KR102336691B1 - 다이설피람 및 시스플라틴을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 다이설피람 및 시스플라틴을 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 등에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 조성물은 알데하이드 탈수소효소의 활성을 감소시키고, DNA-PKcs의 인산화 증가를 통해 암세포의 사멸(apoptosis)을 유도함으로써 암 종양의 크기를 현저하게 감소시키는 효과가 있다. 따라서, 본 발명은 중추 신경계 암을 포함한 다양한 종류의 알데하이드 탈수소효소를 과발현하는 암을 치료하기 위한 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

다이설피람 및 시스플라틴을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 {Pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cancer, comprising disulfiram and cisplatin as an active ingredient}

본 발명은 다이설피람 및 시스플라틴을 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 등에 관한 것이다.

뇌를 비롯한 중추 신경계에 발생하는 종양(암)은 발달된 현대의 의약 기술로도 치료가 어려운 난치성 질환이다. 이 중 비정형 유기형/간상 종양(Atypical teratoid/rhabdoid tumor; AT/RT)은 주로 3세 미만 어린이에서 진단되며, 예후가 좋지 않은 악성 뇌종양 중 하나이다. AT/RT는 매우 공격적이기 때문에 대부분의 환자는 집중적인 복합 요법으로 치료된다. AT/RT의 희귀성과 현재까지 사용된 다양한 치료 요법을 고려할 때 표준 치료법은 아직 확립되지 않은 것으로 볼 수 있다.

암 줄기세포(cancer stem cells; CSCs) 또는 종양개시세포(tumor initiating cells; TICs)로 불리는 미분화된 세포의 뚜렷한 아집단은 약물 내성 및 암 재발에 있어 중추적인 역할을 담당하는 것으로 제안되었다. 이들 세포는 AT/RT 세포에서 높은 수준의 알데하이드 탈수소효소(aldehyde dehydrogenase; ALDH) 발현이 나타나고, 이들에서 ALDH를 억제하는 경우 자기 재생(self-renewal) 능력이 감소된다.

한편, 시스플라틴(cis-diamminedichloroplatinum; CDDP)은 고환암, 방광암, 난소암, 대장암, 폐암, 두경부암 및 AT/RT와 같은 광범위한 고형 종양에 대해 임상적 활성을 발휘하는 가장 널리 사용되는 백금(platinum) 기반 화합물 중 하나이다. 시스플라틴은 종종 부분 반응 또는 질병 안정화와 관련된 초기 치료의 성공을 이끌기도 한다. 그러나 항암제로서 시스플라틴의 임상적 유용성에 대한 한계는 일부 종양에서 나타나는 내성 및 용량 의존적 신장독성(nephropathy)이다. 여러 증거들은 시스플라틴 내성은 줄기-유사(stem-like) 특성과 관련이 있음을 시사하고 있다. 또한, 유방암으로부터 유래한 ALDH 양성 줄기-유사 세포는 시스플라틴에 대한 내성에 중요한 역할을 하는 것으로 보고된바 있다.

AT/RT는 평균 발병 연령이 26개월이고 전체 생존 기간이 18개월인 것으로 알려져 있다. 진단 시점에서의 어린 나이는 방사선 요법을 제한함으로써 그 암울한 예후에 기여하며, 따라서 다양한 복합 요법이 연구되고 있다. 현재 사용되고 있는 AT/RT에 대한 화학 요법에는 시스플라틴, 사이클로포스파미드(cyclophophamide), 빈크리스틴(vincristine) 및 에토포시드(etoposide)가 포함된다. 그러나 이러한 치료적 접근법에도 불구하고, AT/RT의 예후는 여전히 어두운 실정이다.

KR 10-1956982 B1

본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염; 및 시스플라틴을 유효성분으로 포함하는, 알데하이드 탈수소효소 과발현 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 알데하이드 탈수소효소 과발현 암에 대한 시스플라틴의 항암 증진용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염; 및 시스플라틴[cisplatin; cis-diamminedichloroplatinum(II)]을 유효성분으로 포함하는, 알데하이드 탈수소효소(Aldehyde dehydrogenase) 과발현 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다:

[화학식 1]

상기 화학식 1에서 R은 각각 독립적으로 탄소수 1 내지 6의 분지 또는 직쇄의 알킬기.

또한, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염; 및 시스플라틴의 치료학적 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 알데하이드 탈수소효소 과발현 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

더욱이, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염; 및 시스플라틴을 유효성분으로 포함하는 조성물의, 알데하이드 탈수소효소 과발현 암의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 다이설피람(disulfiram; diethylcarbamothioylsulfanyl N,N-diethylcarbamodithioate) 또는 그 대사체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 조성물은 암 세포의 아포토시스(apoptosis)를 유도할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 조성물은 DNA-PKcs(DNA-dependent protein kinase, catalytic subunit)의 인산화를 촉진시킬 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 조성물은 알데하이드 탈수소효소의 활성을 감소시킬 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 암은 비정형 유기형/간상 종양(Atypical teratoid/rhabdoid tumor), 교모세포종(Glioblastoma), 별아교세포종(Astrocytoma), 뇌간교종(Brainstem glioma), 뇌실막세포종(Ependymoma) 및 수모세포종(Medulloblastoma)을 포함하는 중추 신경계 암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 암은 비정형 유기형/간상 종양일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 시스플라틴과 동시에(simultaneous), 별도로(separate), 또는 순차적(sequential)으로 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

