KR102266936B1

KR102266936B1 - 황기를 발효시킨 황기 발효물의 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR102266936B1
Application number: KR1020180162268A
Authority: KR
Inventors: 박신영; 김소영; 김재현; 최혜선
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2018-12-14
Filing date: 2018-12-14
Publication date: 2021-06-21
Also published as: KR20200074356A

Abstract

황기를 발효시킨 황기 발효물의 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 상기 추출물은 우수한 항염증 효과를 나타낼 뿐만 아니라, 발효시키지 않은 황기 추출물과 비교하여 현저하게 우수한 항염증 효과를 나타내는 바, 염증성 질환을 예방 또는 치료하는데 유용하게 사용할 수 있다.

Description

황기를 발효시킨 황기 발효물의 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for treating or preventing inflammatory diseases comprising the extract of fermented Astragalus membranaceus Bunge}

황기를 발효시킨 황기 발효물의 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

황기(Astragalus membranaceus Bunge)는 한국·중국·일본에 분포하는 여러해살이풀로, 황기뿌리는 독성이 없어 안전하여 식품원료로도 사용되고 다양한 약리효능이 있기 때문에 약재용으로도 사용된다. 일반적으로 주로 식품원료로 사용하는 황기는 1년생 황기의 주피를 거의 벗긴 뿌리이다.

황기는 전통적으로 피로, 식욕감퇴, 자연발한, 호흡곤란 등의 증세를 치료하고 쇠약해진 기운을 회복시켜 주는 용도로 많이 사용되어 왔으며, 항염증 및 항고혈압, 간장보호, 항산화, 항바이러스, 심장혈관보호, 면역증진활성, 항노화 등의 효능이 보고된 바 있다. 최근에는 새로운 cylcoartane-typesaponin 물질의 항염증 효과를 비롯해 항암효과, 골다공증 개선, 관절연골 분해 억제 효과 등이 보고된 바 있다.

황기의 다양한 활성은 triterpenoid glycosides, flavonoid 및 polysaccharide와 같은 다양한 생리활성 화합물들을 함유하고 있기 때문이다. 특히 황기의 flavonoid 성분은 다양한 생리활성의 주요 활성물질로 평가되고 있는데 calycosin-7-O-β-D-glucopyranoside, calycosin, formononetin 성분들이 있다. 황기의 주요 triterpenoid glycosides로는 agroastragaloside I, agroastragaloside II, isoastragaloside II, astragaloside IV, agroastragaloside V 등이 알려져 있다. 그 외, 칼슘, 콜린, 구리, 필수 지방산, 철, 마그네슘, 망간, 칼륨, 아연 성분도 함유하고 있다.

최근, 황기의 이소플라보노이드계 화합물인 칼리코신 배당체(calycosin 7-O-β-D-glucopyranoside)가 골관절염을 완화시키는 효과가 있음이 보고되었다. 칼리코신 배당체는 이소플라보노이드계 화합물로서 히알루로니데이즈(hyaluronidase)의 활성을 저해하고, 관절을 보호하며 관절조직의 기질 성분의 분해를 일으키는 인터루킨-1 베타(IL-1β)의 활성을 저해하여 관절을 보호하는 효과가 있었다. 히알루로니데이즈는 연골조직에 많이 함유되어 연골조직 탄력성에 역할을 하는 히알루론산(hyaluronic acid)을 분해하는 효소이기 때문에 히알루로니데이즈 활성을 저해하는 물질은 골관절염을 억제하는 효과가 있을 것으로 기대된다. 황기의 칼리코신 배당체는 연골 골관절염 조골세포에 의해 유도되는연골분해효소(MMP-3, MMP-13) 유전자 발현을 억제하는 효과도 있었다. 골관절염은 퇴행성 관절염으로서 증상의 개선이나 치료효과를 위해 부작용이 적은 식품용 약용작물을 이용한 식의약 소재 개발이 유효하며 이상의 결과들로 황기 성분과 추출물이 퇴행성 관절염을 개선하거나 치료하는 효과가 있는 것으로 기대된다.

한편, 아직 발효된 황기를 의약용으로 사용한 바는 없다.

