KR102265802B1 - 프로피오니박테륨 및 효모의 공-배양 - Google Patents

프로피오니박테륨 및 효모의 공-배양 Download PDF

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Abstract

본 발명은 프로피오니박테륨과 공-배양하여 자랄 수 있는 효모 세포와 같은, 균류 세포를 제공한다. 또한 그러한 세포들을 생산하는 방법 및 공배양으로 본 발명의 균류 세포와 프로피오니박테륨을 이용한 발효 공정을 제공한다. 그러한 공-배양은 분명하게 폐기물 발효 브로스의 화학적 산소 요구량 부하를 감소시킨다.

Description

프로피오니박테륨 및 효모의 공-배양{Co-cultivation of Propionibacterium and yeast}
본 발명은 생물공정(bioprocess) 기술 분야에 관한 것으로, 특히 효모와 프로피오니박테륨(즉, 프로피오니박테리아속)의 공-배양co-cultures)을 이용한 생물공정 분야에 관한 것이다.
높은 유기화학적 산소 요구량(COD)을 갖는 폐기물은 상황에 맞게 처리해야하만 하는 생태학적 부담이다. 이러한 폐기물들은 유제품, 과채류, 또는 당 생산 산업과 같은 다양한 산업의 부산물일 수 있다. 예를 들어, 치즈 생산과정에서 얻어지는 부산물같은 유제품 산업에서 발생된 유장(whey)이 그것이다. 이 공정은 높은 COD를 갖는 많은 부피의 유장(감미 또는 산성)을 결과적으로 만들어내지만, 한편으로는 예를 들어 우유 단백질 및 락토스와 같은, 유용한 건조물의 함량이 상대적으로 낮기 때문에,쉽게/경제적으로 이용할 수 없다.
치즈생산 공정에서 남겨진 유장의 COD 값은 35,000 mg O2/L 에서 100,000 mg O2/L 범위일 수 있다. 높은 유기물 부하의 주요 원인은 락토스이며, 이것은 COD 값의 90% 까지 나타낼 수 있다. 산성 유장(sour whey)의 경우에 젖산의 존재는 이러한 문제를 더 증가시킨다. 또한 락토스는 유장 건조 물질의 약 75%를 차지하며, 보통 미생물을 이용하는 공정에 의해 활용될 수 있다. 바이오에탄올과 바이오가스 생산, 락토스 또는 단백질의 추출, 유기산 또는 바이오매스의 생산과 같은, 유장 활용의 몇 가지 해결책들이 연구되었지만, 그러나 여전히 경제적인 방식의 유장 활용에 대한 요구가 존재한다.
WO 2011/140649는 식용 바이오매스(biomass) 생산을 위해 젖산균과 효모의 혼합 배양에 의한 유장의 활용을 개시한다. 이 과정은 유장의 COD 부하를 성공적으로 감소시킬수 있지만, 최종 산물은 상업적 가치가 적다.
유장은 방선균목(Actinomycetales (Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (1st Edition, 1986)))에 속하는, 프로피오니박테륨 속(Propionibacterium sp.) 박테리아의 배양을 위해 이용될 수 있다. 프로피오니박테륨속은 유기산(프로피온산 및 아세트산), 비타민 B12 및 비피터스(bifidogenic) 화합물들과 같은 다양한 산물들의 생산자로 알려져 있다. 프로피오니박테륨 속(Propionibacterium sp.) 은 유장에서 성공적으로 배양될 수 있는데 반해 그들은 발효된(이용된) 유장에서 축적되고 명백하게 최종 COD 부하(load)에 기여하는 유기산을 생산하기 때문에 충분하게 COD 부하를 더 낮출 수 없다. 이하에서, 용어 "프 로피오니박테륨 속( Propionibacterium sp.)" 및 "프로피오니박테륨"은 상호 교체되어 사용된다.
프로피오니박테륨 속 및 다른 박테리아의 공-배양은 폐배지의 COD 부하를 감소시킬 수 있는 것으로 알려져 있으나(Miyano et al., 2000), 그러한 과정은 식ㅍ품용(food grade)이 아니라는 단점을 가지고 있으며 식품 가공 공장 내에서 사용되는 것 조차 제외된다.
프로피오니박테륨 속에 의해 생산된 대사산물들은 다른 미생물들, 특히 곰팡이의 성장을 억제하는 것으로 알려져 있으며, 식품 부패 방지 용도로 잘 알려져 있다. US　5,260,061는 효모의 성장을 억제하기 위해 식품에 적용하기 위한 프로피오 니박테륨 속의 응용을 기술한다. WO 2008/030089 는 치즈 제조 과정에서 우수한 풍미/향기 특성을 얻을 목적으로 프로피오니박테륨 속과 효모의 공-배양을 기술한다. 이 경우, 이용된 효모 세포는 프로피오니박테륨 속 유래의 성장 억제 물질에 내성이 없었기 때문에, 프로피오니박테륨 속은 혼합 배양에서 효모의 성장을 조절하고, 최종적으로 억제하는데 이용되었다.
상기 기술된 종래 기술 측면에서, 본 발명의 목적은 상대적으로 낮은 COD를 나타내는 최종 소비된 발효 배지인, 감미(sweet) 또는 산성(sour) 유장에서 귀중한 생명공학 제품을 생산하는 신규한 생물공정을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 본 발명의 공정에 유용한 균류 세포(fungal cells)를 제공하는 것이다.
본 발명은 상대적으로 낮은 COD를 나타내는 최종 소비된 발효 배지인, 감미(sweet) 또는 산성(sour) 유장에서 귀중한 생명공학 제품을 생산하는 신규한 생물공정을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 본 발명의 공정에 유용한 균류 세포(fungal cells)를 제공하는 것이다.
발명의 요약
본 발명은 신규한 균류 세포들(fungal cells), 바람직하게 프로피오니박테륨과 공-배양하여 성장할 수 있는, 효모 세포들(yeast cells)을 제공함으로써 상기 언급된 목적을 달성한다. 그러한 균류 세포 또는 세포들은 프로피오니박테륨 배양 후 얻어지는 정지기(stationary-phase) 상청액(폐배지(spent medium))에서 성장할 수 있는 그들의 능력에 의해 특성화/정의될 수 있다. 본 발명은 또한 프로피오니박테륨과 공-배양에서 상기 배지의 존재하에서 성장할 수 있는 그러한 균류 세포들을 사용하는 생명공학적 공정들과 관련된다.
따라서, 본 발명의 일 측면은 프로피오니박테륨 배양의 정지기 상청액에서 성장할 수 있는 균류 세포에 관련된 것이다.
그러한 균류 세포는 본 특허 출원에서 기술된 돌연변이유발(mutagenesis)/선택(selection) 과정들에 의해 증식가능하도록 얻어질 수 있다. 균류 세포들, 특히 프로피오니박테륨 배양의 정지기 상청액에서 성장할 수 있는 능력을 갖는 효모 세포들은 본 발명에 따른 발효 공정으로부터 얻어진 부산물들의 COD 부하의 감소에 유용하다. 그러한 균류 세포들(특히 그러한 효모 세포들)은 이전에는 업계의 통상의 기술자들이 입수할 수 없었다.
본 발명의 균류 세포들은 이하에서 기술되는 공정들에 의해 다른 균류 세포들과 쉽게 구별되고 식별될 수 있다. 특히, 여기서 잘-정의된 배양 배지 및 잘 정의된 배양 조건들은, 본 발명에 따른, "프로피오니박테륨 배양의 정지기 상청액에서 성장"의 균류 세포의 능력을 시험하기 위하여 개시된다.
