MX2012002337A - Uso de metformina en el tratamiento y prevencion de cancer. - Google Patents

Abstract

Se divulga en la presente un método para tratar un tumor en un sujeto en necesidad del mismo que comprende administrar una cantidad aumentada de metformina y una cantidad reducida de uno o más agentes quimioterapéuticos. Un ejemplo de una cantidad aumentada de metformina es aproximadamente 250 mg/día. También se divulga un método para prevenir cáncer o retardar la recurrencia de cáncer en un sujeto que comprende administrar una cantidad efectiva de metformina al sujeto. En un ejemplo de tal método, la cantidad de metformina es aproximadamente 75 mg/día. También se divulga una composición que comprende una cantidad aumentada de metformina, y una cantidad reducida de uno o más agentes quimioterapéuticos y un portador farmacéuticamente aceptable. También se divulgan equipos que comprenden metformina y uno o más agentes quimioterapéuticos.

Description

USO DE METFORMINA EN EL TRATAMIENTO Y PREVENCIÓN DE CÁNCER CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona al campo de terapia de tumores.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los tratamientos quimioterapéuticos para cáncer pueden reducir efectivamente la masa de tumor, pero la enfermedad frecuentemente recurre. Para explicar este fenómeno, la hipótesis de células madre de cáncer sugiere que los tumores contienen un número pequeño de células madre de cáncer, de auto-renovación, formadoras de tumor dentro de una población de células de cáncer no formadoras de tumor (1, 2). Distinto a la mayoría de las células dentro del tumor, las células madre de cáncer son resistentes a la quimioterapia bien definida, y después del tratamiento, pueden regenerar todos los tipos de célula en el tumor a través de su comportamiento similar a célula madre. Por ésta razón, los fármacos que selectivamente se dirigen a las células madre de cáncer ofrecen gran promesa para el tratamiento de cáncer, aunque ninguno se conoce actualmente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Un aspecto de la presente invención se relaciona a un método para tratar un cáncer/tumor en un sujeto en necesidad del mismo, que comprende administrar una cantidad aumentada de metformina y una cantidad reducida de uno o más agentes quimioterapéuticos . En una modalidad, la cantidad aumentada de metformina es 250 mg/dia.

Otro aspecto de la presente invención se relaciona a una composición que comprende una cantidad aumentada de metformina, y una cantidad reducida de uno o más agentes quimioterapéuticos y un portador farmacéuticamente aceptable. En una modalidad, la cantidad aumentada de metformina es la cantidad aumentada de metformina que es aproximadamente 25 mg, 75 mg o 250 mg.

Otro aspecto de la presente invención se relaciona a un método para prevenir cáncer o retardar la recurrencia de cáncer en un sujeto, que comprende administrar una cantidad efectiva de metformina al sujeto. En una modalidad, la cantidad de metformina es la cantidad de metformina de aproximadamente 75 mg/dia.

Otro aspecto de la presente invención se relaciona a un equipo que comprende un frasquito de metformina, un frasquito de uno o más agentes quimioterapéuticos, instrucciones para el uso de la metformina y el agente (s) quimioterapéutico conjuntamente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1A- Figura IB contiene representaciones gráficas de datos de los experimentos, los resultados de los cuales indican que la metformina previene la transformación de células MCF10A-ER-Src . Figura 1A: Número de células cultivadas en la presencia o ausencia de 4-hidroxi tamoxifen (TAM) 1 µ? con las concentraciones indicadas de metformina durante 24 horas. Figura IB: Número relativo de focos, colonias en agar blando, y mamósferas en células no tratadas o tratadas con TAM en la presencia de la concentración indicada de metformina.

La Figura 2 es una gráfica de barras de datos de los experimentos, los resultados de los cuales indican que la metformina inhibe el crecimiento de mamósferas, las mamósferas de 6-dias de edad de las lineas de células indicadas fueron o no fueron tratadas con metformina 0.1 mM durante 48 horas, y el número de mamósferas contadas.

La Figura 3A - Figura 3C contiene representaciones gráficas de datos de los experimentos, los resultados de los cuales indican que la metformina selectivamente extermina células madre de cáncer y funciona sinergísticamente con doxorubicina . Figura 3A: Número de células madre de cáncer (CD44alto/CD24bajo; negro) y células de cáncer (CD44bajo/CD24alto; gris) en la población MCF-10A transformada (36 h de tratamiento con TAM) que se trató con doxorubicina, metformina 0.1 mM, o ambos (n = 3) . Figura 3B: Células madre de cáncer (SC) y no células madre de cáncer (NSC) obtenidas mediante la clasificación se trataron con metformina 0.1 mM durante 0, 24 y 48 horas. Figura 3C : Volumen de tumor en ratones desnudos en el número indicado de días después de la inyección de las células madre de cáncer MCF10A-ER-Src que fueron o no fueron tratadas con metformina 0.1 mM durante 1 hora antes de la inyección.

La Figura 4A-Figura 4B contiene representaciones gráficas de datos de los experimentos, los resultados de los cuales indican que la metformina y doxorubicina actúan en combinación para reducir la masa de tumor y prolongan la remisión en ratones desnudos. Figura 4A: Volumen de tumor (valores medios y 95% de intervalos de confidencia) de ratones inyectados con células MCF10A-ER-Src transformadas (tiempo 0 indica el tiempo de inyección) que fueron no tratadas, o tratadas mediante inyecciones intraperitoneales cada 5 días (3 ciclos; las flechas indican el día o inyecciones) con 4 mg/kg de doxorubicina (Dox) , 100 pg/ml metformina (Met) o ambos. Figura 4B: Número de células madre de cáncer (CD44alto/CD24bajo) en células obtenidas de tumores tratados con Dox o la combinación de Dox + Met después de 3 ciclos de tratamiento (día 25).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La hipótesis de células madre de cáncer sugiere que, distinto a la mayoría de células de cáncer dentro de un tumor, las células madre de cáncer resisten los fármacos quimioterapéuticos y pueden regenerar los diversos tipos de células en el tumor, para de esta manera causar recurrencia de la enfermedad. Así, los fármacos selectivamente se dirigen a las células madre de cáncer ofrecen gran promesa para el tratamiento de cáncer, particularmente en combinación con quimioterapia. Aquí, los inventores muestran que bajas dosis de metformina, un fármaco estándar para diabetes, inhibe la transformación celular y selectivamente extermina las células madre de cáncer en cuatro tipos genéticamente diferentes de cáncer de seno. La combinación de metformina y un agente quimioterapéutico bien definido, doxorubicina , extermina tanto las células madre de cáncer como las no células madre de cáncer en cultivo. Además, esta terapia combinatoria reduce la masa de tumor y previene la recurrencia mucho más efectivamente que cualquier fármaco solo en un modelo de ratón de xenoinjerto. Los ratones permanecen libres de tumor por al menos dos meses después de que se finaliza la terapia combinatoria con metformina y doxorubicina. Estos resultados proporcionan evidencia adicional que sustenta la hipótesis de la células madre de cáncer, y proporciona una exposición razonada y base experimental para utilizar la combinación de metformina y fármacos quimioterapéuticos para mejorar el tratamiento de pacientes con cáncer de seno y otros cánceres.

Los aspectos de la presente invención están basados en los descubrimientos de que la metformina aumenta los efectos anti-tumor de agentes quimioterapéuticos utilizados en tratamientos terapéuticos (por ejemplo, terapia de cáncer) . Como tal, la cantidad del agente quimioterapéutico requerida para producir los efectos anti-tumor terapéuticos se reduce. La reducción en la cantidad del agente quimioterapéutico da por resultado efectos secundarios disminuidos al recipiente del agente quimioterapéutico . Por consiguiente, un aspecto de la presente invención se dirige a un método para incrementar el efecto anti-tumor de un agente quimioterapéutico, el método que comprende administrar a un paciente en necesidad del mismo una cantidad aumentada de metformina y una cantidad reducida de un agente quimioterapéutico .