대한민국 등록특허 10-0994444

본 발명의 일 목적은, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명의 일 측면에 따라, 황기(Astragalus membranaceus Bunge)를 발효시킨 황기 발효물의 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 측면에 따라, 황기(Astragalus membranaceus Bunge)를 발효시킨 황기 발효물의 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품이 제공된다.

본 발명의 다른 측면에 따라, 황기(Astragalus membranaceus Bunge)를 발효시킨 황기 발효물의 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증제가 제공된다.

본 발명의 다른 측면에 따라, 황기(Astragalus membranaceus Bunge)를 발효시킨 황기 발효물의 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 피부외용제가 제공된다.

본 발명의 상황버섯균으로 황기를 발효시킨 황기 발효물의 추출물은 우수한 항염증 효과를 나타낼 뿐만 아니라, 발효시키지 않은 황기 추출물과 비교하여 현저하게 우수한 항염증 효과를 나타내는 바, 염증성 질환을 예방 또는 치료하는데 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 황기를 발효시킨 황기 발효물의 추출물의 세포독성을 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명에 따른 황기를 발효시킨 황기 발효물의 추출물의 IL-6생성 억제 효과 평가 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 황기를 발효시킨 황기 발효물의 추출물의 IL-8생성 억제 효과 평가 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 황기를 발효시킨 황기 발효물의 추출물의 IL-6발현 억제 효과 평가 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 황기를 발효시킨 황기 발효물의 추출물의 IL-8발현 억제 효과 평가 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따른 황기를 발효시킨 황기 발효물의 추출물의 MAPKs 발현 억제 효과 평가 결과를 나타낸 그래프이다. (A): ERK 1/2 인산화 억제, (B): JNK 1/2의 인산화 억제

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 일 측면은, 황기(Astragalus membranaceus Bunge)를 발효시킨 황기 발효물의 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 약학적 조성물에서,

상기 발효 황기는 상황버섯균을 처리하여 발효시킨 것일 수 있고, 상기 상황버섯균은 경기도농업기술원 버섯연구소에서 분양 받은 '고려상황'으로 펠리누스 린테우스(Phellinus linteus) 균주일 수 있다.

또한, 상기 황기 발효물은 황기 및 미강을 혼합하여 발효시킨 것일 수 있고, 이때, 황기 및 미강의 혼합은 황기 1 중량부에 대하여 미강을 0.01 내지 1 중량부로 혼합할 수 있고, 황기 1 중량부에 대하여 미강을 0.1 내지 0.5 중량부로 혼합할 수 있고, 황기 1 중량부에 대하여 미강을 0.25 중량부로 혼합할 수 있다.

이때, 미강은 상황버섯균의 영양원으로서 역할을 할 수 있다.

상기 염증성 질환은 알레르기, 피부염, 천식, 아토피 및 건선으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 본 발명의 상황버섯균으로 황기를 발효시킨 황기 발효물의 추출물은 우수한 항염증 효과를 나타낼 뿐만 아니라, 발효시키지 않은 황기 추출물과 비교하여 현저하게 우수한 항염증 효과를 나타내는 바, 알레르기, 피부염, 천식, 아토피 또는 건선 등과 같은 염증성 질환을 예방 또는 치료하는데 유용하게 사용할 수 있다.

구체적으로, 상기 황기를 발효시킨 황기 발효물의 추출물은 하기의 단계들을 포함하는 제조방법에 의해 제조될 수 있다:

1) 황기를 발효시킨 황기 발효물에 추출용매를 가하여 추출하는 단계;

2) 단계 1)의 추출물을 여과하는 단계; 및

3) 단계 2)의 여과한 추출물을 감압 농축하여 황기를 발효시킨 황기 발효물의 추출물을 제조하는 단계.

상기 방법에 있어서, 황기는 재배한 것, 시판되는 것 등 제한 없이 사용할 수 있다.

상기 방법의 단계 1)에서, 상기 발효 황기는 상황버섯균을 처리하여 발효시킨 것일 수 있고, 상기 상황버섯균은 경기도농업기술원 버섯연구소에서 분양 받은 '고려상황'으로 펠리누스 린테우스(Phellinus linteus) 균주일 수 있다.