뿐만 아니라, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 알데하이드 탈수소효소 과발현 암에 대한 시스플라틴의 항암 증진용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 시스플라틴과 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 조성물은 시스플라틴과 25 : 1 내지 50 : 1 (화학식 1로 표시되는 화합물 : 시스플라틴) 의 비율로 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 알데하이드 탈수소효소의 활성을 감소시키고, DNA-PKcs의 인산화 증가를 통해 암세포의 사멸(apoptosis)을 유도함으로써 암 종양의 크기를 현저하게 감소시키는 효과가 있다. 따라서, 본 발명은 중추 신경계 암을 포함한 다양한 종류의 알데하이드 탈수소효소를 과발현하는 암을 치료하기 위한 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 동물 실험을 위한 약물 투여 기간 및 시점을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 2a 내지 도 2d는 다이설피람 및 시스플라틴의 병용 처리에 의한 AT/RT 세포의 생존력 저하의 상승 효과를 나타낸 도이다: (도 2a) 다이설피람, 시스플라틴, 에토포시드 또는 4-HC의 농도별 처리에 따른 AT/RT 세포 및 세포주에서의 세포 생존력을 나타낸 도; (도 2b 및 도 2c) 다이설피람 및 시스플라틴을 병용 처리한 경우와 각각을 단독으로 처리한 경우의 세포 생존력을 그래프로 나타낸 도(*, p <0.05; **, p <0.001; ***, p <0.0001); (도 2d) 다이설피람 및 시스플라틴 병용 처리의 상승 효과에 대한 아이소볼로그램 분석.
도 3a 및 3b는 다이설피람과 시스플라틴의 병용 처리에 의한 ALDH 활성 억제를 나타낸 도이다: (도 3a) AT/RT 세포 및 세포주에서 ALDH 양성 세포를 확인한 ALDEFLUOR™ 분석 결과; (도 3b) ALDH 활성의 정량적 분석 결과(*, p <0.05; **, p <0.001; ***, p <0.0001).
도 4a 및 도 4b는 다이설피람 또는 시스플라틴의 단독 처리 또는 다이설피람 및 시스플라틴의 병용 처리에 의한 AT/RT에서의 단백질 발현을 나타낸 도이다: (도 4a) 웨스턴 블롯에 의한 단백질 발현 밴드 사진; (도 4b) 웨스턴 블롯 결과의 정량화 그래프(*, p <0.05; **, p <0.001; ***, p <0.0001).
도 5a 내지 도 5d는 AT/RT 마우스 모델에서 다이설피람과 시스플라틴의 병용 투여에 의한 장기 치료 효능을 보여주는 도이다: (도 5a) 종양의 크기를 나타내는 대표적인 생물발광 이미징 사진; (도 5b) 생물발광 이미징에 의한 ROI의 크기를 나타낸 그래프; (도 5c) 실험군의 생존율 중앙값을 카플란-메이어 생존 곡선으로 나타낸 도(***, p <0.001); (도 5d) BT16-effLuc 투여 이후 각 약물의 처리에 따른 마우스 무게 변화를 나타낸 그래프.
도 6a 및 도 6b는 AT/RT 마우스 모델에서 다이설피람과 시스플라틴의 병용 투여에 의한 단기 치료 효능을 보여주는 도이다: (도 6a) 헤마톡실린 및 에오신으로 염색한 마우스 뇌 조직의 대표 이미지(상단) 및 종양 부피를 정량화한 그래프(하단); (도 6b) 면역형광 염색의 대표 이미지(상단) 및 각 단백질에 대한 양성 세포를 정량화한 그래프(하단; *, p <0.05; **, p <0.001; ***, p <0.0001).
도 7은 다이설피람 및 시스플라틴의 병용 투여에 의한 세포사멸(apoptosis) 유도함으로써 향상된 치료 효능을 나타내는 것과 관련된 신호전달 경로의 개략도.

알데하이드 탈수소효소를 과발현하는 대표적인 중추 신경계 종양인 비정형 유기형/간상 종양(이하 'AT/RT'라 함)은 일반적으로 3세 미만의 어린이에서 발생하는 공격성 종양(aggressive tumor)이다. AT/RT에 대한 집중적 다중 치료 요법에도 불구하고, 그 예후는 여전히 나쁘다. 비균질(heterogeneous) AT/RT 세포의 소집단은 AT/RT 치료를 어렵게 만드는 이유 중의 하나로 여겨져 왔다. 이들 세포는 알데히드 탈수소효소(ALDH)의 발현 수준이 높게 나타나는 것으로 알려져 있다. 본 발명자들은 ALDH 억제제 다이설피람과 시스플라틴을 조합하여 AT/RT에 대한 항암 효과를 조사한 결과 각각의 물질을 단독 투여한 경우보다 현저하게 향상된 항암 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.

AT/RT 환자로부터 유래한 1차 배양 세포 및 확립된 세포주를 다음과 같은 시험관내(in vitro) 실험에 사용하였다: 세포 생존력 평가, 유세포 분석(flow cytometry), ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 웨스턴 블롯 및 면역 형광(immunofluorescence) 분석. AT/RT 동소 이종이식(orthotopic xenograft) 마우스 모델에서 생물발광 실시간 이미징(bioluminescence live imaging)을 통해 종양의 부피 및 생존율을 분석하였다(실험예 참조).

