CN106727468A - 二甲双胍及联合二甲双胍和长春新碱在制备治疗白血病药物中的应用及药物组合物 - Google Patents

二甲双胍及联合二甲双胍和长春新碱在制备治疗白血病药物中的应用及药物组合物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种二甲双胍及联合二甲双胍和长春新碱在制备治疗白血病药物中的应用及药物组合物，以及二甲双胍和长春新碱在制备治疗白血病药物中的应用；同时提供了一种治疗白血病的药物组合物。其中，二甲双胍可以显著增强白血病细胞对长春新碱的敏感性，联合二甲双胍及低剂量的长春新碱可显著诱导白血病细胞凋亡。

Description

二甲双胍及联合二甲双胍和长春新碱在制备治疗白血病药物 中的应用及药物组合物
技术领域
本发明涉及一种二甲双胍的新用途，具体涉及一种二甲双胍及联合二甲双胍和长春新碱在制备治疗白血病药物中的应用及药物组合物。
背景技术
白血病(血癌)是一类由造血干细胞异常增生引起的疾病。白血病多发于青少年，是35岁以下发病率、死亡率最高的恶性肿瘤。白血病在我国被列为十大高发性肿瘤之一。目前全国白血病患者已达到400多万人，每年新增4万人。治疗策略的贫瘠导致白血病患者死亡率居高不下。因此开发新的白血病治疗药物和治疗策略是急需解决的问题。化疗是目前白血病治疗的主要方案，长春新碱是白血病化疗应用最广泛的药物。临床研究表明，长春新碱不仅对患者有较大副作用，而且白血病患者使用长春新碱一段时间后，极易对长春新碱产生耐性。但目前还没有有效的方法解决长春新碱的毒性和耐药性问题。因此探索新的治疗策略以降低长春新碱的毒性和耐药性，对于白血病的治疗是非常有意义的。
发明内容
为了改善上述问题，本发明的目的在于提供一种二甲双胍、联合二甲双胍和长春新碱在制备治疗白血病药物中的应用及药物组合物。
本发明通过下述技术方案实现：
二甲双胍在制备治疗白血病药物中的应用。
二甲双胍和长春新碱在制备治疗白血病药物中的应用。
进一步地，所述长春新碱的浓度为0.1-1μM；所述二甲双胍的浓度为1-20mM。
一种药物组合物，包括二甲双胍和长春新碱。
进一步地，所述长春新碱的浓度为0.1～1μM；所述二甲双胍的浓度为1～20mM。
再进一步地，所述药物组合物的剂型为片剂、糖衣丸、明胶胶囊、可注射制剂、可饮用混悬剂或可崩解糊剂。
本发明具有以下优点及有益效果：
本发明联合使用二甲双胍和长春新碱能够有效的诱导白血病细胞的凋亡，从而，二甲双胍和长春新碱联合使用可作为治疗白血病的临床药物。本发明将二甲双胍和长春新碱制成治疗白血病的药物组合物，扩展了二甲双胍在治疗白血病中的用途，通过制备成多种不同剂型可实现对白血病的有效治疗。
附图说明
图1为Oncomine数据库分析AMPK的催化亚基AMPKα1的mRNA在急性T淋巴细胞白血病患者中的表达情况。
图2为Oncomine数据库分析AMPK的催化亚基AMPKα1的mRNA在急性B淋巴细胞白血病患者中的表达情况。
图3为免疫印迹检测白血病患者外周血细胞中pT172-AMPK(具有活性的AMPK)的表达情况。
图4为用5mM二甲双胍(Met)处理K562细胞0,6,12,及24小时(hrs)，免疫印迹检测pAMPK(具有活性的AMPK)及总AMPK，Actin(肌动蛋白)作为内参。
图5为用5mM二甲双胍(Met)处理A301细胞0,6,12及24小时(hrs)，免疫印迹检测pAMPK(具有活性的AMPK)及总AMPK，Actin(肌动蛋白)作为内参。
图6为用不同浓度(0,5,10,15及20mM)的二甲双胍(Met)处理K562细胞24小时，MTS法检测细胞的生存能力。
图7为用不同浓度(0,5,10,15及20mM)的二甲双胍(Met)处理A301细胞24小时，MTS法检测细胞的生存能力。
图8为用不同浓度(0,0.4,1.6,6.4及25.6μM)的长春新碱(VCR)处理K562细胞24小时，MTS法检测细胞的生存能力。
