KR102253478B1

KR102253478B1 - 바이구아나이드 유도체를 유효성분으로 포함하는 교모세포종 예방 또는 치료용 의약 조성물

Info

Publication number: KR102253478B1
Application number: KR1020150066845A
Authority: KR
Inventors: 강석구; 이지현; 장종희; 정재호; 최준정; 김성욱; 유상희; 김홍우; 이순임
Original assignee: 이뮤노메트테라퓨틱스 인코포레이티드
Priority date: 2015-05-13
Filing date: 2015-05-13
Publication date: 2021-05-20
Also published as: US9539238B2; KR20160134932A; US20160331724A1

Abstract

본 발명은 바이구아나이드 유도체를 유효성분으로 포함하는 교모세포종 예방 또는 치료용 의약 조성물을 제공한다. 화학식 1의 화합물 및 그의 약제학적으로 허용되는 염은 교모세포종의 예방 또는 치료를 위해 사용될 수 있다. 또한, 화학식 1의 화합물 및 테모졸로마이드의 병용 치료는 화학식 1의 화합물 단독 또는 테모졸로마이드 단독의 투여와 비교하여 우수한 효과를 제공할 수 있다.

Description

바이구아나이드 유도체를 유효성분으로 포함하는 교모세포종 예방 또는 치료용 의약 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING A BIGUANIDE DERIVATIVE AS AN ACTIVE INGREDIENT FOR PREVENTING OR TREATING GLIOBLASTOMA}

본 발명은 교모세포종 예방 또는 치료용 바이구아나이드 유도체의 용도에 관한 것이다.

교모세포종 (glioblastoma; GBM)은 가장 치명적인 뇌암으로, 최선의 치료에도 불구하고 한정적인 생존율을 보인다. 표준적인 1차 치료 방법은 수술과, 이어서 동시에 행해지는 테모졸로마이드 (temozolomide; TMZ) 방사선치료(Radiation therapy; RT) 병합요법이다. 중추신경계 암에 관한 NCCN 지침에 따르면, 단지 환자의 1/3 만이 1 년 동안 생존하였으며, 5% 미만만이 5년이상 생존 할 수 있었다. 어린 연령에서 좋은 예후를 보이는 GBM 환자들에게는 알킬화 (메틸화)제인 TMZ가 현재 수술 후의 RT와 더불어 표준 치료법이다 (Network NCC. NCCN Guidelines Version 2.2014 Updates Central Nervous System Cancers.2014;2.2014:http://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/cns.pdf, 2014.). 그러나, 환자들은 결국 질환의 재발로 인하여 사망하게 된다.

암은 세포 집단으로부터 발병되고 지속된다는 증거가 점점 커지며 보고되고 있다. 적은 양의 암줄기세포 (cancer stem cell;CSC)가 치료에서 살아나도 결국 질병이 재발할 수 있기 때문에, CSC의 존재는 치료에 최초 반응을 보인 환자에게도, 이 독특한 군(population)의 완전한 제거가 필요할 것이라는 임상적 암시를 제기한다. 축적된 증거는 CSC 군이 비-CSC 군보다 통상의 암 치료에 더 높은 저항을 보인다고 기재한다. 예를 들어, CD133 양성 GBM CSC는 항암화학요법과 방사선요법에 대해 강한 종양의 저항을 보였다 (Bao S, Wu Q, McLendon RE, et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response.Nature.2006; 444 (7120):756-760.). 결과적으로, CSCs의 표적화와 이 세포들이 잠재적으로 서식할 미세환경의 변화를 목적으로 하여 신규한 치료 체계가 개발되었다. 마커의 표면을 표적으로 하여, 신호의 연쇄반응과 미세환경이 적용되고 검사가 이루어졌다 (Chen K, Huang YH, Chen JL. Understanding and targeting cancer stem cells: therapeutic implications and challenges. Acta Pharmacologica Sinica . 2013; 34 (6):732-740.).

연구는, 바이구아나이드 유도체이며 제2형 당뇨 환자의 혈당 농도를 감소시키는데 가장 널리 사용되고 있는 경구형 치료제인 메트포르민 (N',N'-dimethyl biguanide)이 암 발병률을 감소시키고 암 환자의 제2형 당뇨 발병률을 향상시킨다는 것을 공개하고 있으므로, 바이구아나이드의 항종양성 효과를 나타내는 실험적 증거가 축적되었고, 1세대 메트포르민의 임상 실험이 진행될 것으로 예상된다 (Cufi S, Vazquez-Martin A, Oliveras-Ferraros C, Martin-Castillo B, Joven J, Menendez JA. Metformin against TGF beta-induced epithelial-to-mesenchymal transition (EMT): from cancer stem cells to aging-associated fibrosis. Cell Cycle. 2010; 9 (22):4461-4468.). 형질전환된 세포나 형질전환의 가능성을 가진 세포에 대한 바이구아나이드의 직접적 영향은 치료제로부터 유도된 강한 스트레스에 대한 항상 반응(homeostatic response)의 결과나 세포 내에서 에너지 보존 상태나 AMPK 활성화로 이어지는, 에너지 고갈에 의한 산화적 인산화 (OXPHOS)의 저해에서 기인할 수 있다. 그러나 아직 연구는 진행 중이다. 주목할 만한 것은, Hirsch et al. 은 덩어리의 생성과 자가 생성 종양을 발생시키는 유방암세포가 메트포르민에 대해 악화된 감도를 보인다는 것을 기재했다는 것이다 (Hirsch HA et al., Metformin selectively targets cancer stem cells, and acts together with chemotherapy to block tumor growth and prolong remission. Cancer Research.2009;69(19):7507-7511). 이 그룹은 TGF-β가 유도된 EMT 가 메트포르민의 항암 줄기 세포의 작용을 기반으로 하는 공통의 분자적 기작을 나타낼 수 있다고 제안한다 (Cufi S et al., Metformin against TGFbeta-induced epithelial-to-mesenchymal transition (EMT): from cancer stem cells to aging-associated fibrosis. Cell Cycle.2010; 9 (22):4461-4468.). 그러나, 이 개념을 뒷받침하는 연구는 아직 한계가 있다.