따라서, 바람직한 실시예에서, 상기 정지기 상청액(상기 균류 세포가 본 발명에 따른 것인지를 테스트하기 위해 사용됨)은 60 g/L 감미 유장 파우더(sweet whey powder), 5 g/L 효모 추출물(yeast extract), 및 40 mg/L 칼슘 D-판토테네이트(calcium D-pantothenate)로 이루어진 배지에서 35℃ 그리고 pH 6.5 혐기성(anaerobic) 조건하에서 배양된 Propionibacterium freudenreichii 의 정치 배양(stationary culture)으로부터 얻는다. 바람직하게 감미 유장 파우더는 식품 등급 품질을 가지고, 바람직하게 그것은 적어도 63%wt 락토스, 적어도 10%wt 단백질 그리고 최대 5%wt 물을 포함한다.
프로피오니박테륨 배양의 정지기 상청액에서 자랄 수 있는 능력은 프로피오니박테륨 배양의 정지기 상청액에서 자랄 때, 균류(효모) 세포에 의해 달성되는 최대 성장 속도(maximum growth rate)라는 용어로 정의될 수 있다. 따라서, 다른 바람직한 실시예에서, 프로피오니박테륨 배양의 정지기 상청액내의 상기 균류 세포의 상기 성장 능력은 적어도 0.02 h-1의 최대 성장 속도(μmax)로 상기 정지기 상청액에서 성장하는 상기 균류 세포의 능력으로 정의된다. 미생물의 배양에서 성장 속도를 측정하는 방법은 업계에 잘 알려져 있다.
프로피오니박테륨 배양의 정치배양 상태는 상기 배양이 통기(aeration)상태에 노출되지 않았을 때 시간에 따른 배양 배지 내의 아세트산(acetic acid) 및 프로피온산(propionic acid)의 일정한 농도로 나타낼 수 있다. 다른 실시예에서, 프로피오니박테륨 배양의 정지상태는 시간에 따른 프로피오니박테륨의 일정한 세포 밀도(g(DW)/L) 로)로 나타낼 수 있다.
바람직한 실시예에서, 프로피오니박테륨 배양의 정지기 상청액에서 성장하는 균류 세포의 능력은 이하에 설명될, 실시예 2에 기술되어진 시험 방법으로 시험된다.
바람직한 균류 세포는 효모 세포(yeast cell)이다.
일 실시예에서, 균류 세포는 수납 번호(accession number) DSM 28271로 독일미생물자원센터(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ))에 2014. 1. 20. 자로 기탁된 효모세포이다.
본 발명의 두 번째 측면은 생명공학적 산물을 생산하기 위한 공정에 관련된 것이며, 상기 공정은 배양 배지 내에서 프로피오니박테륨과 균류 세포의 공-배양을 포함한다. 상기 균류 세포는 바람직하게 프로피오니박테륨 배양의 정지기 상청액에서 성장할 수 있다.
상기 균류 세포는 상기 기술되고 이하에서도 기술될, 본 발명에 따른 균류 세포와 같은, 바람직하게는 효모 세포이다.
상기 생명공학적 산물은 바람직하게 프로피오니박테륨에 의해 생산된 것이다.
바람직한 생명공학적 산물은 비타민 B12(vitamin B12)이다.
바람직한 실시예에서, 통기가 발생하는 제 2 단계(second phase)가 뒤따르는 통기(aeration)가 없는 제 1 단계(first phase)를 포함한다. 바람직하게, 두 단계는 적어도 24시간, 또는 48시간, 또는 72시간 지속된다.
바람직한 실시예에서, 프로피오니박테륨의 성장의 적어도 90%(% 그램 건조 중량(% gram dry weight))는 통기없는 제1단계 동안 일어난다.
다른 바람직한 실시예에서, 배양 배지의 화학적 산소 요구량(chemical oxygen demand (COD))은 배양 배지의 초기 COD의 25% 와 동등한 수준 또는 그 이하로 감소되며, 바람직하게 10%와 동등한 수준 또는 그 이하, 1%와 동등한 수준 또는 그 이하이다.
다른 바람직한 실시예에서, 배양 배지는 유장(whey)이다(또는 포함한다). 상기 배양 배지는 예컨대, 감미 유장(sweet whey), 또는 산성 유장(sour whey)이거나 또는 포함한다.
바람직하게, 본 발명의 공정에서, 상기 균류 세포는, 상기 프로피오니박테륨이 상기 배양에서 그것의 최대 세포 밀도[g(DW)/L] 의 적어도 90%에 도달할 때, 그 때 추가되거나 또는 그 때 이후에 추가된다. 본 발명의 공정의 다른 실시예에서, 상기 균류 세포는 상기 프로피오니박테륨이 그것의 정지기 성장 단계일 때 또는 그 이후에 추가된다.
본 발명은 더 나아가 프로피오니박테륨-내성 효모 균주와 같은, 프로피오니박테륨-내성 균류 균주를 만드는 방법과 관련된다.
상기 방법은 다음을 포함한다:
1. 출발 균류 균주(fungal strain)를 얻는 단계.
2. 출발 균류 균주를 돌연변이 유발제 및/또는 돌연변이 조건에 노출시키는 단계.
3. 처음 농도의 아세트산 및/또는(바람직하게는 "및") 프로피온산의 존재에서 2단계의 노출된 균류 균주를 배양하는 단계.
4. 3단계의 상기 배양된 균류 균주를 돌연변이 유발제 및/또는 돌연변이 조건에 선택적으로 노출시키고, 상기 선택적으로 노출된 균류 균주를 두 번째 농도의 아세트산 및/또는 (바람직하게 "및") 프로피온산의 존재하에서 배양하는 단계, 여기서 상기 두번째 농도는 바람직하게 각각이 상기 처음의 농도보다 더 크다.
5. 3 또는 4 단계의 상기 배양된 균류 균주를 돌연변이 유발제 및/또는 돌연변이 조건에 노출하는 단계.
6. 프로피오니박테륨 배양의 정지기 단계 상청액을 포함하는 배지에서 6 단계의 노출된 균류 균주를 배양하는 단계.
7. 증가된 농도의 프로피오니박테륨 배양의 정지기 상청액으로 7 단계를 선택적으로 반복하는 단계.
8. 그렇게 함으로써 프로피오니박테륨 배양의 정지기 상청액에서 성장할 수 있는 균류 세포를 획득하는 단계.
본 발명에 따른 바람직한 돌연변이 유발제는 에틸 메탄술포네이트(ethyl methanesulfonate)이다. 그러나 돌연변이 유발제, 즉, 화학적으로 또는 물리적으로 돌연변이의 빈도수를 증가시키는데 이용될 수 있다면, 어떤 것이든 포함될 수 있다. 상기 방법에 이용될 수 있는 잘 알려진 돌연변이 유발제는 다음을 포함한다: 수퍼옥사이드(superoxide), 하이드록실 라디칼(hydroxyl radicals) 및 과산화수소(hydrogen peroxide)와 같은, 활성 산소종(Reactive oxygen species (ROS)); 탈아민제(deaminating agents), 예를 들어, 아질산(nitrous acid); 다환 방향족 탄화수소(polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH)); 에틸니트로소우레아(ethylnitrosourea) 또는 메틸 메탄술포네이트(methyl methanesulfonate)와 같은 알킬화제(alkylating agents); 구아닌(guanine); 니트로소아민(nitrosamines); 니트로소구아니딘(nitrosoguanidine); 머스터드 가스(mustard gas); 비닐 클로라이드(vinyl chloride); 방향족 아민(aromatic amines); 아미드(amides); 2-아세틸아미노플루오렌(2-acetylaminofluorene); 식물의 알칼로이드(alkaloid); 빙카 종(Vinca species)으로부터 유래한 것과 같은; 브로민(bromine); 그들의 화학적 구조에서 브로민을 포함하는 화합물; 소듐 아지드(sodium azide); 벤젠(benzene). 적절한 돌연변이 조건 또는 물리적 돌연변이유발원은 예를 들어, UV 조사, X-선에 노출 및/또는 방사능에 노출이다.