Definiciones Como se utiliza en la presente, la frase "agente citotóxico" significa un agente utilizado para tratar el crecimiento celular anormal y progresivo no controlado. Los agentes citotóxicos¦ preferidos incluyen, por ejemplo, ciclofosfamida , ifosfamida, citarabina, 6-mercaptopurina , 6-tioguanina, vincristina, doxorubicina y daunorubicina, clorambucilo, carmustina, vinblastina, metotrexato y paclitaxel .

Como el término se utiliza en la presente, una "cantidad aumentada" de metformina es una cantidad suficiente para producir un aumento reproductible, estadísticamente significante de los efectos anti-tumor de un agente quimioterapéutico (por ejemplo, agente citotóxico) o terapia (por ejemplo, terapia de radiación). El aumento de un efecto anti-tumor se puede determinar a través de una variedad de medios conocidos en la técnica. Por ejemplo, el aumento de un efecto anti-tumor se puede determinar a través de una disminución estadísticamente significante en la cantidad administrada en el agente o terapia requerida para producir los efectos anti-tumor. Esto se determina por ejemplo, mediante la comparación con un grupo de control apropiado que recibe una cantidad estándar de la terapia en la ausencia de metformina .

Como el término se utiliza en la presente, un "agente quimioterapéutico" se refiere a una sustancia química o fármaco utilizado en el tratamiento de un tumor. Tales agentes son frecuentemente agentes citotóxicos.

Como el término se utiliza en la presente, "terapia de radiación" se refiere al uso de la radiación ionizante para exterminar células de cáncer y contraer tumores.

Como el término se utiliza en la presente, una "cantidad reducida" de un agente quimioterapéutico (por ejemplo, un agente citotóxico) o terapia es una cantidad que es menor que la cantidad estándar administrada a un sujeto, que sufre de un tumor para el tratamiento del tumor, para producir los mismos o mejores resultados terapéuticos. Un beneficio de utilizar una cantidad reducida de un agente quimioterapéutico o terapia de tumor es una reducción de los efectos secundarios experimentados por el recipiente, con los mismos o incrementados resultados terapéuticos. La reducción en la cantidad puede ser una reducción en la cantidad dada en una o más administraciones individuales (dosificación) , una reducción en la frecuencia de administración, o una combinación de los mismos. La guía para dosificaciones estándares y regímenes de programas de administración se proporcionan en la técnica para el profesional experto (por ejemplo, en el Physicians' Desk Reference, 56.sup.th Ed. (2002) Publisher Edward R. Barnhart, New Jersey ( " PDR" ) ) . La cantidad reducida es notablemente menor que una dosis estándar comúnmente utilizada en la administración terapéutica (por ejemplo, reducida a aproximadamente 90%, 80% o 70% de la dosificación estándar) . En algunos casos el beneficio terapéutico será obtenido de la administración de una cantidad de dosificación que es una reducción de la dosificación estándar a menor que 75% (por ejemplo, la administración está dentro de aproximadamente 75% a 25% de la dosificación estándar) . El beneficio terapéutico se espera que sea obtenido de la administración de una cantidad de dosificación que es una reducción de la dosificación estándar a aproximadamente 60%, 50% o 40% de la dosificación estándar. En algunos casos, el beneficio terapéutico será obtenido de la administración de una cantidad de dosificación que es una reducción de la dosificación estándar a menor que 40% (por ejemplo, la administración está dentro de aproximadamente 40% a 10% de la dosificación estándar) . En una modalidad, la dosificación es aproximadamente 30% de la dosificación estándar. En una modalidad, la dosificación es aproximadamente 20% de la dosificación estándar. En una modalidad, la dosificación es aproximadamente 10% de la dosificación estándar.

Como el término se utiliza en la presente, un "efecto anti-tumor" o "efecto anti-cáncer" se refiere a la reducción en el crecimiento del tumor, tasa de crecimiento, tamaño, dispersión, metástasis asi como la prevención de ocurrencia y/o recurrencia de un tumor en un individuo.

Por el término "tratar" como en "tratar un sujeto" se propone para dar ayuda médica a tal sujeto especialmente, para los propósitos de prevenir el desarrollo de, o prevenir el empeoramiento de una condición fisiológica o médica indeseada, o para los propósitos de aminorar tal condición en tal sujeto, ya sea humano o animal. A menos que se establezca de otra manera, el término "tratar" no está limitado a cualquier duración de tiempo particular o cualquier nivel particular de dosis.

Los términos "composición" o "composición farmacéutica" se utilizan intercambiablemente en la presente y se refiere a composiciones y formulaciones que usualmente comprenden un excipiente, tal como un portador farmacéuticamente aceptable que es convencional en la técnica y que es adecuado para la administración en un sujeto. Tales composiciones se pueden formular específicamente para la administración por la vía de una o más de un número de rutas, incluyendo pero no limitadas a la administración oral, ocular y nasal y los similares.

El "portador farmacéuticamente aceptable" significa cualquier medio farmacéuticamente aceptable para mezclar y/o suministrar la composición de suministro dirigida a un sujeto. El término "portador farmacéuticamente aceptable" como se utiliza en la presente significa un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como un rellenador líquido o sólido, diluyente, excipiente, solvente o material encapsulante, involucrado en llevar o transportar los presentes agentes desde un órgano, o porción del cuerpo, a otro órgano, o porción del cuerpo. Cada portador debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes en la formulación y es compatible con la administración a un sujeto, por ejemplo un humano.

Como se utiliza en la presente, un "sujeto" se refiere a un animal tal como un mamífero, ave, reptil, anfibio o pez. El término "mamífero" se propone para comprender un "mamífero" singular y "mamíferos" plurales, e incluye, pero no está limitado: a humanos, primates tales como simios, monos, orangutanes y chimpancés; cánidos tales como perros y lobos; félidos tales como gatos, leones y tigres, équidos tales como caballos, vacas, burros y cebras, animales alimenticios tales como vacas, cerdos y ovejas; ungulados tal como venado y jirafas; roedores tales como ratones, conejos, ratas, hámster y conejillos de indias.

El término "individuo", "sujeto" y "paciente" se utilizan intercambiablemente en la presente y se refieren a un animal, por ejemplo un mamífero, tal como un humano.

El término "metformina" como se emplea en la presente se refiere a metformina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma tal como la sal de clorhidrato, la sal de fumarato de metformina (2:1), y la sal de succinato de metformina (2:1) como es divulgado en la Solicitud Norteamericana No. de Serie 09/262,526 presentada el 4 de Marzo de 1999, la sal de bromhidrato, el acetato de p-clorofenoxi o el embonato, y otras sales de metformina conocidas de ácidos carboxílicos mono y dibásicos incluyendo aquellas divulgadas en la Patente Norteamericana No. 3,174,901, todas las sales que son colectivamente referidas como metformina. La metformina empleada en la presente puede ser sal de clorhidrato de metformina, específicamente, aquella comercializada como Glucophage . RT . (marca comercial de Bristol-Myers Squibb Company) .

El término "derivado" como se utiliza en la presente, se refiere a compuestos con estructura química similar y función similar.

Es esta especificación y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un" "uno" y "el" incluyen referencias plurales a menos que el contexto claramente lo dicte de otra manera. Asi, por ejemplo, la referencia a una composición para suministrar "un fármaco" incluye la referencia a dos o más fármacos. En la descripción y reclamación de la presente invención, la siguiente terminología será utilizada de acuerdo con las definiciones expuestas enseguida.