현재의 연구에서, 교모세포종 치료에 있어서 신규한 약물 단독 또는 이를 공지의 치료제인 TMZ와 병용하였을 때의 가능성을 평가하기 위하여, 줄기세포의 특성이나 동소 이종 이식(orthotopic xenograft) 동물의 생존에 대한 HL156A 단독 또는 이를 종래의 치료제인 TMZ와 병용하였을 때의 효과가 평가되었다.

본 발명은 교모세포종 예방 또는 치료용 바이구아나이드 유도체와 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 용도를 제공한다.

본 발명은 교모세포종 예방 또는 치료용인 하기 화학식 1의 바이구아나이드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 신규한 용도; 화학식 1의 바이구아나이드 유도체와 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효 성분으로 포함하는 교모세포종 예방 또는 치료용 약학적 조성물; 화학식 1의 바이구아나이드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 유효한 양을 투여하는 단계를 포함하는, 교모세포종 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

[화학식 1]

화학식 1의 화합물의 화학명은 N-(N-(4-(트리플루오로메톡시)페닐)카바마이미도일)피롤리딘-1-카복시마이다마이드이다. 본 발명에서 화합물을 HL156A이라고도 부른다.

하기의 예에서 보여진 것과 같이, 화학식 1에 나타난 화합물이나 이의 약학적으로 허용된 염은 교모세포종 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

이에 따라, 본 발명은 화학식 1의 화합물을 포함하는 교모세포종 예방 또는 치료용 약학적 조성물; 교모세포종 예방 또는 치료용 약물을 제조할 수 있는 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 용도; 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 약학적으로 유효한 양을 투여하는 단계를 포함하는, 교모세포종 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

일 실시예에 따르면, 상기의 약학적 조성물은 테모졸로마이드(TMZ)와의 병용 치료에 사용된다. 하기의 실시예에서, HL156A와 테모졸로마이드(TMZ)의 병용 치료는 동소 이종이식 생쥐에서 증가된 생존력을 보였다.

이에 따라, 본 발명은 화학식 1의 화합물 및 테모졸로마이드(TMZ)를 유효성분으로 포함하는 교모세포종 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 투여방식에 따라 적절한 제형으로 제형화될 수 있다.

본 발명은 화학식 1의 화합물 및 테모졸로마이드(TMZ)를 유효성분으로 포함하는 제형을 제공한다.

[화학식 1]

한편, 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염은 유기산이나 무기산을 이용하여 제조한 산 부가 염일 수 있다. 예를 들어, 유기산은 포름산, 아세트산, 프로피온산, 락트산, 뷰티르산, 이소부티르산, 트리플루오로아세트산, 말산, 말레산, 말론산, 푸마르산, 숙신산, 숙신모노아미드산, 글루탐산, 타르타르산, 옥살산, 구연산, 글리콜산, 글루쿠론산, 아스코르브산, 벤조산, 프탈산, 살리실산, 안트라닐산, 디클로로 아세트산, 아미노옥시아세트산, 벤젠술폰산, 4-톨루엔설폰산, 메탄술폰산을 포함하며, 무기산은, 그 예로, 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 질산, 탄산, 붕산일 수 있다.

예를 들어, 상기에서 기술한 산 부가 염은 1) 직접 화학식 1의 화합물과 산을 혼합하는 것; 2) 화합물 중 하나와 산을 용매나 수화용매에서 용해시켜 그 용액을 혼합하는 것; 또는 3) 용매나 수화용매에서 화학식 1의 화합물과 산을 혼합하는 것을 포함하는, 염을 제조하는 전형적인 방법을 통해 제조한다.

구체적인 일 실시예에 따르면, 화학식 1의 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염은 포름산, 아세트산, 프로피온산, 락트산, 뷰티르산, 이소부티르산, 트리플루오로아세트산, 말산, 말레산, 말론산, 푸마르산, 숙신산, 숙신모노아미드산, 글루탐산, 타르타르산, 옥살산, 구연산, 글리콜산, 글루쿠론산, 아스코르브산, 벤조산, 프탈산, 살리실산, 안트라닐산, 벤젠술폰산, p-톨루엔설폰산, 메탄술폰산, 디클로로아세트산, 아미노옥시아세트산, 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 질산, 탄산, 붕산으로 이루어진 군에서 선택된 산의 염일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 유효 성분과 더불어 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 본 명세서에서 명시되었듯, 용어 "약학적으로 허용 가능한 담체"는 투여를 위해 약학적으로 유효한 화합물로 제형화되는데 유용한 공지의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 의미하며, 이는 실질적으로 무독성이나 무감도의 환경에서 사용된다.

부형제의 정확한 비율은 표준적 약학 적용뿐 아니라 용해도, 화학적 특성, 유효 성분의 선택적 투여 경로에 따라 결정될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피막제, 팽창제, 윤활제, 광택제, 착향제 등과 같은 적절하고 생리학적으로 유용 가능한 보조제를 사용하여 목적하는 투여 방법에 적절한 제형으로 제형화될 수 있다.