또한, 단계 1)의 추출물은 통상적으로 사용되는 식물 추출물의 제조방법이라면 한정되지 않고 사용할 수 있으며, 열수추출, 초음파추출, 가압추출 방법 등을 사용할 수 있다. 또한, 상기 단계 1)의 추출용매는 물, 알코올 또는 이들의 혼합물을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 알코올로는 C₁ 내지 C₂ 저급 알코올을 이용할 수 있고, 구체적으로 저급 알코올은 에탄올 또는 메탄올일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 용매를 물로 사용하여, 초음파 추출하였으나, 이는 일례일 뿐, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 방법에 있어서, 단계 3)의 감압 농축은 진공 감압 농축기 또는 진공회전증발기를 이용할 수 있다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명의 황기를 발효시킨 황기 발효물의 추출물은 추가적으로 유기용매로 추출하는 제조방법을 통해 분획물로 제조될 수 있다. 상기 유기용매로는 헥산, 에틸 아세테이트, 부탄올 또는 물일 수 있다. 상기 분획물로는 헥산, 에틸 아세테이트 및 부탄올을 단계적으로 첨가한 후, 각 용매 첨가 단계에서 가용성 분획을 획득한 헥산, 에틸 아세테이트 및 부탄올 분획물, 및 상기 부탄올 분획물을 제거하고 남은 물층을 농축한 물 분획물이 모두 사용가능하나, 구체적으로 헥산 분획물일 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 전체 중량에 대하여 유효성분인 황기를 발효시킨 황기 발효물의 추출물 또는 이의 분획물을 10 내지 95 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 상기 유효성분 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 액제, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제, 주사제제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다. 비경구 투여는 복강내, 직장내, 피하, 정맥, 근육내 또는 흉부내 주사 방식을 포함할 수 있다.

상기 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 이는 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 환자의 민감도, 투여 시간, 투여 경로, 치료기간, 동시에 사용되는 약물 등에 따라 달라질 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명에 따른 조성물에 포함되는 유효성분의 양은 0.0001 내지 1,000 ㎎/㎏, 구체적으로 0.001 내지 500 ㎎/㎏일 수 있다. 상기 투여는 하루에 1회 수회일 수 있다.

본 발명의 조성물은 단독 또는 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 병용 투여시, 투여는 순차적 또는 동시일 수 있다.

본 발명의 다른 측면은, 황기(Astragalus membranaceus Bunge)를 발효시킨 황기 발효물의 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명에 따른 본 발명의 상황버섯균으로 황기를 발효시킨 황기 발효물의 추출물은 우수한 항염증 효과를 나타낼 뿐만 아니라, 발효시키지 않은 황기 추출물과 비교하여 현저하게 우수한 항염증 효과를 나타내는 바(실험예 참조), 알레르기, 피부염, 천식, 아토피 또는 건선 등과 같은 염증성 질환을 예방 또는 개선하는데 유용하게 사용할 수 있다.

본 발명의 황기를 발효시킨 황기 발효물의 추출물은 식품에 그대로 첨가하거나, 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있다. 이때, 첨가되는 유효성분의 함량은 목적에 따라 결정될 수 있고, 일반적으로는 전체 식품 중량의 0.01 내지 90 중량부일 수 있다.

건강기능식품의 형태 및 종류는 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 건강기능식품은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환의 형태일 수 있다. 상기 건강기능식품은 추가성분으로서 여러 가지 향미제, 감미제 또는 천연 탄수화물을 포함할 수 있다. 상기 감미제는 천연 또는 합성 감미제일 수 있고, 천연 감미제의 예로는 타우마틴, 스테비아 추출물 등이 있다. 한편, 합성 감미제의 예로는 사카린, 아스파르탐 등이 있다. 또한, 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드, 디사카라이드, 폴리사카라이드, 올리고당 및 당알코올 등일 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 상기 서술한 추가성분 외에, 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙스탄 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 등을 더 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합으로 사용될 수 있다. 상기 첨가제의 비율은 본 발명의 조성물의 100 중량부당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택될 수 있다.