Otro aspecto de la invención se relaciona a un método para reducir los efectos secundarios de un agente quimioterapéutico durante el tratamiento de un sujeto para un tumor, el método que comprende administrar el sujeto una cantidad aumentada de metformina y una cantidad reducida del agente quimioterapéutico, en donde la cantidad del agente quimioterapéutico administrada causa menos efectos secundarios comparada con una cantidad convencional del agente quimioterapéutico. La invención además se dirige a una composición farmacéutica inhibidora de tumor que comprende una cantidad aumentada de metformina y una cantidad reducida de uno o más agentes quimioterapéuticos , en donde la cantidad inhibidora de tumor del agente (s) quimioterapéutico es una cantidad que da por resultado efectos secundarios disminuidos .

En una modalidad de los métodos descritos en la presente, el agente quimioterapéutico no es inhibidor para las células madre de cáncer. En otra modalidad de los métodos descritos en la presente, el agente quimioterapéutico es inhibidor para las células madre de cáncer. También se contemplan terapias de combinación con agentes quimioterapéuticos inhibidores y no inhibidores de células madre de cáncer.

En una modalidad, la cantidad aumentada de metformina se administra con un coctel de agentes quimioterapéuticos estándares (por ejemplo, en cantidades reducidas) , a un paciente después de la cirugía para la remoción de un tumor (por ejemplo, cáncer) .

El efecto de la co-administración de metformina, como es discutido en la presente, también se espera que aumente otras formas de terapias anti-tumor (por ejemplo, terapias hormonales tales como la terapia de interferona, o terapia de radiación) . Como tales, los métodos terapéuticos descritos en la presente para el uso de agentes quimioterapéuticos alternativamente se pueden realizar utilizando cantidades aumentadas de metformina y utilizando cantidades reducidas de administración y/o frecuencia de estas otras formas de terapias de tumor y sus agentes terapéuticos correspondientes también. El uso de cantidades aumentadas de metformina con combinación de una o más terapias y/o en combinación con una o más de otros terapéuticos descritos en la presente también es contemplado.

El efecto de la co-administración de metformina, como es discutido en la presente, además se espera que aumente los efectos de otros agentes que exterminan tumor/células de cáncer. Esto incluye otros agentes (por ejemplo, fármacos) que no son tradicionalmente parte de la quimioterapia, tales como fármacos que afectan la transformación de las células (por ejemplo, Exendin4, aspirina, meloxicam, indometaacina, celecoxib, piroxican, nimesulfuro, sulindac, tocilizumab, simvastatina , cerulenina, mevastatina ) . Tales agentes se pueden probar en ensayos (por ejemplo, los ensayos de células descritos en la presente) para la sinergia/mejoramiento mediante la co-administración de metformina. Como tales, los métodos terapéuticos descritos en la presente para el uso de agentes quimioterapéuticos alternativamente se pueden realizar utilizando cantidades aumentadas de metformina y utilizando cantidades reducidas de administración y/o frecuencia de estos otros agente de exterminación de tumor/cáncer. Tales agentes que exterminarían tumor/células de cáncer, incluyen, sin limitación, anticuerpo (por ejemplo, anti-HER2), tamoxifen y otros compuestos que inhiben la transformación. El uso de cantidades aumentadas de metformina con combinaciones de uno o más terapias y/o agentes, y/o combinación con uno o más de otros terapéuticos y/o agentes descritos en la presente también es contemplado.

La habilidad de la metformina para aumentar un agente quimioterapéutico dado o tratamiento para de esta manera permitir que una cantidad reducida se haya dado a un sujeto, está dentro de la habilidad del profesional experto. Por ejemplo, el aumento de un agente terapéutico o tratamiento del tumor es evidenciado por la eficacia incrementada del agente o tratamiento cuando está en combinación con la administración de metformina, como es comparado con uno o más controles apropiados que carecen de la administración de metformina. La eficacia del tratamiento se puede estimar con un profesional ordinariamente experto. La eficacia se puede estimar en modelos animales de cáncer y tumor, por ejemplo el tratamiento de un roedor con un cáncer, y cualquier tratamiento administración de las composiciones o formulaciones que conducen una disminución de por lo menos un síntoma del tumor, por ejemplo una reducción en el tamaño del tumor o un alentamiento o detención de la velocidad de crecimiento del tumor que indica tratamiento efectivo.

La eficacia para cualquier formulación dada también se puede estimar utilizando un modelo animal experimental de cáncer, por ejemplo, ratones o ratas de tipo silvestre, o de preferencia, la trasplantación de células de tumor semejante a aquella descrita en los ejemplos enseguida. Cuando se utiliza un modelo animal experimental, la eficacia del tratamiento es evidenciada cuando una reducción en un síntoma del tumor, por ejemplo, una reducción del tamaño del tumor o un alentamiento o detención de la velocidad de crecimiento del tumor ocurre más temprano en los animales tratados contra los no tratados. Por "más temprano" se propone que una disminución, por ejemplo, en el tamaño de tumor ocurre por lo menos 5% más temprano, pero de preferencia más, por ejemplo un día más temprano, dos días más temprano, 3 días más temprano o más.

Los experimentos detallados en la sección de Ejemplos enseguida indican que la metformina selectivamente extermina las células madre de cáncer, y que esta exterminación ocurre cuando las células madre de cáncer se exponen en la concentración relativamente baja de la metformina. Como tal, otro aspecto de la invención se relaciona a un método para prevenir o retardar el desarrollo y un tumor/cáncer en un sujeto que comprende administrar metformina al sujeto. Tal sujeto puede ser, por ejemplo, predispuesto para el desarrollo de tumor (por ejemplo genéticamente o debido a la exposición de agentes carcinogénicos ) . Sin limitación, ejemplos de tales predisposiciones genéticas incluyen mutaciones predispuestas emergentes a brcal, brcall, rb o p53. En una modalidad, el sujeto ha recibido previamente quimioterapia o terapia de radiación y está en alto riesgo para desarrollar un cáncer secundario. Un ejemplo tal es un sujeto quien se trató para leucemia infantil o linfoma. En una modalidad la metformina se administra por los métodos descritos en la presente, para poner en contacto una lesión precancerosa (por ejemplo, una lesión de la piel) para de esta manera prevenir que la lesión se desarrolle en cáncer. En otra modalidad, la metformina se administra después de la remoción de tal lesión (por ejemplo, para el contacto con el sitio de remoción) .

Otro aspecto de la presente invención se relaciona al tratamiento de médula ósea o muestras de células madre de médula ósea de sangre periférica con metformina antes de los trasplantes autólogos en el tratamiento de cáncer de sangre, para de esta manera reducir las células madre de cáncer. Tal tratamiento disminuirá la probabilidad de resembrar ,células madre. En una modalidad, la metformina se puede administrar al sujeto que recibe el trasplante después de que el trasplante ha tomado lugar (por ejemplo, por días, semanas, meses o un año después del trasplante) .

Otro aspecto de la presente invención se relaciona a la administración de bajas dosis de metformina para la prevención de cáncer de largo plazo en un sujeto. En una modalidad, tal administración está en la forma de un suplemento dietético o un alimento regular suplementado con la metformina (por ejemplo, alimento animal formulado tal como alimento para perros, alimento para gatos o alimento rutinariamente dado a animales de granja). Tales formulaciones de alimentos y suplementos dietéticos también están abarcadas por la presente invención.

Otro aspecto de la presente invención se relaciona a un ensayo para probar derivados de metformina para la habilidad para mejorar agentes quimioterapéut icos , agentes de exterminación de tumor y otras terapias, en la exterminación de células de cáncer. Los ensayos de células descritos en la sección de Ejemplos enseguida se pueden adaptar para tales ensayos por la persona experta.