통상의 기술자는 상기 2단계 내지 4단계는 생략가능할 것이라고 인식할 것이다. 예를 들어, 1단계의 출발 균주가 이미 충분하게 아세트산 및/또는 프로피온산에 내성을 가진다면, 또는 만약 그렇지 않으며 프로피오니박테륨 배양의 정지기 상청액을 포함하는 배지에서 성장을 할 수 있다면. 이러한 경우에 상기 1단계의 출발 균주는 직접 5단계의 돌연변이 유발제 및/또는 조건에 노출된다.
본 발명의 다른 측면은 상기 방법에 의해 얻어진 균류 균주에 관련된다.
발명의 상세한 설명
본 발명에 사용된, "상청액(supernatant)" 또는 "배양 상청액(culture supernatant)"이라는 표현은 발효 브로스(fermentation broth)를 여과하거나 또는 원심분리하고, 따라서 세포 및 다른 불수용성 물질들은 제거하여 얻어진 액체를 의미한다. 상기 상청액은 미생물에 의해 (아직) 소비되지 않은 배양 배지의 어떤 영양성분들 또는 다른 성분들과 발효동안 미생물에 의해 생산된 어떤 생산물들을 포함한다.
"배양 배지(Culture medium)" 는 미생물이 성장할 수 있는 영양성분을 포함하는 배지로 이해될 수 있다. 액체 배양 배지가 바람직하다.
"브로스(Broth)" 또는 "발효 브로스(fermentation broth)"는 미생물이 자라는 또는 자란 배양 배지에 관한 것으로 이해될 수 있다. 브로스는 미생물에 의해 생산된 사용되지 않은 영양성분들 및/또는 산물(product)들을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른, "정지기 상청액(stationary-phase supernatant)" 또는 "폐배지(spent medium)"는 정지기 발효 브로스의 상청액으로 이해될 수 있다.
상기 정지기라 함은 미생물이 실질적으로 자라는 것을 중단한, 가령, 배양하는 동안 미생물이 그들의 최고 세포 밀도에까지 다다른, 배양의 단계로 이해될 수 있다. 배양의 정지기는 또한 발효 산물들의 농도를 모니터링하여 발견해낼 수 있다. 일 실시예에서 프로피오니박테륨 배양의 정지기는 아세트산 및/또는 프로피온산의 농도가 그것의 최대값에 이르렀을 때, 또는 그렇지 않으면 최대값의 90%에 다다랐을 때 그 단계가 시작하는 것으로 정의된다.
"유장(Whey)"은 렌넷(rennet) 또는 산성 물질이 추가되거나 형성될 때 그 자리에서 응고한 후에 우유로부터 분리한, 유제품 생산과정에서 발생하는 부산물이다. "감미 유장(Sweet whey)"은 체다 또는 스위스 치즈와 같은 렌넷 타입의 고형 치즈를 만드는 동안 제조된다. "산 유장(Acid whey)" 또는 "산성 유장(sour whey)"은 코티지 치즈(cottage cheese) 또는 스트레인 요거트(strained yogurt)와 같은 산성 타입 유제품을 만드는 동안 생산된 부산물이다.
"화학적 산소 요구량(chemical oxygen demand)" 또는 "COD"는 ISO 6060:1989 표준법에 의해 결정되는 화학적 산소 요구량으로 이해될 수 있다. 이 방법에 따라 결정할 COD가 허용된 최대 COD인 700 mg/L를 초과하는 경우, 시료를 물로 희석해야할 수 있는 것으로 이해된다. 그 다음 COD는 결정된 COD로부터 희석배율로 곱하여 계산된다.
본 발명은 프로피오니박테륨과 공-배양에 내성을 갖는 균류 세포를 제공한다. 또한, 본 발명은 프로피오니박테륨과 균류 세포를 공배양하는 공정을 제공하며, 여기서 세포는 프로피오니박테륨에 의해 생산된 억제성 화합물들에 대해 내성을 갖는다.
본 발명은 프로피오니박테륨과 그들의 억제성 대사산물들의 존재하에서 성장할 수 있는 균류 세포들을 제공한다. 이러한 세포들은 프로피오니박테륨이 이전에 배양된 성장 기질상에서 일반적으로 이용가능한 균류 세포들의 자연발생적인 무작위적 돌연변이체의 선택 과정에 의해 수득된다. 바람직하게 그러한 내성 균류 세포들의 선택은 적어도 두 단계로 수행된다. 첫 번째 단계로, 예를 들어 아세트산 및 프로피온산과 같은, 더 많은 농도의 유기산에서도 견딜 수 있는 균류 세포들의 무작위적 돌연변이체들이 선택된다. 두 번째 단계로, 이러한 산-내성 세포들의 무작위적 돌연변이체들은 프로피오니박테륨이 이전에 배양되고 성장의 정지 단계에 도달하였던, 사용된 성장 배지에서 추가로 한차례 더 선택을 받게 된다. 바람직하게 본 발명에 의해 제공되는 상기 균류 세포는 효모 세포이다.
예를 들어, 프로피오니박테륨 배양의 정지기 상청액에서 성장할 수 있는 프로피오니박테륨과 공-배양에 내성을 가지는, 본 발명의 균류 세포는, 랜덤 돌연변이에 의해, 유전공학에 의해, 또는 천연 분리물을 스크리닝함으로써 가능할 수 있는, 전형적인 선별 방법에 의해 수득될 수 있다.
프로피오니박테륨과 공배양하는 과정에서 내성이 있는 균류 세포를 사용하는 본 발명의 생명공학적 공정은 다음의 단계들을 포함할 수 있다:
1. 배양 배지의 준비
2. 프로피오니박테륨의 접종
3. 통기없이 발효
4. 유산소 조건으로의 전환
5. 내성 효모 세포의 접종
6. 프로피오니박테륨과 효모의 공배양으로 발효의 지속
7. 선택적으로 후속 공정 및 생산물 회수
발효배지 (The fermentation medium)
발효 배지는 프로피오니박테륨과 균류 세포 모두가 성장할 수 있는 적절한 발효 배지라면 어떤 것이든지 이용될 수 있다. 예를 들어 상기 발효 배지는 당밀(molasses) 또는 유장(whey)을 포함할 수 있다. 상기 발효 배지는 성장 속도를 또는 목적으로 하는 산물들의 생산을 증가시키기 위하여 특유의 첨가제들(미네랄, 비타민, 질소 및 추가적인 탄소원, 전구체 등과 같은)이 추가될 수 있는 다양한 산업에서 발생한 폐기물 스트림(유장 같은)로 구성될 수 있다. 상기 배지는 프로피오니박테륨에게 알맞는, 글루코스, 락토스, 프럭토스와 같은 탄소원, 젖산 및 황산 암모늄(ammonium sulphate)과 같은 질소원, 아미노산, 펩타이드, 및 단백질을 다양하게 포함할 수 있다. 상기 발효 배지의 pH 는 공정의 시작단계에서 조절될 수 있거나 또는 프로피오니박테륨의 우수한 성장이 가능하도록 하는 발효 공정 및/또는 산물 생산 동안 유지될 수 있다.