본 발명의 다른 측면은, 황기(Astragalus membranaceus Bunge)를 발효시킨 황기 발효물의 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증제를 제공한다.

본 발명의 다른 측면은, 황기(Astragalus membranaceus Bunge)를 발효시킨 황기 발효물의 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 피부외용제를 제공한다.

상기 피부 외용제에서 본 발명의 황기를 발효시킨 황기 발효물의 추출물은 전체 외용제 총 중량에 대하여 0.001 내지 5 중량%의 함량으로 배합하여 사용할 수 있고, 단독으로, 또는 비슷한 활성을 갖는 다른 화합물을 함께 배합하여 사용할 수 있다.

본 발명의 황기를 발효시킨 황기 발효물의 추출물을 피부 외용제로 사용하는 경우, 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 피부용 외용제에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 또한, 상기 성분들은 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.

<제조예 1> 발효 미생물의 준비

본 발명의 황기를 발효시킨 황기 발효물의 발효에 사용하기 위한 균주는, 경기도농업기술원 버섯연구소에서 분양 받은 '고려상황'으로 펠리누스 린테우스(Phellinus linteus) 균주으로써 계대배양하면서 사용하였다. 균의 고체 배양용 MYG(malt extract 1.0%, yeast extract 0.4%, glucose 0.4%, agar 2%)를 제조하여 사용하였다.

<실시예 1> 황기 발효물의 제조

황기는 충북 제천산 3 년근을 구입하여 사용하였다. 황기 2 kg을 톱밥형태로 분쇄하여 미강과 4:1비율로 잘 섞은 후 증류수를 가해 혼합한 후 톱밥종균 배양병에 각 300g씩 병입한 후 121℃에서 40 분간 autogclave에서 멸균하였고, 이 후 상황버섯균사체를 각 배양병에 접종하여 25℃ 온도의 incubater에서 30일간 배양하며 발효시켰다.

<실시예 2> 황기 발효물의 추출물 제조

상기 실시예 1에서 얻은 상황버섯균 배양 황기를 동결건조 한 뒤 물 추출물을 제조하였다. 물 추출물의 제조는 다음과 같다.

발효물 5 g에 DW 100 mL씩 가하여 ultrasonicator로 1시간 씩 2회 초음파 추출한 후 Whatman No. 2 여과지로 여과하였다. 여과액을 rotary vacuum evaporater (BUCHI, USA)로 50℃ 이하에서 감압·농축하였고, 이를 같은 추출용매로 용해하여 본 실험의 시료로 사용하였다.

<비교예 1> 황기 추출물 제조

발효 전 후의 비교를 위하여, 발효시키지 않은 황기사용하여 물 추출물을 제조하였다. 구체적인 제조방법은 하기와 같다.

황기는 충북 제천산 3 년근을 구입하여 사용하였다. 황기 2 kg을 톱밥형태로 분쇄하여 사용하였다. 분쇄된 황기 5 g에 DW 100 mL씩 가하여 ultrasonicator로 1시간 씩 2회 초음파 추출한 후 Whatman No. 2 여과지로 여과하였다. 여과액을 rotary vacuum evaporater (BUCHI, USA)로 50℃ 이하에서 감압·농축하였고, 이를 같은 추출용매로 용해하여 본 실험의 시료로 사용하였다.

<실험 재료 준비 및 실험 방법>

1. 세포 배양

항염증 효과 평가를 위한 비만세포를 하기와 같은 방법으로 배양하여 사용하였다.

세포배양에서 필요한 Iscove's Modified Dulbecco's Media (IMDM) 배지는 Welgene (Daegu, Korea) 제품을 사용하였으며, Fetal bovine serum (FBS)는 Hyclone (New zealand) 제품을 구입해 사용하였다. 실험에 사용한 사람 비만세포주 HMC-1는 항생제 (100 U/mL Penicillin, 100 U/mL Streptomycin)와 10% FBS가 첨가된 IMDM 배지에서 37 ℃, 5% CO₂ incubator에 적응시켜 배양하였다. 계대 배양은 이틀에 한 번씩 하였다.

