, SCF, FLT3L 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "사이토카인"은 세포에서 생산되어 세포 신호 전달에 사용되는 비교적 작은 크기의 다양한 단백질로서, 자신을 포함하는 다른 세포에 영향을 끼칠 수 있다. 일반적으로 염증 또는 감염에 대한 면역 반응과 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 상기 사이토카인은 예를 들면, IL(Interleukin)-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-11, IL-15, IL-21, IL-12, IL-18, BMP4(Bone Morphogenetic Protein 4), 액티빈 A(Acivin A), 노치 리간드(Notch Ligand), G-CSF(Granulocyte-colony Stimulating Factor), SDF-1(Stromal Cell-derived Factor-1) 등일 수 있고, 구체적으로 IL-3, IL-6 IL-15, IL-7, IL-2, IL-21, IL-12, IL-18 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 목적상, 상기 성장인자 및 사이토카인은 분리된 세포를 목적 세포로 직접 리프로그래밍하는 배지에 포함되며, 성장인자 및 사이토카인의 종류는 직접 리프로그래밍에 이용될 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "GSK3β(Glycogen Synthase Kinase 3 beta, Glycogen Synthase Kinase-3β) 저해제(Inhibitor)"는 글리코겐 신타제 키나제 3 베타의 활성을 저해 또는 억제하는 물질을 의미한다. 상기 GSK3β 저해제는 예를 들면, 1-Azakenpaullone, 2-D08, 3F8, 5-Bromoindole, 6-Bio, A 1070722, Aloisine A, AR-A014418, Alsterpaullone, AZD-1080, AZD2858, Bikinin, BIO, BIO-acetoxime, Bisindolylmaleimide I, Bisindolylmaleimide I Hydrochloride, CAS 556813-39-9, Cazpaullone, CHIR98014. CHIR98023. CHIR99021(CT99021), CP21R7, Dibromocantherelline, GSK-3β Inhibitor I, VI, VII, X, XI,XV, GSK-3 Inhibitor IX, XVI, Hymenidin, Hymenialdisine, HMK-32, I3M(Indirubin-3-monoxime, Indirubin, Indole-3-acetamide, IM-12, Kenpaullone, L803-mts, Leucettine L41, Lithium, Lithium Carbonate, LY-2090314, Manzamine A MeBIO, Meridianine A, NP00111, NP031115, NP031111, NSC 693868, Palinurin, Ro 31-8220 Methanesulfonate, SB-216763, SB-415286, TC-G 24, TCS 2002, TCS 21311, Tideglusib, Tricantin, Trihydrochloride, Tungstate, TWS-119, TZDZ-8, Zinc 등일 수 있고, 구체적으로 CHIR99021일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 a)의 제 1 배지는 SCF, FLT3L, IL-3 및 IL-6 및 CHIR99021를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 a)의 제 1 배지는 FBS(Fetal Bovine Serum), 항생제 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 항생제는 페니실린/스트렙토마이신(Penicillin/Streptomycin)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 a)의 제 1 배지는 FBS, 페니실린/스트렙토마이신, SCF, FLT3L, IL-3 및 IL-6 및 CHIR99021를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
보다 구체적으로, 상기 a)의 제 1 배지는 8 내지 12%의 FBS, 0.1 내지 2%의 페니실린/스트렙토마이신, 80 내지 120 ng/ml의 인간 SCF, 80 내지 120 ng/ml의 인간 FLT3L, 10 내지 30 ng/ml의 인간 IL-3, 10 내지 30 ng/ml의 인간 IL-6, 2 내지 7 uM의 CHIR99021을 포함하는 StemSpan SFEM II일 수 있고, 더욱 구체적으로, 10%의 FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 100 ng/ml의 인간 SCF, 100 ng/ml의 인간 FLT3L, 20 ng/ml의 인간 IL-3, 20 ng/ml의 인간 IL-6, 5 uM의 CHIR99021을 포함하는 StemSpan SFEM II일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 b)의 제 2 배지는 성장인자, 사이토카인 및 AHR(Aryl Hydrocarbon Receptor) 길항제(Antagonist)를 포함하는 것일 수 있다.
상기 용어 "성장인자" 및 "사이토카인"은 전술한 바와 같다.
본 발명에서 용어, "AHR(Aryl Hydrocarbon Receptor) 길항제(Antagonist)"는 TCDD(Dioxin(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin))에 의해 활성화되는 리간드-활성화 전사인자(Transcription Factor)인 AHR의 활성을 하향조절하거나 감소시키는 물질을 의미한다. 상기 AHR 길항제는 예를 들면, 스템레게닌 I[StemRegenin I, SRI; 4-(2-(2-(벤조[b]티오펜-3-일)-9-이소프로필-9H-퓨린-6-일아미노)에틸)페놀하이드로클로라이드, 4-(2-((2-Benzo[b]thiphen-3-yl)-9-isopropyl-9H-purin-6-yl)amino)ethyl)phenol hydrochloride], CH-223191(1-메틸-N-[2-메틸-4-[2-(2-메틸페닐)디아제닐]페닐-1H-피라졸-5-카르복사미드, 1-Methyl-N-[2-methyl-4-[2-(2-methylphenyl)diazenyl]phenyl-1H-pyrazole-5-carboxamide) 등일 수 있고, 구체적으로 스템레게닌 I일 수 있으나, 직접 리프로그래밍 효율을 높일 수 있는 역할을 하는 것이면 이에 제한되지 않고 사용할 수 있다.
상기 b)의 제 2 배지는 SCF, FLT3L, IL-15, IL-7, IL-2 및 스템레게닌 I을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 b)의 제 2 배지는 FBS, 항생제 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 항생제는 페니실린/스트렙토마이신일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 b)의 제 2 배지는 FBS, 페니실린/스트렙토마이신, SCF, FLT3L, IL-15, IL-7, IL-2 및 스템레게닌 I을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
보다 구체적으로, 상기 b)의 제 2 배지는 8 내지 12%의 FBS, 0.1 내지 2%의 페니실린/스트렙토마이신, 10 내지 30 ng/ml의 인간 SCF, 10 내지 30 ng/ml의 인간 FLT3L, 100 내지 500 IU/ml의 인간 IL-2, 10 내지 30 ng/ml의 인간 IL-7, 10 내지 30 ng/ml의 인간 IL-15, 1 내지 3 uM의 스템레게닌 I일 수 있고, 더욱 구체적으로, 10%의 FBS, 1%의 페니실린/스트렙토마이신, 20 ng/ml의 인간 SCF, 20 ng/ml의 인간 FLT3L, 200 IU/ml의 인간 IL-2, 20 ng/ml의 인간 IL-7, 20 ng/ml의 인간 IL-15, 2 uM의 스템레게닌 I일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 c)의 제 3 배지는 사이토카인, GSK3β 저해제 및 AHR 길항제를 포함하는 것일 수 있다.
상기 용어 "사이토카인", "GSK3β 저해제" 및 "AHR 길항제"는 전술한 바와 같다.
상기 c)의 제 3 배지는 IL-2, IL-15, IL-21, IL-12, IL-18, CHIR99021 및 스템레게닌 I을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 c)의 제 3 배지는 FBS, 항생제 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 항생제는 페니실린/스트렙토마이신일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 c)의 제 3 배지는 FBS, 페니실린/스트렙토마이신, IL-2, IL-15, IL-21, IL-12, IL-18, CHIR99021 및 스템레게닌 I을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