상기 배지는 프로피오니박테륨의 접종 전에, 발효 배지에 초기에 존재할 수 있는 미생물을 충분히 불활성화할 수 있는 공정에 의해 일반적으로 처리된다. 이러한 공정들은 살균/저온살균(pasteurization)일 수 있으며, 예를 들어, 고압증기 멸균(autoclaving), 여과(filtration), 방사선조사(irradiation) 및/또는 화학적 처리를 들 수 있다.
배양기(cultivation vessel) 또는 발효조(fermenter)는 초기에 존재하는 미생물의 충분한 부분을 제거할 수 있는 방법에 의해 준비되어야하고, 그 다음 발효 배지를 채운다. 본 발명의 공정에서 사용되는 배양기는 그것이 목적으로 하는 온도를 유지할 수 있고, pH 또는 영양 변화도가 커지는 것을 방지하기 위하여 적절히 젓는 상태를 유지할 수 있는 한, 매우 간단할 수 있다. 그것은 이상적으로 약간의 과압(overpressure)을 억제할 수 있다.
프로피오니박테륨의 접종(Inoculation with Propionibacterium )
프로피오니박테륨 접종물은 최종 종균 볼륨(volume) 또는 사용된 공정에 따라 하나 또는 그 이상의 단계로 이루어질 수 있다. 상기 접종물은 프로피오니박테륨의 성장을 돕는 배지에서 준비될 수 있다. 상기 접종물은 바람직한 온도로 바람직한 시간동안 배양되고 그 후 발효 배지에 접종하는데 이용될 수 있다. 접종물의 후속 단계 또는 발효 단계를 위한 접종 볼륨은 1 내지 20% 범위일 수 있다.
통기없는 발효(Fermentation without aeration)
발효 브로스는 처음에 최적의 성장 또는 산물 생산을 위한 목표 온도에서 통기없이 유지될 수 있다. 상기 온도는 25°C 내지 40°C 범위일 수 있고, 바람직하게 35°C일 수 있다. 만약 당류가 발효 배지에 존재한다면 상기 pH 값은 목표값에서 유지되어야 하며, 이는 5.5 내지 8.0의 범위일 수 있으며, 바람직하게 6.5일 수 있다. 상기 pH 값은 H2SO4, HCl, NaOH, NH4OH, 등과 같은 몇몇의 다양한 산/염기들에 의해 유지될 수 있다. 상기 생물공정들은 통기가 없는 채로 수행될 수 있으며 또는 CO2 및/또는 N2 스파징(sparging) 및/또는 과압(overpressure) 하에서 유지될 수 있다. CO2 과압 하에서의 배양이 선호된다.
발효 배지의 교반은 pH 변화도가 커지는 것을 방지하기 위하여 충분하게 이루어져야하며, 이들에 제한되지 않지만, 러쉬톤 터빈(Rushton turbines), 선박 프로펠러(marine propellers) 또는 내부 및/또는 외부 재순환 펌프(recirculation pump)들로 수행될 수 있다.
유산소 조건으로 전환(Switch to aerobic conditions)
프로피오니박테륨이 소비하는 영양성분들이 소진된 후에 상기 배양은 유산소 조건으로 전환될 수 있다. 공기는 배양기 안으로 투입될 수 있으며 이하에서 기술할 효모의 성장에 충분해야한다. 통기율(aeration rate)은 또한 효모가 프로피오니박테륨에 의해 생산된 유기산을 대사시키는 정도에 영향을 준다.
이 때 브로스의 특성에 영향을 미치거나(즉, 거품억제), 프로피오니박테륨에 의해 생산된 산물의 형성에 영향을 미치거나(즉, 5,6-다이메틸벤즈이미다졸), 또는 효모의 성장 또는 산물 생성에 영향을 미치는(질소원, 전구체 등), 추가 보충물들을 투입할 수 있다.
배양이 유산소 조건으로 전환된 후에 상기 pH는 다시 목표 수준에서 유지되어야 한다. 상기 pH값은 효모가 잘 성장할 수 있도록 5.5 내지 8, 바람직하게 6.5의 범위를 가질 수 있다.
프로피오니박테륨 -내성 효모 세포의 접종(Inoculation of the propionibacterium-tolerant yeast cell)
내성 효모 세포의 접종물은 최종 종균 볼륨에 따라 하나 또는 그 이상의 단계를 포함할 수 있다. 효모 접종물은 효모의 성장을 돕는 배지에서 준비된다. 상기 접종물은 목표 시간 동안 바람직한 온도에서 배양된다. 통기 조건으로 전환된 이후에 효모 접종물은 배양된 프로피오니박테륨으로 발효 배지를 접종하는데 이용될 수 있다. 접종물의 후속 단계 또는 최종 단계를 위한 접종 볼륨은 이들에 제한되지 않지만 1 내지 20% 범위일 수 있다. 바람직하게 상기 효모 접종물은 최종 볼륨의 5%를 나타낸다.
미생물의 공-배양 결과에 의한 발효의 유지(Continuation of the fermentation by the resulting co-culture of microorganisms)
발효 브로스는 목표 온도에서 유지되고 pH값은 계속해서 적절한 산 또는 염기를 추가하여 목표 값에서 유지된다. 교반 및 통기는 유기산의 완전한 활용을 보장하기 위하여 필요한 수준에서 유지되어야 한다. 통기 및/또는 혼합 정도는 효모에 의한 유기산의 대사에 영향을 미친다.
또한 이 때, 브로스의 특성에 영향을 미치거나(즉, 거품억제), 프로피오니박테륨에 의해 생산된 산물의 형성에 영향을 미치거나 또는 효모의 성장 또는 산물 생산에 영향을 미치는 추가 보충물들이 투입될 수 있다. 발효 브로스 상청액의 COD 값 및 프로피오니박테륨 또는 효모 세포들에 의해 생산된 가치있는 산물의 수율은 브로스의 목표로하는 특성을 달성하기 위하여 모니터된다. 그러한 공-배양 과정을 이용하여 브로스 상청액의 COD 값을 20000 mg　O2/L 이하로 감소시킬 수 있으며, 바람직하게 15000 mg　O2/L이하로, 더 바람직하게 10000 mg　O2/L 이하로, 그리고 더욱 더 바람직하게 5000 mg　O2/L 이하로 감소시킬 수 있다. 만약 상기 선택된 높은 가치의 산물이 비타민 B12이면, 비타민 B12의 수율은 5 mg/L 이상, 바람직하게 10 mg/L 이상, 더욱 더 바람직하게 20 mg/L 이상 그리고 더욱더 바람직하게 100　mg/L 이상일 수 있다.