약학적 조성물은 정제, 캡슐, 알약, 과립제, 산제, 주사제 또는 액제의 형태로 제형화될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

약학적 조성물의 제형과 약학적으로 허용된 담체는 하기에 명시된 참고문헌에 따라 당해 분야의 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다: (Urquhart et al., Lancet, 16:367, 1980); (Lieberman et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS-DISPERSE SYSTEMS, 2nd ed., vol. 3, 1998); (Ansel et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS & DRUG DELIVERY SYSTEMS, 7th ed., 2000); (Martindale, THE EXTRA PHARMACOPEIA, 31st ed.); (Remington's PHARMACEUTICAL SCIENCES, 16th-20th editions); (THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, Goodman and Gilman, eds., 9th ed., 1996); (Wilson and Gisvolds' TEXTBOOK OF ORGANIC MEDICINAL AND PHARMACEUTICAL CHEMISTRY, Delgado and Remers, eds., 10th ed., 1998). 또한, 약학적 조성물의 개념은 하기에 명시된 참고문헌에 따라 설명될 수 있다 (Platt, Clinics Laboratory Medicine. 7:289-99, 1987); (Aulton, PHARMACEUTICS: THE SCIENCE OF DOSAGE FORM DESIGN, Churchill Livingstone, NY, 1988); (EXTEMPORANEOUS ORAL LIQUID DOSAGE PREPARATIONS, CSHP, 1998); (Drug Dosage, The Journal of the Kansas Medical Society. 70(1): 30-32, 1969).

한편, 본 발명의 용어 "치료"는 증상을 완화하고, 일시적으로 또는 영구적으로 증상의 원인을 제거하는 것, 증상의 발병이나 상기 상태, 장애, 질환의 진행을 예방하거나 차단하는 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 유효한 양의 약학적 조성물의 유효성분은 질병을 치료하는데 요구되는 양을 의미한다. 그러므로, 유효성분의 유효한 양은 질병의 종류와 정도, 조성물에 포함된 유효 성분과 기타 성분의 종류와 내용, 제형의 종류, 환자의 연령, 무게, 일반적인 의학적 상태, 성별, 식습관, 투여 기간과 경로, 조성물의 분비율, 치료 시간, 병용되는 약물의 수와 같은 다양한 요인에 따라 적절하게 조절될 수 있다. 성인의 경우, 예를 들어, 1일에 1회에서 수 회 투여 시, 화학식 1의 화합물이 총 용량 1 내지 3,000 mg/kg 만큼 투여될 수 있다.

화학식 1의 화합물과 이의 약학적으로 허용된 염은 교모세포종 예방과 치료를 위해 사용된다.

도 1a는 HL156A(N-(N-(4-(트리플루오로메톡시)페닐)카바마이미도일)피롤리딘-1-카복시마이다마이드) 및 메트포르민의 구조이다. 상기 화합물은 조성안에 메트포르민의 중심부인 바이구아나이드를 포함한다.
도 1b는 줄기 세포의 생존력에 대한 HL156A, TMZ, 및 병용 치료의 효과를 나타낸 그림이다. 치료는 세포 생존력에 최소한의 효과를 나타내었다.
도 1c는 AMPK와 mTOR 경로에 대한 약물의 효과를 나타낸 그림이다. 비록 바이구아나이드가 AMPK의 효능제로서 작용하여 결과적으로 mTOR 억제가 뒤따른다고 알려져있지만, 이는 GSC11 및 X01 세포에서는 관찰되지 않았다 (* : 통계학적으로 유의함, ns : 통계학적으로 유의하지 않음).
도 2는 교모세포종 암줄기세포의 줄기세포성(stemness) 및 신경 및 교세포 분화(neuroglial differentiation) 에 대한 HL156A 및 TMZ의 효과를 나타낸 그림이다.
도 2a 및 2b는 신경구(neurosphere) 형성 분석에 의해 줄기세포성에 대한 약물의 효과를 평가한 그림이다. HL156A 및 HL156A와 TMZ 병용 치료로 인해 신경구 형성의 수가 감소되었다.
도 2c는 CD133, Sox와 같은 줄기세포성을 대표하는 마커가 병용 치료군에서 적게 발현된 것을 나타낸 그림이다.
도 2d는 치료가 GSC11에서의 신경교의 분화에 영향을 미치지 않은 것을 나타낸 그림이다. (* : 통계학적으로 유의함)
도 3은 GSC11의 침윤 특성에 대한 HL156A, TMZ 및 병용 치료의 효과를 나타낸 그림이다.
도 3a 및 3b는 HL156A 및 HL156A와 TMZ의 병용 치료는 3D 콜라겐 매트릭스 침윤 분석에 대한 감소된 침윤성을 나타낸 그림이다. (도 3a: 이식 세포와 약물 동시, 도 3b: 사전 이식, 12시간 후 약물 치료)
도 3c는 EMT 경로와 관련된 마커를 HL156A 치료에서 변경한 것을 나타낸 그림이다. 각각 취득한 CSCs에서의 EMT 및 TGF-β 시그널링과 관련된 마커의 발현은 시료의 대부분이 이러한 경로가 포함하고 있는 유전자를 발현한다는 것을 밝혀냈다.
도 4a는 F¹⁸-FDG 흡수가 HL156A, TMZ 및 병용 치료에서 현저하게 감소함을 나타낸 그림이다. FDG 흡수의 감소는 병용 치료군에서 가장 두드러졌고, 이는 낮은 신진 대사 상태를 암시하는 것이다(ns: 통계학적 유의하지 않음).
도 4b는 고효율(High throughput) 유전자 발현의 마이크로어레이를 나타낸 그림이다. 유전자 발현 마이크로어레이 데이터는 유전자 세트의 농축 분석 대상이다. 유전자 세트는 병용 치료군에서 차등적으로 발현되었다.
도 5는 이종 이식된 종양의 증식과 동물의 생존에 대한 HL156A 및 HL156A와 TMZ 병용 치료의 효과를 나타낸 그림이다.
도 5a는 HL156A, TMZ 및 HL156A와 TMZ 병용의 종양을 염색하고 관찰한 그림이다. HL156A 및 병용 치료한 동물은 대조군보다 경계가 덜 불규칙 (less irregular margin)함을 보였다. 특히, 병용 치료군은 종양의 부피 감소를 나타내었다.
도 5b는 병용 치료군의 생존이 급격히 증가함을 나타낸 그림이다. (p=0.0000).