Dosificación y Administración En aplicaciones terapéuticas, los dosificaciones estándares y programa de administración del agente quimioterapéutico o terapia utilizado puede variar dependiendo de un número de variables, tal como combinaciones de agentes citotóxicos o terapias que son administrados, el tipo de tumor, la edad, peso y condición clínica del paciente recipiente, la ruta de administración y la experiencia y buen juicio del clínico profesional que administra la terapia. Sin embargo, la presente invención permite que tal dosificación y/o programa de administración sea reducido significativamente, para de esta manera da por resultado efectos secundarios disminuidos del tratamiento.

En una modalidad, la cantidad de metformina administrada puede ser una dosis estándar comúnmente utilizada en la administración terapéutica para el tratamiento de diabetes tipo 2 (de aproximadamente 1500 mg/dia a aproximadamente 2550 mg/día) . En otra modalidad, la cantidad terapéutica de metformina (por ejemplo, utilizada en aumentar el tratamiento de tumor con un agente quimioterapéutico, o utilizada en la prevención de desarrollo de tumor) es notablemente menor que una dosis estándar comúnmente utilizada en administración terapéutica para el tratamiento de la diabetes tipo 2 (por ejemplo, reducida a aproximadamente 90%, o aproximadamente 1350 mg/dia, 80%, o aproximadamente 1200 mg/día, o 70%, o aproximadamente 1050 mg/día, de la dosificación estándar) . En algunos casos, el beneficio terapéutico será obtenido de la administración en una cantidad de dosificación que es una reducción de la dosificación estándar a menor que 75% (por ejemplo, la administración está dentro de aproximadamente 75%, o aproximadamente 1125 mg/día, a 25%, o aproximadamente 375 mg/día, de la dosificación estándar) . El beneficio terapéutico se espera que sea obtenido de la administración de una cantidad o dosificación que es una reducción de la dosificación estándar a aproximadamente 60%, o aproximadamente 900 mg/día, 50%, o aproximadamente 750 mg/día, o 40%, o aproximadamente 600 mg/día, de la dosificación estándar. En algunos casos, el beneficio terapéutico se ha obtenido de la administración de una cantidad de dosificación que es una reducción de la dosificación estándar a menor que 40% (por ejemplo, la administración está dentro de aproximadamente 40% a 10% de la dosificación estándar, o de aproximadamente 600 mg/día a aproximadamente 150 mg/dia, ) . En una modalidad, la dosificación es aproximadamente 30%, o aproximadamente 450 mg/dia, de la dosificación estándar. En una modalidad, la dosificación es aproximadamente 20%, o aproximadamente 300 mg/dia, de la dosificación estándar. En una modalidad, la dosificación es aproximadamente 10%, o aproximadamente 150 mg/dia, de la dosificación estándar.

La administración se realiza tal que los agentes administrados (por ejemplo, metformina y agente quimioterapéutico) hacen contacto con el tumor o el sitio del tumor (por ejemplo, después de la remoción del tumor) . Las rutas adecuadas de administración son conocidas en la técnica. Los agentes descritos en la presente se pueden administrar en cualquier manera encontrada apropiada por un clínico, tal como aquellos descritos en Physicians Desk Reference, 56.sup.th Ed. (2002) Publisher Edward R. Barnhart, New Jersey ("PDR"). Por ejemplo, parenteralmente, enteralmente, tópicamente. Los agentes combinados, o cada agente individualmente se pueden administrar por cualquier medio conocido en la técnica. Tales modos incluyen la administración oral, rectal, nasal, tópica (incluyendo bucal y sublingual), o parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa e intradérmica) . La metformina y el agente aumentado se puede administrar sistémicamente como se puede administrar localmente al, o cerca de sitio del tumor (por ejemplo, mediante la inyección en el tumor o un órgano o parte del cuerpo que contiene el tumor) . En una modalidad, la metformina y los agentes terapéuticos aumentados (por ejemplo, agentes quimioterapéuticos ) se administran en el sistema nervioso central.

La administración puede ser pre-operativa o post-operativa, o ambas. En una modalidad, la metformina se administra tres veces al día (por ejemplo, 25 mg/dosis) durante un mes antes de la cirugía y remoción del tumor.

La administración de metformina (cuando es aplicable con un agente quimioterapéutico) en los métodos descritos en la presente puede ser por un periodo prolongado de tiempo (por ejemplo, 6-12 meses, o 1, 2, 3 años o indefinidamente) . En una modalidad, la metformina se administra más frecuentemente que el agente quimioterapéutico. Por ejemplo, un sujeto se puede administrar con el agente (s) (por ejemplo, doxorubicina ) , en una frecuencia significantemente reducida que es de otra manera prescrita, tal como 3 días/meses, mientras que se administra metformina (por ejemplo, 250 mg/día) en una base diaria .

Generalmente, la dosis y administración programada debe ser suficiente para dar por resultado el alentamiento, y de preferencia la regresión, en el crecimiento del tumor (s) y también de preferencia causar regresión completa del tumor. En algunos casos, la regresión se puede monitorear por una disminución en los niveles de sangre de los marcadores específicos del tumor. Una cantidad efectiva de un agente farmacéutico es aquella que proporciona una mejora o jetivamente identificable como es notado por el clínico u otro observador calificado. La regresión de un tumor en un paciente típicamente se mide con referencia al diámetro de un tumor. La disminución en diámetro de un tumor indica regresión. La regresión también es indicada por la falla de los tumores para recurrir después de que ha detenido el tratamiento.

La metformina y los agentes quimioterapéuticos en combinación, o separadamente, se suministran en intervalos periódicos que pueden variar de varias veces al día a una vez por mes. Como es mencionado en lo anterior, los agentes se administran hasta que se ha obtenido el efecto terapéutico deseado. Adicionalmente, con el fin de evitar efectos secundarios, no todos los componentes de la combinación pueden requerir suministro en cada administración.

Agentes Terapéuticos Los fármacos citotóxicos actualmente disponibles se pueden dividir ampliamente por su mecanismo de acción en cuatro grupos: agentes alquilantes, anti-metabolitos , antibióticos y misceláneos de otras actividades. La elección de un agente citotóxico particular para tratar un individuo con cáncer es influenciado por muchos factores, incluyendo el tipo de cáncer, la edad y salud general del paciente, y problemas de resistencia de multifármaco .

La composición de la invención puede utilizar una variedad de agentes citotóxicos, incluyendo pero no limitados a los siguientes ejemplos (incluyendo posibles fuentes): los agentes alquilantes ciclofosfamida (Bristol-Meyers Squibb) , ifosfamida (Bristol-Meyers Squibb) , clorambucilo ¦ (Glaxo Wellcome) y carmustina (Bristol-Meyers Squibb) ; los antimetabolitos citarabina (Pharmacia & Upjohn), 6-mercaptopurina (Glaxo Wellcome) , 6-tioguanina (Glaxo Wellcome) y metotrexato (Immunex); los antibióticos de doxorubicina (Pharmacia & Upjohn), daunorubicina (NeXstar) y mitoxantrona (Immunex); y agente misceláneos tales como vincristina (Lilly), vinblastina (Lilly) y paclitaxel (Bristol-Meyers Squibb) . Los agentes citotóxicos preferidos incluyen ciclofosfamida, ifosfamida, citarabina, 6-mercaptopurina , 6-tioguanina, doxorubicina, daunorubicina, mitoxantrona y vincristina. El agente citotóxico mucho más preferido es ciclofosfamida e ifosfamida.