본 발명의 일 실시예에서는 시험관내(in vitro) 및 생체내(in vivo) 실험을 통해 다이설피람 및 시스플라틴의 병용 투여는 AT/RT에 대한 뛰어난 항암 효과를 나타냄을 증명하였다. 또한, 아이소볼로그램(Isobologram) 분석에 의해 상기와 같은 병용 치료가 AT/RT 세포의 사멸을 상승적으로 증가시키는 것을 밝혀냈다(실시예 1 참조).

또한, 본 발명의 일 실시예에서는 AT/RT 세포에 약 3-5%가 함유된 ALDH 양성 세포의 효소 활성은 병용 처치에 의해 효과적으로 감소됨을 확인하였다(실시예 2 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 상기와 같은 상승적 증강 효과에 대해 적어도 부분적으로는 ATF3에 의해 매개되는 절단된 PARP-의존성 세포 사멸의 증가를 통해 발생함을 보여주었다(실시예 3 참조).

또한, 본 발명의 일 실시예에서는 AT/RT 마우스 모델에서, 다이설피람과 시스플라틴의 병용 투여는 종양의 부피를 감소시키고 생존을 연장시켰으며, 마우스 뇌 조직에서의 면역형광분석 결과는 시험관내에서 관찰된 ATF3 및 절단된 PARP 단백질 발현 결과와 일치하였다(실시예 4 및 5 참조).

상기와 같은 결과를 종합하면, 다이설피람과 시스플라틴의 병용은 AT/RT 환자의 치료를 위한 새로운 전략으로 사용될 수 있음을 확인한 것이다.

따라서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염; 및 시스플라틴(cisplatin)을 유효성분으로 포함하는, 알데하이드 탈수소효소 과발현 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다:

[화학식 1]

상기 화학식 1에서 R은 각각 독립적으로 탄소수 1 내지 6의 분지 또는 직쇄의 알킬기를 나타내며, 예를 들면 메틸, 에틸, 프로프-1-일, 프로프-2-일, 1-메틸-프로프-1-일, 2-메틸-프로프-2-일, 2,2-디메틸-프로프-1-일, 부트-1-일, 부트-2-일, 3-메틸-부트-1-일, 3-메틸-부트-2-일, 펜트-1-일, 펜트-2-일, 펜트-3-일, 헥스-1-일, 헥스2-일, 및 헥스-3-일 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 “시스플라틴”은 “시스플라티늄”이라고도 불리우며, 하기의 화학식 2로 표시되는 화합물 cis-diamminedichloridoplatinum(II) (CDDP)을 의미한다.

[화학식 2]

본 명세서에서 사용된 용어, “예방”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 암 증상을 차단하거나, 암 증상을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어, “치료”란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 암 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용할 수 있다.

산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻을 수 있다.

이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다.

본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 상기 화학식 1의 화합물을 산 수용액 중에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 또한, 이 혼합물에서 용매나 과량의 산을 증발시킨 후 건조시키거나 또는 석출된 염을 흡입 여과시켜 제조할 수도 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수도 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면, 상기 화학식 1의 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약 상 적합할 수 있다. 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

본 발명의 화합물의 범위에는 약학적으로 허용 가능한 염뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 이성질체, 수화물 및 용매화물이 모두 포함될 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 유효성분 이외에 약학적 조성물로 제조하기 위하여 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및/또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여된다. 본 발명에 있어서, “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 결정될 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따른 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 예를 들면, 경구 투여, 비강 내 투여, 경기관지 투여, 동맥 주사, 정맥 주사, 피하 주사, 근육 주사 또는 복강 내 주사에 의해 투여될 수 있으며, 암 조직에 직접 주사하여 투여될 수 있다. 일일 투여량은 하루 일회 내지 수회 나누어 투여할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물 다이설피람(disulfiram; diethylcarbamothioylsulfanyl N,N-diethylcarbamodithioate) 또는 그 대사체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

[화학식 3]

본 발명의 “다이설피람”은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 중 하나로서, 기존에 알코올 중독 치료제로 사용되었으며, 알데하이드 탈수소효소(ALDH)에 대하여 비가역적 저해 활성을 나타낸다. 다이설피람은 물에는 거의 녹지 않는 결정으로 알코올, 에터, 아세톤 및 벤젠과 같은 용매에 용해될 수 있다.

본 발명에는 또한 다이설피람의 유사체 또는 유도체가 사용될 수 있다.

본 발명에서 다이설피람 유사체는 다이설피람과 그 구조가 유사하며 유사한 약리활성, 즉 시스플라틴과의 병용 투여시 항암 효과를 증진시키는 것으로, 예를 들면 대한민국 공개출원 제2007-7028346호에 개시된 것을 포함할 수 있다.

본 발명에서는 또한 다이설피람의 대사체가 사용될 수 있다. 이러한 대사체는 본 발명에 따른 효과를 나타내는 한 다양한 것이 사용될 수 있으며, 예를 들면 N,N-diethyldithiocarbamate를 포함한다.

본 발명에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 다이설피람의 농도는 10 내지 50μM일 수 있으나, 상기 농도 범위에 제한되는 것은 아니다.