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 이를 밝힌 방법은 이하의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이에 한정되지 않고, 다른 다양한 실시예도 실시할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 또한, 이하의 실시예는 본 발명을 완성시키기 위해 완전히 당업자에게 본 발명의 범위를 보이기 위한 것으로, 본 발명은 특허청구범위에 의해서만 정의된다.

시험 재료 및 방법

세포주

미국 휴스턴의 엠디엔더슨 암센터에서 신경 교종 환자로부터 제거된 1차 신경 교종의 생검 조직에서 구축된 GSC11 및 교모세포종을 가지는 여자 환자에서 유래한 X01 세포가 이 실험에 사용되었다(Jiang H, Gomez-Manzano C, Aoki H, et al. Examination of the therapeutic potential of Delta-24-RGD in brain tumor stem cells: role of autophagic cell death. Journal of the National Cancer Institute.2007;99(18):1410-1414.).

렌티 바이러스 벡터의 형질 도입과 발현

GFP가 안정적으로 발현된 GSC11s (G-GSC11)는 완전 배지에서 GSC11 세포를 증식시킴으로써 생성되었고, 그런 다음, GFP-발현 렌티 바이러스 상청액을 공급하여, 폴리브렌(Polybrene, Sigma)는 최종 농도 8 ug/ml가 되게 첨가하였고, 18시간 동안 세포 배양하였다. 감염 후, 세포는 새로운 배양 배지에 두고, 표준 방법으로 배양하였다. 감염되지 않은 세포를 제거하기 위해 1 mg/ml 퓨로마이신(puromycin, Life Technologies Korea, Seoul, Korea)을 처리한 세포는 안정적인 G-GSC11을 생성하였다. GFP-발현 GSC11s는 fluorescence activated cell sorting (FACS)를 이용한 추가 실험에 사용하기 위해 분리 하였다.

세포 생존력 분석

세포 생존에 대한 HL156A, TMZ 및 HL156A와 TMZ 병용의 효과는 3-(4,5-디메틸치아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸리움 브로마이드 (MTT) 분석법으로 측정하였다. 세포를 96 웰 플레이트에 접종하여 24시간 동안 37°C에서 배양하고, 5일간 HL156A, TMZ 및 이들을 병용 처리하였다. MTT 시약 (10μl/웰)을 첨가하고 4시간동안 37°C에서 배양 후, 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 각각의 실험은 연속해서 세번 반복 하였고, 그 결과는 대조군에 대한 %생존 세포로 나타내었다.

웨스턴 블로팅

각 시료로부터 20 μg의 총 단백질을 Laemmli 샘플 버퍼로 처리하고, 5분간 100에서 가열하였다. 그런 다음, 각 웰에 로딩하여 8% SDS 폴리아크릴 아마이드 젤 전기영동 (PAGE)을 이용하여 분획한 다음, 니트로 셀룰로스 막(GE Healthcare life-Sciences)을 이용하여 electrobloting 하였다. 막은 TBS-T안에 5%무지방 분유를 섞어 차단하고, AMPK-mTOR 경로와 관련된 줄기세포성(stemness) 마커, EMT-관련 마커등의 단백질에 대한 항체를 4에서 하룻밤 배양한 다음, 실온에서 한 시간 동안 퍼옥시다아제-결합 goat anti-rabbit IgG (1:2000, santa cruz)를 검출하였다. 반복 세척하고, 막은 화학 발광 시약(ECL; Amersham Life Science, Inc.)으로 현상하였다. 밴드 밀도는 TINA 이미지 소프트웨어(Raytest, Straubenhardt, Germany)를 사용하여 측정하였다.

신경구 ( Neurosphere ) 형성 분석법

GSC11 과 X01 세포는 2 % 1×B27, 20 ng/ml 0.02 % bFGF, 20 ng/ml 0.02 % EGF 및 1 % antibiotic antimycotic 용액(100×, Gibco, Invitrogen Korea, Seoul, South Korea)로 구성된 DMEM/F-12를 함유하는 배지에서 배양하였다. 세포는 3주간 다른 조건에서 배양하였다. 형태(morphology)와 종양구(tumor sphere) 사이즈를 측정하기 위해 역상 대조 현미경(I×71 Inverted Microscope; Olympus, Tokyo, Japan)를 사용하여 세포 배양을 관찰하였다. 세포 사진은 DP 컨트롤러 소프트웨어(Olympus)를 사용하는 디지털 카메라(DP70 Digital Microscope Camera; Olympus)로 촬영했다.