2. 세포독성(MTS) 평가

세포독성은 MTS assay를 이용하여 확인하였다. HMC-1을 96 well plate에 5×10⁴ cells/well 로 분주한 후, 30분 뒤 신효월도산을 각각 50, 100, 250, 500 μg/mL 농도별로 처리하였다. 24시간 동안 배양한 후, MTS solution을 20 μL씩 첨가한 후, 37 ℃, 5% CO₂ incubator에서 2시간 배양하였다. microplate reader를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.

3. ELISA

HMC-1를 48 well plate에 5×10⁵ cells/well 로 분주하였고, 30분 뒤 시료를 각 각 50, 100 250 μg/mL 처리한 후, 1시간 뒤 PMA (50nM), A23187 (1μM)를 처리 하고 8시간 뒤, 세포를 가라앉게 한 후, 배양 상층액을 수거하였다. 4℃에 하룻밤 동안 있던 1차 항체 coating plate를 다음날, 30분 실온 상태로 둔 뒤, 3번 wash buffer로 세척 후, Assay buffer를 200μL 분주하였다. 1시간 뒤 3번 세척하였다. sample과 standard를 100μL 분주 후, 2시간 실온 상태로 두었다. 5번 세척하고, working Detector (2차 항체 + SA-HRP) 100μL 분주 후, 1시간 실온 상태로 두었다. 7번 세척 후, Substrate Solution을 100μL 분주하고, 암실에서 최대 30분 기다렸다. 마지막으로, Stop Solution (1M H₃PO₄)을 50μL 분주한 후, microplate reader를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

4. RNA 분리 및 Real time PCR 실시

Real-time PCR과 data분석은 StepOnePlus RealTime PCR System (Life technologies Korea., Seoul, Korea)을 이용하여 시행하였다. Cycle threshold (Ct) value는 StepOnePlus에 의해 자동적으로 계산되었다. 추출된 genomic DNA 2μl에 PCR mixture 18μl를 넣은 후 pipet 을 이용하여 기포가 생기지 않도록 혼합하다. PCR mixture는 SYBR Green (iQ™SYBR Green Supermix, Bio-Rad Co., Hercules, CA, USA)과 10 pmol의 두 개 의 primer (Bioneer Co., Daejeon, Korea), 그리고 멸균 증류수를 포함한다. Quantification을 위해 사용된 primer 는 human IL-6-Forward (AAG CCA GAG CTG TGC AGA TGA GTA) 와 human IL-6-Reverse (TGT CCT GCA GCC ACT GGT TC), human IL-8-Forward (ACA CTG CGC CAA CAC AGA AAT TA) 와 human IL-8-Reverse (TTT GCT TGA AGT TTC ACT GGC ATC), human β-actin-Forward (ATT CGG GAC AGG ATG CAG AAG) 와 human β-actin-Reverse (ATG GAG CCA CCG ATC CAC A) 이다. 각 gene을 quantification 하기 위한 cycling 순서는 다음과 같이 진행하다. 먼저 95℃에서 10분간 유지하다. 이후 95℃에서 15초, 67℃에서 60초를 40 cycles를 반복하다. 마지막으로 72℃에서 5분간 유지한다. Melting curve의 분석은 0.2℃ 간격으로 65 ℃에서부터 95℃까지 상승시켰다.