발효 브로스의 후속 공정(Downstream processing of the fermentation broth)
유기산들이 소비되고 상청액의 COD가 만족스러운 수준에 도달한 후에, 생물공정은 중단된다. 상기 브로스의 불수용성 성분들과 함께 혼합된 프로피오니박테륨/효모 바이오매스(biomass)는 원심분리, 여과 또는 다른 어떠한 방식이든지 적절한 방법에 의해서 상기 상청액으로부터 분리될 수 있다. 상기 상청액은 COD가 낮고, 수처리 시설에 배치될 경우 작은 부담을 주거나, 이상적인 경우에는 그것이 환경에 직접적으로 처리될 수 있을 정도로 COD가 낮다. 상기 바이오매스가 비타민 및 단백질, 특히 비타민 B12와 같은 가치있는 물질들로 농축된 경우, 이러한 물질들은 동물 사료 첨가제로 사용될 수 있다. 선택적으로, 상기 바이오매스는 귀중한 물질, 예를 들어 임의의 형태의 비타민 B12 (예. 시아노코발아민(cyanocobalamin) 또는 메틸코발아민(methylcobalamin))의 분리를 위한 출발 물질로 이용될 수 있다. 순도에 따라서, 비타민 B12 는 동물 사료 첨가제로 또는 인간이 섭취하는 의약품 또는 건강보조 식품으로 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 효모는 클루베로마이세스 ( Kluyveromyces ) 속 (예. K. 락티 스(K. lactis ); K. 막시아누스 (K. marxianus )), 바람직하게 K. 락티스 (K. lactis ), 및/또는 야로위아 ( Yarrowia ) 속, 바람직하게 Y. 리폴리티카 (Y. lipolytica ) 일 수 있다. 그러나, 상기 균주는 또한 데바리오마이세스 ( Debaryomyces ) 속 (예. 데바리오마이세스 한세니 ( Debaryomyces hansenii )), 칸디다( Candida ) 속 (예. 칸디다 베르사 티리스(Candida versatilis )), 크립토코쿠스( Cryptococcus ) 속, 로도토룰 라(Rhodotorula) 속, 피치아 ( Pichia ) 속, 트리코스포론 ( Trichosporon ) 속 (예. 트 리코스포론 바이겔리 ( Trichosporon beigelii )), 토루라스포라 ( Torulaspora ) 속, 이 사첸키아(Issatchenkia) 속 (예. 이사첸키아 오리엔탈리스 ( Issatchenkia orientalis)), 제오트리컴 ( Geotrichum ) 속, 사카로미세스 ( Saccharomyces ) 속, 또는 지고사카로미세스(Zygosaccharomyces) 속 일 수 있다. 이러한 세포들은 당업계에서 입수 가능하며, 기탁기관으로부터 입수할 수 있거나 식품으로부터 분리할 수 있다.
도 1은 유장에서 두 단계의 공정으로 프로피오니박테륨 속(Propionibacterium sp.)에 의한 락토스의 활용 및 아세트산, 프로피온산 및 비타민 B12의 생산을 보여준다. 이러한 방식으로 COD 값은 85000 mg　O2/L 에서 36000 mg　O2/L으로 감소될 수 있다. 75시간까지 발효는 통기(aeration)없이 수행되었으며, 75 시간 이후에 공기를 주입하였다.
도 2는 유장에서 두 단계 공정으로 프로피오니박테륨 속(Propionibacterium sp.)에 의한 락토스의 활용 및 아세트산 및 프로피온산 및 비타민 B12의 생산을 보여주며, 내성 DSM 28271 효모 배양물이 상기 단계에서 추가되었고 산소가 주입되었다. 이러한 방식으로 COD 값은 85000 mg　O2/L 에서 13000 mg　O2/L으로 감소될 수 있다. 75시간까지 발효가 통기없이 수행되었고 75시간 이후에 효모 및 공기가 투입되었다.
도 3은 본 발명에 따른, 내성 효모와 프로피오니박테륨 속의 공-배양 생물공정의 도식화된 설명을 보여준다.
도 4는 유장에서 두 단계 공정으로 프로피오니박테륨 속(Propionibacterium sp.)에 의한 락토스의 활용 및 아세트산 및 프로피온산 및 비타민 B12의 생산을 보여주며, 내성 K. lactis ABLMKL6 효모 배양물이 상기 단계에서 추가되었고 산소가 주입되었다. 이러한 방식으로 COD 값은 80000 mg　O2/L 에서 14500 mg　O2/L으로 감소될 수 있다. 112시간까지 발효를 통기없이 수행하였고 112시간 이후에 효모 및 공기가 주입되었다.
실시예
실시예 1- 프로피오니박테륨 -내성 효모 세포의 준비
칸디다 유틸리스 ( Candida utilis ) NRRL Y-7586 효모는 72시간 동안 효모 추출물 (20 g/L), 펩톤 (20 g/L) 및 덱스트로스 (10 g/L)로 이루어진 YEPD 배지에서 배양하였고, 0.1M 인산 완충액 (pH 7) 으로 2번 세척하였으며, 99.9% 사멸률을 얻기 위하여 적절한 양의 돌연변이 유발제(에틸 메탄술포네이트)에 노출시켰다. 어떠한 다른 적절한 균류 세포 또는 효모 세포든지 이용될 수 있다. 살아남은 세포들은 최소 억제 농도로 효모 추출물 (10 g/L) 및 아세트산 및 프로피온산을 포함하는 배지에서 배양되었다. 35℃에서 3일 동안 배양한 후에 이 브로스에서 얻은 앨리쿼트(aliquot)를 YEPD 배지에 옮겼고, 72시간 동안 성장하도록 두었으며 다른 돌연변이 유발 단계에 들어갔다. 살아남은 세포들은 효모 추출물 (10 g/L) 을 포함하고 아세트산 및 프로피온산의 농도가 증가된(이전 단계에 비해) 배지에서 그 다음 배양된다. 이 과정은 효모가 아세트산 및 프로피온산의 높은 농도에 내성을 가졌을 때까지 되풀이하여 반복하였다 (즉, 15 g/L의 농도에서 자랄 수 있고 아세트산 및 프로피온산을 소비할 수 있는 효모). 이러한 방법으로 C. utilis ABLMCU1 균주를 얻었다.
고농도의 아세트산 및 프로피온산에 내성을 가지는 C. utilis 균주(ABLMCU1)로, 이번에는 억제제로 프로피오니박테륨의 발효로부터 얻은 희석된 정지기 상청액을 사용하여, 유사한 돌연변이/선별 방법을 사용하였다. 더 구체적으로, C. utilis 는 이전에 유기산들에 대해 내성을 가지고, YEPD 배지에서 자라고, 에틸 메탄술포네이트에 노출되었으며 그 다음 배지에서 배양되어 선별된다. 여기서 배지는 유장에서 프로피오니박테륨 프루덴레이키 균주 ABLM1700 의 발효로 얻어지는 정지기 상청액(유장, 5 g/L 효모 추출물, 20 mg/L CoCl2, 35°C에서 96시간 동안 배양된 프로피오니박테륨 프루덴레이키, 배지 "As"로 이하에서 언급되는 상청액) 및 유기산들(즉, 아세트산(15 g/L), 프로피온산(15 g/L) 및 효모 추출물(10 g/L)에 내성을 갖는 효모 세포의 성장을 위한 배지(여기서 배지 "Bs"로 언급됨)의 혼합물이다. 이러한 배지는 As:Bs = 3:7의 비율로 혼합되었고, 여기서 상기 값은 ABLMCU1 효모 세포가 자랄 수 있었던 값이다. 72시간 후에 최종 C. utilis 배양의 앨리쿼트는 YEPD로 옮겼고, 성장시켰고, 다시 에틸 메탄술포네이트에 노출시켰으며, 그 후에 As:Bs를 더 높은 비율로 즉, 4:6으로 혼합된 As 및 Bs의 배지 혼합물에 옮겼다. 이 과정은 희석되지 않은 프로피오니박테륨 발효의 정지기 상청액(100% As)에 내성인 효모 콜로니가 얻어질때까지 반복하였다. 최종 효모 균주는 독일미생물자원센터(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ))에 2014년 1월 20일 기탁하였고 수납 번호(accession number) DSM 28271로 입수가능하다.