图9为用不同浓度(0,0.4,1.6,6.4及25.6μM)的长春新碱(VCR)处理A301细胞24小时，MTS法检测细胞的生存能力。
图10为用5mM二甲双胍(Met)和0.4μM(VCR)单独或者联合处理K562细胞24小时，免疫印迹检测细胞凋亡标志物PARP1的剪切，pAMPK(AMPK的活性形式)的表达量，Actin(肌动蛋白)作为内参。
图11为用5mM二甲双胍(Met)和0.4μM(VCR)单独或者联合处理A301细胞24小时，免疫印迹检测细胞凋亡标志物PARP1的剪切，pAMPK(AMPK的活性形式)的表达量，Actin(肌动蛋白)作为内参。
图12为用5mM二甲双胍(Met)和0.4μM(VCR)单独或者联合处理K562细胞和A301细胞24小时，流失细胞仪检测细胞凋亡(subG1细胞数目)。
图13为用5mM二甲双胍(Met)和0.4μM(VCR)单独或者联合处理K562细胞24小时，MTS检测细胞的生存能力。
图14为用5mM二甲双胍(Met)和0.4μM(VCR)单独或者联合处理A301细胞24小时，MTS检测细胞的生存能力。
图15为K562细胞中过表达shGFP(针对绿色荧光蛋白的shRNA，作为阴性对照)和shAα1(针对AMPK的催化亚基AMPKα1的shRNA)，免疫印迹检测pAMPK(AMPK的活性形式)及总AMPK的表达量，Actin(肌动蛋白)作为内参。
图16为用5mM二甲双胍(Met)和0.4μM(VCR)单独或者联合处理沉默AMPKα1的K562细胞24小时，免疫印迹检测细胞凋亡标志物PARP1的剪切，pAMPK(AMPK的活性形式)的表达量，Actin(肌动蛋白)作为内参。
图17为用5mM二甲双胍(Met)和0.4μM(VCR)单独或者联合处理沉默AMPKα1的K562细胞24小时，流失细胞仪检测细胞凋亡(subG1细胞数目)。
图18为用5mM二甲双胍(Met)和0.4μM(VCR)单独或者联合处理沉默AMPKα1的K562细胞24小时，MTS检测细胞的生存能力。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的实施方式并不限于此。
长春新碱是白血病治疗的一线化疗药物。但其副作用及耐药性是临床中所遇的瓶颈。因此，降低白血病患者对长春新碱的用药剂量和克服耐药性是临床白血病治疗急需解决的问题。二甲双胍是目前应用最为广泛的Ⅱ型糖尿病治疗药物。本发明的发明人研究表明，二甲双胍可以显著增强白血病细胞对长春新碱的敏感性，联合使用二甲双胍及低剂量的长春新碱可显著诱导白血病细胞凋亡。机制上，发明人研究发现AMP-activated proteinkinase(AMPK，腺苷酸活化蛋白激酶)在二甲双胍促进长春新碱诱导的白血病细胞凋亡过程中起着重要作用。因此，联合使用二甲双胍及长春新碱是白血病治疗的一种新策略，接下来通过试验进行说明。
实施例1
一、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的活性及其催化亚基(AMPKα1)在临床白血病样本中显著降低
AMPK在维持细胞内的能量稳态过程中起着重要作用。AMPK在调控肿瘤细胞的生长及生存过程中也扮演着重要的角色。研究发现，AMPK的催化亚基AMPKα1的mRNA表达水平在白血病样本中显著降低(图1、2)，经过分析发现，AMPK的活性在白血病样本中也显著降低(图3)。已有研究表明，抑制AMPK可显著降低黑色素瘤细胞对化学药物的敏感性。因此，推测AMPK活性的降低与白血病的耐药性有着相关性。
二、二甲双胍可显著增加白血病细胞中AMPK的活性，但对白血病细胞的生存力没有显著影响
二甲双胍是目前用于治疗Ⅱ型糖尿病一线药物。研究表明，二甲双胍可有效预防及治疗肿瘤。二甲双胍可激活AMPK从而抑制肿瘤细胞的生长及生存。发明人研究发现，二甲双胍也可显著增加白血病细胞K562和A301细胞中AMPK活性(图4、5)，但对两株细胞的生存力却没有显著的影响(图6、7)。