3차원 침윤 분석

스피로이드(spheroid)에서 증식한 G-GSC11s은 폴리디메틸실록산(PDMS)-바탕의 마이크로-웰(diameter and depth of microwells : 6mm and 500㎛)을 사용하여 콜라겐 I 매트릭스에서 배양하였다. 마이크로웰은 1% poly(ethyleneimine) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 용액을 10분 동안 처리한 다음, 30분 동안 0.1% glutaraldehyde (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 처리한 후, 콜라겐에 PDMS 웰이 잘 부착되도록 하룻밤 PBS로 세척하였다. 4mg/ml 콜라겐 I 매트릭스는 제조사에 의해 제공되는 추천 메뉴얼에 따라 높은 농도의 생쥐 꼬리 콜라겐 I (BD Bioscience, CA, USA)로부터 준비하였다. 간단히 설명하자면, 원하는 최종 농도에 맞춰 젤을 제조하기 위해서 10x phosphate buffered saline (PBS), 1N NaOH, 멸균 dH2O 및 콜라겐 I를 혼합하였다. 이 용액은 잘 섞어 사용하기 전까지 4에서 보관하였다. G-GSC11 스피로이드를 캡슐화 하기 위해서, 콜라겐 I 용액 (4mg/ml) 10ul 를 마이크로-웰에 피펫팅하고, 싱글 G-GSC11 스피로이드는 배양 플레이트에서 콜라겐 I 매트릭스로 옮겨 두고, 콜라겐 I 용액(4mg/ml) 10 ul를 G-GSC11 spheroid에 떨어뜨렸다. 배양기는 30분 동안 5% CO2와 37에서 배양되었다. 세포 생존력은 콜라겐 메트릭스로 주입하기 전에 G-GSC11 스피로이드를 8μM 에티디움 호모다이머-1 (Invitrogen Korea, Seoul, South Korea)로 30분 동안 37에서 염색하여 나타내었다. 완전히 젤 화 된 후, 2 % 1×B27, 20 ng/ml 0.02 % bFGF, 20 ng/ml 0.02 % EGF, 및 1 % antibiotic antimycotic 용액(100×, Gibco, Invitrogen Korea, Seoul, South Korea)으로 구성된 DMEM/F-12를 함유하는 배양 배지의 수퍼레이어(superlayer)를 첨가하였다. 약제의 효과를 관찰하기 위해, 각 약제의 최종 농도를 고려한 배지를 혼합하였다. 이미지는 G-GSC11 스피로이드의 다이나믹한 형태 (dynamic morphology) 를 관찰하기 위하여 역상 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경(inverted confocal laser scanning microscope) (Nikon Ti-E, Tokyo, Japan)를 사용하여 촬영하였다. 침윤 분석 정량을 위해, 최대 영역은 침윤성(초기 시간 × 100에서 특정 시간 / spheroid 영역에 침입한 영역)을 정의하기 위해 파라미터로서 사용된 세포의 이동 엣지(migrating edge)를 이동시킴으로써 확보하였다(covered). 데이터는 이미지 분석소프트웨어 Image J (NIH, Bethesda, Maryland, USA)를 사용하여 분석하였다.

F ¹⁸ - FDG 주입

GSC11은 24시간 동안 3 x10⁵ 세포/웰을 12 웰 플레이트에 넣어 두었다. 배지는 ¹⁸F-FDG 약 0.5 uCi를 함유하는 무당(glucose-free) DMEM 배지 (Gibco, Invitrogen Korea, Seoul, South Korea)로 바꾸고 15분 동안 배양하였다. 세포는 PBS로 세번 세척하였고, 각 웰에 용해 버퍼0.1 mL를 첨가하였다. Wallac 148 Wizard 3 gamma-counter (PerkinElmer Life and. Analytical Science, Shelton, CT, USA)를 사용하여 방사성 양을 측정하기 위해 용균 세포를 회수하였다. 측정된 방사성은 단백질 함량을 표준화 하였다.

유전자 발현 마이크로어레이와 유전자 온톨로지(ontology) 분석

총 RNA는 Qiagen miRNA kit를 사용하여 제조사 프로토콜에 따라 100mg의 조직에서 추출하였다. 약제 처치군과 대조군의 발현 프로파일은 Illumina HumanHT-12 v4 Expression BeadChip (Illumina, Inc., San Diego, CA,USA)을 사용하여 획득하였다. 데이터는 log2로 변환되었고 Dr. Richard Simon 과 BRB-ArrayTools 개발 팀에 의해 개발 된 BRB-ArrayTools를 사용한 분위수 정규화 방법(quantile normalization method)으로 표준화하였다. 어레이 세트를 통해 최소한의 변화를 보인 유전자는 분석에서 제외하였다. 어레이의 적어도 20%, 평균값의 적어도 1.5배 차이로 발현된 유전자는 유지하였다. BRB-ArrayTools 의해 제공되는 유전자 세트 비교 툴은 유전자 온톨로지 분석에 사용하였다.

동소 이종 이식 동물 모델 ( Orthotopic xenograft animal model)

4~8주령 수컷 무흉선 누드 마우스(athymic nude mice) (Central Lab. Animal Inc., Seoul, South Korea)를 실험에 사용하였다. 마우스는 연구 시작 전 적절한 건강을 확보하기 위해서, 무균 상태의 마이크로아이소레이터(microisolator) 케이지에 보관하고 최소 1 주일 동안 관찰하였다. 조명, 온도 및 습도는 집중 제어 하였다. 모든 실험 절차는 연세대학교 의학대학 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었다. 마우스는 복강내 주입된 Zoletil　 (30 mg/kg; Virbac Korea, Seoul, South Korea) 과 xylazine (10 mg/kg; Bayer Korea, Seoul, South Korea) 용액으로 마취시켰다. GSC11은 두개골 내에 guide-screw system 을 사용하여 누드 마우스의 우측 전두엽에 주입 하였다. 마우스에 4.5 mm의 깊이로 삽입 된 Hamilton syringe (Dongwoo Science Co., Seoul South Korea)를 통해 5 × 10⁵ 세포가 주입되었다. 그런 다음, HL156A 15mg/kg 과 TMZ 66.6mg / kg 및 이들을 병용하여 마우스에 투여하였다 (그룹 당 N = 5). 종양구 주입일로부터 5일간, HL156A은 실험하는 동안 매일 경구 투여되었고, TMZ는 복강 내 투여 되었다. 마우스의 체중은 매일 조사하였다. 체중이 원래 체중에 비해 15 % 이상 감소하면, 마우스는 프로토콜에 따라 안락사 시켰다. 마우스가 죽으면 신중하게 마우스 두뇌를 제거하고 H-E 염색 슬라이드를 제작한 후 신경교종생성(gliomagenesis)를 관찰하였다.