Los agentes quimioterapéuticos son conocidos en la técnica e incluyen por lo menos los taxanos, mostazas de nitrógeno, derivados de etilenimina, sulfonatos de alquilo, nitrosoureas , triazenos; análogos de ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina, alcaloides de vinca per vinca, antibióticos, enzimas, complejo de coordinación de platino, urea sustituida, derivados de metil hidrazina, supresores adrenocorticales o antagonistas. Más específicamente, los agentes quimioterapéuticos pueden ser uno o más agentes elegidos del grupo no limitantes de esteroides, progestinas, estrógenos, antiestrógenos o andrógenos. Aún más específicamente, los agentes de quimioterapia pueden ser azaribina, bleomicina, brioestatina-1, busulfano, carmustina, clorambucilo, carboplatino, cisplatino, CPT-11, ciclofosfamida , citarabina, dacarbazina, dactinomicina, daunorubicina, dexametasona, dietilstilbestrol , doxorubicina, etinil estradiol, etoposido, fluorouracilo, fluoximesterona, gemcitabina, · caproato de hidroxiprogesterona, hidroxiurea, L-asparaginasa , leucovorina, lomustina, mecloretamina, acetato de medroprogesterona, acetato de megestrol, melfalano, mercaptopurina , metotrexato, metotrexato, mitramicina, mitomicina, mitotano, paclitaxel, butirato de fenilo, prednisona, procarbazina , semustina estreptozocina, tamoxifen, taxanos, taxol, propionato de testosterona , talidomida, tioguanina, tiotepa, mostaza de uracilo, vinblastina o vincristina . También se contempla el uso de cualquiera de las combinaciones de agentes de quimioterapia.

Otros agentes terapéuticos adecuados se seleccionan del grupo que consiste de radioisótopo, suplemento de boro, inmunomodulador y agente quimiosensibili zante (Ver, las Patentes Norteamericanas Nos. 4,925,648 y 4932,412). Los agentes quimioterapéuticos adecuados se describen en REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 19th Ed . (Mack Publishing Co. 1995), y en Goodman and Gilman' s The Pharmacological Basis of Therapeutics (Goodman y colaboradores, Eds. Macmillan Publishing Co, New York, 1980 and 2001 editions) . Otros agentes quimioterapéuticos adecuados, tales como fármacos experimentales, son conocidos para aquellos de habilidad en la técnica. Es bien conocido en la técnica que varios métodos de terapia de radionúclido se pueden utilizar para tratamiento de cáncer y otras condiciones patológicas como es descrito, por ejemplo, en Harbert, "Nuclear Medicine Therapy", New York, Thieme Medical Publishers, 1087, pp. 1-340. Por otra parte un radioisótopo terapéutico adecuado se selecciona del grupo que consiste de a -emisores, ß-emisores, ?-emisores, emisores de electrón de Auger, agente de capturacion de neutrón que emiten partículas a - y radioisótopos que decaen por la captura de electrones. De preferencia, el radioisótopo se selecciona del grupo que consiste de 225Ac, 198Au, 32P, 1251, 1311, 90Y, 186Re, 188Re, 67Cu, 177Lu, 213BÍ, 10B y 211At.

En otra modalidad, diferentes isótopos que son efectivos sobre diferentes distancias como un resultado de sus emisiones de energía individuales se utilizan como primero y segundo agente terapéutico. Tales agentes se pueden utilizar para lograr tratamiento más efectivo de tumores, y son útiles en pacientes que se presentan con múltiples tumores de diferentes tamaños, como en circunstancias clínicas normales.

Pocos de los isótopos disponibles son útiles para tratar los depósitos de tumor muy pequeños y células individuales. En estas situaciones, un fármaco o toxina puede ser un agente terapéutico más útil. Por consiguiente, en modalidades preferidas de la presente invención, los isótopos se utilizan en combinaciones con las especies no isotópicas tales como fármacos, toxinas y agentes de captura de neutrones. Muchos fármacos y toxinas son conocidos que tienen efectos citotóxicos sobre células, y se pueden utilizar en conexión con la presente invención. Esos se encuentran en compendios de fármacos y toxinas, tal como Merck Index, Goodman y Gilman, y los similares y las referencias citadas en lo anterior.

Los fármacos que interfieren con la síntesis de proteína intracelular también se pueden utilizar en los métodos de la presente invención; tales fármacos son conocidos para aquellos expertos en la técnica e incluyen puromicina, cicloheximida y ribonucleasa .

Terapia de Radiación Una variedad de terapias de radiación se utilizan en la terapia de tumor. Los solicitantes contemplan el uso de cantidades aumentadas de metformina para permitir cantidades reducidas de cualquiera o una combinación de tales terapias de radiación en el tratamiento de tumor.

Para algunos tipos de tumores, la radiación se puede dar a áreas que no tienen evidencia de tumores. Esto se hace para prevenir que las células de tumor crezcan del área que recibe la radiación. Esta técnica es llamada terapia de radiación profiláctica. La terapia de radiación también puede ser dada para ayudar a reducir los síntomas tal como el dolor del cáncer que se ha dispersado a los huesos y otras partes del cuerpo. Esta es llamada terapia de radiación paliativa.

La radiación puede provenir de una maquina externa al cuerpo (radiación externa) , se puede colocar dentro del cuerpo (radiación interna) o puede utilizar materiales radioactivos no sellados que van a través del cuerpo (terapia de radiación sistémica) . El tipo de radiación que se da depende del tipo de cáncer, su ubicación, cuanto afecta el cuerpo la radiación que sea necesaria, la salud general del paciente y la historia médica, si el paciente tendrá otros tipos de tratamiento de cáncer, y otros factores. La mayoría de la gente quienes reciben terapia de radiación para cáncer tienen radiación externa. Algunos pacientes tienen terapia de radiación tanto externa como interna o sistémica, ya sea una después de la otra o en el mismo tiempo. La terapia de radiación externa usualmente se da en una base fuera del paciente; la mayoría de los pacientes no necesitan permanecer en el hospital. La terapia de radiación externa se utiliza para tratar la mayoría de tipos de cáncer, incluyendo cáncer de la vejiga, cerebro, seno, cérvix, laringe, pulmón, próstata y angina. Además, la radiación externa se puede utilizar para aliviar el dolor o facilitar otros problemas cuando el cáncer se dispersa a otras partes del cuerpo desde el sitio primario.

La terapia de radiación intraoperativa (IORT) es una forma de radiación externa que se da durante la cirugía. La IORT se utiliza para tratar el cáncer localizado que no pues ser completamente removido o que tienen alto riesgo de recurrencia (provenir nuevamente) en tejidos vecinos. Después de que todo o la mayoría de cáncer es removido, una dosis de alta energía grande de radiación se dirige directamente en el sitio de tumor durante la cirugía (cerca del tejido sano que es protegido con escudos especiales) . El paciente permanece en el hospital para recuperarse de la cirugía. La IORT se puede utilizar en el tratamiento de cáncer de tiroides y colorectal, cánceres ginecológicos, cáncer del intestino delgado, y cáncer del páncreas. También está siendo estudiado en experimentos clínicos (estudios de investigación) para tratar algunos tipos de tumores de cerebro y sarcomas pélvicos en adultos.

La irradiación craneal profiláctica (PCI) es la radiación externa dada al cerebro cuando el cáncer primario (por ejemplo, cáncer de pulmón de célula pequeña) tiene un alto riesgo de dispersión al cerebro.