보다 구체적으로, 상기 c)의 제 3 배지는 8 내지 12%의 FBS, 0.1 내지 2%의 페니실린/스트렙토마이신, 100 내지 500 IU/ml의 인간 IL-2, 40 내지 60 ng/ml의 인간 IL-12, 10 내지 30 ng/ml의 인간 IL-15, 90 내지 110 ng/ml의 인간 IL-18, 10 내지 30 ng/ml의 IL-21, 1 내지 3 uM의 CHIR99021 및 1 내지 3 uM의 스템레게닌 I를 포함하는 RPMI 1640일 수 있고, 더욱 구체적으로, 10%의 FBS, 1%의 페니실린/스트렙토마이신, 200 IU/ml의 인간 IL-2, 50 ng/ml의 인간 IL-12, 20 ng/ml의 인간 IL-15, 100 ng/ml의 인간 IL-18, 20 ng/ml의 IL-21, 2 uM의 CHIR99021 및 2 uM의 스템레게닌 I를 포함하는 RPMI 1640일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 리프로그래밍 인자 및 CAR 유전자가 도입된 분리된 세포는 상기 a)의 제 1 배지에서 4 내지 7 일 동안 배양하고, 상기 b)의 제 2 배지에서 10 내지 14 일 동안 배양한 후, c)의 제 3 배지에서 14 일 이상 배양하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서는, CAR-iNK 제 1 배지에서 서로 다른 배양 기간(3, 5, 7, 9 일) 동안 배양하고 이후 실시예 1과 동일한 조건으로 CAR-iNK 제 2 배지 및 제 3 배지에서 배양한 후, CAR-iNK 생산 수율을 비교 분석한 결과, CAR-iNK 제 1 배지에서 5 일간 배양했을 때 약 80%로 가장 높은 CAR-iNK 생산 수율이 나타남을 확인하였다(도 7A).
본 발명의 다른 일 실시예에서는, 20 ng/ml 인간 IL-21, 2 μM CHIR99021, 2μM 스템레게닌 I(SR1), 50 ng/ml 인간 IL-12, 및 100 ng/ml 인간 IL-18을 포함하는 CAR-iNK 제 3 배지에서 배양한 경우 CAR-iNK 수득 효율이 증가됨을 확인하였다(도 7B). 또한, 상기 각 조성의 CAR-iNK 제 3 배지에서 7 일 또는 14 일간 배양하였을 때, 14 일간 배양한 경우 CAR-iNK 수득 효율이 최대 15배까지 증가됨을 확인하였다(도 7B). 이는 CAR-iNK가 CAR-iNK 제 1 배지에서 5 일간, CAR-iNK 제 2 배지에서 12 일간, CAR-iNK 제 3 배지에서 2-3 주간 배양하였을 때 가장 우수한 생산 효율(CD19-CAR-iNK 세포: 최대 45.9%(도 6A), MSLN-CAR-iNK 세포: 43.7%(도 4), HER2-CAR-iNK 세포: 47.8%(도 5)을 나타내는 것임을 시사하였다.
본 발명의 방법에 따라 제조된 CAR-iNK 세포는 CD56+, CD16+, CD3- 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 발현할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 "CD56+", "CD16+" 및 "CD3-"은 NK 세포의 표면에 있는 지표로서, 본 발명에서는 CD56+, CD16+ 및 CD3-의 발현을 유세포 분석기(Flow cytometry)를 통해 분석하여 CAR-iNK 세포가 제조된 것을 확인하였다(도 3 ~ 6).
또한, 본 발명의 방법에 따라 제조된 CAR-iNK 세포는 다양한 암세포에 대한 살상능이 우수한 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, CAR-iNK 세포와 공배양된 암세포에서 암세포 용해능을 갖는 CD107a+ 세포 및 인터페론-감마+ 세포의 빈도(%)가 증가하고(도 8 ~ 도 15), 혈액암 세포주, 췌장암 세포주, 전립선암 세포주, 대장암 세포주, 폐암 세포주, 간암 세포주, 위암 세포주, 흑색종 세포주에 대한 iNK 세포의 살상능을 확인한 결과, 우수한 살상능을 나타내는 것을 확인하였다(도 16 ~ 도 18). 또한, 췌장암이 발생한 마우스 모델에 CAR-iNK 세포 주입 후 14일차에 종양 크기가 CAR 유전자가 도입되지 않은 iNK 세포 또는 iNK 세포를 주입하지 않은 대조군에 비해 현저히 감소한 것을 확인하였다(도 19).
본 발명의 다른 양태는 상기 방법에 따라 제조된 CAR-iNK 세포를 제공한다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
상기 CAR-iNK 세포는 전술한 바와 같이, 다양한 암세포에 대한 살상능이 우수한 것일 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 상기의 방법에 따라 제조된 CAR-iNK 세포를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물을 제공한다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
본 발명에서 용어 "예방"은 상기 조성물의 투여에 의해 암을 억제시키거나 발생을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 용어, "치료"는 상기 조성물의 투여에 의해 암에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 용어, "세포치료제"는 개체로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA 규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종 세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.
상기 세포치료제 조성물은 본 발명의 방법에 따라 제조된 CAR-iNK 세포를 포함함으로써 암 예방 또는 치료 효능이 있는 것일 수 있다.
상기 세포치료제 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 CAR-iNK 세포를 1.0x104 내지 1.0x1010개 세포/ml, 바람직하게는 1.0x105 내지 1.0x109개 세포/ml로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 세포치료제 조성물은 약학 분야의 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위 투여형의 약학 제제로 제형화시켜 투여할 수 있으며, 상기 제제는 1회 또는 수회 투여에 의해 효과적인 투여량을 포함한다. 이러한 목적에 적합한 제형으로는 비경구투여 제제로서 주사용 앰플과 같은 주사제, 주입 백과 같은 주입제, 및 에어로졸 제제와 같은 분무제 등이 바람직하다. 상기 주사용 앰플은 사용 직전에 주사액과 혼합 조제할 수 있으며, 주사액으로는 생리 식염수, 포도당, 만니톨, 링거액 등을 사용할 수 있다. 또한, 주입 백은 염화폴리비닐 또는 폴리에틸렌 재질의 것을 사용할 수 있으며, 박스터(Baxter), 벡톤 디킨슨(Becton Dickinson), 메드셉(Medcep), 내셔날 호스피탈 프로덕츠(National Hospital Products) 또는 테루모(Terumo) 사의 주입 백을 예시할 수 있다.
상기 약학 제제에는 상기 유효성분 외에 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용가능한 통상의 불활성 담체, 예를 들어, 주사제의 경우에는 보존제, 무통화제, 가용화제 또는 안정화제 등을, 국소 투여용 제제의 경우에는 기제(Base), 부형제, 윤활제 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
이렇게 제조된 본 발명의 세포치료제 조성물 또는 이의 약학 제제는 당업계에서 통상적으로 사용하는 투여방법을 이용하여 암 치료에 사용되는 다른 세포와 함께 또는 그러한 세포와의 혼합물의 형태로 투여될 수 있으며, 바람직하게는 치료가 필요한 환자의 질환 부위에 직접 생착 또는 이식하거나 복강에 직접 이식 또는 주입하는 것이 가능하나 이에 한정되지는 않는다. 또한, 상기 투여는 카테터를 이용한 비외과적 투여 및 질환부위 절개 후 주입 또는 이식 등 외과적 투여방법 모두 가능하다. 또한 통상의 방법에 따라 비경구적으로, 예를 들면 직접 병변에 투여하는 것 외에 혈관 내 주입에 의한 이식도 가능하다.
상기 세포치료제 조성물은 1 일 0.0001 내지 1000 mg/kg으로, 구체적으로 0.001 내지 100 mg/kg의 용량으로 투여할 수 있으며, 상기 투여는 하루에 한 번 또는 수회 나누어 투여할 수도 있다. 그러나, 유효성분의 실제 투여량은 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태는 상기의 방법에 따라 제조된 CAR-iNK 세포를 유효성분으로 포함하는, 암 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
본 발명에 있어서, 상기 암은 CAR-iNK 세포의 면역반응 등에 의해 예방 또는 치료의 결과를 나타내는 암일 수 있다. 상기 암은 예를 들면, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종암, 골원성 육종, 골수암, 골수종, 골수이형성증, 림프종, 비-호지킨 림프종, 혈액암, 흑색종, 척색종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프혈관내피육종, 활액막종, 중피종, 어윙 육종, 위암, 평활근육종, 횡문근육종, 결장암종, 결장암, 대장암, 직장암, 췌담관암, 췌장암, 담도암, 담낭암, 간암, 유방암, 난소암, 자궁암, 전립선암, 림프종, 전백혈병, 백혈병, 급성 백혈병, B-세포 급성 림프성 백혈병(BALL), T-세포 급성 림프성 백혈병(TALL), 소림프구성 백혈병(SLL), 급성 림프성 백혈병(ALL); 만성 백혈병, 만성 골수 백혈병(CML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 땀샘 암종, 피지선암종, 갑상선유두암, 낭종암, 갑상선 수질암, 기관지원성암종, 신장 세포 암종, 간암, 담즙 관 암종, 융모 막암종, 정상피종, 태생성 암종, 빌름스 종양, 자궁경부암, 고환 종양, 폐 암종, 폐암, 소세포 폐암종, 방광 암종, 상피 암종, 두경부암, 뇌암, 신경교종, 성상세포종, 신세포암, 교모세포종, 수모세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관아세포종, 청신경종, 핍지교종, 뇌수막종, 흑색종, 신경아세포종, 망막아세포종 및 육종일 수 있고, 구체적으로는 CD19, MSLN 또는 HER2 중 어느 하나 이상의 발현과 연관된 암, 예를 들면, 골수이형성증, 골수이형성 증후군. 