또한 본 발명에 있어서, 상기 시스플라틴의 농도는 10 내지 50μM일 수 있으나, 상기 농도 범위에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에 있어서 상기 조성물은 암 세포의 아포토시스(apoptosis)를 유도할 수 있다. 실시예 5에서 나타난 결과에 따르면, 다이설피람과 시스플라틴의 병용 투여에 의해 절단된 PARP가 증가함을 확인하였으며, 이는 AT/RT 세포의 아포토시스가 현저하게 증가한 것임을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 DNA-PKcs(DNA-dependent protein kinase, catalytic subunit)의 인산화를 촉진시킬 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 다이설피람 또는 시스플라틴의 단독 투여와 비교하여 다이설피람 및 시스플라틴의 병용 투여시 DNA 손상 관련 단백질(DNA-PKcs, γ-H2AX), 스트레스 관련 단백질(ATF3), 세포자살 단백질(cleaved PARP)의 발현이 증가하였고, 항세포자살 단백질(survivin)의 발현이 감소한 것을 확인하였다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 알데하이드 탈수소효소의 활성을 감소시킬 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 암은 알데하이드 탈수소효소를 과발현하는 암은 시스플라틴에 내성을 나타내는 암일 수 있으며, 이러한 경우 본 발명에 따른 조성물은 특히 유용하다. 상기 알데하이드 탈수소효소는 암 세포 중에서도 종양의 발생, 증식, 전이, 재발 등에 중요한 역할을 하는 암줄기세포(cancer stem cells)에서 과발현된다고 알려져 있다.

본 발명에 있어서, 상기 암은 알데하이드 탈수소효소의 발현이 높게 나타나는 비정형 유기형/간상 종양(Atypical teratoid/rhabdoid tumor), 교모세포종(Glioblastoma), 별아교세포종(Astrocytoma), 뇌간교종(Brainstem glioma), 뇌실막세포종(Ependymoma) 및 수모세포종(Medulloblastoma)을 포함하는 중추 신경계 암에 사용될 수 있다. 특히, AT/RT는 보통 어린이에서 발생하는 척수 및 뇌를 포함하는 중추신경계에서 발생하는 악성 뇌암으로, 소뇌, sPNET(supratentorial primitive neuroectodermal tumors), 송과선, 척수 및 다발성 부위의 순으로 발생한다.

본 발명에 있어서, 상기 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 시스플라틴과 동시에(simultaneous), 별도로(separate), 또는 순차적(sequential)으로 투여될 수 있으나, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의하여 적절하게 변경될 수 있다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 알데하이드 탈수소효소 과발현 암에 대한 시스플라틴의 항암 증진용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

[화학식 1]

상기 화학식 1에서 R은 각각 독립적으로 탄소수 1 내지 6의 분지 또는 직쇄의 알킬기를 나타내며, 그 예는 전술한 바와 같다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 시스플라틴과 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 예를 들면, 5일 동안 매일 상기 조성물을 투여하되, 첫 째날에는 상기 조성물과 시스플라틴을 동시에 투여하고, 이후 둘 째날부터 다섯 째날까지는 상기 조성물만을 단독 투여할 수 있으며, 4일 후 상기 투여 일정을 한번 더 반복할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 시스플라틴과 25 : 1 내지 50 : 1의 비율로 투여될 수 있으며, 예를 들면 25 : 1, 26 : 1, 27 : 1, 28 : 1, 29 : 1, 30 : 1, 31 : 1, 32 : 1, 33 : 1, 34 : 1, 35 : 1, 36 : 1, 37 : 1, 38 : 1, 39 : 1, 40 : 1, 41 : 1, 42 : 1, 43 : 1, 44 : 1, 45 : 1, 46 : 1, 47 : 1, 48 : 1, 49 : 1 또는 50 : 1의 비율로 투여될 수 있다(상기 조성물 : 시스플라틴).

본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실험 재료 및 방법

1. 세포 배양

기관 검토위원회의 승인(IRB #1801-117-917) 및 적절한 서면 동의 절차를 거쳐, 서울대학교 어린이 병원에서 수술 치료를 받은 환자로부터 AT/RT 종양 조직(N=4)을 얻었다. AT/RT의 병리학적 진단을 확인한 후, 세포는 기존에 알려진 방법(Neuro-oncology, vol. 19, pp. 1079-1087, 2017)에 따라 분리 및 배양되었다. AT/RT 하위그룹은 환자의 조직에서 면역조직화학(Immunohistochemistry)에 의해 확인되었다.

확립된 AT/RT 세포주 BT12 및 BT16은 Nationwide Children's Hospital로부터 받아 사용하였다. 인간 신경 줄기세포주, HB1.F3은 세포 생존력 분석을 위한 정상 세포 대조군으로서 사용하였다. 모든 세포는 10% FBS(fetal bovine serum; Gibco, 미국) 및 1x 항생제-항진균제를 함유하고 있는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium; WelGENE, 대한민국)에서 배양하였다. 1차 배양된 세포는 계대수 7 이하를 사용하였다. 세포는 배양기에서 온도 37℃및 5% CO₂ 조건에서 배양하였다.

2. IC ₅₀ (The half maximal inhibitory concentration)

다이설피람(disulfiram), 시스플라틴(cisplatin), 에토포시드(etoposide) 및 4-HC(4-Hydroperoxycyclophosphamide; cyclophosphamide의 활성화 형태)는 셀렉켐(Selleckchem, 미국)에서 구입하였다. 모든 약물을 DMSO(dimethyl sulfoxide; Sigma Aldrich, 미국)로 희석하고, 분주하여 -80℃에서 보관하였다.