상기 기술된 과정으로 프로피오니박테륨-내성 C. utilits 균주를 얻었다. 그러나, 유사한 과정이 다른 프로피오니박테륨-내성 균주를, 예를 들어, 다른 효모 균주로부터 출발한, 성공적으로 생산하는데 이용되었다는 것을 반드시 알아야 한다. 예를 들어, 클루베로마이세스 락티스 ( Kluyveromyces lactis ) Y-17597 균주는 유사한 과정으로 처리되었고 그 결과 본 발명에 따른 프로피오니박테륨-내성 균류(fungal) 균주(K. lactis ABLMKL6) 를 얻었다. 따라서 상기 과정은 다른 효모 균주들에 적용가능하고 반복가능한 것으로 보였다.
실시예 2- " 프로피오니박테륨 배양의 정지기 상청액에서 자랄 수 있는 능력"을 확립하기 위한 테스트
다음의 방법은 균류 균주, 예를 들어, 효모 균주가 청구항 1에 따른, "프로피오니박테륨 배양의 정지기 상청액에서 자랄 수 있는" 것인지 여부를 결정하는데 유용하다.
스텝 1: 프로피오니박테륨 배양의 정지기 상청액을 수득하는 단계
첫 단계의 프로피오니박테륨 종균(seed culture)은 다음과 같은 배지 P1(표 1, 아래)으로 준비된다. 균주 수집(culture collection)으로 얻은, 100㎕의 프로피오니박테륨 원배양물(stock culture) (프로피오니박테륨 프루덴레이키 ATCC 6207)은 50 mL의 배지 P1으로 옮기고 통기없이, 흔들지 않고 35°C 에서 4일 동안 인큐베이션한다.
15 mL의 이 첫 단계의 종균은 그 다음 135 mL의 배지 P2(표 2, 아래)로 가득차 있는 150 mL 유리병으로 옮겨지고 두 번째 단계의 종균을 얻기 위하여 공기없이 흔들지 않고 35°C 에서 4일 동안 인큐베이션한다.
그렇게 얻어진 두 번째 단계의 100 mL의 종균은 그 다음 900 mL의 배지 P3 으로 가득찬 1L 워킹 볼륨(working volume) 교반 탱크 생물반응기로 접종하는데 이용한다. 배양 파라미터는 다음과 같다: 온도: 35 ± 0.5 oC, pH: 6.5 ± 0.1 (15% NaOH 또는 H2SO4으로 조절된), 교반: 100 ± 10 RPM, CO2로 스파징: 0.1 ± 0.05 vvm, NH4 + 농도: 400 ± 100 mg/L (15% (NH4)2SO4를 이용하여 12시간마다 조절된, pH 6.5). 상기 발효는 락토스의 농도가 1g/L 아래로 내려갈때까지 지속한다. 발효의 마지막에, 브로스 내의 아세트산과 프로피온산의 총 농도는 바람직하게 20 g/L 이상이다.
그렇게 얻어진 50 mL의 발효 브로스는 10000 g 에서 원심분리하고 상기 상청액은 에를렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크로 옮기고 20분간 121°C 에서 고압멸균시킨다. 상기 고압멸균된 배지는 "프로피오니박테륨 배양의 정지기 상청액"이다.
스텝 2: 프로피오니박테륨의 정지기 상청액에서 성장할 수 있는 능력을 테스트하는 단계
테스트되는 균류 세포의 접종물은 바람직하게 10 mL 의 Y1 배지(표 4)에 100㎕의 원배양물을 추가하여 준비된다. 상기 접종균은 35°C, 200 RPM로 72시간 동안 회전식 진동기(rotary shaker)에서 인큐베이션한다. 최종 배양균은 다음 단계에서 "균류 접종물(fungal inoculum)"로 이용된다.
상기 스텝 1에서 얻어진 정지기 상청액을 포함하는, 고압멸균된 에를렌마이어 플라스크는 2.5　mL의 균류 접종물로 접종하고, 35°C 에서 200 RPM의 회전식 진동기에서 인큐베이션한다. 상기 초기 pH 값은 pH 6.5로 맞춘다. 이것을 "시험 배양(test cultivation)"으로 간주한다.
균종의 성장은 배양 24시간이 경과한 후의 pH 변화를 측정하여 평가된다. 일 실시예에서, 만약 시험 배양에서 브로스의 pH 값이, 배양 시간 24시간이 경과한 후, 처음 pH (pH 6.5)에서 pH 8.0 또는 그 이상으로 증가하게 된다면, 시험 균류 세포는, 첨부된 청구항 1에 언급된 "프로피오니박테륨의 정지기 상청액에서 자랄 수 있는" 것으로 간주된다.
따라서, 만약 시험 배양에서 브로스의 pH 값이 배양시간 24시간이 경과한 후에 8.0 아래로 유지된다면, 시험 균류 세포는 프로피오니박테륨의 정지기 상청액에서 자랄 수 없는 것으로 간주될 수 있다.
프로피오니박테륨 배양의 정지기 상청액에서 자라는 것으로 주장된 균류 세포는 바람직하게 상기 시험에서 긍정적인 결과를 얻은 것이다.
실시예 2 b)- 대체 시험
대안으로, 균종의 성장은 배양 24시간이 경과된 후 OD 변화를 측정하여 평가될 수 있다.
만약 브로스의 광학밀도(620 nm에서 측정된)의 차이가 배양 후 24시간 안에 적어도 0.5까지 증가한다면, 시험 균류 세포는 첨부된 청구항 1에 언급된, 프로피오니박테륨 배양의 정지기 상청액에서 자랄 수 있는 것으로 간주될 수 있다. 대안으로, 만약 시험 배양에서 균류 세포의 최대 성장 속도(μmax) 가 0.02 h-1 또는 그 이상이라면, 시험 균류 세포는 첨부된 청구항 1에 언급된, 프로피오니박테륨 배양의 정지기 상청액에서 자랄 수 있는 것으로 간주된다.
따라서, 만약 브로스의 광학밀도(620 nm에서 측정된)의 차이가 접종 후에 24시간 안에 0.5 미만까지 증가한다면, 시험 균류 세포는 청구항 1에 언급된, 프로피오니박테륨 배양의 정지기 상청액에서 자랄 수 없는 것으로 간주된다. 대안으로, 만약 시험 배양에서 균류 세포의 최대 성장 속도(μmax) 가 0.02 h-1 미만 이라면, 첨부된 청구항 1에 언급된, 프로피오니박테륨 배양의 정지기 상청액에서 시험 균류 세포는 자랄 수 없는 것으로 간주된다.
따라서, 프로피오니박테륨 배양의 정지기 상청액에서 자라는 것으로 주장된 균류 세포는 상기 대체 시험들 중 하나에서 긍정적인 결과를 얻은 것이다.