전백혈병, 혈액암, 급성 백혈병, B-세포 급성 림프성 백혈병(BALL), T-세포 급성 림프성 백혈병(TALL), 소림프구성 백혈병(SLL), 급성 림프성 백혈병(ALL); 만성 백혈병, 만성 골수 백혈병(CML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 비-호지킨 림프종, 림프종, 골수종, 췌장암, 담도암, 폐암, 난소암, 유방암, 자궁암, 직장암, 대장암, 결장암, 골수암, 간암, 뇌암, 전립선암, 위암, 신경교종, 흑색종, 편평세포 암종, 두경부암, 신세포암, 교모세포종, 수모세포종, 육종 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 보다 구체적으로는 혈액암, 췌장암, 전립선암, 대장암, 폐암, 간암, 위암, 흑색종 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 약학 조성물은 본 발명의 방법에 따라 제조된 CAR-iNK 세포를 포함함으로써 암 예방 또는 치료 효능이 있는 것일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 CAR-iNK 세포를 1.0x104 내지 1.0x1010개 세포/ml, 바람직하게는 1.0x105 내지 1.0x109개 세포/ml로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있고, 상기 담체는 비자연적 담체(Non-naturally Occuring Carrier)를 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
또한, 상기 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 경피흡수제, 겔제, 로션제, 연고제, 크림제, 첩부제, 카타플라스마제, 페이스트제, 스프레이, 피부 유화액, 피부 현탁액, 경피 전달성 패치, 약물 함유 붕대 또는 좌제의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다.
구체적으로, 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제 등도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 상기 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 예를 들면, 상기 약학 조성물은 1 일 0.0001 내지 1000 mg/kg으로, 구체적으로 0.001 내지 100 mg/kg의 용량으로 투여할 수 있으며, 상기 투여는 하루에 한 번 또는 수회 나누어 투여할 수도 있다.
상기 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
상기 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 개체에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 "개체"는 암이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함한 모든 동물을 의미한다. 본 발명의 약학 조성물을 개체에게 투여함으로써 상기 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다면 개체의 종류는 제한없이 포함될 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는, 상기 세포치료제 조성물 또는 약학 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료방법을 제공한다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
본 발명은 직접 리프로그래밍을 통해 분리된 세포로부터 CAR-iNK 세포를 직접 생산함으로써 생산 공정이 간소화되고 생산 시간이 최소 32 일 정도로 종래의 리프로그래밍 기술을 이용하여 NK 세포를 생산 후 이에 CAR 유전자를 도입하였던 방법에 비해 짧아 이에 따라 비용이 절감되며, NK 세포 생산 효율이 최대 47.8%로 우수하고, 유도 만능 줄기세포를 경유하지 않고 생산됨에 따라 안전성이 확보되어, 종래 리프로그래밍 기술과 차별화되는 우수한 CAR-iNK 세포 생산 효과가 있다.
아울러, 본 발명은 종래의 직접 체취, 줄기세포 분화 과정 등을 통해 NK 세포를 수득하는 방법과는 달리, NK 세포와 계통이 다르고 수집이 용이한 세포를 리프로그래밍 배지에서의 배양을 통해 NK 세포를 직접 제조할 수 있는 바, 세포 종류, 품질에 대한 광범위한 선택지를 제공할 수 있음에 의의가 있다.
뿐만 아니라, 본 발명의 방법에 따라 제조된 CAR-iNK 세포는 전술한 바와 같이 암세포 살상능이 우수한 바, 이를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물 및 약학 조성물로 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 분리된 세포로부터 CAR 유전자가 도입된 iNK 세포를 직접 리프로그래밍을 통해 분화 공정과정 없이 생산함으로써 암세포 살상 기능이 강화된 CAR-NK 세포를 초기 세포의 제한이 없이 높은 효율로 생산할 수 있으며, 생산 공정이 간소화됨으로써 비용 및 시간이 절감하는 효과가 있다. 종래 리프로그래밍 기술을 통해 생산되는 유도만능 줄기세포를 경유하지 않고 NK 세포를 생산할 수 있음으로써 안전성 측면에서 개선된 차별화되는 우수한 NK 세포 생산 효과가 있다. 또한, 상기 방법으로 제조된, CAR 유전자가 도입된 iNK 세포는 암세포 살상능이 우수한 바, 암 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물 혹은 약학 조성물로서 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 CAR 유전자 4종의 구성 도메인을 나타낸 도이다.
도 2는 체세포 직접 리프로그래밍 및 CAR 유전자 도입에 의한 CAR-iNK 제조방법의 모식도이다.
도 3은 PBMC 세포로부터 제조한 CD19-CAR-iNK 세포를 확인한 결과이다.
도 4는 PBMC 세포로부터 제조한 MSLN-CAR-iNK 세포를 확인한 결과이다.
도 5는 PBMC 세포로부터 제조한 HER2-CAR-iNK 세포를 확인한 결과이다.
도 6은 (A) CAR를 발현하는 렌티바이러스 도입 시기(Day 0, Day 14, Day 24)에 따라 제조된 CD19-CAR-iNK 세포를 확인한 결과, (B) PBMC 세포로부터 제조한 iNK 세포에서 CD19-CAR 유전자의 삽입 여부를 확인한 결과이다.
도 7은 CAR-iNK 제 1 배지 및 제 3 배지의 조성 또는 배양 시간에 따른 CAR-iNK 생산 효율을 확인한 결과이다.
도 8은 제조된 CD19-CAR-iNK 세포와 암세포의 공배양시 CD107a 발현 세포의 빈도를 확인한 결과이다.
도 9는 제조된 CD19-CAR-iNK 세포와 암세포의 공배양시 CD107a 발현 세포의 빈도를 확인한 결과이다.
도 10은 제조된 MSLN-CAR-iNK 세포와 암세포의 공배양시 CD107a 발현 세포의 빈도를 확인한 결과이다.
도 11은 제조된 HER2-CAR-iNK 세포와 암세포의 공배양시 CD107a 발현 세포의 빈도를 확인한 결과이다.
도 12는 제조된 CD19-CAR-iNK 세포와 암세포의 공배양시 IFN-감마 발현 세포의 빈도를 확인한 결과이다.
도 13은 제조된 CD19-CAR-iNK 세포와 암세포의 공배양시 IFN-감마 발현 세포의 빈도를 확인한 결과이다.
도 14는 제조된 MSLN-CAR-iNK 세포와 암세포의 공배양시 IFN-감마 발현 세포의 빈도를 확인한 결과이다.
도 15는 제조된 HER2-CAR-iNK 세포와 암세포의 공배양시 IFN-감마 발현 세포의 빈도를 확인한 결과이다.
도 16은 제조된 CD19-CAR-iNK 세포의 암세포 살상능을 확인한 결과이다.
도 17은 제조된 MSLN-CAR-iNK 세포의 암세포 살상능을 확인한 결과이다.
도 18은 제조된 HER2-CAR-iNK 세포의 암세포 살상능을 확인한 결과이다.
도 19는 췌장암 세포 이종이식 마우스 동물 모델에서 MSLN-CAR-iNK 세포의 종양 성장 억제 효과를 확인한 결과이다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: CAR를 코딩하는 렌티바이러스 벡터 구축
CAR(Chimeric Antigen Receptor)를 코딩하는 이중 시스트론 렌티바이러스 벡터를 제작하기 위해, CD19, HER2(Human Epidermal Growth Factor Receptor 2) 또는 MSLN(Mesothelin)에 각각 결합하는 4종의 CAR 유전자를 제작하였다. 상기 각 CAR 유전자는 항체 도메인(scFv)을 포함하는 세포 바깥 도메인, 세포막 관통 도메인 및 세포내 도메인을 코딩하는 유전자를 포함하여 구성되었다. 구체적으로, 상기 각 CAR 유전자는 하기와 같이 구성되었다(도 1).
i) CD8 리더(leader)(서열번호 1), CD19 scFv(서열번호 2), CD8 힌지(Hinge)(서열번호 5), CD8 막 관통(Transmembrane, TM) 도메인(Domain)(서열번호 6), Fc-γ(Gamma) 수용체(서열번호 7) 및 GFP(Green Fluorescent Protein)(서열번호 11)를 포함하는 CD19-CAR1 유전자;
ii) CD8 리더(서열번호 1), CD19 scFv(서열번호 2), CD8 힌지(서열번호 5), CD8 막 관통 도메인)(서열번호 6), CD28 세포내(Intracellular) 도메인(서열번호 8), CD3ζ(Zetta)(서열번호 9), IRES(Internal Ribosome Entry Site)(서열번호 10) 및 GFP(서열번호 11)를 포함하는 CD19-CAR2 유전자;