La terapia de radiación interna (también llamada braquiterapia) utiliza radiación que se coloca muy cercana o dentro del tumor. La fuente de radiación usualmente se sella en un sostenedor pequeño llamado un implante. Los implantes puede estar en la forma de alambres delgados, tubos de plástico, llamados catéters, cintas, cápsulas o semillas. El implante se coloca directamente en el cuerpo. La terapia de radiación interna puede requerir una estancia en el hospital. La radiación interna usualmente se suministra en una de dos maneras, cada una de las cuales utiliza implantes sellados. La terapia de radiación intersticial se inserta en el tejido en o cerca del sitio del tumor. Este se utiliza para tratar tumores de la cabeza y cuello, próstata, cérvix, ovario, seno y regiones perianales y pélvicas. Algunas mujeres tratadas con radiación externa para el cáncer de seno reciben una "dosis de refuerzo" de radiación que puede utilizar radiación intersticial o radiación externa. La terapia de radiación intracavitaria o intraluminal se inserta en el cuerpo con un aplicador. Esta comúnmente se utiliza en el tratamiento del cáncer uterino. Los investigadores también están estudiando otros tipos de terapia radiación externa para otros cánceres, incluyendo seno, bronquial, cervical, vesícula biliar, oral, rectal, traqueal, uterina y vaginal. La terapia de radiación sistémica utiliza materiales radioactivos tal como yodo 131 y estroncio 89. Los materiales se pueden tomar por la boca o inyectar en el cuerpo. La terapia de radiación sistémica es de alguna veces utilizada para tratar cáncer de la tiroides y el linfoma no de Hodgkin adulto.

Tumores Los tumores que son tratados por los métodos y composiciones de la presente invención pueden ser malignos (por ejemplo, carcinogénicos o "cáncer") o benignos. Ejemplos de tumores benignos para el tratamiento incluyen adenomas de tiroides, adenomas adrenocorticales y adenomas de pituitaria, tumores de cerebro benignos (por ejemplo, glioma, astrocitoma, meningioma) . Por "cáncer" usualmente se propone un grupo de enfermedades que tienen la aparición de tumores como síntomas. Estos tumores están compuestos de células atípicas, que tienen una capacidad para el crecimiento autónomo, una delimitación imprecisa, una habilidad para invadir los tejidos vecinos y vasos y una tendencia para diseminarse por la producción de metástasis. Sin limitación, ejemplos de canceres que pueden ser tratados por los métodos y composiciones descritos en la presente incluyen cáncer de vejiga, melanoma, cáncer de seno, linfoma no de Hodgkin, cáncer de colon y rectal, cáncer pancreático, , cáncer endometrial, cáncer de próstata, cáncer de riñon (célula renal) cáncer de piel, (no melanoma), leucemia, cárícer de tiroides, cáncer de pulmón, cáncer cervical, cáncer ovárico, cáncer testicular. El crecimiento primario y metastático de los siguientes tumores se pueden inhibir por los métodos descritos en lo anterior: carcinomas epidermoides vulvares, carcinomas cervicales, adenocarcinomas endometriales , adenocarcinomas ováricos y melanomas oculares.

Puesto que la metformina puede cruzar la barrera hematoencefálica, su administración, de acuerdo con los métodos descritos en la presente, puede ser útil en tratar o prevenir tumores del sistema nervioso central, o prevenir la dispersión de cánceres al sistema nervioso central.

Las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden estar en la forma de dosificación de sólido, semi-sólido o liquido, tal como, por ejemplo, suspensión, aerosoles o los similares. De preferencia las composiciones se administran en formas de dosificación unitaria adecuadas para la administración individual de cantidades de dosificación precisas. Las composiciones también pueden incluir dependiendo de la formulación deseada, portadores o diluyentes no tóxicos, farmacéuticamente aceptables, que se definen como vehículos comúnmente utilizados para formular composiciones farmacéuticas para administración animal humana. Las composiciones se pueden proporcionar como formulaciones de liberación sostenida o de liberación sincronizada. El portador o diluyente puede incluir cualquier material de liberación sostenida conocido en la técnica, tal como monostrearato de glicerilo o distearato de glicerilo, solo o mezclado con una cera. Las preparaciones de liberación controlada se pueden lograr mediante el uso de polímeros para formar en complejo o adsorber la metformina y/o agente quimioterapéutico . El suministro controlado se puede ejercer al seleccionar macromoléculas apropiadas (por ejemplo, poliésteres, poliaminoácidos , polivinil pirrolidona, etilenvinilacetato, metilcelulosa, carboximetilcelulosa y sulfato de protamina) y la concentración de macromoléculas así como los métodos de incorporación con el fin de controlar la liberación. También se puede utilizar la microencapsulación . La formulación de liberación sincronizada puede proporcionar una combinación de liberación inmediata y pulsada por todo el día. El diluyente se selecciona para no afectar la actividad biológica de la combinación. Ejemplos de tales diluyentes son agua destilada, solución salina fisiológica, solución de Ringer, solución de dextrosa y solución de Hank. Además, la composición farmacéutica de la formulación también puede incluir otros portadores, adyuvantes, emulsificantes tales como poloxámeros o estabilizadores no tóxicos, no terapéuticos, no inmunogénicos y los similares. Cantidades efectivas de tal diluyente o portador serán aquellas cantidades que son efectivas para obtener una formulación farmacéuticamente aceptable en términos de solubilidad de componentes, o actividad biológica y los similares.

Otro aspecto de la presente invención se relaciona a una formulación para tratar cáncer con la combinación de fármacos anterior. En una modalidad, la formulación incluye un dispositivo de liberación controlada donde uno o varios de los fármacos están siendo liberados en un aspecto retardado. Tal formulación puede estar en la forma de una tableta (o una pildora) que libera diferentes dosis de fármacos en diferentes intervalos de tiempo después de que se toman oralmente .

Otro aspecto de la presente invención se relaciona a un equipo para el tratamiento de un sujeto por los métodos divulgados en la presente (por ejemplo, terapia de tumor) . El equipo comprende uno o más frasquitos de la metformina y uno o más frasquitos del agente (s) quimioterapéutico (ya sea conjuntamente o en frasquitos separados) en las dosis proporcionadas en lo anterior. El equipo además puede contener instrucciones que describen su uso en combinación.

El equipo puede incluir una formulación de tanto la metformina junto con uno o más de los agentes quimioterapéuticos .

Método para seleccionar un agente que modula un agente o agentes quimioterapéuticos que son modulados por metformina .

La presente invención proporciona métodos para seleccionar agentes (por ejemplo, derivados de metformina) que modulan agentes quimioterapéuticos por los métodos de la presente invención. El tumor, cáncer y/o células madre de cáncer se pueden utilizar para ensayar compuestos de prueba (por ejemplo, un derivado de metformina) para la eficacia en la exterminación de las células. En los métodos, un derivado de metformina se administra con un agente quimioterapéutico conocido a las células, y su habilidad para exterminar las células se determina al medir un parámetro indicador de las células (por ejemplo, viabilidad celular) . La viabilidad celular se compara con un control apropiado que no ha recibido el derivado de metformina, y una exterminación aumentada (por ejemplo, un efecto sinergistico) indica que el derivado de metformina es un agente que modula el agente quimioterapéutico .

La presente invención también proporciona métodos para seleccionar agentes que son aumentados en su habilidad de exterminación de tumor, cáncer y/o células madre de cáncer, por metformina. En los métodos, un compuesto de prueba se administra con metformina (o un derivado de metformina identificado) a las células, y su habilidad para exterminar las células se determina al medir un parámetro indicativo de las células (por ejemplo, viabilidad celular) . La viabilidad celular se compara con un control apropiado que no ha recibido el compuesto de prueba, y una exterminación aumentada (por ejemplo, un efecto sinergistico) indica que el compuesto de prueba es un agente que se aumenta por la metformina .