통계학적 분석

데이터는 Windows, 버전 12.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)용 SPSS를 이용하여 분석하였다. Student T- test 또는 MannWhitney U test는 약제 처리된 세포에 FDG 주입 생존력 평균치 비교를 위해 사용하였다. Kaplan-Meier 생존 곡선 및 로그 순위 통계는 생존 분석에 이용하였다. 결과는 때 P <0.05 일 때, 통계학적으로 유의한 것으로 간주하였다.

결과

HL156A(N-(N-(4-(트리플루오로메톡시)페닐)카바마이미도일)피롤리딘-1-카복시마이다마이드) 의 화학 구조는 도 1a에 나타내었다. 모든 실험에서, HL156A는 아세트산 염 형태로 사용하였다. 이는 높은 생체 이용 효능을 가지는 바이구아나이트의 유도체이다. 반면, 메트포르민은 낮은 생체 이용 효능을 가지며, 제한된 혈액 뇌장벽 투과성을 가지고 있어, OCT1 수송체에 세포 단독으로 들어가며, 뇌에 높은 침투성을 가진다.

세포 생존력에 대한 HL156A , TMZ 및 병용 처치의 효과

GBM 암 줄기 세포 라인인 X01와 GSC11을 사용하여, MTT 분석법을 통해 HL156A, TMZ 및 HL156A와 TMZ의 병용 처치에 대한 세포 생존력을 조사하였다. 약제의 준치사량 처치는 세포에 영향을 나타내었다(도 1b). 세포를 죽이지 않고 특정 세포 현상(specific cellular phenomenon)을 알아보기 위해 각 약제의 치사량을 사용했다. 추가 실험을 하기 위해 HL156A 10μM 및 TMZ 500 μM 을 채택하였다.

GSC11과 X01 세포의 AMPK 및 mTOR 경로에 대한 HL156A , TMZ 및 병용 처치 효과

일반적으로, 바이구아나이드는 AMPK의 아고니스트로서 작용하며, 결과적으로, mTOR 억제로 이어진다고 알려져 있다. 그러나 이는 교모세포종 종양구(tumor sphere)의 경우에는 해당하지 않는다. AMPK 활성화에 의한 mTOR 억제가 GSC11 및 X01 세포에서는 관찰되지 않았다(도 1c).

종양구의 줄기세포성( stemness )에 대한 HL156A , TMZ 및 병용 처치의 효과

HL156A는 GSC11 및 X01의 줄기세포성(stemness)을 감소시키는 것 처럼보이며, 신경구(neurosphere) 형성 분석법(도 2a 및 2b)과 nestin, CD133, Sox-2, Notch 1, Notch 2 및 Oct3/4과 같은 줄기능(stemness) 마커를 이용한 western blotting 에 의해 밝혀 졌다. Neurosphere 수는 HL156A 처치로 인해 현저히 감소하였고, 이러한 억제 효과는 병용 처치에서 가장 두드러졌다. CD133, OCT 3/ 4, Sox-2, Notch 1 및 Notch2의 감소된 발현은 GSC11 또는 X01에서도 관찰되었다 (도 2c).

GSC11과 X01의 신경교 분화에 대한 HL156A , TMZ 및 병용 처치의 효과

HL156A나 TMZ 모두 olig2, Tuj1 및 GFAP와 같은 신경 세포 마커의 발현으로 인해 신경교 분화를 촉진 시키지는 않는다(도 2d). 따라서, 줄기세포를 표적으로 하는 제안된 메커니즘의 하나인 종양 세포의 분화에 의한 치료적 효과는 약제의 메커니즘이 아니라고 생각된다.

GSC11의 침윤 특성에 대한 HL156A , TMZ 및 병용 처치의 효과

콜라겐 I 매트릭스의 3D 침윤 분석에서, HL156A는 낮은 수준의 침윤성을 나타내었다(도 3a, 이식 세포와 약물 동시). 실험 중의 세포 생존력이 평가된 바와 같이, 세포 생존력에 대한 약제의 효과가 아니었기 때문에, 유의한 세포사가 아니다. 실제 임상 상황을 되풀이하기 위해 종양이 형성된 후 약제를 환자에게 투여하였고, 동일한 분석법을 실시하였지만 이식 12시간 이후 약제 처치하였다(도 3b). 비록 설정이었지만, 침윤의 억제 효과는 병용 처치에서 가장 두드러졌다. 여러 그룹에서 EMT 관련 마커들이 GBM에서 상향 조절되고, EMT가 진행되고 있는 암세포에 의한 중간엽 형질의 취득(acquisition of mesenchymal traits)은 줄기세포 프로그램의 취득과 관련된 것이라고 보고된 바와 같이 (Ortensi B, Setti M, Osti D, Pelicci G. Cancer stem cell contribution to glioblastoma invasiveness. Stem cell research&therapy. 2013;4(1):18.,), β-catenin, zeb1, N-cadherin 및snail EMT와 같은 EMT 관련 마커들의 발현은 HL156A 및 병용 처치에 대한 β-catenin, zeb1, 및 N-cadherin의 발현이 감소 되었음을 밝힌 것으로 평가되었다. 이는 약제가 종양구에 있어서 EMT 관련 경로를 교란시킬 수 있음을 시사한다(도 3c).