iii) CD8 리더(서열번호 1), MSLN(Mesothelin) scFv(서열번호 3), CD8 힌지(서열번호 5), CD8 막 관통 도메인(서열번호 6), CD28 세포내 도메인(서열번호 8), CD3ζ(서열번호 9), IRES(서열번호 10) 및 GFP(서열번호 11)를 포함하는 MSLN-CAR 유전자; 및
iV) CD8 리더(서열번호 1), HER2(Human Epidermal Growth Factor Receptor 2) scFv(서열번호 4), CD8 힌지(서열번호 5), CD8 막 관통 도메인(서열번호 6), CD28 세포내 도메인(서열번호 8), CD3ζ(서열번호 9), IRES(서열번호 10) 및 GFP(서열번호 11)를 포함하는 HER2-CAR 유전자.
상기 IRES는 CAR 유전자를 이중 시스트론을 구성하는 벡터에 클로닝하기 위해 삽입하였다. 상기 4종의 CAR 유전자를 포함하는 각 벡터는 CAR1(Addgene ID:113014)로부터 도 1의 각 도메인을 합성하고 오버랩 PCR(Overlap PCR, Gibson Assembly)을 통해 CAR를 발현하는 렌티바이러스를 제작하였다.
실시예 2: PBMC로부터 NK 세포로의 직접 리프로그래밍
분리된 말초혈액 단핵세포(Peripheral Blood Mononuclear Cell: PBMC)를 배양액(2.5% StemPro-34 영양 보충물(Nutrient Supplement), 2 mM 글루타맥스(Glutamax) I, 1% 페니실린/스트렙토마이신(Penicillin/Streptomycin), 20 ng/ml 인간 IL(Interleukin)-3, 20 ng/ml 인간 IL-6, 100ng/ml 인간 SCF(Stem Cell Factor), 100 ng/ml 인간 FLT3L(FMS-related Tyrosine Kinase-3 Ligand)을 포함하는 Stempro SFEM II)에서 2 일에 한번씩 배지를 교환하며 4 일간 배양하였다.
상기 PBMC 세포에 리프로그래밍 인자(Oct4, Sox2, Klf4 및 Myc)를 형질전환하기 위해 리프로그래밍 인자를 발현하는 센다이바이러스 시스템[Oct4, Sox2, Klf4 및 Myc 발현 RNA 기반 센다이바이러스(CytoTune 2.0 Sendai Reprogramming Kit, Thermo Scientific); OSKM-SeV]과 실시예 1의 4종의 CAR를 발현하는 4종의 렌티바이러스를 이용하였다. 구체적으로, PBMC 세포를 리프로그래밍 인자로 형질전환시키기 위해 상기 센다이바이러스(5 MOI), PBMC 세포 및 폴리브렌(4 μg/ml)가 포함된 표준 배양 배지(SCM 배지)에서 1 일 동안 배양 후 다음에서 제시된 제 1 배지, 제 2 배지, 제 3 배지로 순차적으로 교체하면서 배양하였다. 상기 방법으로 형질전환된 세포(2x105 개 세포/48-웰 플레이트)를 GSK3β(Glycogen Synthase Kinase 3β) 저해제(Inhibitor)를 포함하는 CAR-iNK 제 1 배지(10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 100 ng/ml 인간 SCF, 100 ng/ml 인간 FLT3L, 20 ng/ml 인간 IL-3, 20 ng/ml 인간 IL-6, 5 uM CHIR99021을 포함하는 StemSpan SFEM II)에서 5-6일간 배양한 후, AHR(Aryl Hydrocarbon Receptor) 길항제(Antagonist)를 포함하는 CAR-iNK 제 2 배지(10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 20 ng/ml 인간 SCF, 20 ng/ml 인간 FLT3L, 200 IU/ml 인간 IL-2, 20 ng/ml 인간 IL-7, 20 ng/ml 인간 IL-15, 2 uM 스템레게닌 I(StemRegenin I, SR1)을 포함하는 StemSpan SFEM II)에서 12 일 동안 배양하고, 이후 GSK3β 저해제 및 AHR 길항제를 포함하는 CAR-iNK 제 3 배지(10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 200 IU/ml 인간 IL-2, 50 ng/ml 인간 IL-12, 20 ng/ml 인간 IL-15, 100 ng/ml 인간 IL-18, 20 ng/ml IL-21, 2 uM CHIR99021 및 2 uM 스템레게닌 I를 포함하는 RPMI 1640)에서 14 일 이상 배양하여 NK 세포로 유도하였다(도 2). CAR를 발현하는 렌티바이러스는 도 2와 같이 리프로그래밍 인자와 동시에(Day 0), 리프로그래밍 인자 도입 후 CAR-iNK 제 1 배지에서 배양하는 단계(Day 4), CAR-iNK 제 2 배지에서 배양하는 단계(Day 14) 또는 CAR-iNK 제3배지에서 배양하는 단계(Day 24) 중 선택하여 배양 배지에 접종함으로써 PBMC 세포로부터 NK 세포로 전환되는 리프로그래밍 과정의 세포에 형질전환되었다.
상기 직접 리프로래밍을 통해 CD19-CAR1 유전자, CD19-CAR2 유전자, MSLN-CAR 유전자 또는 HER2-CAR 유전자가 도입된 NK 세포가 제조되었는지 확인하기 위해, CD56 항체, CD3 항체, CD19 항원, MSLN 항원, HER2 항원으로 상기 세포를 염색 후 유세포 분석기(Flow Cytometry)를 이용하여 iNK 세포(CD56+ 및 CD3-)군, CD19 CAR-iNK 세포(CD56+ 및 CD19+)군, MSLN CAR-iNK 세포(CD56+ 및 MSLN+)군 및 HER2 CAR-iNK(CD56+ 및 HER2+)군을 분석하였다. 구체적으로, 직접 리프로그래밍을 통해 유도된 NK(iNK) 세포를 형광이 부착된 상기 항체, 항원이 첨가된 1% BSA(Bovine Serum Albumin) 및 2 mM EDTA(Ethylenediaminetetraacetic Acid)를 포함한 인산염완충액(FACS 완충액)에 투여하고 상온에서 20 분 반응 후, 세포를 원심분리기를 이용하여 세척 및 회수한 후, FACS(BD Bioscience)로 분석하였다.
또한, 각 CAR 유전자가 iNK 세포 게놈에 삽입되었는지를 확인하기 위해서 각 세포의 게놈 DNA를 CD19 CAR에 대한 프라이머(서열번호 12 및 13), MSLN CAR에 대한 프라이머(서열번호 14 및 15), HER2 CAR에 대한 프라이머(서열번호 16 및 17)를 이용한 PCR 유전자 분석을 통해 확인하였다.
그 결과, CD56+CD3- CD19-CAR-iNK 세포가 최대 45.9%(도 3, 도 6A), CD56+CD3- MSLN-CAR-iNK 세포가 43.7%(도 4), CD56+CD3- HER2-CAR-iNK 세포가 47.8%(도 5)의 효율로 제조됨을 확인하였다.
또한, 도 6과 같이, CAR를 발현하는 렌티바이러스를 리프로그래밍 인자와 동시에(Day 0), 리프로그래밍 인자 도입 후 CAR-iNK 제 2 배지에서 배양하는 단계(Day 14) 또는 CAR-iNK 제3배지에서 배양하는 단계(Day 24) 중 선택하여 배양 배지에 접종하였을 시, CD56+CD3- CD19-CAR-iNK 세포가 각각 15.5%, 31.6%, 45.9%의 효율로 생산됨을 확인하였다.
실시예 3: 배양 기간 최적화
3-1. CAR-iNK 제1배지에서의 배양 기간 최적화
CAR-iNK 제1배지에서 서로 다른 배양 기간(3, 5, 7, 9 일) 동안 배양하고 이후 실시예 1과 동일한 조건으로 CAR-iNK 제 2 배지 및 제 3 배지에서 배양한 후, CAR-iNK 생산 수율을 비교 분석하였다.
그 결과, CAR-iNK 제 1 배지에서 5 일간 배양했을 때 약 80%로 가장 높은 CAR-iNK 생산 수율이 나타남을 확인하였다(도 7A).
3-2. CAR-iNK 제 3 배지의 조성 최적화
실시예 1과 동일한 조건으로 CAR-iNK 제 1 배지 및 제 2 배지에서 배양한 후 서로 다른 조성의 CAR-iNK 제 3 배지에서 배양하여 CAR-iNK 생산 수율을 비교 분석하였다.
그 결과, 20 ng/ml 인간 IL-21, 2 μM CHIR99021, 2 μM 스템레게닌 I(StemRegenin 1, SR1), 50 ng/ml 인간 IL-12, 및 100 ng/ml 인간 IL-18을 추가한 CAR-iNK 제 3 배지에서 배양한 경우 CAR-iNK 수득 효율이 증가됨을 확인하였다(도 7B). 또한, 상기 각 조성의 CAR-iNK 제 3 배지에서 7 일 또는 14 일간 배양하였을 때, 14 일간 배양한 경우 CAR-iNK 수득 효율이 최대 15배까지 증가됨을 확인하였다(도 7B).
상기의 결과를 바탕으로 CAR-iNK는 CAR-iNK 제 1 배지에서 5 일간, CAR-iNK 제 2 배지에서 12 일간, CAR-iNK 제 3 배지에서 2-3 주간 배양하였다.
실시예 4: CD107a+ 세포 정량 분석
실시예 2에서 제조된 CAR-iNK 세포의 암세포 살상 가능성을 검증하기 위해, CAR-iNK 세포를 암세포와 공배양한 후 발현되는, 암세포 용해능을 갖는 CD107a+ 세포의 빈도를 정량 분석하였다. 구체적으로, 암세포인 Raji(Raji B, Human B Lymphocytes; Burkitt's Lymphoma), Jurkat T(Immortalized Human T Lymphocytes), SNU-291(Human B-lymphoblastoid Cells), SNU-817(Human B-lymphoblastoid Cells), HCT116(Human Colon Cancer Cells), NIC-H460(Human Lung Cancer Cells), HepG2(Human Liver Hepatocellular Carcinoma Cells), Mia-paca-2(Human Pancreas Ductal Adenocarcinoma Cells), PC3(PC-3, Human Prostate Cancer Cells) 각각 1x106개 세포/ml와 CAR-iNK 세포 1x106개 세포/ml를 6-웰 플레이트에 각각 1 ml씩 분주한 후, 400g로 1 분간 원심분리하고, 이를 2 시간 또는 16 시간 동안 37℃, 5% CO2 존재 하에서 세포배양기에서 배양한 후, 유세포 분석기를 통해 CD107a+ 세포의 빈도를 확인하였다. 구체적으로, CD107a+ 세포의 빈도는 CAR-iNK 세포를 형광이 부착된 CD56 및 CD107a에 대한 항체가 첨가된 FACS 완충액에서 20 분 동안 상온에서 반응 후, 상기 세포를 원심분리기를 이용하여 세척 및 회수한 다음 FACS 분석하였다.