Los compuestos de prueba se adicionan convenientemente en solución, o forma fácilmente soluble, al menos de células en cultivo. Los agentes se pueden adicionar en un sistema de flujo pasante, como una corriente, intermitente o continua, o alternativamente, la adición de un bolo del compuesto, individualmente o incrementadamente a una solución de otra manera estática. En un sistema de flujo pasante, se utilizan dos fluidos, donde uno es una solución fisiológicamente neutra, y el otro es la misma solución con el compuesto de prueba adicionado. El primer fluido se pasa sobre las células, seguido por el segundo. En un método de una solución, un bolo del compuesto de prueba se adiciona al volumen del medio que circunda las células. Las concentraciones totales de los componentes del medio de cultivo no deben cambiar significantemente con la adición del bolo, o entre las dos soluciones en un método de flujo pasante. En algunas modalidades, las formulaciones de agente no incluyen componentes adicionales, tales como conservadores, que pueden tener un efecto significante sobre una formulación total. Así, en una modalidad, las formulaciones consisten esencialmente de un agente de prueba y un portador fisiológicamente aceptable, por ejemplo agua, etanol, DMSO, etc. Sin embargo, si un compuesto es líquido sin un solvente, la formulación puede consistir esencialmente del compuesto mismo.

Una pluralidad de ensayos se pueden correr en paralelo con diferentes concentraciones de agente para obtener una respuesta diferencial de las diversas concentraciones. Como es conocido en la técnica, la determinación de la concentración efectiva de un agente típicamente utiliza un intervalo de concentraciones que resulta de diluciones 1:10 u otra escala log. Las concentraciones además pueden ser refinadas con una segunda serie de diluciones, si es necesario. Típicamente, una de estas concentraciones sirve como un control negativo, es decir en concentración cero o abajo del nivel de detección del agente o en o debajo de la concentración del agente que no da un cambio detectable en el fenotipo.

Compuestos de Prueba El término "compuesto de prueba" o "agente de prueba" como se utiliza en la presente y por toda la especificación cuando se utiliza en referencia a un ensayo de selección, significa cualquier molécula orgánica o inorgánica, incluyendo ácidos nucleicos modificados y no modificados tales como ácidos nucleicos de antisentido, RNAi, tal como siRNA o shRNA, péptidos, peptidomiméticos , receptores, ligandos y anticuerpos.

El compuesto de prueba puede ser cualquier molécula, compuesto u otra sustancia que puede ser administrada a un animal de prueba. En algunos casos, el agente de prueba no interfiere sustancialmente con la viabilidad del animal. Los compuestos de prueba adecuados pueden ser moléculas pequeñas, polímeros biológicos, tales como polipéptidos, polisacáridos , polinucleótidos y los similares. Los compuestos de prueba típicamente serán administrados al animal en una dosificación de 1 ng/kg a 10 mg/kg, usualmente de 10 pg/kg a 1 mg/kg. Los compuestos de prueba se pueden identificar que son terapéuticamente efectivos, tales como agentes anti-proliferativos, o como compuestos principales para el desarrollo de fármaco.

En algunas modalidades, el compuesto de prueba puede ser de una diversidad de librerías, tales como librerías de péptido o no de péptido aleatorias o combinatorias. Muchas librerías son conocidas en la técnica, tales como, por ejemplo, librerías químicamente sintetizadas, librerías de exhibición de fago recombinante y librerías basadas en traducción in vivo.

Ejemplos de librerías químicamente sintetizadas se describen en Fodor y colaboradores (Science 251:767-73 (1991) ), Houghten y colaboradores (Nature 354:84-86 (1991)), Lam y colaboradores (Nature 354:82-84 (1991)), Medynski (Bio/Technology 12:709-10 (1994)), Gallop y colaboradores (J. Med. Chem. 37:1233-51 (1994)), Ohlmeyer y colaboradores (Proc. Nati. Acad. Sci . USA 90:10922-26 (1993) ), Erb y colaboradores (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91:11422-26 (1994)), Houghten y colaboradores (Biotechniques 13:412-21 (1992) ), Jayawickreme y colaboradores (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91:1614-18 (1994)), Salmón y colaboradores (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:11708-12 (1993)), Publicación de Patente Internacional WO 93/20242, y Brenner and Lerner (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:5381-83 (1992)) .

Ejemplos de librerías de exhibición de fago se describen en Scott y Smith (Science 249:386-90 (1990)), Devlin y colaboradores (Science 249:404-06 (1990)), Christian y colaboradores (J. Mol. Biol. 227:711-18 (1992)), Lenstra (J. Immunol. Meth. 152:149-57 (1992)), Kay y colaboradores (Gene 128:59-65 (1993)), y Publicación de Patente Internacional 94/18318.

Las librerías basadas en traducción in vivo incluyen pero no están limitadas a, aquellas descritas en la Publicación de Patente Internacional WO 91/05058, y Mattheakis y colaboradores (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91:9022-26 (1994)). A manera de ejemplos de librerías no de péptido, una librería de benzodiazepina (ver, por ejemplo, Bunin y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91:4708-12 (1994)) se puede adaptar para el uso. Las librerías de péptido (ver, por ejemplo, Simón y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:9367-71(1992)) también se pueden utilizar. Otro ejemplo de una librería que se puede utilizar, en la cual las funcionalidades de amida en péptidos se han permetilado para generar una librería combinatoria químicamente transformada, es descrito por Ostresh y colaboradores (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91:11138-42 (1994) ) .

El agente de prueba utilizado en e-1 método de selección puede ser seleccionado de un grupo de sustancias químicas, molécula pequeña, entidad química, secuencias de ácido nucleico, una acción; análogos de ácido nucleico o proteína o polipéptido o análogos del fragmento de los mismos. En algunas modalidades, el ácido nucleico es DNA o RNA, y análogos de ácido nucleico, por ejemplo puede ser PNA, pcPNA y LNA. Un ácido nucleico puede ser de una sola o doble hebra, y se puede seleccionar de un grupo que comprende; ácido nucleico que codifica una proteína de interés, oligonucleótidos , PNA, etc. Tales secuencias de ácido nucleico incluyen, por ejemplo, pero no limitados a, secuencia de ácido nucleico que codifica proteínas que actúan como represores transcripcionales, moléculas de antisentido, ribozimas, secuencias de ácido nucleico inhibidoras pequeñas, por ejemplo pero no limitadas a RNAi, shRNAi, siRNA, micro RNAi (mRNAi), oligonucleótidos de antisentido, etc. Una proteína y/o agente de péptido o fragmento del mismo, puede ser cualquier proteína de interés, por ejemplo, pero no limitado a; proteínas mutadas; proteínas terapéuticas; proteínas truncadas, en donde la proteína está normalmente ausente o expresada en niveles inferiores en la célula. Las proteínas de interés se pueden seleccionar de un grupo que comprende; proteínas mutadas, proteínas genéticamente diseñadas, péptidos, péptidos sintéticos, proteínas recombinantes , proteínas quiméricas, anticuerpos, proteínas humanizadas, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, proteínas modificadas y fragmentos de los mismos. El agente se puede aplicar al medio, donde hace contacto con la célula (tales como células de origen de endodermo) e induce sus efectos. Alternativamente, el agente puede ser intracelular dentro de la célula (por ejemplo, de origen de endodermo) como un resultado de la introducción de la secuencia de ácido nucleico en las células y su transcripción que da por resultado la producción del ácido nucleico y/o agente de proteína dentro de la célula. Un agente también abarca cualquier acción y/o evento de las células (por ejemplo, células de origen de endodermo) que se someten. Como ejemplos no limitantes, una acción puede comprender cualquier acción que activa un cambio fisiológico en la célula, por ejemplo pero no limitado a; choque térmico, irradiación ionizante, choque frío, impulso eléctrico, exposición de luz y/o longitud de onda, exposición de UV, presión, acción de estiramiento, exposición de oxigeno incrementada y/o disminuida, exposición a especies de oxigeno reactivas (ROS), condiciones sistémicas, exposición de fluorescencia etc. Los estímulos ambientales también incluyen estímulos ambientales intrínsecos definidos enseguida. La exposición del agente puede ser continua o no continua.