1차 배양된 AT/RT 세포(N=4), 확립된 AT/RT 세포주(N=2) 및 HB.F3(N=1)은 약물을 처리하기 24시간 전에 시딩(seeding)하고, 약물(0, 0.1, 1, 5, 10, 20, 50 및 100μM)에 72시간 동안 노출시켰다. 약물 없이 동일한 양의 DMSO를 함유하는 배지에서 성장한 세포를 대조군으로서 사용하였다. 세포 생존율은 제조사의 프로토콜에 따라 EZ-Cytox(DAEIL Lab, 대한민국)를 사용하여 평가하였다. 각 약물의 IC₅₀ 값은 프리즘(Prism) 소프트웨어를 사용한 비선형 회귀 분석(nonlinear regression analysis)에 의해 결정 및 계산되었다.

분석 결과는 약물 미처리 대조군과 비교하여 약물이 처리된 세포에서 세포 생존율의 백분율로 제시하였다. IC₅₀ 분석 이후 추가 실험을 위해, 2개의 1차 배양 AT/RT 세포(SNUH.AT/RT09 및 SNUH.AT/RT11)와 2개의 확립된 AT/RT 세포주(BT12 및 BT16)를 사용하였다.

3. 아이소볼로그램 분석 (Isobologram analysis)

다이설피람 기반 조합(시스플라틴과 다이설피람, 에토포시드와 다이설피람 및 4-HC와 다이설피람)의 상승적 또는 부가적 항-세포 생존력(anti-cell viability) 효과를 시험하기 위해, 상응하는 조합물을 각각 1 : 1 비율(0, 0.1, 1, 5, 10, 20, 50 및 100μM)로 비례하여 제조하였다. 상이한 조합에서의 상승작용(synergism), 부가작용(additivity) 또는 길항작용(antagonism)은 다중 약물 효과 방정식(multiple drug effect equation)에 기초하여 계산되었고, CompuSyn 소프트웨어(미국)를 사용하는 차우-탈라레이(Chou-Talalay) 알고리즘에 따라 Fa(fraction affected) >0.5인 조합 지수(combination index; CI)에 의해 정량화되었다. CI 값은 부가적(CI =1), 상승적 (CI <1) 및 길항적(CI >1)으로 해석되었다. Fa <0.5는 성장 억제 효과가 낮고 세포 집단의 많은 부분이 성장을 나타내기 때문에 관련성이 없는 것으로 간주되었다.

4. ALDEFLUOR 분석

ALDEFLUOR™ 분석은 기존에 알려진 방법에 따라 수행하였다(European Journal of Cancer, vol. 50, pp. 137-149, 2014). 음성 대조군으로는 ALDH 억제제 DEAB(Diethylaminobenzaldehyde)를 사용하였다. 유세포 분석은 FACSCalibur™ (BD Biosciences, 미국)에 의해 데이터를 획득하였다. ALDEFLUIR 형광은 488nm에서 계산하였고, 표준 FITC(fluorescein isothiocyanate) 530/30-nm 대역 패스 필터를 사용하여 형광 방출을 검출하였다.

5. ALDH 활성도 분석

ALDH 효소의 활성 분석은 제조사의 지침에 따라 비색(colorimetric) ALDH 활성 분석 키트(Abcam, 미국)을 이용하여 수행되었다. 간단히, 다이설피람 및/또는 시스플라틴을 처리한 세포(2×10⁶)를 준비하고, NADH 표준을 96-well 플레이트에 첨가한 후 ALDH 분석 버퍼(buffer)로 50μl/well이 되도록 조정하였다. 세포를 ALDH 분석 버퍼와 혼합하고 실온에서 20-60분 동안 배양한 후, 최종 생성물을 450nm 흡광도에서 측정하였다. ALDH 활성은 nmol/min/ml로 표현되었다.

6. 웨스턴 블롯 (Western blot)

약물 처리 후, RIPA(radioimmunoprecipitation assay) 버퍼(GenDEPOT, 미국)을 사용하여 단백질을 용해시킨 다음, 기존에 보고된 방법에 따라 웨스턴 블롯을 수행하였다(Neuro-oncology, vol. 19, pp. 1079-1087, 2017).

1차 항체는 pDNA-PKcs (1:1,000, Abcam, 미국), γ(1:2,000, Abcam), phospho-p53 (p-p53, 1:1,000, Abcam), phospho-C-Jun (p-C-Jun, 1:1,000, Abcam), C-Jun (1:1,000, Abcam), P38 (1:1,000, Abcam), phospho-p38 (p-p38, 1:1,000, Abcam), ATF3 (1:200, Cell Signaling), 절단된 PARP (1:1,000, Abcam), Survivin (1:5,000, Abcam) 및 β액틴 (1:5,000, Sigma-Aldrich)에 대하여 사용되었다.

밴드 밀도는 Image J 소프트웨어를 통해 분석되었다. 데이터는 상응하는 β액틴의 수준에 따라 표준화(normalize)하였다.

7. 동소 이종이식(orthotopic xenograft) 마우스 모델 및 다이설피람과 시스플라틴의 투여

실험에 사용된 모든 마우스는 서울대학교 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee; IACUC No. 18-0020-C1A0)에 의해 승인되었다. 7주령 암컷 BALB/c 누드 마우스는 30mg/kg 졸레틸(Zoletil) 및 10mg/kg 자일라진(Xylazine)의 복강내(intraperitoneal) 주사에 의해 마취하였다.

BT16 발현 루시퍼라제(BT16-effluc)는 기존에 알려진 방법에 따라 생물발광 이미징(bioluminescence imaging)에 사용하였다(Neuro-oncology, vol. 19, pp. 1079-1087, 2017). BT16-effluc 세포(3μl의 PBS 중 1.2×10⁶)는 1μl/min의 주입 속도로 해밀턴(Hamilton) 주사기를 사용하여 정위 장치(stereotaxic device)를 통해 뇌로 주입하였다. 정위 좌표는 브레그마(bregma)의 전방 1mm 및 측면 2mm, 경막(dura)으로부터 3mm 깊이로 선택되었다.

BT16-effLuc 세포를 주사하고 7일 경과 후, 마우스를 무작위로 식염수 처리군 (대조군), 다이설피람 처리군 (다이설피람), 시스플라틴 처리군 (시스플라틴) 및 다이설피람 및 시스플라틴 병용 처리군 (다이설피람+시스플라틴)의 네 그룹으로 분류하였다. 도 1의 약물 처리 계획에 나타낸 바와 같이, 마우스에 복강내 주사를 통해 5일 동안 매일 1회의 25mg/kg 다이설피람(총 5회, 총 125mg/kg) 및 5mg/kg 시스플라틴(총 1회) 주사를 한 세트로 하여, 2주에 걸쳐 2회 처리하였다. 첫째 날, 좌측 측면에서 다이설피람을 처리한 후, 우측 측면에서 시스플라틴을 처리하고, 병용 처리군에 순차적으로 두 약물을 주사하였다. 다이설피람의 투여 용량은 유효 용량(100mg/kg)의 1/4로 결정되었다.

장기 생존 분석의 경우 생존 종료점은 120일이었고, 마우스의 수는 대조군(N=12), 다이설피람 처리군(N=13), 시스플라틴 처리군(N=10) 및 다이설피람 및 시스플라틴 병용 처리군(N=14)과 같이 사용하였다. 54일의 종료점을 갖는 단기 종양 부피 분석을 위해, 각 그룹당 4마리 마우스를 사용하였다.

8. 생물발광 이미징(Bioluminescence imaging) 및 생존 분석

뇌종양의 성장은 Xenogen IVIS®이미징 시스템에 의한 생물발광 이미징을 통해 모니터링한 다음, 주사 후 63일까지 매 7일마다 이미징을 수행하였다. 생체 내 실시간 영상의 검출을 위해, 마우스에 150mg/kg D-루시페린(Caliper Life sciences, 미국)을 복강내 주사로 투여하였다. 100% O₂ 하에서 2% 아이소플루레인(isoflurane; Piramal Healthcare, 미국)으로 마우스를 마취시킨 후, 생물발광 신호를 1-3분 동안 기록함으로써 이미지를 획득하였다. 관심 영역에서의 발광 강도를 계산함으로써 신호를 분석하고 정량화하였다.

9. 종양 부피 및 면역형광분석

BT16-effluc 세포 주사 후 54일이 경과된 시점에, 조직학적 분석을 위해 마우스를 희생시켰다. 기존에 알려진 방법에 따라 심장 관류(cardiac perfusion)를 수행하고, 절편화(sectioning)을 위해 동결 블록을 제작하였다. 조직을 헤마톡실린 및 에오신(hematoxylin and eosin)으로 염색하여 조직병리학적 검사를 수행하였다. 면역형광 분석은 다음의 1차 항체를 사용하여 수행하였다: ALDH1 (1:100, Abcam), pDNA-PKcs (1:1000, Abcam), γ(1:1000, Abcam), ATF3 (1:50, Santa Cruz Biotechnology, 미국) 및 절단된 PARP (1:400, Abcam). 2차 항체로는 Alexa Fluor 594 또는 488이 접합된 anti-rabbit IgG 또는 Alexa Fluor 594가 접합된 anti-goat IgG (1:500; Invitrogen, 미국)를 사용하였고, 상기 절편은 DAPI(4′; Vector Laboratories, 미국)를 이용하여 마운팅하였다. 형광 이미지는 형광 현미경(Leica, DMi8, 독일)을 사용하여 얻었다. 양성 염색된 슬라이드의 정량은 최소 3 개의 무작위로 염색된 슬라이드로부터 수행되었다.

10. 통계적 분석

데이터는 평균±표준편차(SD) 또는 대조군의 백분율±SD로 나타내었다. 두 그룹 간의 통계 분석은 Student's t-test를 사용하여 분석되었고, 여러 그룹은 일원 분산분석(one way ANOVA)과 사후 테스트(post hoc test)를 사용하여 평가하였다. 생존 데이터는 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존 그래프로 나타냈으며, 로그-순위 검정(log-rank test)로 분석되었다. 통계적 분석은 Prism 5(GraphPad Software, 미국)를 사용하여 처리하였고, 각각의 실험은 적어도 독립적으로 3회 수행하였다. 0.05 이하의 P 값(P <0.05)을 갖는 차이는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.

실시예 1: 세포 독성에 대한 다이설피람 및 시스플라틴의 병용 처리 효과

4개의 1차 배양 AT/RT 세포인 SNUH.AT/RT05, SNUH.AT/RT08, SNUH.AT/RT09, SNUH.AT/RT11, 2개의 확립된 AT/RT 세포주 BT12, BT16 및 인간 신경 줄기세포주 HB1.F3에 대하여 각각의 약물(다이설피람, 시스플라틴, 에토포시드 및 4-HC)을 단독으로 처리한 후 IC₅₀ 값을 측정하였다. AT/RT 세포에서 각 약물의 평균 IC₅₀ 값은 다이설피람의 경우 12.01±10.79μM, 시스플라틴의 경우 34.56±16.96μM, 에토포시드의 경우 16.46±3.82μM, 4HC의 경우 33.08±30.78μM으로 나타났다(도 2a 참조). AT/RT 세포와 비교하여, HB1.F3 세포주는 4-HC를 제외한 다른 모든 약물에서 IC₅₀ 값이 더 높았다(다이설피람의 경우 33.99±8.98μM, 시스플라틴의 경우 59.55±9.35μM, 에토포시드의 경우 82.37±22.33μM, 4-HC의 경우 37.61±9.49μM). 또한, 4-HC를 50μM의 고농도로 처리한 경우 3가지 유형의 AT/RT 세포에서 IC₅₀이 관찰되지 않았다.

다이설피람과 시스플라틴의 또는 에토포시드의 조합이 상승적인 항-세포 생존력 효과를 발생시키는지 여부를 질적으로 평가하기 위해, CI(combination index) 및 Fa(fraction affected)을 계산하였다. 그 결과 도 2b 및 도 2c에서 나타난 바와 같이, 다이설피람의 병용 처리는 대부분의 AT/RT 세포에서 시스플라틴과 용량-의존적 상승작용을 나타냈다. 선택된 조합의 최적 농도에서, 다이설피람과 시스플라틴의 CI 및 Fa 값은 각각 SNUH.AT/RT09에서 1.07 및 0.89, SNUH.AT/RT11에서 0.57 및 0.86, BT12에서 0.45 및 0.80, 및 BT16에서 0.19 및 0.75 이었다(도 2d 참조). 다이설피람 및 시스플라틴의 조합에서 부가적 효과는 SNUH.AT/RT09에서 관찰되었지만, 에토포시드와의 조합의 경우 1차 배양 세포 중 하나가 모든 용량 조합에서 길항작용을 나타냄이 확인되었다. 가장 큰 상승작용을 보이는 약물 용량 및 IC₅₀ 미만의 전체 다이설피람+시스플라틴 조합이 추가 실험을 위해 선택되었다(각각 SNUH.AT/RT09 및 SNUH.AT/RT11의 경우 20 μM, BT12 및 BT16의 경우 5μM).

실시예 2: ALDH 활성도에 대한 다이설피람 및 시스플라틴의 병용 처리 효과

AT/RT 세포에서 대략 2.43±5.52%의 ALDH 양성 세포가 관찰되었다(SNUH.AT/RT09에서 3.49±1.84%, SNUH.AT/RT11에서 5.52±2.06%, BT12에서 2.43±1.10% 및 BT16에서 2.96±1.32%; 도 3a 참조).

다음으로, 다이설피람 또는 다이설피람과 시스플라틴의 병용 처리에 의한 ALDH 활성의 정량적 분석을 수행하였다. 그 결과 도 3b에 나타난 바와 같이, 다이설피람의 단독 처리는 대조군과 비교하여 SNUH.AT/RT09, SNUH.AT/RT11 및 BT-16 세포에서 ALDH의 활성을 2-3배 감소시켰다. 다른 세포와 달리, BT12 세포에서는 다이설피람의 단독 처리에 의해 ALDH 활성이 유의하게 감소되지 않았다. 놀랍게도, 병용 처리는 모든 1차 배양 세포 및 세포주에서 ALDH 활성을 각각 약 8배 및 10배 더 효과적으로 억제하였다(도 3b 참조).

실시예 3: 다이설피람 및 시스플라틴의 병용 처리에 따른 ATF3 조절을 통한 AT/RT 세포 사멸 유도 효과

병용 처리에 따른 상승효과와 관련된 분자적 메커니즘을 이해하기 위해, 먼저 세포 사멸로 이끄는 다이설피람 또는 시스플라틴의 몇몇 신호전달 경로에 관여하는 단백질의 발현 변화를 관찰하였다. 그 결과 도 4a 및 4b에 나타난 바와 같이, 대다수의 AT/RT 세포에서, 다이설피람 및 시스플라틴의 조합은 대조군 및 단독 처리와 비교하여 pDNA-PKcs, γATF3 및 절단된 PARP의 상승적 증가를 나타냈다. 그러나 상기 조합은 p-p38의 발현 수준에 있어서는 상승작용을 유발하지는 않았다. 또한, 병용 처리는 절단된 PARP를 극적으로 증가시킴으로써 세포 성장의 강력한 억제를 나타나게 하였다. 한편, Survivin은 대조군과 비교하여 유의하게 감소되었으며, 다이설피람 또는 시스플라틴의 단독 처리에 의해서도 어느 정도의 감소가 관찰되었다. 다이설피람 단독 처리는 γ-H2AX 및 ATF3의 증가를 초래했지만, 다른 단백질의 발현에는 영향을 미치지 않았다. 시스플라틴 단독 처리에 노출되었을 때에는, γ-H2AX는 증가하였고 p53 및 c-Jun의 인산화가 강력하게 상향 조절되었다(도 4b 참조).

실시예 4: AT/RT 마우스 모델에서 다이설피람 및 시스플라틴의 병용 처리에 따른 생존율 증가 효과

확립된 AT/RT 동물 모델에서 다이설피람 및 시스플라틴의 병용 투여 효과를 확인하기 위해, 상기 실험예 7에서 서술한 바와 같이 약물 처리 일정을 설계하였다(도 1 참조). 생물발광 이미징을 이용하여 생체 내 종양 세포의 성장 변화를 관찰하고, 67일 째에 해당하는 종료점에서 ROI(Region of interest) 및 생존율을 측정하였다.

그 결과 도 5a 내지 5c에 나타난 바와 같이, 병용투여군의 ROI는 대조군인 다이설피람 및 시스플라틴 단독 처리군과 비교하여 시간이 지남에 따라 현저하게 감소되는 것으로 나타났다. 장기 생존율의 중앙값(long-term median survival)에 대한 분석은 다이설피람과 시스플라틴 병용투여군(79.5일)이 대조군(58.5일), 다이설피람 단독투여군(69일), 및 시스플라틴 단독투여군(37일)보다 유의하게 더 오래 생존하였음을 보여주었다(도 5c). 장기 생존율 중앙값 결과는 다이설피람 및 시스플라틴의 병용 치료가 단일 약물 치료와 비교하여 더 오래 생존할뿐만 아니라 감소된 생물발광 신호를 가짐을 보여주었다(도 5a 및 5b).

또한, 마우스는 다이설피람의 단독 투여를 잘 견딜 수 있었고, 생존 기간의 중앙값은 69일이었으며, 투여 후에도 체중을 유지했지만(도 5d 참조), 병용 투여와 비교하였을 때 생물발광 신호를 줄이는 데는 효과적이지 않았다.

실시예 5: AT/RT 마우스 모델에서 다이설피람 및 시스플라틴의 병용 처리에 따른 종양 크기 감소 효과

상기 생물발광 이미징에서 관찰된 종양의 크기에 대한 더 정확한 분석 및 단백질 발현의 면역병리학적 확인을 위해 마우스 뇌 조직을 사용하였다. 다이설피람 및 시스플라틴 병용투여군의 종양 크기(3.68±4.39mm³)는 대조군(81.65 ±3.21mm³), 다이설피람 단독투여군(47.09±30.84mm³) 및 시스플라틴 단독투여군 (40.40±16.92mm³)과 비교하여 현저하게 작은 것으로 나타났다(도 6a).

한편, 마우스 뇌종양 조직에서의 면역형광 분석 결과, 병용 투여 및 다이설피람 단독 처리에 의해 ALDH1의 발현이 감소되는 반면, pDNA-PKcs, γATF3 및 절단된 PARP의 발현은 대조군 및 단독 처리군과 비교하여 유의하게 증가하는 것으로 나타났다(도 6b). 이러한 결과는 상기 실시예 3의 웨스턴 블롯 실험에서 밝혀진 단백질 발현 결과와 일치한다.

상기와 같은 실시예를 통해, 본 발명자들은 다이설피람과 시스플라틴의 조합이 AT/RT에 대해 상승적(synergistic)인 항암 효과를 가지며, 이는 또한 ATF3의 활성화와 함께 절단된 PARP의 강한 증가에 대한 신호전달 경로와 관련이 있음을 증명하였다(도 7 참조). 나아가, AT/RT 동물 모델에서 다이설피람과 시스플라틴의 병용 투여는 대조군 및 단독 투여군과 비교하여 효과적으로 종양 부피를 감소시키고 전체 생존율을 증가시킴을 보임으로써 본 발명을 완성하였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (11)

1. 다이설피람(disulfiram; diethylcarbamothioylsulfanyl N,N-diethylcarbamodithioate) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염; 및 시스플라틴[cisplatin; cis-diamminedichloroplatinum(II)]을 유효성분으로 포함하는, 비정형 유기형/간상 종양(Atypical teratoid/rhabdoid tumor)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
2. 삭제
3. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 암 세포의 아포토시스(apoptosis)를 유도하는 것을 특징으로 하는, 비정형 유기형/간상 종양의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 DNA-PKcs(DNA-dependent protein kinase, catalytic subunit)의 인산화를 촉진시키는 것을 특징으로 하는, 비정형 유기형/간상 종양의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
5. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 알데하이드 탈수소효소의 활성을 감소시키는 것을 특징으로 하는, 비정형 유기형/간상 종양의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
6. 삭제
7. 삭제
8. 제1항에 있어서,
   상기 다이설피람 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 시스플라틴과 동시에(simultaneous), 별도로(separate), 또는 순차적(sequential)으로 투여되는 것을 특징으로 하는, 비정형 유기형/간상 종양의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
9. 다이설피람(disulfiram; diethylcarbamothioylsulfanyl N,N-diethylcarbamodithioate) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 비정형 유기형/간상 종양에 대한 시스플라틴의 항암 증진용 약학적 조성물.
   
10. 제9항에 있어서,
    상기 조성물은 시스플라틴과 동시에(simultaneous), 별도로(separate), 또는 순차적(sequential)으로 투여되는 것을 특징으로 하는, 비정형 유기형/간상 종양에 대한 시스플라틴의 항암 증진용 약학적 조성물.
    
11. 제9항에 있어서,
    상기 조성물은 시스플라틴과 25 : 1 내지 50 : 1 (제9항의 조성물 : 시스플라틴)의 투여 용량(mg/kg) 비율로 투여되는 것을 특징으로 하는, 비정형 유기형/간상 종양에 대한 시스플라틴의 항암 증진용 약학적 조성물.

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