그 결과, CAR 유전자가 도입되지 않은 iNK 대조군 또는 공배양하지 않은 대조군(-)에 비하여, CD19-CAR-iNK 세포(도 8 ~ 9), MSLN-CAR-iNK 세포(도 10), HER2-CAR-iNK 세포(도 11)와 암세포를 공배양할 경우 CD107a+ iNK 세포의 빈도(%)가 증가함을 확인하였다.
실시예 5: 인터페론 감마(IFN-gamma) 발현 세포 정량 분석
실시예 2에서 제조된 CAR-iNK 세포의 암세포 살상 가능성을 검증하기 위해, CAR-iNK 세포를 암세포와 공배양한 후 발현되는, IFN-감마 세포 빈도를 정량 분석하였다. 구체적으로, 암세포인 Raji, SNU-291, SNU-817, HepG2, NIC-H460(Human Lung Cancer Cells), KATO3(KATOIII, Human Gastric Cancer Cells), CFPAC-1(Human Ductal Pancreatic Adenocarcinoma Cells) 각각 1x106개 세포/ml와 CAR-iNK 세포 1x106개 세포/ml를 6-웰 플레이트에 각각 1 ml씩 분주한 후, 400g로 1 분간 원심분리하고, 이를 2 시간 또는 16 시간 동안 37℃, 5% CO2 존재 하에서 세포배양기에서 배양한 후, 유세포 분석기를 통해 IFN-감마 세포의 빈도를 확인하였다. 구체적으로, IFN-감마 세포의 빈도는 CAR-iNK 세포를 0.5% Tween 20, 0.5% BSA를 포함하는 인산염 완충액에서 20분 동안 상온에서 반응 후, 상기 세포를 원심분리기를 이용하여 세척 및 회수하였다. 회수한 세포를 형광이 부착된 CD56 및 IFN-감마에 대한 항체가 첨가된 FACS 완충액에서 20 분 동안 상온에서 반응 후, 상기 세포를 원심분리기를 이용하여 세척 및 회수하고 FACS 분석하였다.
그 결과, CAR 유전자가 도입되지 않은 iNK 대조군 또는 공배양하지 않은 대조군(-)에 비하여, CD19-CAR-iNK 세포(도 12 ~ 13), MSLN-CAR-iNK 세포(도 14), HER2-CAR-iNK 세포(도 15)와 암세포를 공배양할 경우 IFN-감마+ iNK 세포의 빈도(%)가 증가함을 확인하였다.
실시예 6: CAR-iNK 세포의 암세포 살상능 측정
실시예 1에서 제조된 CAR-iNK 세포의 암세포 살상능을 측정하기 위해, 칼세인-AM(Calcein-AM)을 사용한 세포 살상능 측정법을 실시하였다. 구체적으로, 암세포인 Raji, SNU-291, SNU-817, Mia-paca-2, CFPAC-1, PC3(PC-3), LNcap(Androgen-sensitive Human Prostate Adenocarcinoma Cells), DU145(Human Prostate Cancer Cells), HCT116, A549(Human Lung Carcinoma Cells), NIC-H460, HepG2, KATO3(KATOIII), SK-MEL-3(Human Melanoma Cells)를 10% 소태아 혈청을 포함하는 DMEM 배지에서 각각 1x105개 세포/ml이 되도록 희석한 후, 25 μM이 되도록 칼세인-AM을 첨가하고, 37℃에서 1 시간 배양 후에 DMEM 배지로 세척하여, 칼세인 표지 표적 암세포를 제작하였다.
iNK 세포를 배양액을 이용하여 각각 0.25x105개 세포/ml, 1x105개 세포/ml의 밀도로 희석하여 준비한 후에 96-웰 플레이트에 각각 100 ml씩 분주하였다. 제작한 칼세인 표지 표적 암세포(1x105개 세포/ml)를 100 ul/well씩 96-웰 플레이트에 첨가한 후, 400g로 1 분간 원심분리하고, 이를 4 시간 동안 37℃, 5% CO2 존재 하에서 세포배양기에 배양한 후, 각 웰로부터 상층액 100 ul를 취하여 형광 플레이터 리더(485 nm/535 nm)로 측정하였다. 세포살상능(%)은 아래 수식에 따라서 산출하였다.　
암세포 살상능(%)={(측정값-최소값)/(최대값-최소값)}x100
상기 식에서, 최소값은 칼세인 표지 표적 암세포만 존재하는 웰의 측정값이고, 최대값은 칼세인 표지 표적 암세포에 0.1% TritonX-100을 첨가해서 세포를 완전 용해한 웰의 측정값이다.
그 결과, iNK 대조군 대비 CD19-CAR-iNK 세포(도 16), MSLN-CAR-iNK 세포(도 17), HER2-CAR-iNK 세포(도 18)가 높은 암세포 살상능을 보유함을 확인하였으며, 각 CAR-iNK 세포 수에 비례하게 암세포 살상능이 증가함을 확인하였다.
실시예 7: CAR-iNK 세포의 생체내 암세포 살상능 검증
생후 8주차의 누드 마우스(Balb/c-nude Mouse, 평균무게 20-25g)의 등에 루시퍼라제(Luciferase)를 발현하는 CFPAC-1 1x107개 세포/ml 200 μl을 피하 주입(Subcutaneous Injection)하여, 췌장암세포 이종이식 마우스 동물 모델을 제조하였다. 다음날, 음성 대조군으로 PBS 200 ul 또는 실험군으로 iNK, MSLN-CAR-iNK 세포를 같은 용량(1x107개 세포/ml PBS)으로 주입한 후 7일 간격으로 PBS에 용해된 150 ㎕의 D-루시페린(150 ㎍/ml, Promega)을 복강 주사하고 15-20분 후 종양 크기를 IVIS 100(PerkinElmer)를 통해 확인하였다.
그 결과, 14일차에서 PBS를 주입한 조건에서 형성된 대조군의 종양 크기 (1.21x1010 복사휘도(Radiance)) 대비 iNK(5.35x109 복사휘도) 및 CAR-NK(3.83x109 복사휘도) 세포 실험군에서 형성된 종양 크기가 현저히 줄었음을 확인함으로써 CAR-iNK 세포가 iNK 세포 대비 우수한 항암 효과를 나타냄을 확인하였다(도 19).
상기 실시예의 결과로부터, 분리된 세포를 직접 리프로그래밍을 이용하여 항암 활성이 우수한 CAR-iNK 세포를 제조할 수 있음을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> A method for producing CAR gene introduced NK cells and uses thereof <130> KPA190469-KR-P1 <150> KR 10-2019-0036264 <151> 2019-03-28 <150> KR 10-2019-0036265 <151> 2019-03-28 <160> 17 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8 leader <400> 1 atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60 ccg 63 <210> 2 <211> 789 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD19 scFv <400> 2 atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60 ccggacatcc agatgacaca gactacatcc tccctgtctg cctctctggg agacagagtc 120 accatcagtt gcagggcaag tcaggacatt agtaaatatt taaattggta tcagcagaaa 180 ccagatggaa ctgttaaact cctgatctac catacatcaa gattacactc aggagtccca 240 tcaaggttca gtggcagtgg gtctggaaca gattattctc tcaccattag caacctggag 300 caagaagata ttgccactta cttttgccaa cagggtaata cgcttccgta cacgttcgga 360 ggggggacca agctggagat cacaggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg gtcgggtggc 420 ggcggatctg aggtgaaact gcaggagtca ggacctggcc tggtggcgcc ctcacagagc 480 ctgtccgtca catgcactgt ctcaggggtc tcattacccg actatggtgt aagctggatt 540 cgccagcctc cacgaaaggg tctggagtgg ctgggagtaa tatggggtag tgaaaccaca 600 tactataatt cagctctcaa atccagactg accatcatca aggacaactc caagagccaa 660 gttttcttaa aaatgaacag tctgcaaact gatgacacag ccatttacta ctgtgccaaa 720 cattattact acggtggtag ctatgctatg gactactggg gccaaggaac ctcagtcacc 780 gtctcctca 789 <210> 3 <211> 723 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mesothelin scFv <400> 3 caagtccaac tcgttcaatc aggcgcagaa gtcgaaaagc ccggagcatc agtcaaagtc 60 tcttgcaagg cttccggcta caccttcacg gactactaca tgcactgggt gcgccaggct 120 ccaggccagg gactggagtg gatgggatgg atcaacccga attccggggg aactaactac 180 gcccagaagt ttcagggccg ggtgactatg actcgcgata cctcgatctc gactgcgtac 240 atggagctca gccgcctccg gtcggacgat accgccgtgt actattgtgc gtcgggatgg 300 