三、高浓度的长春新碱可显著抑制白血病细胞的生存力，低浓度没有显著影响
长春新碱是白血病治疗中应用最为广泛的化疗药物之一。白血病患者对长春新碱易产生耐药性，导致患者不能得到有效的治疗。因此，开发新的治疗策略，以增强白血病细胞对化疗药物的敏感性是非常有意义的。发明人研究发现，高浓度(25.6μM)的长春新碱可显著抑制白血病细胞K562和A301细胞的生存力，但低浓度的长春新碱0.4μM(该浓度低于白血病首次化疗患者中长春新碱的血液浓度)对两株细胞的生存力没有显著的抑制作用，结果如图8、9所示。
四、联合使用二甲双胍和低浓度的长春新碱可显著抑制白血病细胞的生存力
发明人研究表明，在白血病患者中用AMPK的激活药物可以增加患者对药物的敏感性。联合使用二甲双胍(5mM)及低浓度的长春新碱(0.4μM)可显著诱导白血病细胞K562和A301细胞中凋亡标志物PARP1的剪切(图10、11)，增加凋亡细胞数量(图12)及显著抑制两株细胞的生存力(图13、14)。
五、基因沉默AMPK显著抑制联合使用二甲双胍及长春新碱诱导的细胞凋亡
为了验证AMPK是否在二甲双胍促进长春新碱诱导的细胞凋亡过程中起着重要作用。发明人通过基因沉默的方法将白血病K562细胞中的AMPKα1敲低(图15)。进一步分析发现，敲低AMPKα1可显著的抑制联合使用二甲双胍及长春新碱诱导的PARP1的剪切(图16)，凋亡细胞数量的增加(图17)及细胞生存力的降低(图18)。
通过以上数据以及相应的图示，充分说明本发明联合使用二甲双胍和低剂量的长春新碱能有效的诱导白血病细胞的凋亡，为白血病的治疗提供了新的策略。其中上述图中的***代表p<0.001；**代表p<0.01。
实施例2
基于实施例1的试验证明，本实施例提供一种药物组合物，其包括二甲双胍和长春新碱；其中二甲双胍的浓度为5mM，长春新碱的浓度为0.4μM。采用本实施例的药物组合物能够有效的诱导白血病细胞的凋亡，从而达到治疗白血病的目的。
具体地，上述药物组合物的剂型为片剂、糖衣丸、明胶胶囊、可注射制剂、可饮用混悬剂或可崩解糊剂。通过不同剂型可适用于不同人群，满足不同患者的要求。
实施例3
本实施例与实施例2区别在于，药物组合物中的二甲双胍的浓度为10mM，长春新碱的浓度为0.6μM。
实施例4
本实施例与实施例2区别在于，药物组合物中的二甲双胍的浓度为20mM，长春新碱的浓度为1μM。
实施例5
本实施例与实施例2区别在于，药物组合物中的二甲双胍的浓度为1mM，长春新碱的浓度为0.1μM。
实施例6
本实施例与实施例2区别在于，药物组合物中的二甲双胍的浓度为15mM，长春新碱的浓度为0.8μM。
实施例7
本实施例与实施例2区别在于，药物组合物中的二甲双胍的浓度为3mM，长春新碱的浓度为0.2μM。
应当说明的是，以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

Claims (6)

1.二甲双胍在制备治疗白血病药物中的应用。
2.二甲双胍和长春新碱在制备治疗白血病药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述长春新碱的浓度为0.1～1μM；所述二甲双胍的浓度为1～20mM。
4.一种药物组合物，其特征在于，包括二甲双胍和长春新碱。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述长春新碱的浓度为0.1～1μM；所述二甲双胍的浓度为1～20mM。
6.根据权利要求4或5所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型为片剂、糖衣丸、明胶胶囊、可注射制剂、可饮用混悬剂或可崩解糊剂。
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