5. 단백질 추출 및 Western blot analysis

HMC-1를 6 well plate에 5×106 cells/well로 분주하고, 30분 뒤 각 시료를 2500, 5000 μg/mL 처리한 후, 1시간 뒤 PMA(50 nM), A23187(1 μM)로 자극하고 1시간 뒤, 세포 를 수집하였다. PBS로 세척 한 뒤, lysis buffer를 200 μl 넣고, 20분 동안 lysis 한 후, 원심 분리(13,000 rpm, 5분) 하였다. 단백질 정량은 BSA와 Bio-Radprotein Assay Kit 를 사용하였고, microplate reader를 이용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하고 정량하였다. 만들어진 단백질을 10% SDS-PAGE로 변성 분리하여, 이를 PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane에 15 V에서 1시간 동안 Transfer하 였다. 그리고 Ponceau S solution으로 염색 한 후, Transfer 가 잘 되었는지 확인하였다. 염색을 TBS-T(TBS + 0.05% Tween 20) 용액으로 세척한 후, membrane을 3% BSA가 첨가된 TBS-T 용액에 상온에서 1시간 동안 blocking 하였다. 1차 항체 반응은 1차 항체를 3% BSA에 희석하여 4℃에서 하룻밤 동안 수행하였다. TBST로 3회 15분씩 세척하였다. 2차 항체 반응은 HRP(horse radish peroxidase)가 결합된 anti-mouse IgG, anti-rabbit IgG를 1:2,000으로 희석하여 상온에서 1시간 반응시킨 뒤, TBS-T로 3회 15분씩 세척하여 ECL Substrate에 반응 후, ImageQuantTM LAS 4000 mini을 이용하여 단백질 발현량을 분석하였다.

6. 통계분석

통계분석은 Scheffe's test법을 따라 one-way analysis of variance을 실행하였다. 모든 실험은 3회 이상 반복으로 이루어졌으며, 실험결과는 각 항목에 따라 SPSS statistics 22 software (SPSS Inc. Chicago, IL, USA)를 사용하여 평균치±표준편차 (SD)를 구하여 신뢰수준 p < 0.05에서 통계적 유의성을 평가하였다.

<실험예 1> 황기 발효물의 추출물의 항염증 효과 평가

비만세포를 이용한 알러지성 염증반응에서 황기 물추출물과 실시예 2의 황기 발효물 추출물을 이용하여 항염증활성을 검증하였다.

1-1. HMC-1 Cells에서 세포독성 측정

황기 물추출물(AST extract), 황기발효 0일 추출물(AST-F0) 및 황기발효 30일(AST-F30)추출물의 세포생존율을 측정하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타난 바와 같이,

발효시키지 않은 황기 물추출물(AST extract), 황기발효 0일 추출물(AST-F0) 및 황기발효 30일(AST-F30)추출물은 모두 세포 독성을 나타내지 않음을 알 수 있다.

다만, 황기발효 0일 추출물(AST-F0) 5000 μg/ml의 농도에서 세포독성이 나타남에 따라, 이후의 실험에서 5000 μg/ml 농도의 황기발효 0일 추출물(AST-F0)은 실험에 제외시켰다.

1-2. 염증성 사이토카인 IL-6, IL-8의 생성 억제 효과 평가

PMA+A23187로 자극한 HMC-1 cells에서 황기 물추출물(AST extract), 황기발효 0일 추출물(AST-F0) 및 황기발효 30일(AST-F30)추출물의 염증성 사이토카인 IL-6, IL-8의 생성을 ELISA 방법을 이용하여 측정하였다. IL-6생성 억제 효과 평가 결과를 도 2에, IL-8생성 억제 효과 평가 결과를 도 3에 나타내었다.

도 2 및 도 3에 나타난 바와 같이,

황기 물추출물(AST extract) 2500, 5000 μg/ml 농도와 황기발효 30일(AST-F30)추출물 2500, 5000 μg/ml 농도에서 IL-6생성이 농도 의존적인 억제양상을 나타냈으며(도 2), 동일하게 2500 μg/ml 농도일 때, 황기 발효 30일 추출물의 IL-6 생성 억제효과가 더 우수한 것을 알 수 있다.

또한, IL-8 생성은 황기 물추출물(AST extract) 2500, 5000 μg/ml 농도와 황기발효 30일(AST-F30)추출물 5000 μg/ml 농도에서 유의적인 억제 양상을 보였다(도 3).

1-3. 염증성 사이토카인 IL-6, IL-8의 mRNA 발현 억제 효과

PMA+A23187로 자극한 HMC-1 cells에서 황기 물추출물(AST extract), 황기발효 0일 추출물(AST-F0) 및 황기발효 30일(AST-F30)추출물의 염증성 사이토카인 IL-6, IL-8의 발현을 real-time RT-PCR 방법을 이용하여 측정하였다. IL-6 발현 억제 효과 평가 결과를 도 4에, IL-8 발현 억제 효과 평가 결과를 도 5에 나타내었다.