프로피오니박테륨을 위한 합성배지 P1
조성 함량
트립티케이스 (BBL) 10 g
효모 추출물 (Difco) 10 g
소듐 DL-락테이트(Sigma) 10 g
KH2PO4 (Sigma) 2.5 g
MnSO4 (Sigma) 0.05 g
증류수 up to 1000 mL
pH 는 NaOH/HCl로 7.0 로 조절
121°C, 1.2 bar 에서 20분간 멸균
프로피오니박테륨을 위한 합성배지 P2
조성 함량
글루코스 (Sigma) 40 g
소듐 DL-락테이트 (Sigma) 40 g
효모 추출물 (Biolife) 10 g
CaCO3 (Sigma) 10 g
CoCl2 (Sigma) 10 mg
칼슘 D-판토테네이트* (Sigma) 20 mg
증류수 up to 1000 mL
pH 는 NaOH/HCl로 7.0 로 조절
121°C, 1.2 bar 에서 20분간 고압멸균
*멸균 후 추가
프로피오니박테륨을 위한 배지 P3
조성 함량
감미 유장 파우더** 60 g/L
효모 추출물 (Biolife) 5 g/L
칼슘 D-판토테네이트* (Sigma) 40 mg/L
121°C, 1.2 bar 에서 20분간 고압멸균
*멸균 후 추가
** 다음의 사양을 갖는 식품-등급 감미 유청 파우더: 락토스 최소(Min.) 63%wt., 단백질 최소 10%wt., 수분 최대. 5%가 적절하고, Hoogwegt International (Netherlands), Lactalis Ingredients (France), James Farrell & Co (USA).와 같은 다양한 공급처로부터 얻을 수 있다.
효모를 위한 Y1 배지
조성 함량
박토 펩톤 (Biolife) 20 g
효모 추출물 (Biolife) 10 g
글루코스 (Sigma) 20 g
증류수 up to 1000 mL
121°C, 1.2 bar 에서 20분간 고압멸균
실시예 3- 프로피오니박테륨 및 효모의 효과적인 공-배양
i) 프로피오니박테륨 접종물 준비
프로피오니박테륨의 접종물은 두 단계로 준비하였다. 프로피오니박테륨 프루 덴레이키 ABLM2475 (비타민 B12를 생산하는 균주라면 어떤 것이든, 예를 들어 프로 피오니박테륨 프루덴레이키 ATCC6207와 같은 것이라도 이용될 수 있다)의 스톡(stock) 현탁액 0.5 mL를 50 mL의 최초 영양 배지(vegetative medium) (효모 추출물 20 g/L 및 DL-락테이트 20 g/L) 에 접종하고 35°C에서 4일 동안 인큐베이션하였다. 최초 영양 단계는 그 다음, 400 mL의 두 번째 단계 영양 배지(글루코스 40 g/L, 효모 추출물 40 g/L, DL-락테이트 40 g/L, 탄산칼슘 10 g/L, 염화 코발트 20 mg/L, 판토테네이트 10 mg/L)로 옮겨졌고, 수산화나트륨으로 pH 값을 지속적으로 중화하면서 4일 동안 배양하였다. 전체 두 번째 단계는 그 다음 최종 생물반응기로 옮겨졌다.
ii) 내성 효모 접종물 준비
내성 효모 접종물은 또한 두 단계로 준비하였다. 250 mL 에를렌마이어 플라스크 내에서 효모 DSM 28271의 스톡 현탁액 0.5 mL를 최초 영양 배지(효모 추출물 40 g/L, 펩톤 40 g/L 및 글루코스 10 g/L) 50　mL에 접종하였고, 그리고 220 RPM의 회전식 진동기로 35°C에서 2일간 인큐베이션하였다. 상기 최초 영양 단계는 그 다음 1000 mL 에를렌마이어 플라스크 내의 200 mL의 같은 배지로 옮겼다. 그리고 220 RPM의 회전식 진동기로 35°C에서 2일 동안 배양하였다.
iii) 발효
7 L 워킹 볼륨 생물 반응기는 효모 추출물(5 g/L) 및 염화 코발트(20 mg/L)로 보충된 산성 유장(COD는 80.000　mg　O2/L) 4 L 로 채웠다. 그리고 121°C에서 1시간 동안 멸균하였다. 35°C로 식힌 후에 판토테네이트(10 mg/L)를 추가하였고 프로피오니박테륨의 종균으로 생물반응기를 접종하였다. 배양온도는 35°C 였고, 교반속도는 100 RPM 이었다. 생물반응기의 내부는 CO2 가스 (10 mL/min)로 스파지하였고 pH는 6.5로 유지하였다 (NaOH를 이용하여). 90 시간 후에 락테이트 및 락토스는 고갈되고 대략 8 및 15 g/L 의 아세트산 및 프로피온산이 생산되었다. 이때, 20 mg/L 5,6-다이메틸벤즈이미다졸이 추가되고, 교반속도는 500 RPM으로 증가되고, 1 vvm 로 공기를 주입하고 생물반응기는 5% 의 내성 효모로 접종되었다. pH 값은 6.5로 유지하였다 (H2SO4를 이용하여). 48시간 후에 모든 유기산들이 효모에 의해 소비되고 상기 발효는 중단되었다. 상기 과정은 15 mg/L의 비타민 B12를 생산하였다. 프로피오니박테륨과 효모로 이루어진 바이오매스는 원심분리로 제거되었고 최종 상청액의 COD값은 12.000 mg　O2/L로, 85% 감소되었다.
예시적인 공정의 도식화된 흐름도는 도 3에서 보여진다.
실시예 4- 프로피오니박테륨과 효모(K. lactis ABLMKL6)의 효과적인 공-배양
i) 프로피오니박테륨 접종물 준비
프로피오니박테륨의 접종물을 두 단계로 준비하였다. 프로피오니박테륨 프루덴레이키 ABLM2475 (프로피오니박테륨 프루덴레이키 ATCC6207와 같이, 비타민 B12를 생산할 수 있는 균주라면 어떤 것이든지 사용될 수 있다) 스톡 현탁액 0.5 mL를 50 mL의 최초 영양 배지(효모 추출물 20 g/L 및 DL-락테이트 20 g/L)에 접종하였고 35°C에서 4일 동안 인큐베이션하였다. 최초 영양 단계는 그 다음, 400 mL의 두 번째 단계 영양 배지 (글루코스 40 g/L, 효모 추출물 40 g/L, DL-락테이트 40 g/L, 탄산칼슘 10 g/L, 염화 코발트 20 mg/L, 판토테네이트 10 mg/L) 로 옮겨졌고, 수산화나트륨으로 pH 값을 지속적으로 중화하면서 4일 동안 배양하였다. 전체 두 번째 단계는 그 다음 최종 생물반응기로 옮겨졌다.
ii) 내성 효모 접종물 준비
내성 효모 접종물은 또한 두 단계로 준비하였다. 250 mL 에를렌마이어 플라스크 내에서 내성 효모 K. lactis ABLMKL6 의 스톡 현탁액 0.5 mL를 50　mL의 최초 영양 배지(효모 추출물 40 g/L, 펩톤 40 g/L 및 글루코스 10 g/L) 50　mL에 접종하였고, 220 RPM 회전식 진동기로 35°C에서 2일간 인큐베이션하였다. 최초 영양 단계는 그 다음 1000 mL의 에를렌마이어 플라스크 내의 200 mL 의 같은 배지로 옮겼다. 그리고 220 RPM 회전식 진동기로 35°C에서 2일간 배양하였다.