gacttcgact actgggggca gggcactctg gtcactgtgt caagcggagg aggtggatca 360 ggtggaggtg gaagcggggg aggaggttcc ggcggcggag gatcagatat cgtgatgacg 420 caatcgcctt cctcgttgtc cgcatccgtg ggagacaggg tgaccattac ttgcagagcg 480 tcccagtcca ttcggtacta cctgtcgtgg taccagcaga agccggggaa agccccaaaa 540 ctgcttatct atactgcctc gatcctccaa aacggcgtgc catcaagatt cagcggttcg 600 ggcagcggga ccgactttac cctgactatc agcagcctgc agccggaaga tttcgccacg 660 tactactgcc tgcaaaccta caccaccccg gacttcggac ctggaaccaa ggtggagatc 720 aag 723 <210> 4 <211> 723 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HER2 scFv <400> 4 caggtgcagc tgcagcagag cggccctgag ctgaagaagc ccggcgagac agtcaagatc 60 agctgcaagg ccagcggcta ccccttcacc aactacggca tgaactgggt gaaacaggcc 120 ccaggccagg gactgaagtg gatgggctgg atcaacacca gcaccggcga gagcaccttc 180 gccgacgact tcaagggcag attcgacttc agcctggaaa ccagcgccaa caccgcctac 240 ctgcagatca acaacctgaa gagcgaggac agcgccacct acttttgcgc cagatgggag 300 gtgtaccacg gctacgtgcc ctactggggc cagggcacca ccgtgaccgt gtccagcggc 360 ggagggggct ctggcggcgg aggatctggg ggagggggca gcgacatcca gctgacccag 420 agccacaagt ttctgagcac cagcgtgggc gaccgggtgt ccatcacctg caaagccagc 480 caggacgtgt acaacgccgt ggcctggtat cagcagaagc ctggccagag ccccaagctg 540 ctgatctaca gcgccagcag ccggtacacc ggcgtgccca gcaggttcac cggcagcggc 600 agcggcccag acttcacctt caccatcagc agcgtgcagg ccgaggacct ggccgtgtac 660 ttctgccagc agcacttccg gacccccttc accttcggct ccggcaccaa gctggaaatc 720 aag 723 <210> 5 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8 hinge <400> 5 accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60 tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120 gacttcgcct gtgat 135 <210> 6 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8 Transmembrane domain <400> 6 atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60 accctttact gc 72 <210> 7 <211> 141 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc gamma receptor <400> 7 agacgactca agatccaggt ccgaaaggca gctatagcca gccgtgagaa agcagatgct 60 gtctacacgg gcctgaacac ccggagccag gagacatatg agactctgaa gcatgagaaa 120 ccaccccagg gatccggaag t 141 <210> 8 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD28 Intracellular domain <400> 8 aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60 gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120 tcc 123 <210> 9 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3 zetta <400> 9 agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60 tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120 cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180 gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240 cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300 tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336 <210> 10 <211> 575 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IRES <400> 10 gcccctctcc ctcccccccc cctaacgtta ctggccgaag ccgcttggaa taaggccggt 60 gtgcgtttgt ctatatgtta ttttccacca tattgccgtc ttttggcaat gtgagggccc 120 ggaaacctgg ccctgtcttc ttgacgagca ttcctagggg tctttcccct ctcgccaaag 180 gaatgcaagg tctgttgaat gtcgtgaagg aagcagttcc tctggaagct tcttgaagac 240 aaacaacgtc tgtagcgacc ctttgcaggc agcggaaccc cccacctggc gacaggtgcc 300 tctgcggcca aaagccacgt gtataagata cacctgcaaa ggcggcacaa ccccagtgcc 360 acgttgtgag ttggatagtt gtggaaagag tcaaatggct cacctcaagc gtattcaaca 420 aggggctgaa ggatgcccag aaggtacccc attgtatggg atctgatctg gggcctcggt 480 gcacatgctt tacatgtgtt tagtcgaggt taaaaaacgt ctaggccccc cgaaccacgg 540 ggacgtggtt ttcctttgaa aaacacgatg ataat 575 <210> 11 <211> 717 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GPF <400> 11 atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60 ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120 ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180 ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240 cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300 ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360 gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420 aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480 ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540 gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600 tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660 ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaag 717 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD19 CAR_F <400> 12 gagaattctc acgcgtgcca c 21 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD19 CAR_R <400> 13 ggagaggggc ttagcgaggg ggcagggcct 30 <210> 14 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MSLN CAR_F <400> 14 tggagctctc gagaattctc acgcgtgcca ccatggccct ccctgtca 48 <210> 15 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MSLN CAR_R <400> 15 gcggcgctgg cgtcgtggtc ttgatctcca ccttg 35 <210> 16 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HER2 CAR_F <400> 16 tggagctctc gagaattctc acgcgtgcca ccatggactg gatctggcgg attc 54 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HER2 CAR_R <400> 17 gcgtcgtggt cttgatttcc agcttggtgc 30