도 4 및 도 5에 나타난 바와 같이,

황기 물추출물(AST extract) 5000 μg/ml 농도와 황기발효 30일 (AST-F30) 추출물 2500, 5000 μg/ml 농도에서 IL-6 발현이 농도 의존적인 억제양상을 나타냈으며(도 4), 동일하게 2500 μg/ml 농도일 때, 황기 발효 30일 추출물의 IL-6 발현 억제효과가 현저하게 우수한 것을 알 수 있다.

또한, IL-8 생성은 황기 물추출물(AST extract) 5000 μg/ml 농도와 황기발효 30일 (AST-F30) 추출물 5000 μg/ml 농도에서 유의적인 억제 양상을 보였으며(도 5), 황기 발효 30일 추출물의 IL-6 발현 억제효과가 현저하게 우수한 것을 알 수 있다.

1-4. 세포내 신호전달체계인 MAPKs 발현 억제 효과

PMA와 A23187로 활성화된 HMC-1 cells에서 황기 물추출물(AST extract), 황기발효 0일 추출물(AST-F0) 및 황기발효 30일(AST-F30)추출물의 세포내 신호전달체계인 MAPKs의 발현을 측정하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타난 바와 같이,

황기발효 30일(AST-F30)추출물은 2500, 5000 μg/ml 농도에서 농도 의존적으로 ERK 1/2의 인산화를 억제하였으며, 5000 μg/ml 농도에서 유의적인 억제양상을 보였다.

또한, 황기발효 30일(AST-F30)추출물은 5000 μg/ml 농도에서 JNK 1/2의 인산화를 억제하는 것을 알 수 있다.

따라서, 본 발명의 상황버섯균으로 황기를 발효시킨 황기 발효물의 추출물은 우수한 항염증 효과를 나타낼 뿐만 아니라, 발효시키지 않은 황기 추출물과 비교하여 현저하게 우수한 항염증 효과를 나타내는 바, 알레르기, 피부염, 천식, 아토피. 건선 등의 염증성 질환을 예방 또는 치료하는데 유용하게 사용할 수 있다.

<제제예 1> 건강식품의 제조

황기 발효물의 추출물 500ng

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70mg

비타민 E 1.0mg

비타민 0.13mg

비타민 B2 0.15mg

비타민 B6 0.5mg

비타민 B12 0.2mg

비타민 C 10mg

비오틴 10mg

니코틴산아미드 1.7mg

엽산 50mg

판토텐산 칼슘 0.5mg

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75mg

산화아연 0.82mg

탄산마그네슘 25.3mg

제1인산칼륨 15mg

제2인산칼슘 55mg

구연산칼륨 90mg

탄산칼슘 100mg

염화마그네슘 24.8mg

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

<제제예 2> 건강음료의 제조

황기 발효물의 추출물 500ng

구연산 1000mg

올리고당 100g

매실농축액 2g

타우린 1g

정제수를 가하여 전체 900ml

통상의 건강 음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 건강 음료 조성물 제조에 사용하였다.

상기 조성비는 비교적 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호 도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims

황기 1 중량부에 대하여 미강을 0.01 내지 1 중량부로 혼합하고,
상기 혼합물에 상황버섯균을 처리하여 발효시킨 황기 발효물의 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는,
알레르기 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
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삭제
제1항에 있어서,
상기 추출물은 물, 메탄올 및 에탄올로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 이들의 혼합물을 용매로 사용하여 추출된 것을 특징으로 하는, 건강기능식품 조성물.
제1항에 있어서,
상기 알레르기 염증성 질환은 알레르기, 피부염, 천식, 아토피 및 건선으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 건강기능식품 조성물.
삭제
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황기 1 중량부에 대하여 미강을 0.01 내지 1 중량부로 혼합하고,
상기 혼합물에 상황버섯균을 처리하여 발효시킨 황기 발효물의 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는,
알레르기 염증성 질환의 예방 또는 개선용 피부외용제.