¹⁸ F- FDG 흡수 분석에 의한 세포 대사 평가

세포 대사에 대한 약제의 효과를 평가하기 위해, ¹⁸F-FDG 흡수를 알아보았다. ¹⁸F-FDG는 약제가 처리된 세포에서 감소 되었고, 그 감소는 병용 치료군에서 가장 두드러졌다. 따라서, 약제는 세포 대사를 감소 시키고, 그 억제 정도는 병용 군에서 가장 명백하였다(도 4a).

마이크로어레이 데이터의 유전자 온톨로지 분석

Illumina HumanHT-12 v4 Expression BeadChip를 이용하여 전사체를 분석하고, 계층적 클러스터링(hierarchical clustering)과의 히트맵(heatmap)이 생성되었다(도 4b). 몇몇의 FBLN7과 같은 하향 조절 유전자 중, 병용 처치시 차등적으로 발현되는 유전자는, 세포외 기질, 세포 이동을 조절한다고 알려져 있는 분자인 Lyn, 및 라미닌 타입의 LAMA4과 상호 작용하는 부착 분자 (adhesion molecule)를 포함한다. 우리는 BRB - Array 툴을 사용하여 TMZ와 병용 처치 중에서 차등 발현하는 Gene Ontology 유전자 세트를 분석하였다. TMZ 단독 처치와 비교할 때, 병용 처치는 세포 부착, 세포 이동, 세포 운동 및 세포 부착의 조절(표 1)에 관련된 유전자 세트를 포함하는 차등적으로 발현하는 유전자 세트를 나타내었다.

이종 이식된 종양의 증식에 대한 HL156A의 효과

마지막으로, 동소 이종 이식 마우스의 종양에 대한 약제의 효과를 분석하였다. 동소 이종 이식된 마우스의 생존을 분석하였다. 동물을 희생 시킨 후, 동물의 뇌를 꺼내어 염색하였다. 비록 병용 처치가 덩어리(mass)의 형성을 막지는 못했지만, 크기 및 질량 함량은 병용 처치군 마우스(도 5a)에서 제한되었다. 이는, HL156A 및 TMZ의 병용 처치가 동물의 전체 생존력에 있어서 이득이라는 것을 밝힌 것이다(P = 0.000, log rank test, 도 5b).

디스커션

GBM의 이해에 대한 최근의 진전에도 불구하고, 환자의 생존력은 여전히 굉장히 제한 되어있다. 비록 완전 절제를 수술시에 실시한 후라고 하더라도, 재발하는 경향이 있고 환자의 생명을 앗아간다. 질병에 대한 새로운 전략이 그에 따라 필요할 듯 하다. 많은 보고서에서 잠재적 질병 재발의 원인이 신경 교종 종양구(glioma tumorsphere)의 화학 치료 및 방사선 내성을 가리 켰을 때, GBM의 종양구 및 그 고유의 특성과 관련된 중요 분자의 식별을 목표로 하는 것은 합리적인 접근 방법이 될 수 있다.

본 연구에서는 줄기능(stemness) 및 신경 교종 종양구(glioma tumorsphere)의 침윤 특성에 대한 HL156A, TMZ 및 병용 처치의 효과를 조사하였다.

새로운 약제 HL156A와 이미 잘 알려진 TMZ의 기존 치료법의 병용 치료가 줄기능(stemness) 및 GSC11의 침윤 특성을 저해시키고, 이러한 효과는 EMT 관련 마커의 변화와 관련된 것으로 보인다. 기존 요법인 메트포르민의 유사 부가적 효과가 유방암 줄기 세포 모델에서 발견되었다(Lee H, Park HJ, Park CS, et al. Response of breast cancer cells and cancer stem cells to metformin and hyperthermia alone or combined. PloS One.2014;9(2):e87979.). 이 그룹은 AMPK의 활성화 및 mTOR의 불활성화를 통해, 이상고열(hyperthermia)의 세포 독성 효과에서 메트포르민의 부가적 효과를 보였다. 게다가, 메트포르민(metformin)은 우선적으로 유방암 줄기 세포를 죽이고, 방사선 민감(radiosensitize) 암 세포를 죽인다고 알려져 있다(Song CW, Lee H, Dings RP, et al. Metformin kills and radiosensitizes cancer cells and preferentially kills cancer stem cells. Scientific Reports.2012;2:362.). 이러한 종류의 효과는 GBM에서도 알려져 있다. 한 그룹은 WHO 등급 III 및 IV 악성 신경 교종(malignant gliomas)에 대한 보조 치료로서 메트포르민에 TMZ 기반 화학 요법을 더한 치료법을 보도했다(Soritau O, Tomuleasa C, Aldea M, et al. Metformin plus temozolomide-based chemotherapy as adjuvant treatment for WHO grade III and IV malignant gliomas. Journal of Balkan Union Oncology. 2011;16(2):282-289.). 그리고, 또 다른 그룹은 구체적으로 메트포르민에 soragenib를 더함으로써 GBM의 암 줄기 세포를 표적으로 하였다(Aldea MD, Petrushev B, Soritau O, et al. Metformin plus sorafenib highly impacts temozolomide resistant glioblastoma stem-like cells. Journal of Balkan Union Oncology. 2014;19(2):502-511.). 본 연구의 병용 치료군에서 우수한 생존 결과에 대해 설명 가능한 것은 1) HL156A에 의한 악화된 세포 에너지 대사 환경 외에 TMZ 종양 세포의 독성 효과 2) 종양구(tumor sphere)의 침윤 특성에 대한 TMZ 및 HL156A의 부가적 억제 효과가 덜 공격적인 종양의 표현형이라는 결과를 들수 있다. 이는 대사적으로 활성 상태인 종양 세포에 덜 유리한 환경을 제공하기 위해서, 일반적인 대사 스트레스에 의한 신경 교종 종양구를 표적으로 하는 것은 암 세포의 이질성을 감안 할 때, 합리적 접근일 수 있다. 비록 잘 알려진 비구아나이드 메트포르민이 HL156A와 유사한 효과를 가질 수 있지만, 뇌에 메트포르민의 공급(delivery)은 제한되어 있다. 새로운 화합물은 이러한 단점을 극복하고 일반적으로 높은 생체 이용 가능성(bioavailability)을 보여 준다.