Claims (21)

  1. 리프로그래밍 인자(Reprogramming Factor)가 도입된 분리된 세포를 a) SCF(Stem Cell Factor), FLT3L(FMS-related Tyrosine Kinase-3 Ligand), IL-3, IL-6 및 CHIR99021를 포함하는 제 1 배지; b) SCF, FLT3L, IL-15, IL-7, IL-2, 스템레게닌 I 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 5개 이상을 포함하는 제 2 배지; 및 c) IL-2 및 IL-15를 포함하는 제 3 배지;에서 순차적으로 배양하여 NK 세포로 직접 리프로그래밍 시키는 단계를 포함하는, CAR-iNK(induced Natural Killer) 세포 제조방법으로서, 상기 제조방법은 CAR(Chimeric Antigen Receptor) 유전자를 추가로 도입하는 단계를 포함하는 것으로, 상기 CAR 유전자는 배양 전, 상기 a)의 제 1 배지에서 배양하는 기간, 상기 b)의 제 2 배지에서 배양하는 기간 또는 상기 c)의 제 3 배지에서 배양하는 기간 중 선택되는 어느 하나의 시점에서 상기 분리된 세포에 도입되는 것인, CAR-iNK 세포 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제 3 배지는 IL-21, IL-12, IL-18, CHIR99021, 스템레게닌 I 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함하는 것인, CAR-iNK 세포 제조방법.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서, 상기 a)의 제 1 배지, b)의 제 2 배지 또는 c)의 제 3 배지는 FBS(Fetal Bovine Serum), 항생제 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함하는 것인, CAR-iNK 세포 제조방법.
  9. 제1항에 있어서, 리프로그래밍 인자 및 CAR 유전자가 도입된 분리된 세포는 상기 a)의 제 1 배지에서 4 내지 7 일 동안 배양하고, 상기 b)의 제 2 배지에서 10 내지 14 일 동안 배양한 후, c)의 제 3 배지에서 14 일 이상 배양하는 것인, CAR-iNK 세포 제조방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 리프로그래밍 인자는 Lin28, Asc11, Pitx3, Nurr1, Lmx1a, Nanog, Oct4, Oct3, Sox2, Klf4, Myc 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인, CAR-iNK 세포 제조방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 리프로그래밍 인자는 Oct4, Sox2, Klf4 및 Myc인, CAR-iNK 세포 제조방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 CAR 유전자는
    i) CD8 리더(Leader), CD19 scFv, CD8 힌지(hinge), CD8 막 관통 도메인 및 Fc-γ 수용체를 포함하는 CAR 유전자;
    ii) CD8 리더, CD19 scFv, CD8 힌지, CD8 막 관통 도메인, CD28 세포내 도메인, CD3ζ 및 IRES(Internal Ribosome Entry Site)를 포함하는 CAR 유전자;
    iii) CD8 리더, MSLN(Mesothelin) scFv, CD8 힌지, CD8 막 관통 도메인, CD28 세포내 도메인, CD3ζ 및 IRES를 포함하는 CAR 유전자; 및
    iV) CD8 리더, HER2(Human Epidermal Growth Factor Receptor 2) scFv, CD8 힌지, CD8 막 관통 도메인, CD28 세포내 도메인, CD3ζ 및 IRES를 포함하는 CAR 유전자;로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인, CAR-iNK 세포 제조방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 CAR 유전자는 GFP(Green Fluorescent Protein)를 추가로 포함하는 것인, CAR-iNK 세포 제조방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 리프로그래밍 인자 및 CAR 유전자가 도입되는 분리된 세포는 NK 세포를 제외한 체세포인 것인, CAR-iNK 세포 제조방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 제조된 CAR-iNK 세포는 CD56+, CD16+, CD3- 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 발현하는 것인, CAR-iNK 세포 제조방법.
  16. 삭제
  17. 제1항, 제2항, 및 제8항 내지 제15항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 CAR-iNK 세포를 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물.
  18. 제1항, 제2항, 및 제8항 내지 제15항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 CAR-iNK 세포를 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 암은 CD19, MSLN 또는 HER2으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 발현과 연관된 암인, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 CD19, MSLN 또는 HER2으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 발현과 연관된 암은 골수이형성증, 골수이형성 증후군. 전백혈병, 혈액암, 급성 백혈병, B-세포 급성 림프성 백혈병(BALL), T-세포 급성 림프성 백혈병(TALL), 소림프구성 백혈병(SLL), 급성 림프성 백혈병(ALL); 만성 백혈병, 만성 골수 백혈병(CML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 비-호지킨 림프종, 림프종, 골수종, 췌장암, 담도암, 폐암, 난소암, 유방암, 자궁암, 직장암, 대장암, 결장암, 골수암, 간암, 뇌암, 전립선암, 위암, 신경교종, 흑색종, 편평세포 암종, 두경부암, 신세포암, 교모세포종, 수모세포종, 육종 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 상기 CD19, MSLN 또는 HER2으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 발현과 연관된 암은 혈액암, 췌장암, 전립선암, 대장암, 폐암, 간암, 위암, 흑색종 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
KR1020200037719A 2019-03-28 2020-03-27 Car 유전자가 도입된 nk 세포의 제조방법 및 그의 용도 KR102298640B1 (ko)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20190036264 2019-03-28
KR1020190036265 2019-03-28
KR20190036265 2019-03-28
KR1020190036264 2019-03-28