iii) 발효
7 L 워킹 볼륨 생물 반응기는 효모 추출물(5 g/L) 및 염화 코발트(20 mg/L)로 보충된 산성 유장(COD는 80.000　mg　O2/L)4 L 로 채웠다. 그리고 121°C에서 1시간 동안 멸균하였다. 35°C로 식힌 후에 판토테네이트(10 mg/L)를 추가하였고 프로피오니박테륨의 종균으로 생물반응기를 접종하였다. 배양온도는 35°C 였고, 교반속도는 100 RPM 이었다. 생물반응기의 내부는 CO2 가스 (10 mL/min)로 스파지하였고 pH는 6.5로 유지하였다 (NaOH를 이용하여). 112시간 후에 락테이트 및 락토스는 고갈되고 대략 4 및 14 g/L의 아세트산 및 프로피온산이 생산되었다. 이때, 20 mg/L 5,6-다이메틸벤즈이미다졸이 추가되고, 교반속도는 500 RPM으로 증가되고, 1 vvm 로 공기를 주입하고 생물반응기는 5% 의 내성 효모로 접종되었다. pH 값은 6.5로 유지하였다 (H2SO4를 이용하여). 72시간 후에 모든 유기산들이 효모에 의해 소비되고 상기 발효는 중단되었다. 상기 과정은 16 mg/L의 비타민 B12를 생산하였다. 프로피오니박테륨과 효모로 이루어진 바이오매스는 원심분리로 제거되었고 최종 상청액의 COD값은 14.500 mg　O2/L로 81 % 감소되었다.
독일생물자원센터 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ)) DSM28271 20140120

Claims (15)

  1. 생명공학적 산물을 생산하기 위한 공정으로,
    상기 공정은 배양 배지에서, 프로피오니박테륨 및 효모 세포의 공-배양을 포함하며, 여기서 상기 효모 세포는 프로피오니박테륨 배양의 정지기(stationary-phase) 상청액에서 성장할 수 있는 세포이며,
    여기서 상기 프로피오니박테륨 배양의 정지기 상청액은 균주 수집으로 얻은 100 μL의 프로피오니박테륨 프루덴레이키 ATCC 6207 원배양물을 50 mL의 배지 P1으로 옮기고 통기없이 흔들지 않고 35℃에서 4일 동안 인큐베이션하여 첫 단계의 프로피오니박테륨 종균(seed culture)을 준비하고; 뒤이어 이 첫 단계의 종균(seed culture) 15 mL를 135 mL의 배지 P2로 채워진 150 mL 유리병으로 옮기고 두 번째 단계의 종균을 얻기 위하여 통기없이 흔들지 않고 35℃ 에서 4일 동안 인큐베이션하고; 뒤이어, 상기 두 번째 단계의 종균(seed culture) 100 mL를 900 mL의 배지 P3를 충전한 1 L의 워킹 볼륨의 교반 탱크 생물 반응기에 접종하여,
    온도:35±0.5℃, 15% NaOH 또는 H2SO4로 조절된 pH: 6.5 ± 0.1, 교반:100±10 RPM, CO2로 스파징:0.1±0.05 vvm, NH4+ 농도:400±100mg/L, 12 시간마다 pH6.5의 15%(NH4)2SO4를 이용하여 조절되는, 배양 파라미터로 배양하고
    상기 발효는 락토스의 농도가 1 g/L미만이 될 때까지 수행되고 발효 종료 시에 브로스 중의 아세트산과 프로피온산과의 합계 농도는 20 g/L 이상이며; 이어서 그렇게 얻어진 발효 브로스 50 mL를 10000 g에서 원심분리하고 상청액을 에를렌마이어 플라스크로 옮겨, 121℃에서 20분간 고압멸균하고 그 고압멸균된 배지가 상기 프로피오니박테륨 배양의 정지기 상청액인 공정.
  2. 제1항에 있어서, 상기 효모 세포는 클루베로마이세스 속, 야로위아 속, 데바리오마이세스 속, 칸디다 속, 크립토코쿠스 속, 로도토룰라 속, 피치아 속, 트리코스포론 속, 토루라스포라 속, 이사첸키아 속 또는 제오트리컴 속인 공정.
  3. 제1항에 있어서, 상기 효모 세포는 클루베로마이세스 속 또는 칸디다 속인 공정.
  4. 제1항에 있어서, 상기 효모 세포는 클루베로마이세스 락티스 종 또는 칸디다 유틸리스 종인 공정.
  5. 제1항에 있어서, 상기 효모 세포는 클루베로마이세스 락티스 종인 공정.
  6. 제1항에 있어서, 상기 효모 세포는 2014년 1월 20일에 독일, 브라운슈바이크의 독일미생물자원센터(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ))에, 수납 번호(accession number) DSM 28271로 입수가능하게 기탁된 효모 세포인 공정.
  7. 제1항에 있어서, 상기 생명공학적 산물은 상기 프로피오니박테륨에 의해 생산된 것인 공정.
  8. 제1항에 있어서, 여기서 상기 생명공학적 산물은 비타민 B12인 공정.
  9. 제1항에 있어서, 여기서 상기 공정은 유산소 단계가 뒤따르는 통기가 없는 단계를 포함하는 공정.
  10. 제9항에 있어서, 여기서 상기 프로피오니박테륨의 적어도 90%의 성장[% 그램 건조 중량]이 통기가 없는 단계 동안 일어나는 공정.
  11. 제9항에 있어서, 여기서 상기 효모 세포의 적어도 90%의 성장[% 그램 건조 중량]이 유산소 단계 동안 일어나는 공정.
  12. 제1항에 있어서, 여기서 상기 배지의 화학적 산소 요구량(COD)은 배양 배지 초기 COD의 25% 이하 수준으로 감소되는 공정.
  13. 제1항에 있어서, 여기서 상기 배양 배지는 유장을 포함하는 것인 공정.
  14. 1) 출발 효모 균주를 얻는 단계;
    2) 출발 효모 균주를 돌연변이 유발제 또는 돌연변이 조건에 노출시키는 단계;
    3) 첫번째 농도의 아세트산 또는 프로피온산 존재 하에서 2) 단계의 노출된 효모 균주를 배양하는 단계;
    4) 선택적으로 돌연변이 유발제 또는 돌연변이 조건에 상기 3) 단계의 배양된 효모 균주를 노출시키고, 상기 선택적으로 노출된 효모 균주를 두 번째 농도의 아세트산 또는 프로피온산 존재 하에서 배양하는 단계로, 여기서 각각 상기 두 번째 농도는 상기 첫 번째 농도보다 더 크며;
    5) 상기 3) 또는 4) 단계의 배양된 효모 균주는 돌연변이 유발제 또는 돌연변이 조건에 노출시키는 단계;
    6) 프로피오니박테륨 배양의 정지기 단계 상청액을 포함하는 배지에서 상기 5) 단계의 노출된 효모 균주를 배양하는 단계; 및
    7) 증가된 농도의 프로피오니박테륨 배양의 정지기 상청액으로 6) 단계를 선택적으로 반복하는 단계를 포함하며,
    8) 그렇게하여 프로피오니박테륨 배양의 정지기 상청액에서 성장할 수 있는 효모 세포를 수득하는 단계를 포함하는, 프로피오니박테륨-내성 효모 균주를 제조하는 방법.
  15. 2014년 1월 20일에 독일, 브라운슈바이크의 독일미생물자원센터(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ))에, 수납 번호(accession number) DSM 28271로 입수가능하게 기탁된 효모 세포.
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