이 연구에 있어서, HL156A 효과의 기초가 되는 세포 기전(mechanism)은 기대한 AMPK 활성화와 그 결과로서의 mTOR의 억제 경로를 보이지 않았다는 점이 특징적으로 보인다. 최근, Liu등은 AMPK가 교모세포종에서 활성화되고 메트포르민의 증식억제 효과는 AMPK와 관계 없음을 보고 하였다 (Liu X, Chhipa RR, Pooya S, et al. Discrete mechanisms of mTOR and cell cycle regulation by AMPK agonists independent of AMPK. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.2014;111(4):E435-444.). 본 연구는 또한 GSC11 및 X01에서 기저 AMPK의 발현이 유사하게 증가하고, AMPK 활성화 및 그에 따른 mTOR의 억제가 신경 교종 종양구에 대한 HL156A 및 HL156A 와 TMZ의 병용 처치에 의한 억제 효과가 명확하지 않다는 것을 확인하였다.

이 연구의 결과의 또 다른 독특한 양태는, 신경 교종 종양구의 침윤 특성에 대한 억제 효과가 EMT 관련 마커의 변화와 관련 될 수 있다는 것이다. GBM 확장과 침윤의 발병에 있어서의 EMT 경로의 증거가 이 시점에서는 견고하지 않다. 비록 배아 발달 동안 GBM 침윤 및 미성숙 신경 세포 이동의 과정에서 유사성이 존재하고, 그 과정이 조금은 알려졌다 하더라도, 침윤 특성 및 EMT에 관련한 직적접인 증거는 여전히 부족하다. 그럼에도 불구하고, 몇몇 증거는 유사 분자 변경이 GBM의 병태 생리(pathophysiology) 및 이 경로를 억제 한 후의 결과로서 존재 할 수 있고, 이러한 치명적 질병의 침윤 특성에서의 이 경로의 역할을 특정하기 위한 연구가 필요함을 제시한다. siRNA 또는 shRNA에 의한 EMT 경로를 대상으로 하는 유사 실험이 도움이 될 수 있다.

비록 TMZ 반응군을 식별 했음에도 불구하고, 환자는 질병의 재발로 인해 사망한다. GBM의 치료적 한계를 극복하기 위해 제안된 몇몇 전략은 대부분 여전히 성공적이지 않다. 정상적인 뇌 조직으로의 종양 특유의 침투 본성으로 인해, 수술 중 완전한 절제는 불가능하다. 따라서, 암 줄기 세포를 포함하여 잠재적 잔존 암 세포에 대한 적절한 보조 요법은 질병의 불리한 운명을 극복하기 위해 중요하다. 새로운 전략으로서 GBM 종양구를 표적으로 하는 것은 이러한 맥락에서 광범위하게 평가 될 필요가 있다.

이론상 주의할 점은 GBM 특정 줄기 세포의 동정에 관한 제한된 정보는 실험에 있어서 세포 선별이 제한된다는 것이다. 예를 들어, 암 줄기 세포를 정의하는 표면 마커에 대한 논쟁이 여전하다. 또한, GBM의 일부 특성은 종양 이질성(tumor heterogeneity)의 또 다른 축인 질환의 클론 진화 모델로 설명 할 수 있다. 이질성은 종양의 공간 구조에 의해 정의 되며, 클론진화 모델에 의해 더욱 설명할 수 있다. 또한, 병용 모델이 제안 된 바와 같이, 질환의 특정 성질을 이해하기 위해 더 많은 증거의 누적이 필요하다. 일반적인 세포 내 에너지 대사의 변화는 이 두 모델에서 종양 세포를 표적으로 할 수 있는 등의 적절한 치료 방법이 될 것으로 보인다. 따라서, GBM 종양구에 대해 새로 개발 된 약제 HL156A와 기존 TMZ와의 병용 사용은, 질병에 대한 새로운 전략으로서 보다 더 평가 될 필요가 있다.

Claims

하기의 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 교모세포종 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
[화학식 1]
제1항에 있어서,
상기 약학적으로 허용 가능한 염은 포름산, 아세트산, 프로피온산, 락트산, 뷰티르산, 이소부티르산, 트리플루오로아세트산, 말산, 말레산, 말론산, 푸마르산, 숙신산, 숙신모노아미드산, 글루탐산, 타르타르산, 옥살산, 구연산, 글리콜산, 글루쿠론산, 아스코르브산, 벤조산, 프탈산, 살리실산, 안트라닐산, 벤젠술폰산, p-톨루엔설폰산, 메탄술폰산, 디클로로아세트산, 아미노옥시아세트산, 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 질산, 탄산, 붕산으로 이루어진 군에서 선택된 산의 염인 약학적 조성물.
제2항에 있어서, 상기 약학적으로 허용가능한 염은 아세트산의 염인 약학적 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 테모졸로마이드(TMZ)와 병용 치료에 사용되는 약학적 조성물.
하기의 화학식 1의 화합물 및 테모졸로마이드(TMZ)를 유효성분으로 포함하는 교모세포종 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
[화학식 1]
하기의 화학식 1의 화합물 및 테모졸로마이드(TMZ)를 유효성분으로 포함하는 제형.
[화학식 1]
제6항에 있어서,
상기 제형은 정제, 캡슐, 알약, 과립제, 산제, 주사제 또는 액제로 이루어진 군에서 선택된 제형.