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20200115358A KR20200115358A (ko) 2020-10-07
KR102298640B1 true KR102298640B1 (ko) 2021-09-07

Family

ID=72610717

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020200037719A KR102298640B1 (ko) 2019-03-28 2020-03-27 Car 유전자가 도입된 nk 세포의 제조방법 및 그의 용도
KR1020200037718A KR102298639B1 (ko) 2019-03-28 2020-03-27 면역세포의 제조방법 및 그의 용도

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020200037718A KR102298639B1 (ko) 2019-03-28 2020-03-27 면역세포의 제조방법 및 그의 용도

Country Status (6)

Country Link
US (2) US20220160769A1 (ko)
EP (2) EP3954762A4 (ko)
JP (3) JP7429713B2 (ko)
KR (2) KR102298640B1 (ko)
CN (2) CN113874492B (ko)
WO (2) WO2020197318A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023038475A1 (ko) * 2021-09-10 2023-03-16 한국생명공학연구원 유도 자연살해세포의 제조방법 및 그의 용도

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112656789A (zh) * 2020-12-31 2021-04-16 中国科学院生态环境研究中心 Ficz在抑制肿瘤细胞迁移中的应用
WO2023038476A1 (ko) * 2021-09-10 2023-03-16 한국생명공학연구원 자연살해세포의 제조방법 및 이의 감염성 질환 예방 또는 치료 용도
WO2023090780A1 (ko) * 2021-11-22 2023-05-25 재단법인 아산사회복지재단 자연살해세포-특이적 키메릭항원수용체 및 이의 용도
CN114350608B (zh) * 2022-01-27 2024-05-28 昭泰英基生物医药（香港）有限公司 一种诱导t细胞重编程为类nk细胞的组合物及其应用
CN114958771B (zh) * 2022-06-27 2023-12-05 广东康盾创新产业集团股份公司 一种ipsc-car-nk细胞的制备方法
KR20240066123A (ko) 2022-11-07 2024-05-14 마루테라퓨틱스 주식회사 Nk 세포의 분화 효율 및 기능성 증가를 위한 배양 방법
CN115804776A (zh) * 2022-12-16 2023-03-17 国纳之星(上海)纳米科技发展有限公司 一种芳香烃受体抑制剂和5-氟尿嘧啶合用在治疗抑制肿瘤药物中的应用
CN117660335A (zh) * 2023-12-14 2024-03-08 广州百康细胞生命科技有限公司 一种使用化学重编辑法将体细胞转化成免疫细胞的方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018195175A1 (en) * 2017-04-18 2018-10-25 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Antigen-specific immune effector cells

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK2614077T3 (en) 2010-09-08 2016-11-21 Chemotherapeutisches Forschungsinstitut Georg-Speyer-Haus Chimeric antigen receptors with an optimized hinge region
EP3567102A1 (en) * 2012-04-24 2019-11-13 Dan S. Kaufman Method for developing natural killer cells from stem cells
KR101550269B1 (ko) * 2014-01-22 2015-09-07 한국생명공학연구원 섬유아세포로부터 조혈줄기세포로의 직접 역분화 유도 방법
WO2015164740A1 (en) 2014-04-24 2015-10-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Application of induced pluripotent stem cells to generate adoptive cell therapy products
WO2016109661A1 (en) * 2014-12-31 2016-07-07 Anthrogenesis Corporation Natural killer cells and uses thereof
CN106349389B (zh) 2015-07-21 2019-11-15 科济生物医药（上海）有限公司 肿瘤特异性抗egfr抗体及其应用
AU2016342183B2 (en) * 2015-10-20 2022-03-03 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Methods for directed differentiation of pluripotent stem cells to immune cells
JP7114490B2 (ja) 2016-06-24 2022-08-08 アイセル・ジーン・セラピューティクス・エルエルシー キメラ抗体受容体（ＣＡＲｓ）の構成およびその使用方法
CN107384949B (zh) * 2017-06-27 2019-01-15 闾民 表达GPC3嵌合抗原受体的iNKT细胞及制备、应用
WO2019059713A2 (ko) * 2017-09-21 2019-03-28 한국생명공학연구원 자연살해세포의 제조방법 및 그의 용도
KR102167548B1 (ko) * 2017-09-21 2020-10-19 한국생명공학연구원 자연살해세포의 제조방법 및 그의 용도

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018195175A1 (en) * 2017-04-18 2018-10-25 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Antigen-specific immune effector cells

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023038475A1 (ko) * 2021-09-10 2023-03-16 한국생명공학연구원 유도 자연살해세포의 제조방법 및 그의 용도

Also Published As

Publication number Publication date
EP3954762A1 (en) 2022-02-16
US20220184128A1 (en) 2022-06-16
EP3954762A4 (en) 2023-01-18
CN113874493A (zh) 2021-12-31
JP2022527932A (ja) 2022-06-07
EP3950935A4 (en) 2023-06-07
KR102298639B1 (ko) 2021-09-07
JP2023179554A (ja) 2023-12-19
JP2022528086A (ja) 2022-06-08
CN113874492A (zh) 2021-12-31
JP7429713B2 (ja) 2024-02-08
EP3950935A1 (en) 2022-02-09
KR20200115358A (ko) 2020-10-07
KR20200115357A (ko) 2020-10-07
CN113874492B (zh) 2024-03-19
US20220160769A1 (en) 2022-05-26
CN113874493B (zh) 2024-05-10
WO2020197318A1 (ko) 2020-10-01
WO2020197319A1 (ko) 2020-10-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102298640B1 (ko) Car 유전자가 도입된 nk 세포의 제조방법 및 그의 용도
Li et al. Human iPSC-derived natural killer cells engineered with chimeric antigen receptors enhance anti-tumor activity
JP7008350B2 (ja) Ｃａｒ発現ベクター及びｃａｒ発現ｔ細胞
JP7058728B2 (ja) ナチュラルキラー細胞の製造方法及びその用途
JP7018387B2 (ja) 腫瘍標的療法のためのｃｘｃｒ６形質導入ｔ細胞
US20240139248A1 (en) Immunocompetent cell that expresses a cell surface molecule specifically recognizing human mesothelin, il-7 and ccl19
JP5557288B2 (ja) 細胞のリプログラミングに用いられる複数遺伝子の発現制御システム
JP2021532796A (ja) タンパク質ヘテロ二量体およびその使用
CN116514998B (zh) 一种嵌合抗原受体、嵌合抗原受体-自然杀伤细胞及其在制备抗肿瘤药物中的应用
US20230212515A1 (en) Method for obtaining car-nk cells
JP2021069322A (ja) Ｃｄ４陽性制御性ｔ細胞の製造方法
KR102604208B1 (ko) 유도 자연살해세포의 제조방법 및 그의 용도
CN116286660B (zh) 一种ipsc-（car）自然杀伤细胞、制备方法及其在肿瘤治疗中的应用
CN113786416B (zh) 转基因的nk细胞在治疗癌症中的用途
CN113599395B (zh) 含有nk细胞的治疗癌症的药物组合物
KR20190133254A (ko) 키메라 항원 수용체 (car) t 세포 요법의 부작용을 치료하는 방법
WO2024040138A1 (en) Universal natural killer cells derived from human pluripotent stem cells and method of use
Xiong et al. Immune Cell Generation from Human-Induced Pluripotent Stem Cells: Current Status and Challenges
Du Co-Expansion of Gamma Delta T Cells and Cytokine Induced Killer Cells for Adoptive Immune Cell Therapy

Legal Events

Date Code Title Description
A302 Request for accelerated examination
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant