KR20120080579A - 암 치료와 예방에 있어 메트포르민의 사용 - Google Patents

Abstract

본 발명은 메트포르민의 강화시키는 양 및 하나 또는 그 이상의 화학요법제의 감소된 양의 투여를 포함하는, 필요로 하는 대상체에서의 종양의 치료 방법에 관한 것으로, 메트포르민의 강화시키는 양의 하나의 예는 약 250 mg/일이다. 또한 본 발명은 대상체에의 메트포르민의 유효량의 투여를 포함하는, 암의 예방 또는 암의 재발 지연 방법에 관한 것으로, 그러한 방법의 하나의 예는 메트포르민의 양이 약 75 mg/일인 것이다. 본 발명에서는 메트포르민의 강화시키는 양, 및 하나 또는 그 이상의 화학요법제의 감소된 양 및 약학적으로 수용가능한 운반체를 포함하는 조성물에 관해 기술하고, 또한 메트포르민과 하나 또는 그 이상의 화합요법제를 포함하는 키트를 제공한다.

Description

암 치료와 예방에 있어 메트포르민의 사용{USE OF METFORMIN IN CANCER TREATMENT AND PREVENTION}

본원은, 미국 가특허출원 제 61/236,778호(2009년 8월 25일 출원)에 관련하여 미국 특허법 제 119조(e)의 우선권의 이익을 주장하고, 이 출원은 그 전체가 본 명세서에 참고로서 원용된다.

본 발명은 미국 NIH에 의해 수여된 CA 57436 및 CA 107486 하의 정부 지원하에 이루어졌다.

본 발명은 종양을 치료하는 방법에 관한 것이다.

암에 대한 화학요법(chemotherapeutic) 치료는 효과적으로 종양 괴(tumor mass)를 줄일 수 있지만, 질병이 종종 재발하게 되고, 이 현상을 설명하기 위해, 암줄기세포 가설(cancer stem cell hypothesis)에서는, 종양이 비종양형성암세포(non-tumor-forming cancer cells) 집단 내에 소수의 종양형성(tumor-forming), 자가재생(self-renewing) 암줄기세포를 포함한다고 한다(선행기술문헌 1, 2). 종양 내 대부분의 세포와 달리 암줄기세포는 확립된 화학요법에 저항성을 가지며, 치료 후에, 그들의 줄기세포 유사 거동(stem cell-like behavior)을 통해 종양의 모든 세포 종류를 재생할 수 있다. 이러한 이유로 현재는 어떠한 것도 알려져 있지 않지만, 선택적으로 암줄기세포를 표적으로 하는 약물이 암 치료에 있어 큰 가능성을 제공한다.

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본 발명의 한 측면은 메트포르민(metformin)의 강화시키는 양 및 하나 또는 그 이상의 화학요법제(chemotherapeutic agents)의 감소된 양의 투여를 포함하는, 필요로 하는 대상체에서의 암/종양치료 방법에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 메트포르민의 강화시키는 양은 250 mg/일이다.

본 발명의 다른 측면은 메트포르민의 강화시키는 양, 및 하나 또는 그 이상의 화학요법제의 감소된 양 및 약학적으로 수용가능한 운반체(pharmaceutically acceptable carrier)를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 메트포르민의 강화시키는 양은 약 25 mg, 75 mg, 250 mg 이다.

본 발명의 다른 측면은 유효량의 메트포르민의 대상체에의 투여를 포함하는, 대상체에서의 암의 예방 방법 또는 암의 재발 지연 방법에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 메트포르민의 양은 약 75 mg/일이다.

본 발명의 또 다른 측면은 메트포르민 바이알(vial), 하나 또는 그 이상의 화학요법제 바이알, 메트포르민과 화학요법제의 병용에 관한 지시를 포함하는 키트에 관한 것이다.

도 1A - 도 1B는 메트포르민이 MCF10A-ER-Src 세포의 형질전환(transformation)을 방지하는 결과를 나타내는 실험데이터의 그래프이다. 도 1A: 1μM 4-히드록시 타목시펜(4-hydroxy tamoxifen, TAM)의 존재 또는 부존재 하에서, 지시된 농도의 메트포르민과 함께 두었을 때 24시간 동안 증식한 세포 수. 도 1B: 지시된 농도의 메트포르민의 존재 하에서 처리되지 않거나 TAM 처리된 세포에서 병소(foci), 연질 아가(agar)에서의 콜로니(colonies), 맘모스피어(mammospheres)의 상대적인 수.
도 2는 메트포르민이 맘모스피어의 증식을 억제하는 실험 결과를 나타내는 막대그래프이다. 지시된 세포주(cell lines)로부터의 6일 된 맘모스피어를 48시간 동안 0.1 mM 메트포르민으로 처리하거나 처리하지 않은 다음 맘모스피어의 수를 측정하였다.
도 3A - 도 3C는 메트포르민이 선택적으로 암줄기세포를 치사하고 독소루비신(doxorubicin)과 함께 상승적으로 작용하는 결과를 나타내는 실험데이터의 그래프이다. 도 3A: 독소루비신, 0.1 mM 메트포르민, 또는 상기 둘이 함께 처리된, 형형질전환된(36시간 동안 TAM 처리) MCF-10A 집단(n=3)에서 암줄기세포(CD44고/CD24저; 흑색)와 암세포(CD44저/CD24고; 회색)의 수. 도 3B: 분류하여 얻어진 암줄기세포(SC)와 비줄기암세포(NSC)는 0.1 mM 메트포르민으로 0, 24, 48시간 동안 처리되었다. 도 3C: 주입하기 한 시간 전에 0.1 mM 메트포르민으로 처리하거나, 처리하지 않은 MCF10A-ER-Src 암줄기세포를 주입한 후 지시된 일수(number of days)에서의 누드마우스들의 종양 부피.
도 4A - 도 4B는 메트포르민과 독소루비신이 조합해서 누드마우스에서 종양 괴를 줄이고 관해(remission)를 연장시키는 작용을 한다는 결과를 나타내는 실험 데이터의 그래프이다. 도 4A: 5일마다(3주기; 화살표는 일(day) 또는 주입을 의미한다) 4 mg/kg 독소루비신(Dox), 100 ㎍/ml 메트포르민(Met), 또는 이들 둘 다를 복강내주사를 통해 처리하거나, 처리하지 않은 형질전환된 MCF10A-ER-Src세포가 주입된(시간 0은 주입한 때를 의미) 마우스의 종양 부피(평균값, 95% 신뢰구간을 가짐). 도 4B : 3주기 처리 후에(25일) 독소루비신이나 독소루비신+메트포르민의 조합으로 처리된 종양으로부터 얻어진 세포에서의 암줄기세포(CD44고/CD24저)의 수.

암줄기세포 가설에 의하면, 종양 내 대부분의 암세포와 달리, 암줄기세포는 화학요법제에 대한 저항성이 있고 종양에서 다양한 세포 종류를 재생할 수 있어 질병을 재발시킬 수 있다. 따라서 선택적으로 암줄기세포를 표적으로 하는 약물은, 특히 화학요법과 조합하여, 암치료에 큰 가능성을 제공한다. 여기서, 당뇨병의 표준 약물인 메트포르민의 저용량은 세포의 형질전환을 억제하고 유전적으로 상이한 4종류의 유방암의 암줄기세포를 선택적으로 치사한다. 메트포르민과 확립된 화학요법제인 독소루비신을 조합하면 배양에서 암줄기세포와 비줄기암세포를 모두 치사할 수 있다. 게다가 이러한 조합 치료는 이종이식(xenograft) 마우스 모델에서 어느 약물 단독보다 더 효과적으로 종양 괴를 감소시키고 재발을 방지한다. 메트포르민과 독소루비신에 의한 조합 치료가 끝나고 적어도 두 달 간은 마우스는 종양이 없는 채로 있다. 이러한 결과들은 암줄기세포 가설을 지지하는 추가적 증거를 제공하고 유방암 및 다른 암 환자의 치료를 향상시키기 위해 메트포르민과 화학요법제를 조합하여 사용하는 이유 및 실험적 근거를 제공한다.

본 발명은 메트포르민이 치료요법(예를 들어 암 치료법)에 사용되는 화학요법제의 항종양 효과(anti-tumor effects)를 강화시킨다는 발견에 근거한 것으로, 항종양 효과를 나타내는데 필요한 화학요법제의 양이 감소하게 된다. 화학요법제 양의 감소는 수용자가 받는 화학요법제에 의한 부작용을 줄이는 결과를 가져온다. 따라서, 본 발명의 한 측면은 화학요법제의 항종양 효과를 증가시키는 방법, 즉, 필요로 하는 환자에의 메트포르민의 강화시키는 양 및 화학요법제의 감소된 양의 투여를 포함하는 방법이다.

정의

본 명세서에서 사용되는 "세포독성제(cytotoxic agent)"는 비정상적이고 비통제된 진행성 세포 증식을 치료하는데 사용되는 물질을 의미한다. 바람직한 세포독성제에는 예를 들어, 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 시타라빈(cytarabine), 6-메르캅토푸린(6-mercaptopurine), 6-티오구아닌(6-thioguanine), 빈크리스틴(vincristine), 독소루비신(doxorubicin), 그리고 다우노루비신(daunorubicin), 클로람부실(chlorambucil), 카르무스틴(carmustine), 빈블라스틴(vinblastine), 메토트렉세이트(methotrexate), 그리고 파클리탁셀(paclitaxel)이 포함된다.

본 명세서에서 사용되는 메트포르민의 "강화시키는 양"은 화학요법제(예를 들어, 세포독성제) 또는 치료(예를 들어, 방사선 치료)에 있어 통계상 의미있고, 재현 가능한 항종양 효과의 강화를 만들어 내기에 충분한 양을 의미한다. 항종양 효과의 강화는 종래기술에서 알려진 다양한 방법을 통하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 항종양 효과의 강화는 항종양 효과를 나타내는데 필요한 물질의 투약량 또는 치료량의 통계상 의미있는 감소를 통해 측정될 수 있다. 이는 예를 들어, 메트포르민이 없는 기준량의 치료를 받은 적절한 대조군과 비교함에 의해 측정될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 "화학요법제(chemotherapeutic agent)"는 종양의 치료에 있어 사용되는 화학 물질(chemical) 또는 약물을 의미한다. 그러한 물질은 종종 세포독성제이다.

본 명세서에서 사용되는 "방사선 치료(radiation therapy)"는 암세포를 치사하고 종양을 축소시키기 위한 전리방사선(ionizing radiation)을 사용한 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는, 화학요법제(예를 들어, 세포독성제) 또는 치료의 "감소된 양"은 종양치료를 위해 종양으로 고통받는 대상체에게 투여되어 동일하거나 더 좋은 치료 결과를 만들어내는 표준량 미만의 양을 의미한다. 화학요법제 또는 종양치료의 감소된 양을 사용하는 이점의 하나는 동일 또는 그 이상의 치료결과와 함께, 그 치료를 받은 수용체에서 발생하는 부작용을 줄일 수 있다는 점이다. 양의 감소는 하나 또는 그 이상의 개별 투여량(용량)의 감소, 투여빈도의 감소, 또는 그의 복합적인 감소가 될 수 있다. 표준용량과 투여 일정 계획(administration schedules regimen)의 지도는 숙련된 의사에게 제공된다(예를 들어, Physicians' Desk Reference, 56. sup.th Ed. (2002) Publisher Edward R. Barnhart, New Jersey ("PDR")). 감소된 양은 통상적으로 치료 투약에 사용되는 표준용량보다 현저하게 낮다(예를 들어, 표준용량의 약 90%, 80%, 또는 70%로 줄어듬). 어떤 경우, 치료적 이점은 표준용량의 75% 미만으로 감소된 용량을 투약하여 얻어질 것이다(예를 들어, 투약은 표준용량의 약 75%에서 25% 내). 치료적 이점은 표준용량의 약 60%, 50%, 또는 40%로 감소된 용량을 투약함으로써 얻어질 것으로 예상된다. 어떤 경우에는 치료적 이점이 표준용량의 40% 미만의 용량을 투약하여 얻어질 것이다(예를 들어, 투약은 표준용량의 약 40%에서 10% 내). 일 실시 형태에서는, 용량이 표준용량의 약 30%이다. 일 실시 형태에서는, 용량이 표준용량의 약 20%이다. 일 실시 형태에서는, 용량이 표준용량의 약 10%이다.

본 명세서에서 사용되는 "항종양 효과(anti-tumor effect)" 또는 "항암효과 (anti-cancer effect)"는 종양증식, 증식속도, 크기, 확산, 전이를 감소시키는 것뿐만 아니라 개체의 종양 발생 및/또는 재발을 방지하는 것을 의미한다.

"치료" 혹은 "대상체의 치료"라는 용어는 바람직하지 않은 생리적 또는 의학적 상태가 발생하거나 악화되는 것을 방지하거나, 인간 또는 동물인 대상체에 있어 그러한 상태를 개선하기 위한 목적으로 대상체에게 의학적인 도움을 주는 것을 의미한다. 달리 기술하지 않는 경우, "치료"라는 용어는 어느 특정 기간 또는 어느 특정 용량 수준에 한정되지 않는다.

"조성물" 혹은 "제약 조성물(pharmaceutical composition)" 은 본 명세서에서 대체적으로 사용되고, 종래기술에서 일반적이고, 대상체에 투여하기 적합한 약학적으로 수용가능한 운반체와 같은 부형제를 통상적으로 포함하는 조성물 또는 제제(formulation)를 가리킨다. 상기 조성물은 특히 구강, 안구, 비강 투여 등을 포함하나 이에 국한되지 않는 하나 또는 그 이상의 경로를 통한 투여를 위해 제제화된다.

"약학적으로 수용가능한 운반체(pharmaceutically acceptable carrier)"는 대상체에게 표적 운반 조성물을 혼합 및/또는 전달하는 어떤 약학적으로 수용가능한 수단을 의미한다. 본 명세서에서 사용된 "약학적으로 수용가능한 운반체"는 하나의 기관이나 몸의 일부분에서 다른 기관이나 몸의 다른 부분으로 대상 물질을 운반 또는 수송하는 것과 관련된 약학적으로 수용가능한 물질, 조성물 또는 매개체(vehicle), 예를 들어, 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질을 의미한다. 각각의 운반체는 제제의 다른 성분과 양립할 수 있어야 하고 인간과 같은 대상체에 투여하기에 적합하다는 면에서 반드시 "수용가능해야" 한다.

본 명세서에서 사용된 "대상체"는 포유류, 조류, 파충류, 양서류 또는 어류등의 동물을 말한다. 용어 "포유류"는 단수의 "포유류"와 복수의 "포유류"를 모두 포괄하는 것으로; 인간, 에이프(ape), 원숭이, 오랑우탄, 침팬지 같은 영장류; 개나 늑대와 같은 갯과의 동물; 고양이, 사자, 호랑이와 같은 고양잇과의 동물; 말, 소, 당나귀, 얼룩말과 같은 말과의 동물, 소, 돼지, 양과 같은 식용동물; 사슴, 기린과 같은 유제류; 마우스, 토끼, 래트, 햄스터, 기니피그와 같은 설치류를 포함하나, 이에 국한되지 않는다.

"개체", "대상체", "환자"는 서로 대체적으로 사용할 수 있고 동물, 예를 들어, 인간과 같은 포유류를 의미한다.

본 명세서에서 사용된 "메트포르민"이라는 용어는 메트포르민 또는 그 약학적으로 수용가능한 염, 예를 들어 염산염(hydrochloride salt), 메트포르민(2:1)푸마르산염(fumarate salt), 메트포르민(2:1)숙신산염(succinate salt)(1999년 3월 4일자 미국출원 제 09/262,526호에 개시), 브롬화수소산염(hydrobromide salt), p-클로로페녹시 아세테이트(p-chlorophenoxy acetate) 또는 엠보네이트(embonate), 그리고 그 외에 알려진 1 염기성 및 2 염기성의 카복시산의 메트포르민염(미국특허 제 3,174,901호에 개시된 것을 포함)을 총체적으로 지칭한다. 본 발명에서 채용하는 메트포르민은 주로 메트포르민 염산염, 즉, Glucophage.RTM(Bristol-Myers Squibb Company의 상표)으로 판매되고 있는 것을 말한다.

본 명세서에서 사용된 "유도체(derivative)"라는 용어는 비슷한 화학적 구조와 기능을 가지는 화합물을 지칭한다.

본 명세서와 첨부된 청구항에서, 문맥상 명확하게 달리 표현하지 않더라도 단수 표현은 복수 표현을 포함한다. 따라서 예를 들어, "약물"을 운반하기 위한 조성물은 둘 또는 그 이상의 약물을 포함하는 표현이다. 본 발명을 설명하고 청구하는데 있어서, 다음에 나오는 용어는 명시된 정의에 따라 사용될 것이다.

본 발명의 다른 측면은 대상체의 종양을 치료하는 동안 화학요법제의 부작용을 줄이는 방법, 메트포르민의 강화시키는 양 및 화학요법제의 감소된 양의 대상체에의 투여를 포함하는 방법에 관한 것으로서, 화학요법제의 감소된 양의 투여는 화학요법제의 통상적인 투여량과 비교해볼 때 부작용을 덜 일으킨다. 본 발명은 메트포르민의 강화시키는 양 및 하나 또는 그 이상의 화학요법제의 감소된 양을 포함하는 종양 억제 제약 조성물에 관한 것으로서, 화학요법제(들)의 종양 억제량은 부작용을 감소시키는 결과를 가져오는 양이다.

본 명세서에 기재된 방법의 일 실시 형태에서는, 화학요법제는 암줄기세포를 억제하지 못한다. 본 명세서에 기재된 다른 실시 형태에서는, 화학요법제는 암줄기세포를 억제한다. 암줄기세포의 억제 및 비억제 화학요법제와의 조합 치료도 고려된다.

일 실시 형태에서, 메트포르민의 강화시키는 양을 표준 화학요법제의(예를 들어, 감소된 양의) 혼합제(cocktail)와 함께 종양(예를 들어, 암) 제거 수술 후의 환자에게 투여한다.

메트포르민의 공동 투여의 효과는, 여기서 논의된 것처럼, 항종양치료의 다른 형태(예를 들어, 인터페론 치료와 같은 호르몬 치료, 또는 방사선 치료)를 향상시킬 것으로 기대된다. 즉, 본 명세서에 기재된 화학요법제를 사용한 치료 방법은, 메트포르민의 강화시키는 양의 사용 및 이들 다른 형태의 종양치료 및 그에 상응하는 치료제의 투여 및/또는 빈도의 감소된 양의 사용에 의해 대체적으로 수행될 수 있다. 하나 또는 그 이상의 치료의 조합과 함께, 및/또는 여기에 기재한 하나 또는 그 이상의 다른 치료와 조합하여 메트포르민의 강화시키는 양을 사용하는 것도 고려된다.

메트포르민 공동 투여의 효과는 여기서 논의된 바와 같은, 종양/암 세포를 치사하는 다른 물질의 효과를 강화시킬 것으로 또한 예상된다. 이는 세포의 형질전환에 영향을 주는 약물(예를 들어, 엑센딘-4(exendin4), 아스피린(aspirin), 멜록시캄(meloxicam), 인도메타신(indomethacin), 셀레콕시브(celecoxib), 피록시칸(piroxican), 니메설파이드(nimesulfide), 술린닥(sulindac), 톡실리주맵(tocilizumab), 심바스타틴(simvastatin), 세룰레닌(cerulenin), 메바스타틴(mevastatin))과 같이 전통적으로 화학요법에 쓰이지 않은 다른 물질(예를 들어, 약물)을 포함한다. 이런 물질들은 메트포르민의 공동 투여로 인한 상승/강화 분석을 통해 시험될 수 있다(예를 들어, 본 명세서에서 기재된 세포 분석(cell assay)). 즉, 본 명세서에 기재된 화학요법제 사용에 의한 치료 방법은 메트포르민의 강화시키는 양의 사용 및 이들 다른 종양/암 치사 물질의 투여 및/또는 빈도의 감소된 양의 사용에 의해 대체적으로 수행될 수 있다. 종양/암 세포를 치사할 수 있는 그러한 물질에는 항체(예로, anti-HER2), 타목시펜 그리고 형질전환을 억제하는 그 외의 화합물이 포함되나 이에 국한되지 않는다. 하나 또는 그 이상의 치료 및/또는 물질의 조합과 함께, 및/또는 하나 또는 그 이상의 다른 치료법 및/또는 여기에 기재한 물질과 조합하여 메트포르민의 강화시키는 양을 사용하는 것도 고려된다.

주어진 화학요법제나 치료를 강화하여 대상체에 주어지는 양을 줄일 수 있는 메트포르민의 능력은 숙련된 의사의 능력 내이다. 예를 들어, 화학요법제 또는 종양치료의 강화는, 메트포르민 투여와 조합한 경우를 메트포르민 투여가 결여된 하나 또는 그 이상의 적절한 대조군과 비교해 볼 때, 그 물질이나 치료의 증가된 효능에 의해 증명된다. 치료의 효능은 통상적으로 숙련된 의사에 의해서 판단될 수 있다. 효능은 암과 종양의 동물 모델, 예를 들어, 암을 가진 설치류의 치료에 의해 평가받을 수 있고, 어떤 치료나 조성물 또는 제제의 투여가 적어도 종양의 한가지 증상을 감소시키면, 예를 들어, 종양의 크기를 감소시키거나 종양의 증식속도를 느리게 혹은 멈추게 하면, 효과적인 치료임을 나타낸다.

어떤 주어진 제제의 효능은 암의 실험 동물 모델, 예로 야생형 마우스 또는 래트, 또는 바람직하게는 아래의 실시예에 기재된 바와 유사한 종양 세포의 이식을 이용하여 판단될 수 있다. 실험 동물 모델을 사용하는 경우, 치료의 효능은 종양의 증상이 감소하는 때에, 예를 들어, 종양의 크기가 줄어들거나 종양의 증식속도를 느리게 혹은 멈추게 하는 것이 치료하지 않은 동물에 비해 치료한 동물에서 일찍 일어나는 경우에, 증명된다. "일찍"의 의미는 예를 들어, 종양 크기의 감소가 적어도 5% 일찍 일어나는 경우, 바람직하게는 그보다 더 빠르게, 예를 들어, 1일, 2일, 3일 또는 그 이상 일찍 일어나는 것을 말한다.

하기 실시예 부분에 상세하게 나타낸 실험에서는 메트포르민이 선택적으로 암줄기세포를 치사하는 것으로 나타나고 그러한 치사는 암줄기세포가 상대적으로 저농도의 메트포르민에 노출되어 있을 때 발생한다. 즉, 본 발명의 다른 측면은 대상체에게 메트포르민을 투여하는 것을 포함하는, 대상체 내의 종양/암을 예방하거나 그 발달을 지연시키는 방법에 관한 것이다. 그러한 대상체는, 예를 들어, 종양을 발달시키는 성향이 있을 수 있다(예를 들어, 유전적으로 혹은 발암물질로 인해). 그러한 유전적 성향의 예는 brca1, brcaⅡ, rb 또는 p53 유전자의 돌연변이를 일으키는 성향을 갖는 것을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 일 실시 형태에서, 대상체는 이전에 화학요법 또는 방사선치료를 받아왔고 2차 암 발생의 위험이 높다. 그러한 일 예는 어린 시절 백혈병이나 림프종(lymphoma) 치료를 받은 대상체이다. 일 실시 형태에서, 메트포르민은 본 명세서에 기재된 방법에 의해 투여되고, 전암성 병변(precancerous lesion)(예를 들어, 피부 병변)에 접촉해서 병변이 암으로 발전하는 것을 막는다. 다른 실시 형태에서는, 메트포르민이 그러한 병변의 제거 후에 투여된다(예를 들어, 제거 부위에 접촉하는 것).

본 발명의 다른 측면은 혈액암의 치료에 있어서 자가조직의 이식에 앞서, 메트포르민에 의한 골수 또는 말초골수줄기세포 샘플의 치료, 그로 인한 암줄기세포의 감소에 관한 것이다. 그러한 치료는 줄기세포 재접종의 가능성을 감소시킬 것이다. 일 실시 형태에서, 메트포르민은 이식을 받은 환자에게 이식이 일어난 후에 투여될 수 있다(예를 들어, 이식 다음에 여러 날, 여러 주, 여러 달, 여러 해 동안).

본 발명의 다른 측면은 장기간의 암 예방을 위하여 대상체에 저용량의 메트포르민을 투여하는 것에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 그러한 투여는 메트포르민을 추가한 식이 보조제나 보통 식품의 형태로 이루어진다(예를 들어, 개 먹이, 고양이 먹이, 또는 일상적으로 주는 가축 먹이와 같은 배합 동물 먹이). 그러한 식품과 식이 보조제의 제제 또한 본 발명에 포함된다.

본 발명의 다른 측면은 메트포르민 유도체의, 화학요법제, 종양치사물질, 그리고 암세포 치사를 위한 그 밖의 치료를 강화시키는 능력을 시험하는 분석에 관한 것이다. 이하의 실시예 부분에 기재되어 있는 세포 분석은 숙련된 기술자에 의해 조정될 수 있다.

용량과 투여량

치료의 적용에 있어, 사용되는 화학요법제 또는 치료의 표준용량(standard dosages)과 투여 일정(administration schedule)은 많은 변수, 예를 들어, 투여되는 세포독성제 또는 치료요법의 조합, 종양의 종류, 나이, 몸무게, 그리고 치료를 받는 환자의 임상 조건, 투여 경로, 그리고 치료를 투여하는 임상의(clinician) 또는 의사의 경험과 판단에 따라 다양할 수 있다. 그러나 본 발명은 그러한 용량 및/또는 투여 일정을 상당히 줄일 수 있고, 그렇게 함으로써 치료에 따른 부작용을 줄일 수 있다.

일 실시 형태에서, 투여되는 메트포르민의 양은 보통 제2형 당뇨병(type 2 diabetes)의 치료적 투여에 통상 사용되는 표준용량이 될 수 있다(약 1500 mg/일에서 약 2550 mg/일). 다른 실시 형태에서, 메트포르민의 치료적 양(예를 들어, 화학요법에 의한 종양치료를 강화시키는데 사용되거나 종양의 발달을 막는데 사용되는)은 제2형 당뇨병의 치료적 투여에 통상 사용되는 표준용량보다 현저하게 낮다(예를 들어, 표준용량의 약 90%, 약 1350 mg/일, 80%, 또는 약 1200 mg/일, 또는 70%, 또는 약 1050 mg/일로 줄어듬). 어떤 경우, 치료적 이점은 표준용량의 75% 미만으로 감소된 용량을 투여함으로써 얻어질 것이다(예를 들어, 표준용량의 약 75%, 또는 약 1125 mg/일 ~ 25% 또는 약 375 mg/일 내로 투여). 또한 치료적 이점은 표준용량의 약 60% 또는 약 900 mg/일, 50%, 또는 약 750 mg/일, 40% 또는 약 600 mg/일로 감소된 용량을 투여함으로써 얻어질 것으로 예상된다. 어떤 경우는 치료적 이점이 표준용량의 40% 미만으로 감소된 용량을 투여함으로써 얻어질 것이다(예를 들어, 표준용량의 약 40%에서 10% 내로, 또는 약 600mg/일에서 약 150mmg/일 내로 투여). 일 실시 형태에서, 용량은 표준용량의 약 30% 또는 약 450 mg/일이다. 일 실시 형태에서, 용량은 표준용량의 약 20% 또는 약 300mg/일이다. 일 실시 형태에서, 용량은 표준용량의 약 10% 또는 약 150mg/일이다.

투여가 행해지면 투여된 물질들(예를 들어, 메트포르민 및 화학요법제)이 종양 또는 종양 부위(예를 들어, 종양의 제거 후에)에 접촉하게 된다. 투여의 적합한 경로는 종래기술에 알려져 있다. 여기서 기재된 물질들은 임상의에 의해 발견된 어떤 방식에 의해서든 투여가 이루어질 수 있고 그러한 것들은 Physicians' Desk Reference, 56. sup.th Ed. (2002) Publisher Edward R. Barnhart, New Jersey ("PDR")에 기재되어 있다. 예를 들어, 비경구적으로, 소화관 내로, 국소적으로 투여가 이루어질 수 있다. 조합된 물질 또는 각각의 물질은 개별적으로 종래기술에서 알려진 임의의 수단을 통해 투여될 수 있다. 이러한 방식은 구강, 직장, 비강, 국소(볼 및 혀 밑을 포함하는), 또는 비경구(피부 밑, 근육 내, 정맥 내, 진피 내를 포함하는) 투여를 포함한다. 메트포르민 및 강화된 물질은 전신적으로, 또는 국부적으로, 또는 종양 부위에 근접하여 투여될 수 있다(예를 들어, 종양으로 또는 종양이 있는 기관 또는 몸의 일부분으로의 주입에 의해). 일 실시 형태에서, 메트포르민과 강화된 치료 물질(예를 들어, 화학요법제)은 중추신경계로 투여된다.

투여는 수술 전 또는 후, 또는 전후 모두에 이루어질 수 있다. 일 실시 형태에서, 메트포르민은 종양제거 수술 전에, 한 달 동안 하루에 세번(예를 들어, 25mg/용량) 투여될 수 있다.

본 명세서에 기재된 방법에 의한 메트포르민의 투여(화학요법제와 함께 적용되는 때)는 오랜 기간 동안 계속될 수 있다(예를 들어, 6 - 12개월간 또는 1, 2, 3년간, 또는 무기한으로). 일 실시 형태에서는, 메트포르민이 화학요법제보다 더 자주 투여된다. 예를 들어, 대상체는, 메트포르민은 일 단위(예를 들어, 250 mg/일)로 투여받으면서 화학요법제(예를 들어 독소루비신)를 3 일/월 등의 다른 처방보다 훨씬 낮은 빈도로 투여받을 수 있다.

일반적으로, 예정된 용량 및 투여는 종양의 증식을 느리게, 바람직하게는 퇴행(regression)하게 하고 또한 바람직하게는 종양의 완전한 퇴행을 일으키는 결과가 나타나기에 충분해야 한다. 어떤 경우, 퇴행은 종양 특이적 표지자(tumor specific markers)의 혈중 농도 감소로 관찰될 수 있다. 제약 물질의 유효량은 임상의나 다른 자격을 갖춘 관찰자에 의해 알 수 있을 정도로 객관적으로 인식 가능한 호전이 생기는 것이다. 환자의 종양의 퇴행은 일반적으로 종양의 직경을 참조하여 측정된다. 종양의 직경이 줄어들면 퇴행을 나타낸다. 종양의 퇴행은 또한 치료가 중단된 후 종양의 재발이 일어나지 않는 것으로도 나타난다.

메트포르민과 화학요법제의 조합, 또는 각각은 주기적인 간격으로 전달되는데 하루에 몇 번에서 한 달에 한 번까지 다양할 수 있다. 위에 언급했듯이, 바라는 치료 성과가 얻어질 때까지 물질이 투여된다. 덧붙여, 부작용을 줄이기 위해서, 조합의 모든 요소가 각각의 투여로 전달되어야 하는 것은 아니다.

치료 물질

현재 입수 가능한 세포독성제는 그들의 작용 메커니즘에 따라 4개의 군으로 크게 나뉘어 질 수 있다: 알킬화제(alkylating agents), 대사억제제(anti-metabolites), 항생제(antibiotics), 그리고 기타 다른 작용 물질. 개체의 암을 치료하기 위한 특정 세포독성제의 선택은 암의 종류, 나이 그리고 환자의 건강, 그리고 다약물내성(multidrug resistance)의 문제 등 많은 요인에 의해서 영향을 받는다.

본 발명의 조성물은 아래의 물질들(가능한 공급원을 포함)을 포함하나 이에 국한되지 않는 다양한 세포독성제를 활용할 수 있다: 알킬화제 시클로포스파미드 ( (Bristol-Meyers Squibb), 이포스파미드 (Bristol-Meyers Squibb), 클로람부실 (Glaxo Wellcome), 그리고 카르무스틴 (Bristol-Meyers Squibb); 대사억제제 시타라빈 (Pharmacia & Upjohn), 6-메르캅토푸린 (Glaxo Wellcome), 6-티오구아닌 (Glaxo Wellcome), 그리고 메토트렉세이트 (Immunex); 항생제 독소루비신(Pharmacia & Upjohn), 다우노루비신(NeXstar), 및 미톡산트론 (mitoxantrone) (Immunex); 및 빈크리스틴 (Lilly), 빈블라스틴 (Lilly), 그리고 파클리탁셀 (Bristol-Meyers Squibb)과 같은 기타 물질. 바람직한 세포독성제에는 시클로포스파미드, 이포스파미드, 시타라빈, 6-메르캅토푸린, 6-티오구아닌, 독소루비신, 다우노루비신, 미톡산트론, 그리고 빈크리스틴이 포함된다. 그 중에서도 시클로포스파미드와 이포스파미드가 가장 바람직하다.

화학요법제는 종래기술에 알려져 있고, 적어도 탁산(taxanes), 질소 머스타드(nitrogen mustards), 에틸렌이민 유도체(ethylenimine derivatives), 알킬 술폰네이트(alkyl sulfonates), 니트로소우레아(nitrosoureas), 트리아젠(triazenes); 폴산 유사체(folic acid analogs), 피리미딘 유사체(pyrimidine analogs), 푸린 유사체(purine analogs), 빈카 알칼로이드(vinca alkaloids), 항생제, 효소(enzymes), 백금 배위 착물(platinum coordination complexes), 치환 우레아(substituted urea), 메틸 하이드라진 유도체(methyl hydrazine derivatives), 부신피질 억제제(adrenocortical suppressants), 또는 안타고니스트(antagonists)를 포함한다. 구체적으로, 화학요법제는 스테로이드(steroids), 프로게스틴(progestins), 에스트로겐(estrogens), 안티에스트로겐(antiestrogens), 또는 안드로겐(androgens)을 포함하되 이에 국한되지 않게 이루어진 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 물질이 될 수 있다. 더 구체적으로는, 화학요법제는 아자리빈(azaribine), 블레오마이신(bleomycin), 브리오스타틴-1(bryostatin-1), 부술판(busulfan), 카르무스틴, 클로람부실, 카르보플라틴(carboplatin), 시스플라틴(cisplatin), CPT-11, 시클로포스파미드, 시타라빈, 다카르바진(dacarbazin), 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신, 덱사메타손(dexamethasone), 디에틸스틸베스트롤(diethylstilbestrol), 독소루비신, 에티닐 에스트라디올(ethinyl estradiol), 에토포사이드(etoposide), 플루오로우라실(fluorouracil), 플루옥시메스테론(fluoxymesterone), 겜시타빈(gemcitabine), 히드록시프로게스테론 카프로에이트(hydroxyprogesterone caproate), 히드록시우레아(hydroxyurea), L-아스파라기나아제(L-asparaginase), 류코보린(leucovorin), 로무스틴(lomustine), 메클로레타민(mechlorethamine), 메드로프로게스테론 아세테이트(medroprogesterone acetate), 메게스트롤 아세테이트(megestrol acetate), 멜파란(melphalan), 메르캅토푸린, 메토트렉세이트, 미트라마이신(mithramycin), 미토마이신 (mitomycin), 미토탄(mitotane), 파클리탁셀, 페닐 부티레이트(phenyl butyrate), 프레드니손(prednisone), 프로카르바진(procarbazine), 세무스틴 스트렙토조신(semustine streptozocin), 타목시펜, 탁산, 탁솔(taxol), 테스토스테론 프로피오네이트(testosterone propionate), 탈리도마이드(thalidomide), 티오구아닌, 티오테파(thiotepa), 우라실 머스타드(uracil mustard), 빈블라스틴, 또는 빈크리스틴이 될 수 있다. 화학요법제들의 어떤 조합의 사용도 고려될 수 있다.

다른 적합한 치료 물질은 방사성 동위원소(radioisotope), 붕소 부가체(boron addend), 면역조절물질(immunomodulator), 화학적 감작제(chemosensitizing agent)로 이루어진 군에서 선택된다(미국 특허 제 4,925,648 호 및 제 4,932,412호 참조). 적합한 화학요법제는 REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 19th Ed. (Mack Publishing Co. 1995)와 Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics (Goodman et al., Eds. Macmillan Publishing Co., New York, 1980 and 2001 editions)에 기재되어 있다. 시약과 같은 다른 적합한 화학요법제는 당 기술분야의 숙련자에게 알려져 있다. 암 및 다른 병적 상태를 치료하기 위해서 방사성 핵종 치료의 다양한 방법을 사용할 수 있음이 당 기술분야에 잘 알려져 있다(Harbert, "Nuclear Medicine Therapy", New York, Thieme Medical Publishers, 1087, pp. 1-340). 게다가 적합한 치료 방사성 동위원소는 α-방사체(emitters), β-방사체, γ-방사체, 오제(Auger) 전자 방사체, α-입자를 방사하는 중성자 포획 물질, 전자 포획에 의해 붕괴하는 방사성 동위원소로 구성된 군에서 선택된다. 바람직하게는, 방사성 동위원소는 225Ac, 198Au, 32P, 125I, 131I, 90Y, 186Re, 188Re, 67Cu, 177Lu, 213Bi, 10B, 그리고 211At로 이루어진 군에서 선택된다.

다른 실시 형태에서, 동위원소의 개별적인 에너지 방출에 따른 결과로 상이한 거리에 대하여 효과가 있는 상이한 동위원소들이 1, 2차 치료물질로 사용된다. 그러한 물질들은 종양의 더 효과적인 치료에 사용될 수 있고 일반적인 임상 상황에서와 같이 상이한 크기의 여러 종양이 있는 환자에게 유용하다.

매우 작은 종양 침착(tumor deposit)과 단일 세포들을 치료하는데 유용한 동위원소는 많지 않다. 이러한 상황에서, 약물이나 독소(toxin)는 더 유용한 치료 물질이 될 수 있다. 따라서 본 발명의 바람직한 실시 형태에서는, 동위원소는 약물, 독소, 그리고 중성자 포획 물질과 같은 비동위원소종과 함께 조합하여 사용된다. 세포독성 효과를 가지는 여러 약물과 독소가 알려져 있고, 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다. 그들은 약물과 독소에 관한 개요서(compendia), 예를 들어, Merck Index, Goodman and Gilman, 기타 유사한 것, 그리고 위에 인용한 선행기술문헌에서 찾을 수 있다.

세포 내 단백질 합성에 개입하는 약물도 본 발명의 방법에 사용될 수 있다; 그러한 약물은 당 기술분야의 숙련자들에게 알려져 있고, 푸로마이신(puromycin), 시클로헥시미드(cycloheximide), 그리고 리보뉴클리아제(ribonuclease)를 포함한다.

방사선 치료

다양한 방사선 치료(radiation therapy)가 종양치료에 사용된다. 메트포르민의 강화시키는 양을 사용하는 것이 종양치료에 있어서 방사선 치료들 중 하나 또는 그 이상의 양을 감소시킬 것으로 생각된다.

종양의 어떤 종류에 있어서, 방사선은 종양의 증거가 없는 곳에 주어질 수 있다. 그렇게 되면 방사선을 받는 곳에 종양 세포들이 증식하는 것을 예방할 수 있다. 이 기술은 예방 방사선 치료(prophylactic radiation therapy)라고 불린다. 방사선 치료는 또한 뼈 또는 다른 몸의 일부분으로 번져나가는 암에 의한 고통과 같은 증상을 완화시키는데 도움을 줄 수 있다. 이를 완화 방사선 치료(palliative radiation therapy)라 한다.

방사선은 몸 밖의 기계로부터 나올 수도 있고(외부 방사선 조사), 몸 안에 놓여질 수도 있으며(내부 방사선 조사), 또는 몸을 투과하는 개방(unsealed) 방사성 물질을 사용할 수도 있다(전신 방사선 치료). 주어지는 방사선의 종류는 암의 종류, 그것의 위치, 방사선이 몸안의 어디까지 가야할 필요가 있는 것인지, 환자의 일반적인 건강과 병력, 환자가 다른 종류의 암 치료를 받을 것인지, 그리고 그 밖의 다른 요인에 의해 좌우된다. 암으로 인해 방사선 치료를 받는 대부분의 사람들은 외부 방사선 조사 치료를 받는다. 어떤 환자들은 내부와 외부 또는 전신 방사선 치료를 차례로, 혹은 동시에 받는다. 외부 방사선 치료는 보통 외래환자에게 주어진다; 대부분의 환자들은 병원에 머물 필요가 없다. 외부 방사선 치료는 방광, 뇌, 유방, 자궁 경부, 후두, 폐, 전립선, 그리고 질을 포함한 암의 대부분의 종류를 치료하는데 사용된다. 게다가, 외부 방사선 조사는 암이 일차 부위에서 다른 몸의 일부분으로 퍼져나갈 때, 고통을 덜어주고 기타 문제들을 완화시키는데 사용될 수 있다.

수술 중 방사선 치료(intraoperative radiation therapy, IORT)는 외부 방사선 조사의 형태로, 수술 중에 행해진다. IORT는 완전히 제거될 수 없거나 주변 조직에 재발(귀환)할 위험이 큰 국소암을 치료하는데 사용된다. 전부 혹은 대부분의 암이 제거된 후에 하나의 대형, 고에너지 선량 방사선이 수술 중에 종양 부위에 직접 조사된다(정상 조직 근방은 특별한 보호체로 보호된다). 환자는 입원해서 수술로부터 회복된다. IORT는 갑상선과 대장암, 부인과 암, 소장암, 췌장암을 치료하는데 사용될 수 있다. 그것은 또한 성인에서 어떤 종류의 뇌종양과 골반 육종을 치료하는 임상 시험을 통한 연구가 진행 중이다.

예방 두개 조사(prophylactic cranial irradiation, PCI)는 원발암(primary cancer)(예를 들어, 소세포폐암)이 뇌로 퍼질 위험이 높은 경우, 뇌에 주어지는 외부 방사선 조사이다.

내부 방사선 치료(근접치료(brachytherapy)라고도 불림)는 종양 내부 혹은 매우 가까이에 놓여지는 방사선을 이용한다. 방사선원은 삽입물(implant)이라 불리는 작은 지지체(holder)에 밀봉된다. 삽입물은 얇은 선, 도관(catheters)이라 불리는 플라스틱 튜브, 띠, 캡슐, 또는 씨앗과 같은 형태가 될 수 있다. 삽입물은 체내로 직접 넣어진다. 내부 방사선 조사 치료는 입원을 해야 할 수도 있다. 내부 방사선 조사는 통상 밀봉된 삽입체를 이용하는 두 가지 방법 중 하나로 제공된다. 근접 방사선 치료는 종양 부위나 그 가까이에 있는 조직으로 삽입되어 진다. 이는 머리와 목, 전립선, 자궁경부, 난소, 유방, 그리고 항문주위와 골반 부위의 암을 치료하는데 사용된다. 유방암 때문에 외부 방사선 조사를 받았던 몇몇 여성들은 방사선의 추가용량(booster dose)을 받는데, 근접 방사선 또는 외부 방사선을 사용할 수 있다. 강내 또는 관내 방사선 치료는 국소장치(applicator)와 함께 체내로 삽입된다. 이는 일반적으로 자궁암 치료에 사용된다. 연구원들은 또한 유방, 기관지, 자궁경부, 담낭, 구강, 직장, 기관(tracheal), 자궁, 그리고 질을 포함한 부위에 발생할 수 있는 다른 암에 대하여도 상기 내부 방사선 치료를 하는 것을 연구 중이다. 전신 방사선 치료는 요오드 131(iodine 131)과 스트론튬 89(strontium 89)와 같은 방사성 물질을 사용한다. 이 물질들은 입을 통해 투여되거나 체내로 주사된다. 전신 방사선 치료는 때때로 갑상선과 성인 비호지킨림프종 암을 치료하는데 사용될 수 있다.

종양

본 발명의 방법들 및 조성물들로 치료되는 종양들은 악성(malignant)(예를 들어, 발암성(carcinogenic) 또는 "암") 또는 양성(benign)일 수 있다. 치료되는 양성 종양의 예에는 갑상선선종, 부신피질선종, 그리고 뇌하수체선종, 양성 뇌종양(예를 들어, 신경아교종, 별아교세포종, 수막종)이 포함된다. "암"은 보통, 증상으로 종양의 출현을 갖는 질병의 군을 의미한다. 이러한 종양들은 자율 증식 능력, 부정확한 경계, 주변 조직과 혈관으로 침투하는 능력, 전이를 통한 전파 경향을 가지는 비정형 세포로 구성된다. 본 명세서에 기재된 방법들 및 조성물들로 치료될 수 있는 암들의 예에는, 방광암, 흑색종, 유방암, 비호지킨 림프종, 결장 및 직장암, 췌장암, 자궁내막암, 전립선암, 신장(콩팥 세포)암, 피부암, (비흑색종), 백혈병, 갑상선암, 폐암, 자궁경부암, 난소암, 고환암이 포함되나 이에 국한되지 않는다. 아래 종양의 일차 및 전이성 증식은 전술한 방법들에 의해 억제될 수 있다: 외음부 표피양암종, 자궁경부암종, 자궁내막선암종, 난소선암종, 그리고 안구 흑색종.

메트포르민은 혈액뇌장벽(blood brain barrier)을 가로지를 수 있기 때문에 본 명세서에 기재된 방법에 따른 메트포르민의 투여는 중추신경계 종양을 치료 또는 예방하거나, 중추신경계로 암이 전파되는 것을 방지하는데 유용하다.

본 발명의 제약 조성물은 고체, 반-고체, 또는 액체(예를 들어, 현탁액, 에어로졸, 또는 그와 유사한 것)의 제형이 될 수 있다. 바람직하게는 조성물은 정밀한 용량의 단일 투여에 적합한 단위 제형(unit dosage forms)으로 투여된다. 또한 바라는 제제에 따라서, 동물이나 인간에게 투여하는 제약 조성물을 만들어내는데 사용되는 매개체로 정의되는 약학적으로 수용가능한, 비독성 운반체 또는 희석제(diluents)를 포함한다. 조성물은 지속 방출성(sustained release) 또는 정시 방출성(timed release) 제제로 제공될 수 있다. 상기 운반체 또는 희석제는, 글리세릴 모노스테아레이트(glyceryl monostrearate) 또는 글리세릴 디스테아레이트 (glyceryl distearate)와 같은, 종래 공지의 어떤 지속 방출성 물질도 포함할 수 있으며, 단독으로 혹은 왁스와 혼합한 것을 포함할 수 있다. 제어 방출 제제(controlled release preparations)는 메트포르민 및/또는 화학요법제를 흡수하거나 복합하는 중합체를 사용하여 달성될 수 있다. 제어적 전달은 적절한 마크로분자(예를 들어, 폴리에스테르, 폴리아미노산, 폴리비닐 피롤리돈, 에틸렌비닐아세테이트, 메틸셀룰로스, 카복시메틸셀룰로스, 그리고 프로타민 설페이트) 및 제어 방출하기 위한 도입 방법뿐만 아니라 마크로분자 농도의 선택에 의해 행하여질 수 있다. 마이크로캡슐화(microencapsulation) 또한 사용될 수 있다. 정시 방출성 제제는 전일에 걸친 즉각적 및 간헐적 방출의 조합을 제공할 수 있다. 상기 희석제는 조합의 생물학적 활성에 영향을 끼치지 않는 것으로 선택된다. 그러한 희석제의 예로는, 증류수, 생리식염수(physiological saline), 링거 용액(Ringer's solution), 덱스트로스 용액(dextrose solution), 행크 용액(Hank's solution)을 들 수 있다. 덧붙여, 제제의 제약 조성물은 또한 다른 운반체, 보조제(adjuvants), 예를 들어 폴록사머(poloxamers) 등의 유화제(emulsifiers), 또는 비독성, 비치료성, 비면역원성 안정제 그리고 그와 유사한 것도 포함할 수 있다. 상기 희석제 또는 운반체의 유효량은 성분의 용해성, 또는 생물학적 활성 등의 측면에서 약학적으로 수용가능한 제제를 얻는데 유효량이다.

본 발명의 다른 측면은 상술한 약물 조합으로 암을 치료하는 제제에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 제제는 하나 또는 몇 개의 약물들이 지연성 방식(delayed fashion)으로 방출되는 제어 방출 장치를 포함한다. 그러한 제제는 구강으로 섭취된 후에 상이한 시간 간격으로 상이한 약물의 용량을 방출하는 정제(또는 알약)의 형태일 수 있다.

본 발명의 다른 측면은 본 명세서에 개시된 방법(예를 들어, 종양치료)에 의해, 대상체를 치료하기 위한 키트에 관한 것이다. 키트는 하나 또는 그 이상의 메트포르민의 바이알 및 하나 또는 그 이상의 화학요법제(들)의 바이알(둘이 함께 혹은 각각의 바이알에)을 위에 제공된 용량으로 포함한다. 상기 키트는 그들의 조합 사용이 기재되어 있는 지시를 더 포함할 수 있다. 상기 키트에는, 메트포르민과 하나 또는 그 이상의 화학요법제가 함께인 제제가 포함될 수 있다.

화학요법제를 조정( modulate )하는 물질 또는 메트포르민에 의해 조정되는 물질의 선별(screening) 방법

본 발명은, 본 발명의 방법에 의한 화학요법제를 조정하는 물질(예를 들어, 메트포르민 유도체)을 선별하는 방법을 제공한다. 종양, 암, 및/또는 암줄기세포는, 상기 세포를 치사하는 효능에 대한 분석 시험 화합물(예를 들어, 메트포르민 유도체)에 사용될 수 있다. 이 방법에서, 메트포르민 유도체는 알려진 화학요법제와 함께 세포로 투여되고, 세포를 치사하는 능력은 세포의 지표 파라미터(indicating parameter)(예를 들어, 세포 생존력(cell viability))를 측정하여 결정된다. 세포 생존력은 메트포르민 유도체를 받지 않은 적절한 대조군과 비교한 결과, 향상된 치사(예를 들어, 상승 효과)는 그 메트포르민 유도체가 그 화학요법제를 조정하는 물질임을 나타낸다.

본 발명은 또한 메트포르민에 의해 종양, 암, 및/또는 암줄기세포를 치사하는 능력이 강화되는 물질을 선별하는 방법을 제공한다. 이 방법에서, 시험 물질은 메트포르민(또는 확인된 메트포르민 유도체)과 함께 세포에 투여되고, 세포를 치사하는 능력은 그 세포의 지표 파라미터(예를 들어, 세포 생존력)를 측정하여 결정된다. 세포 생존력을 그 시험 화합물을 받지 않은 적절한 대조군과 비교한 결과, 향상된 치사(예를 들어, 상승 효과)는 그 시험 화합물이 메트포르민에 의해 강화되는 물질임을 나타낸다.

시험 화합물은 용액, 또는 쉽게 용해되는 형태로 배양 중의 세포 배지에 편리하게 첨가된다. 그 물질은 간헐적 또는 지속적인 흐름(stream)으로서 플로우-쓰루 시스템(flow-through system)으로, 또는 대안으로, 개별적 또는 추가적으로 그 화합물의 덩어리(bolus)를 다른 정적 용액(static solution)에 첨가함으로써 가해질 수 있다. 플로우-쓰루 시스템에서는, 두 유체가 사용되는데, 하나는 생리적 중성용액이고 다른 하나는 시험 화합물이 가해진 동일한 용액이다. 처음의 유체가 세포를 통해 지나가고 두 번째 유체가 잇따른다. 단일 용액 방법(single solution method)에서는, 시험 화합물의 덩어리가 세포를 둘러싸고 있는 배지의 부피에 더해진다. 배지 성분의 총 농도는 상기 덩어리의 첨가로 인해, 또는 플로우-쓰루 시스템에서의 두 용액 간에, 현저하게 바뀌지 말아야 한다. 어떤 실시 형태들에 있어서, 물질 제제는 전체 제제에 현저한 영향을 끼칠 수 있는 보존제와 같은 추가적인 성분들을 포함하지 않는다. 따라서, 일 실시 형태에서, 제제는 시험 물질과 생리학적으로 수용가능한 운반체, 예를 들어, 물, 에탄올, DMSO(dimethyl sulfoxide) 등으로 본질적으로 구성된다. 그러나, 화합물이 용매가 없는 액체라면, 제제는 화합물 그 자체로 본질적으로 구성된다.

복수의 분석들이 다양한 농도에 대한 상이한 반응을 얻기 위해 서로 다른 물질 농도에서 동시에 진행될 수 있다. 종래기술에 알려져 있는 바와 같이, 물질의 유효 농도를 결정하는 것은 통상적으로 1:10, 또는 다른 로그 스케일(log scale), 희석에 따른 농도 범위를 사용한다. 상기 농도는 필요하다면 두 번째의 연속 희석으로 더 정밀화될 수 있다. 통상적으로 그러한 농도 중 하나는 음성 대조군의 역할을 한다(즉, 농도가 0이거나 물질의 검출 수준 이하이거나 또는 표현형의 검출 가능한 변화를 주지 않는 물질 농도 미만인 것).

시험 화합물

선별 분석 시험에 대한 언급에서 본 명세서에 걸쳐 사용된 "시험 화합물(test compound)"또는 "시험 물질(test agent)" 용어는 변형(modified) 또는 비변형의 핵산인 안티센스 핵산(antisense nucleic acids), RNAi, 예를 들어, siRNA 또는 shRNA, 펩티드(peptides), 펩티도미메틱(peptidomimetics), 수용체(receptors), 리간드(ligands), 그리고 항체(antibodies)를 포함하는 유기 또는 무기 분자를 의미한다.

상기 시험 화합물은 시험 동물에게 투여될 수 있는 어떤 분자, 화합물, 또는 다른 물질이 될 수 있다. 어떤 경우, 시험 물질은 동물 생존력에 실질적으로 개입하지 않는다. 적합한 시험 화합물은 소분자들, 폴리펩티드(polypeptides), 다당류(polysaccharides), 폴리뉴클레오티드(polynucleotides)등의 생물학적 중합체(biological polymers)일 수 있다. 상기 시험 화합물은 통상적으로 1 ng/kg에서 10 mg/kg, 보통 10㎍/kg에서 1 mg/kg의 용량으로 동물에게 투여될 것이다. 신약 개발의 선도 화합물처럼 혹은 항증식성 물질처럼 시험 화합물은 치료적으로 효과가 있다고 확인될 수 있다.

어떤 실시 형태에서, 시험 화합물은 랜덤 또는 조합의 펩티드 또는 비펩티드 라이브러리(combinatorial libraries)와 같은 다양성 라이브러리(diversity libraries)로 부터의 것일 수 있다. 여러 라이브러리가 종래기술에 알려져 있는데, 화학적 합성 라이브러리(chemically synthesized libraries), 재조합 파지 디스플레이 라이브러리(recombinant phage display libraries), 그리고 생체 내 번역 기반 라이브러리(in vivo translation-based libraries)를 예로 들 수 있다.

화학적 합성 라이브러리의 예는 Fodor et al. (Science 251:767-73 (1991)), Houghten et al. (Nature 354:84-86 (1991)), Lam et al. (Nature 354:82-84 (1991)), Medynski (Bio/Technology 12:709-10 (1994)), Gallop et al. (J. Med. Chem. 37:1233-51 (1994)), Ohlmeyer et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10922-26 (1993)), Erb et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422-26 (1994)), Houghten et al. Biotechniques 13:412-21 (1992)), Jayawickreme et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1614-18 (1994)), Salmon et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11708-12 (1993)), 국제특허공개 WO 93/20242, Brenner and Lerner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5381-83 (1992))에 기재되어 있다.

파지 디스플레이 라이브러리의 예는 Scott and Smith (Science 249:386-90 (1990)), Devlin et al. (Science 249:404-06 (1990)), Christian et al. (J. Mol. Biol. 227:711-18 (1992)), Lenstra (J. Immunol. Meth. 152:149-57 (1992)), Kay et al. (Gene 128:59-65 (1993)), 국제특허공개 WO 94/18318에 기재되어 있다.

생체 내 번역 기반 라이브러리는 아래의 기재된 것을 포함하지만 이에 국한되지는 않는다. 국제특허공개 WO 91/05058, Mattheakis et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9022-26 (1994). 비펩티드 라이브러리의 예로, 벤조디아제핀 라이브러리 (예를 들어, Bunin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:4708-12 (1994) 참조)를 적용할 수 있다. 펩티드 라이브러리(예를 들어, Simon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9367-71(1992) 참조)도 또한 사용될 수 있다. 다른 사용 가능한 라이브러리의 예로서, 펩티드의 아미드 작용기가 과메틸화되어 화학적으로 변형된 조합 라이브러리를 생성하는 예가 Ostresh et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11138-42 (1994))에 기재되어 있다.

상기 선별 방법에 사용되는 상기 시험 물질은 화학 물질(chemical), 소분자, 화학물(chemical entity), 핵산서열(nucleic acid sequences), 작용; 핵산 유사체 또는 단백질 또는 폴리펩티드 또는 그들의 단편의 유사체를 포함하는 군에서 선택될 수 있다. 어떤 실시 형태에서, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA이고 핵산 유사체는, 예를 들어, PNA, pcPNA, 그리고 LNA이다. 핵산은 단일 가닥 혹은 이중 가닥일 수 있고 관심 단백질(protein of interest)을 암호화하고 있는 핵산, 올리고뉴클레오티드, PNA 등을 포함하는 군에서 선택될 수 있다. 그러한 핵산서열은, 예를 들어, 전사억제제(transcriptional repressors)로 작용하는 단백질을 암호화하고 있는 핵산서열, 안티센스 분자, 리보자임, 작은 억제 핵산서열(예를 들어, RNAi, shRNAi, siRNA, 마이크로 RNAi (mRNAi)를 포함하나 이에 국한되지 않음), 안티센스 올리고뉴클레오티드 등을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 단백질 및/또는 펩티드 물질 또는 그들의 단편은 어떤 관심 단백질일 수도 있는데, 그 예로, 돌연변이 단백질; 치료용 단백질; 절단형 단백질을 포함하되 이에 국한되지 않고, 여기서 단백질은 세포에서 정상적으로 결여되거나 낮은 수준으로 발현되는 것이다. 관심 단백질은 돌연변이 단백질, 유전적으로 조작된 단백질, 펩티드, 합성 펩티드, 재조합 단백질, 키메라(chimeric) 단백질, 항체, 인간화된 단백질, 인간화된 항체, 키메라 항체, 변형 단백질 그리고 그들의 단편을 포함하는 군에서 선택될 수 있다. 상기 물질은 배지에 더해져 세포(내배엽 기원의 세포와 같은)와 접촉하여 그것의 효과를 유도할 수 있다. 또는, 상기 물질은, 핵산서열을 세포 안으로 도입하고 그것의 전사에 의해 핵산 및/또는 단백질 물질을 세포 내에서 생산하는 결과, 세포(예를 들어, 내배엽 기원의 세포) 내에 존재할 수 있다. 물질은 또한 세포들(예를 들어, 내배엽 기원의 세포)을 대상으로 하는 어떠한 작용 및/또는 사건들도 포괄한다. 비제한적 예들로, 그 작용은 세포에서 생리학적 변화를 유발하는 어떠한 작용도 포함할 수 있다. 예를 들어, 열 충격(heat-shock), 이온화 조사(ionizing irradiation), 저온 충격(cold-shock), 전기 충격(electrical impulse), 빛 및/또는 파장 노출(light and/or wavelength exposure), 자외선 노출(UV exposure), 압력, 신축 작용(stretching action), 산소 노출(oxygen exposure)의 증가 및/또는 감소, 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)에의 노출, 국소빈혈 상태(ischemic conditions), 형광 노출(fluorescence exposure) 등을 포함하되 이에 국한되지 않는다. 환경적인 자극에는 내재적인 환경적 자극도 포함된다. 물질에 대한 노출은 지속적이거나 비지속적일 수 있다.

어떤 실시 형태에서, 상기 물질은 다수의 화학 물질 부류, 주로 유기금속분자를 포함하는 유기 분자, 무기 분자, 유전자 서열 등을 아우르는 알려지거나 알려지지 않은 화합물을 포함하는 관심 물질이다. 본 발명의 중요한 측면은 후보 약물을 평가하는 것으로, 유독성 검사(toxicity test)나 그와 유사한 검사를 포함한다. 후보 물질(candidate agents)에는 구조적 상호작용, 특히 수소결합에 필요한 작용기, 통상적으로는 적어도 하나의 아민(amine), 카보닐기(carbonyl), 히드록시기(hydroxyl) 또는 카복실기(carboxyl)를, 흔하게는 적어도 두 개의 화학적 작용기를 갖는 유기 분자가 포함된다. 후보 물질은 종종 하나 또는 그 이상의 상기 작용기로 치환되는 환형 탄소 또는 복소환형 구조 및/또는 방향족 또는 다중방향족(polyaromatic) 구조를 포함한다. 후보 물질은 또한 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 다당류, 지방산, 스테로이드, 퓨린, 피리미딘, 그들의 유도체, 구조적 유사체 또는 그들의 조합물을 포함하는 생체분자 중에서 찾을 수 있다.

또한 시험 물질에는 약학적으로 활성의 약물, 유전적으로 활성의 분자 등이 포함된다. 관심 화합물은, 예를 들어, 화합요법제, 호르몬 또는 호르몬 안타고니스트, 성장 인자 또는 재조합 성장 인자, 그것들의 단편 및 변종을 포함한다. 본 발명에 적합한 약제의 본보기는 The Pharmacological Basis of Therapeutics, Goodman and Gilman, McGraw-Hill, New York, N.Y., (1996), Ninth edition: 물, 염 및 이온; 신장 기능과 전해질 대사에 영향을 끼치는 약물; 위장 기능에 영향을 끼치는 약물; 미생물 질병의 화학 요법; 신생 종양성 질환(Neoplastic Diseases)의 화학 요법; 혈액생성기관에 작용하는 약물; 호르몬 및 호르몬 안타고니스트; 비타민, 피부과학(Dermatology); 및 독물학(Toxicology)의 섹션에 기재되어 있고, 이상 모두는 참조함으로써 본 명세서에 편입된다. 또한 독소, 그리고 생물학적 및 화학적 작용제(chemical warfare agents)를 포함한다(예를 들어, Somani, S. M. (Ed.), "Chemical Warfare Agents," Academic Press, New York, 1992).

상기 물질에는 상술한 모든 분자 분류가 포함되고, 내용 미지의 샘플이 더 포함될 수 있다. 관심사는 식물(plants)과 같은 자연적인 근원으로부터 유도된 자연 발생적 화합물의 복합 혼합물이다. 많은 샘플들이 화합물을 용액 상태로 포함하는데, 적합한 용매에 용해될 수 있는 고체 샘플들도 또한 분석될 수 있다. 관심 샘플에는 환경적인 샘플, 예를 들어, 지하수, 해수, 광산 폐기물 등; 생물학적 샘플, 예를 들어, 작물로부터 준비된 분해물(lysates), 조직 샘플 등; 제조 샘플, 예를 들어, 제약 중의 시간적 추이(time course); 분석을 위해 준비된 화합물의 라이브러리뿐만 아니라; 그 유사한 것이 포함된다. 관심 샘플에는 잠재적인 치료 가치를 가지는 것으로 평가되는 화합물(즉, 후보 물질)이 포함된다.

선별할 화합물에는 메트포르민의 유도체와 후보 물질(본 명세서에서는 시험 물질 또는 시험 화합물이라 하기도 함)이 포함된다. 후보 물질들은 합성 또는 자연 화합물의 라이브러리를 포함하는 다양한 공급원으로부터 얻어진다. 예를 들어, 무작위의 올리고뉴클레오티드 및 올리고펩티드의 발현을 포함하는 다양한 수단들이 생체 분자를 포함하는 광범위한 유기 화합물의 무작위적 및 지향적 합성(random and directed synthesis)에 사용 가능하다. 대안으로, 박테리아, 균류(fungal), 식물 그리고 동물 추출물의 형태인 자연 화합물의 라이브러리를 입수 또는 용이하게 제작 가능하다. 덧붙여, 자연적 또는 합성적으로 제작된 라이브러리와 화합물들을 통상적인 화학적, 물리적 그리고 생화학적 수단을 통해 용이하게 변형하여, 조합 라이브러리를 제작하는데 사용할 수 있다. 알려진 약리 물질은 지향적 또는 무작위적으로 화학적 변형(예를 들어 아실화, 알킬화, 에스테르화, 아미드화 등)이 되어 구조적인 유사체를 만들어낼 수 있다.

물질들은 보통 그 물질을 결여하는 유사 세포들과 함께, 복수의 종양/암/암줄기세포들에게 끼치는 영향으로 선별된다. 물질에 반응한 파라미터의 변화가 측정되고, 그 결과가, 예를 들어, 그 물질의 존재와 비존재 하에, 다른 물질로부터 얻어진 기준 배양 등과의 비교에 의해 평가된다.

파라미터는 바람직하게는 고처리량 시스템(high throughput system)에서 정확하게 측정될 수 있는 세포생존력, 증식 및/또는 종양형성(tumorgenesis)의 정량화 가능한 성분이다. 반면 대부분의 파라미터들은 정량적인 판독(readout)을 제공하지만, 어떤 경우에는 반정량적 또는 정성적인 결과가 수용가능 할 것이다. 판독에는 단일 측정치, 또는 평균, 중간값 또는 분산(variance) 등이 포함될 수 있다. 특징적으로는 여러 번의 동일 분석을 통해 각 파라미터의 파라미터 판독 값의 범위가 얻어질 것이다. 변산도(variability)가 예상되고 각 시험 파라미터 세트에 대한 값의 범위가, 단일값 제공에 사용되는 일반 통계 방법과 함께 표준 통계 방법을 사용하여 얻어질 것이다. 어떤 실시 형태에서, 분석은 컴퓨터화된 분석 또는 컴퓨터 인터페이스를 통해 작동되는 자동 장치화된 고처리량 시스템이다.

선별될 화합물은 자연적으로 발생하는 또는 합성된 분자일 수 있다. 선별될 화합물은 또한 자연적인 근원, 예를 들어, 해양 미생물, 조류, 식물, 그리고 균류로부터 얻어질 수 있다. 또한 시험 화합물은 미네랄 또는 올리고 물질이 될 수 있다. 대안적으로, 시험 화합물은 펩티드 또는 소분자들을 포함하는, 물질들의 조합 라이브러리, 또는 산업적(예를 들어, 화학, 제약, 환경, 농업, 해양, 화장품, 약물, 그리고 생물공학 산업)으로 합성되는 화학적 화합물의 기존 목록들로부터 얻어질 수 있다. 시험 물질에는, 예를 들어, 의약, 치료적, 농업 또는 공업 물질, 환경 오염물질, 화장품, 약물, 유기 및 무기 화합물, 지질, 글루코코르티코이드(glucocorticoid), 항생제, 펩티드, 단백질, 당질, 탄수화물(carbohydrate), 키메라 물질, 그리고 그들의 조합이 포함될 수 있다.

조합 라이브러리는 단계적인 방식으로 합성될 수 있는 많은 종류의 화합물에 대하여 제공될 수 있다. 이러한 화합물에는 폴리펩티드, 단백질, 핵산, 베타-턴 모방체(beta-turn mimetics), 다당류, 인지질(phospholipids), 호르몬, 프로스타글란딘(prostaglandins), 스테로이드, 방향족 화합물, 복소환 화합물, 벤조디아제핀(benzodiazepines), 올리고머 N-치환된 글리신(oligomeric N-substituted glycines), 올리고카바메이트(oligocarbamates)가 포함된다. 본 발명의 방법에 있어서, 선호되는 시험 화합물은 소분자, 핵산과 변형된 핵산, 펩티드, 펩티드 모방체(peptidomimetic), 단백질, 당단백질(glycoprotein), 탄수화물, 지질, 또는 당지질(glycolipid)이다. 바람직하게는, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA이다.

화합물의 큰 조합 라이브러리는 코드화된 합성 라이브러리(encoded synthetic libraries, ESL) 방법(Affymax, WO 95/12608, Affymax WO 93/06121, Columbia University, WO 94/08051, Pharmacopeia, WO 95/35503 그리고 Scripps, WO 95/30642에 기재)에 의해 구축될 수 있다. 펩티드 라이브러리는 파지 디스플레이 방법에 의해 만들어질 수 있다(예를 들어, Devlin, WO 91/18980). 선별될 화합물은 정부적 혹은 사적인 근원으로부터 얻을 수 있다(예를 들어, ChemBridge Corporation (San Diego, CA)의 the DIVERSet E library (16,320 compounds), the National Cancer Institute's (NCI) Natural Product Repository, Bethesda, MD, the NCI Open Synthetic Compound Collection, Bethesda, MD, NCI's Developmental Therapeutics Program, 또는 그와 유사한 것을 포함).

게다가, 자연적 그리고 합성적으로 만들어진 라이브러리와 화합물들은 통상의 화학, 물리, 생화학적 수단에 의해 쉽게 변형된다. 덧붙여, 알려진 약리 물질들은 지향적 혹은 무작위적 화학 변형, 예를 들어, 아실화, 알킬화, 에스테르화, 아미드화 등을 받을 수 있다.

근육 성장과 관련한 요소의 전사(transcription) 및/또는 발현을 조정하는 능력을 가진 상기 기재된 화합물을 선별하기 위해서는, 시험 화합물이 시험 대상체에 투여되어야 한다. 일 실시 형태에서, 시험 대상체는 종양, 암, 및/또는 암줄기세포를 포함하는 세포의 배양이다. 그 세포들은 일차 세포 배양 또는 종양으로부터의 불사화 세포주일 수 있다.

시험 화합물의 투여는 예를 들어, 세포가 유지되어있는 배지 중에 화합물을 희석시키고, 그 시험 화합물을 근육을 가진 동물의 식품 또는 액과 혼합하여, 근육을 가진 동물에 대하여 약학적으로 수용가능한 운반체 내에 그 화학물을 국소 투여하고, 시험 화합물에 의해 적셔진 3차원적 기질을 사용하여(예를 들어, 서방성 비드(slow release beads) 및 그와 유사한 것으로), 그러한 기질을 동물 내에 묻어서, 근육 내에 그 화합물을 투여하여, 비경구적으로 화합물을 투여함으로써 이루어질 수 있다.

또한 다양한 다른 시약이 상기 혼합물에 포함될 수 있다. 이러한 시약들에는 염, 완충제(buffers), 중성단백질(예를 들어, 알부민(albumin)), 계면활성제(detergents) 등과 같은 물질이 포함되는데, 이는 최적의 단백질-단백질 및/또는 단백질-핵산 결합을 촉진, 및/또는 비특이적 또는 배경 상호작용을 감소시키는데 사용될 수 있다. 또한, 프로테아제 억제제, 뉴클레아제 억제제, 항균제(antimicrobial agents) 등과 같은, 분석의 효율을 높이는 시약도 사용될 수 있다.

보존제(preservatives)와 다른 첨가제(additives)도 존재할 수 있다. 예를 들어, 항균제, 항산화제(antioxidant), 킬레이트제(chelating agents), 그리고 불활성 가스(inert gases)가 더해질 수 있다(일반적으로 Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition, Mack, 1980 참조). 위에서 언급한 바와 같이, 선별 분석은 일반적으로 생체 내에서(예를 들어, 배양된 세포에서) 수행된다.

본 명세서에서 달리 정의하지 않았다면, 본원과 관련하여 사용된 과학적 및 기술적인 용어는 당 기술분야의 숙련자들에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다. 더불어, 문맥에서 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하고 복수 용어는 단수를 포함한다.

본 발명은 본 명세서에 기재된 특정한 방법론, 프로토콜, 그리고 시약 등에 제한되지 않고 다양하게 변형될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어는 단지 특정한 실시 형태를 기재하기 위한 목적이고, 발명의 범위를 제한하고자 하는 의도는 아니며 이는 오로지 청구항에 의해 정의된다.

작동 실시예 혹은 달리 지시된 곳 이외에, 본 명세서에서 사용된 성분 또는 반응 조건의 양을 표현하는 숫자들은 모든 경우에 있어 "약"이란 용어를 통해 변형되어 있는 것으로 이해되어야 한다. "약"이라는 용어는 본 발명에 사용될 때 퍼센트로 ±1%와 관련이 있다.

일 측면에서 본 발명은 발명에 필수적인, 그러나 필수적이거나 또는 그렇지 않은 불특정한 요소를 포함할 여지가 있는, 본 명세서에 기재된 조성물, 방법, 그리고 그들의 각각의 구성요소(들)에 관한 것이다(포함하는). 어떤 실시 형태에서는 그 조성물, 방법 혹은 그들의 각각의 구성요소의 기재에 포함될 다른 요소는 실질적으로 발명의 근본과 신규한 특징에 영향을 주지 않는 것들로 제한된다(본질적으로 구성되는). 이는 기재된 방법뿐만 아니라 조성물과 그들의 구성요소 내의 단계에도 동일하게 적용한다. 다른 실시 형태에서는, 본 명세서에 기재된 발명, 조성물, 방법, 그리고 그들의 각각의 구성요소는 그 구성요소, 조성물 또는 방법에 있어 필수적인 요소가 아니라고 여겨지는 어떤 요소도 제외하고자 한다(~로 구성되는).

특정되어 있는 모든 특허들, 특허 출원들, 그리고 간행물은, 설명과 개시의 목적으로, 참고함으로써 본 명세서에 명시적으로 편입된다. 상기 간행물들은 본원의 출원일 전의 그들의 개시에 관해서만 제공된다. 이러한 점에서 이들에 관한 어떤 것도, 본 발명자들이 선발명이라는 이유 또는 다른 어떤 이유로 그러한 개시보다 선행하는 권리가 없다고 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

본 발명은 다음의 번호 매긴 단락의 어느 하나로 정의될 수 있다.

1. 메트포르민의 강화시키는 양 및 하나 또는 그 이상의 화학요법제의 감소된 양의 투여를 포함하는, 필요로 하는 대상체에서의 종양의 치료 방법.

2. 단락 1에서, 메트포르민의 강화시키는 양은 250 mg/일인 방법.

3. 메트포르민의 강화시키는 양, 및 하나 또는 그 이상의 화학요법제의 감소된 양 및 약학적으로 수용가능한 운반체를 포함하는 조성물.

4. 단락 3에서, 메트포르민의 강화시키는 양은 약 25 mg인 조성물.

5. 단락 3에서, 메트포르민의 강화시키는 양은 약 75mg인 조성물.

6. 단락 3에서, 메트포르민의 강화시키는 양은 약 250mg인 조성물.

7. 메트포르민 바이알, 하나 또는 그 이상의 화학요법제 바이알, 메트포르민과 화합요법제의 병용에 관한 지시를 포함하는 키트.

8. 메트포르민의 유효량의 대상체에의 투여를 포함하는, 대상체에서의 암의 예방 또는 재발 지연 방법.

9. 단락 8에서, 메트포르민의 양은 75 mg/일인 방법.

본 발명은 다음의 실시예를 포함하되 이에 국한되지 않고, 아래에서 좀 더 자세히 설명될 수 있다.

실시예

실시예1

본 실시예에 의하면, 유전적으로 상이한 4가지 종류의 유방암에 있어 메트포르민이 선택적으로 암줄기세포를 치사한다. 메트포르민과 확립된 화학요법제인 독소루비신의 조합은 배양에서 암줄기세포과 비줄기암세포를 모두 치사하고 종양 괴를 감소시키며 이종이식 마우스 모델에서 그 중 어느 약물 단독에 비해 더욱 효과적으로 관해를 연장시킨다. 이러한 관찰은 암줄기세포 가설을 독립적으로 지지하고 왜 메트포르민과 화학요법제의 조합이 유방암(또는 가능한 다른 암)에 있어 환자의 치료를 향상시킬 수 있는지에 대한 이유를 제공한다.

메트포르민의 항암 특성을 조사하기 위해서, 먼저 v-Src 종양단백질(oncoprotein)과 에스트로겐 수용체의 리간드결합 도메인의 융합인 ER-Src를 함유하는 비형질전환된 인간 유방 상피세포(MCF-10A)로 구성된 유도가능 형질전환 모델을 활용했다. 이러한 세포들은 타목시펜으로 처리될 때, 24-36시간 내에 형질전환되기 시작한다. 그 형질전환된 세포 집단은, CD44 표지의 발현과, 비부착성 및 비분화성 조건에서 생성되는 다세포의 "미세 종양(micro-tumors)"인 맘모스피어를 형성하는 능력에 의해 정의되는 바, 10%의 암줄기세포를 함유한다(선행기술문헌 18). 덧붙여, 다른 약물에 의해 처리된 유전적 및 표현형적으로 상이한 종양으로부터 파생된 3가지의 다른 유방선암세포주(ER-양성 MCF7 (선행기술문헌 13); HER-양성 SKBR3 (선행기술문헌 14); 삼중 음성 MDA-MB-468 (선행기술문헌 15)를 분석하였다. 이 세포주들은 맘모스피어를 형성할 수 있는 소수의 암줄기세포를 가진다. 모든 실험에 있어서, 메트포르민은 비형질전환된 세포의 증식에 영향을 주지 않을 농도로 사용되었다(0.1 또는 0.3 mM; 도 1A). 암 세포주에의 선행 실험(선행기술문헌 7 - 9)은, 메트포르민의 더 높은 농도(통상 10 - 30 mM), 비형질변환된 세포에 대해서도 독성인 조건을 사용하였다.

유도가능한 MCF-10A 모델에 있어서, 메트포르민은 0.1 mM 메트포르민의 존재 또는 부존재 및/또는 36시간 동안의 TAM에서 증식한 세포의 상반전 이미지에서 보여지듯이(표시하지 않은 데이터), 형태학적 형질전환을 강력하게 억제하였으며, 또 0.1 mM 메트포르민의 존재 또는 부존재 및/또는 TAM에서 증식한 세포의 상처치유/침습 반응 분석에서 보여지듯이(표시하지 않은 데이터), 상처치유 분석에 있어서 침습성 증식을 억제하였으며, 또한 연질 아가에서의 병소형성, 콜로니 형성, 그리고 맘모스피어의 생성을 억제하였다(도 1B). 게다가, 4가지 유방암 세포주로부터 파생된 맘모스피어를 메트포르민으로 처리하자 세포 치사의 결과로 48시간 내에 맘모스피어의 수가 현저하게 감소하였다(도 2). 맘모스피어는 주로 암줄기세포로 구성되어 있으므로(선행기술문헌 18), 이 후자의 관찰은 메트포르민이 암줄기세포를 치사할 수 있다는 것을 암시한다.

두드러지게는, 메트포르민은 형질전환된 MCF-10A 또는 MCF-7세포(도 3A)의 집단 내에서 암줄기세포(CD44고/CD24저)를 우선적으로 치사하였다. 유사하게, 4 가지의 암세포주가 모두 분류되었을 때, 암줄기세포는 상당히 메트포르민에 민감하였지만, 반면에 기준 암세포 집단은 여전히 본질적으로 영향을 받지 않았다(도 3B). 게다가, 단 1시간 동안 메트포르민으로 MCF-10A 암줄기세포에 처리하자 이들 세포가 누드마우스에서 종양을 형성하는 능력을 차단하였고, 심지어 주입 이후 한달 동안 약물이 없는 상태에서도 그러했다(도 3C). 메트포르민이 선택적으로 암줄기세포를 치사하는 능력은, 암세포를 치사하지만 암줄기세포를 치사하지 못하는 화학요법제인 독소루비신과 크게 대조되었다. 그들의 구별되는 특성으로부터 기대되는 바와 같이, 메트포르민은 독소루비신과 함께 작용하여 혼재된 형질전환 집단(the mixed transformed population)에서 비줄기암세포 및 암줄기세포를 함께 감소시킬 수 있었다(도 3A).

상기 세포주에서의 결과에 일치하여, 메트포르민과 독소루비신의 상승효과는 MCF-10A-ER-Src 세포를 누드마우스에 주입한지 10일 후에 일어나는 종양의 치료에서 관찰되었다. 치료한지 15일 후(3주기 매 5일마다)에는 이 약물 조합은 종양을 거의 다 제거시킨 반면에, 독소루비신 단독으로는 겨우 종양 부피를 1/2배로 감소시켰고, 메트포르민 단독으로는 거의 효과가 없었다(도 4A). 독소루비신으로 치료된 마우스는 그로부터 10일 후에(35일) 종양 부피가 더 줄어드는 것으로 나타났다. 단독 메트포르민의 아주 작은 효과는 별개의 보고서(선행기술문헌 8)에서 보여지는 더 큰 효과와 대비를 이룬다. 그러나 이들 연구 사이에는 실험 프로토콜에 있어 많은 차이점이 있었다.

왜 메트포르민과 독소루비신의 조합이 독소루비신 단독보다 효과적인지에 대한 근거를 찾기 위해서, 치료의 3주기 후(25일)에 종양으로부터 회복된 세포 집단을 검사하였다. 세포주로부터의 결과에 따르면, 약물 조합에 의한 치료를 받은 마우스는 암줄기세포가 거의 사라진 반면, 독소루비신만으로 치료받은 마우스는 종양이 쉽게 검출되었다(도 4B). 따라서, 통상적인 화학요법에 비추어 메트포르민의 치료적 이점은 암줄기세포를 치사하는 능력으로 연결된다.

인간 질병의 진행에 대한 암줄기세포 가설은 분화적 종양 형성 특성과 암줄기세포와 비줄기암세포의 확립된 화학요법에 대한 반응에 기초를 두고 있다. 이 모델의 예측은, 지금까지는 시험되지 않았지만, 암줄기세포를 선택적으로 억제하는 약물은 화학요법제과 함께 재발을 지연시키는데 상승적으로 기능해야 한다는 것이다. 놀랍게도, 메트포르민과 독소루비신의 조합으로 치료된 마우스는 치료가 끝난 후 적어도 60일 동안에 관해가 유지되었다(도 4A). 이와 대조적으로, 독소루비신 단독으로 치료 받은 마우스는 20일 후에 종양 증식이 다시 시작되었고 그 재발 후의 종양 성장 속도가 초기 질환에 있어서(즉, 치료가 없는 경우) 관찰된 것과 비슷하였다. 따라서, 조합 치료는 관해를 연장시키는 현저한 효과가 있고 이들 이종이식으로 생긴 종양도 치유할 수 있다. 그들의 잠재적인 의학적 중요성에 더하여, 이러한 관찰들은 암줄기세포 가설에 대해 독립적인 추가의 지지를 제공한다.

우리의 지식으로는, 선택적으로 암줄기세포를 치사하고 독소루비신과 함께 상승적으로 작용하여 암줄기세포 및 비줄기 형질전환 세포 모두를 차단하는 메트포르민의 능력은 매우 특별하다. 유방암의 경우에 있어, 헤르셉틴(herceptin)과 타목시펜은, 각각 HER2 수용체와 에스트로겐 수용체를 발현하는 암 종류에 있어 유용한 약물이지만 몇몇 유형의 유방암의 경우 그러한 수용체가 결여되어 있어 치료에 저항한다. 이들 모든 종류의 유방암에서 메트포르민은 선택적으로 암줄기세포의 증식을 억제하기 때문에 화학요법제와 함께 상승적인 기능을 하기 쉽다. 덧붙여, 메트포르민은 MCF10A-ER-Src 세포의 형질전환을 억제하였고, 이는 이미 발생된 암을 치료하는 것과 대조적으로 암의 발달을 예방하는 능력을 가짐을 암시한다. 확실히, 메트포르민이 세포 형질전환을 억제하는 능력은, 메트포르민으로 치료한 당뇨병환자의 암 발생 정도가 낮게 나타나는 역학 관찰(선행기술문헌 5, 6)의 근간이 될 수 있다. 암 예방제로서, 메트포르민은 바람직하게는 장기적으로 투여되고, 이러한 점에서 본 발명에서 관찰된 항암효과에 필요한 메트포르민의 농도는 당뇨병의 치료를 위해 사용된 것보다 상당히 낮다. 마지막으로, 종양에서 메트포르민과 독소루비신의 구별되는, 세포 종류에 대한 선택성은 누드마우스에서 종양 괴를 줄이고 관해를 연장시키는 현저한 복합적 효과를 설명할 수 있으며, 이는 메트포르민과 화학요법의 조합이 유방암 및 그 밖의 암들에 대한 새로운 치료법이 될 수 있는 이유를 제공해준다.

발명의 방법

세포주( cell lines )

MCF10A 세포들은 유방암 가족력과 질병의 징후가 없는 36세 여성의 유방 절제술로부터 얻어진 섬유낭포 유방 조직에서 유래하는 유방상피세포이다(선행기술문헌 12). 유전적 분석으로는 어떤 HER2/neu 종양유전자의 증폭 또는 H-Ras 종양유전자에서의 돌연변이도 드러나지 않았고, 그 세포들은 에스트로겐 수용체를 발현시키지 않는다. 본 실험들에서는 v-Src 종양단백질과 에스트로겐 수용체의 리간드 결합 도메인이 통합 융합한 것을 함유하는 MCF10A의 유도체를 사용한다. MCF7 세포들은 높은 수준으로 에스트로겐 수용체를 발현하는, HER2/neu에는 음성이고, 그리고 강한 고정 비의존성(anchorage-independent properties)을 갖지 않는, 유방선암종 세포이다(선행기술문헌 13). SKBR3 세포는 HER2/neu수용체를 과발현하는, 고정 비의존성을 갖는, 그리고 이종이식에서 종양을 형성하는 유방선암종 세포이다(선행기술문헌 14). MDA-MB-468 세포는, ER-PR-HER2-음성상태, p53 결핍 , EGFR 과발현, PTEN 손실, MEK/ERK 경로의 구성적 활성화(constitutive activation)를 포함한 여러 가지 재발 기저형 분자 비정상(recurrent basal-like molecular abnormalities)을 나타내는 삼중 음성 유방암종(triple negative breast carcinoma)에 유래한다(선행기술문헌 15). MDA-MB-468 세포는 타목시펜 또는 헤르셉틴 치료에 저항하며 이종이식 실험에서 매우 공격적이고, 큰 종양을 형성한다.

세포 배양

MCF-7, SKBR3, 그리고 MDA-MB-486 세포들을 37℃에서 5% C0₂ 조건 하에서 DMEM 배지 (Invitrogen), 10% 소태아혈청(fetal bovine serum) (Atlanta Biologicals), 페니실린/스트렙토마이신 (Invitrogen)에서 증식시켰다. MCF10A ER-Src 세포들을 전술한 바와 같이(선행기술문헌 16) 배양하였고 40H-타목시펜(TAM)을 EtOH(Sigma)에 용해한 것 1μM을 가하여 형질전환을 유도하였다. 형태적 변화, 표현형 전환 및 병소 형성이 TAM 첨가 후 24-36시간에 일어났다. 또한 위상차현미경(phase-contrast microscopy)을 통해 관찰하였다. 물에 용해된 메트포르민 (Sigma)은 달리 지시가 없다면 통상적으로 0.1 mM로 가해졌다.

상처 치유 운동도 분석( wound healing motility assay )

식스 웰 디시에 웰당 lxl0⁵로 세포를 씨딩하였다. p10 마이크로피펫 팁을 사용하여 밀집한 세포에 한개의 스크래치 상처를 만들었다. 세포들을 PBS로 3회 세정하여 세포 부스러기(cell debris)를 제거하고, 분석 배지에 추가하여, 모니터링하였다. 상처가 난지 0, 12시간 후에 위상차현미경을 통해 이미지를 포착하였다.

콜로니 형성 분석

MCF10A ER-Src로부터의 5xl0⁴ 세포들의 3 샘플(triplicate sample)을, 2.0%의 아가로오즈/MCF-10A 성장 배지와 4:1(v/v)의 비율로 혼합하여 최종 농도가 0.4% 아가로오즈가 되도록 하였다. 0.5% 아가로오즈/성장 배지의 고화된 층의 상부에 세포 혼합물을 플레이팅하였다. 0.4%의 아가로오즈가 함유된 성장 배지를 매 6-7일마다 세포들에 공급하였다. 15일 후에 콜로니의 수를 세었다.

맘모스피어 배양

맘모스피어를 기재한 바(선행기술문헌 17)와 같이, 무혈청 DMEM/F12 배지에서 현탁 배양하고(1000 세포/ml) B27 (1:50, Invitrogen), 0.4% BSA, 20 ng/ml EGF (Preprotech) 및 4 ㎍/ml 인슐린 (Sigma)을 보충하였다. 상기 조건 하에서 메트포르민의 존재 혹은 부존재 하에 형질전환된 세포 집단을 둠으로써 맘모스피어 형성을 시험하였다. 한편 6일된 맘모스피어에 메트포르민을 첨가하고, 처리 후 2일, 4일이 지나서 맘모스피어를 세어 맘모스피어 증식을 시험하였다.

암줄기세포의 분리 및 분석

형질전환된 세포 집단의 플로우 싸이토메트리 세포 분류(flow cytometric cell sorting)를 단일 세포 현탁액 상에서 수행하였다. 세포들을 CD44항체(FITC-접합(conjugated)) (555478, BD Biosciences)와 CD24항체(PE-접합) (555428, BD Biosciences)에 의해 염색하였다. MCF10A ER-Src(TAM-처리된), MCF7, SKBR3 그리고 MDA-MD-486 세포로부터의 암줄기세포(CD44고/CD24저)와 비줄기형질전환세포(CD44저/CD24고)를 0.1 mM 메트포르민으로 처리하고 상이한 시점(12, 24, 48시간)에서 세포 증식을 평가하였다. 실험은 3번 수행되며 데이터는 평균±표준편차를 나타낸다.

이종이식에서 종양 증식과 재발

5x10⁶ MCF10A ER-Src 세포를 16마리의 암컷 nu/nu 마우스(Charles River Laboratories)의 우측 옆구리에 주입하자, 모두에게 ~50mm³ 크기의 종양이 10일 안에 발생하였다. 마우스들을 무작위로 4 그룹으로 나누어 5일마다(3주기) 4 mg/kg 독소루비신, 100 ㎍/ml 메트포르민, 또는 그 조합으로 복강내주사로 처리하거나 하지 않았다. 종양 부피(평균값 및 95% 신뢰구간)를 초기 주입 후에 여러 번 측정하였다. 모든 마우스 실험은 실험동물운영위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 절차와 지침에 따라 수행되었다.

Claims (9)

1. 메트포르민의 강화시키는 양 및 하나 또는 그 이상의 화학요법제의 감소된 양의 투여를 포함하는, 필요로 하는 대상체에서의 종양의 치료 방법.
2. 제 1 항에 있어서,
   메트포르민의 강화시키는 양은 250 mg/일인 방법.
3. 메트포르민의 강화시키는 양, 및 하나 또는 그 이상의 화학요법제의 감소된 양 및 약학적으로 수용가능한 운반체를 포함하는 조성물.
4. 제 3 항에 있어서,
   메트포르민의 강화시키는 양은 약 25 mg인 조성물.
5. 제 3 항에 있어서,
   메트포르민의 강화시키는 양은 약 75 mg인 조성물.
6. 제 3 항에 있어서,
   메트포르민의 강화시키는 양은 약 250 mg인 조성물.
7. 메트포르민 바이알, 하나 또는 그 이상의 화학요법제 바이알, 메트포르민과 화학요법제의 병용에 관한 지시를 포함하는 키트.
8. 메트포르민의 유효량의 대상체에의 투여를 포함하는, 대상체에서의 암의 예방 또는 암의 재발 지연 방법.
9. 제 8 항에 있어서,
   메트포르민의 양은 약 75 mg/일인 방법.

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