En algunas modalidades, el agentes es un agente de interés que incluye compuestos conocidos y desconocidos que abarcan numerosas clases químicas, principalmente moléculas orgánicas, que pueden incluir moléculas organometálicas, moléculas inorgánicas, secuencias genéticas, etc. Un aspecto importante de la invención es evaluar fármacos candidatos, que incluyen la prueba de toxicidad; y los similares. Los agentes candidatos también incluyen moléculas orgánicas que comprenden grupos funcionales necesarios para interacciones estructurales, particularmente de enlace de hidrógeno, y típicamente incluyen por lo menos un grupo amina, carbonilo, hidroxilo o carboxilo, frecuentemente por lo menos dos de los grupos químicos funcionales. Los agentes candidatos frecuentemente comprenden estructuras de carbono cíclicas o heterocíclicas y/o estructuras aromáticas o poliaromáticas sustituidas con uno o más de los grupos funcionales anteriores. Los agentes candidatos también se encuentran entre las biomoléculas , incluyendo péptidos, polinucleótidos , sacáridos, ácidos grasos, esteroides, purinas, pirimidinas, derivados, análogos estructurales o combinaciones de los mismos .

También se incluyen como agentes de prueba los fármacos farmacológicamente activos, moléculas genéticamente activas, etc. Compuestos de interés incluyen, por ejemplo, agentes quimioterapéuticos , hormonas o antagonistas de hormona, factores de crecimiento o factores de crecimiento recombinantes y fragmentos y variantes de los mismos. Ejemplares de agentes farmacéuticos adecuados para esta invención son aquellos descritos en "The Pharmacological Basis of Therapeutics" , Goodman and Gilman, McGraw-Hill, New York, N.Y., (1996), Ninth edition, under the sections: Water, Salts and Ions; Drugs Affecting Renal Function and Electrolyte etabolism; Drugs Affecting Gastrointestinal Function; Chemotherapy of Microbial Diseases; Chemotherapy of Neoplastic Diseases; Drugs Acting on Blood-Forming organs; Hormones and Hormone Antagonists ; Vitamins, Dermatology; and Toxicology, todas incorporadas en la presente por referencia. También se incluyen toxinas, y agentes de armamento biológico y químico, por ejemplo ver Somani, S. M. (Ed.), "Chemical Warfare Aqents", Academic Press, New York, 1992).

Los agentes incluyen todas las clases de moléculas descritas en lo anterior, y además pueden comprender muestras de contenido desconocido. De interés son las mezclas complejas de compuestos que ocurren naturalmente derivados de fuente natural tales como plantas. Mientras que muchas muestras comprenderán compuestos en solución, muestras sólidas que se pueden disolver en un compuesto adecuado también se pueden analizar. Muestras de interés incluyen muestras ambientales, por ejemplo agua subterránea, agua de mar, desecho de minería, etc.; muestras biológicas, por ejemplo lisados de cultivos, muestras de tejido, etc.; muestras de manufactura, por ejemplo curso de tiempo durante la preparación de sustancias farmacéuticas; así como en librerías de compuestos preparados para el análisis; y los similares. Muestras de interés incluyen compuestos que son estimados para valor terapéutico potencial, es decir candidatos de fármaco.

Los compuestos para selección incluye derivados de metformina y agentes candidatos (también referidos en la presente como agentes de prueba o compuestos de prueba) . Los agentes candidatos se obtienen de una amplia variedad de fuentes que incluyen librerías de compuestos sintéticos o naturales. Por ejemplo, los numerosos medios son disponibles para la síntesis aleatoria y dirigida de una amplia variedad de compuestos orgánicos, incluyendo moléculas, incluyendo la expresión de oligonucleótidos aleatorizados y oligopéptidos . Alternativamente, las librerías de compuestos naturales en la forma de extractos bacterianos, fúngales y de planta y de animales son disponibles o fácilmente producidos. Adicionalmente las librerías naturales o sintéticamente producidas y compuestos son fácilmente modificados a través de medios químicos, físicos y bioquímicos convencionales, y se pueden utilizar para producir librerías combinatorias. Los agentes farmacológicos conocidos se pueden someter a modificaciones químicas dirigidas o aleatorias, tal como acilación, alquilación, esterificación, amidificación, etc. para producir análogos estructurales.

Los agentes se seleccionan para el efecto en las células usualmente una pluralidad de tumor/cáncer/células madre de cáncer, usualmente en conjunción con células similares que carecen del agente. El cambio en los parámetros en respuesta al agente se mide, y el resultado se evalúa mediante la comparación a cultivos de referencia, por ejemplo en la presencia y ausencia del agente, obtenido con otros agentes, etc.

Los parámetros son componentes cuantificables de viabilidad celular, crecimiento y/o tumorigénesis que pueden ser medidos precisamente, deseablemente en un sistema de alto rendimiento. Mientras que la mayoría de los parámetros proporcionarán una lectura cuantitativa, en algunos casos un resultado semicuantitativo o cualitativo será aceptable. Las lecturas pueden incluir un valor determinado individual, o pueden incluir una media, valor medio o la variación, etc. Característicamente un intervalo de valores de lectura de parámetros será obtenido para cada parámetro de una multiplicidad de los mismos ensayos. La variabilidad se espera y un intervalo de valores para cada uno de los compuestos de parámetro de prueba se ha obtenido utilizando métodos estadísticos estándares con un método estadístico común utilizado para proporcionar valores individuales. En algunas modalidades, el ensayo es un ensayo computari zado o un sistema de alto rendimiento robótico operado a través de una interfaz de computadora.

Los compuestos que son seleccionados pueden ser moléculas que ocurren naturalmente o sintéticas. Los compuestos que son seleccionados también se pueden obtener de fuentes naturales, tales como microorganismos marinos, algas, plantas y hongos. Los compuestos de prueba también pueden ser minerales o agentes oligo. Alternativamente, los compuestos de prueba se pueden obtener entre librerías combinatorias de agentes, incluyendo péptidos o moléculas pequeñas, o de repertorios existentes de compuestos químicos sintetizados en la industria, por ejemplo, mediante las industrias químicas, farmacéuticas, ambientales, agrícolas, marinas, cosméticas, de fármacos y biotecnológicas . Los compuestos de prueba pueden incluir, por ejemplo agentes farmacéuticos, terapéuticos, agrícolas e industriales, contaminantes ambientales, cosméticos, fármacos, compuestos orgánicos e inorgánicos, lípidos, glucocorticoides , antibióticos, péptidos, proteínas, azucares, carbohidratos, moléculas quiméricas y combinaciones de los mismos.

Las librerías combinatorias se pueden producir para muchos tipos de compuestos que se pueden sintetizar en un aspecto de etapa por etapa. Tales compuestos incluyen polipéptidos , proteínas, ácidos nucleicos, miméticos de beta-vuelta, polisacáridos, fosfolípidos , hormonas, prostaglandinas , esteroides, compuestos aromáticos, compuestos heterocíclicos, benzodiazepinas, glicinas N-substituidas oligoméricas y oligocarbamatos . En los métodos de la presente invención, el compuesto de prueba preferido es una molécula pequeña, ácido nucleico y ácido nucleico modificado, péptido, peptidomimético, proteína, glicoproteína, carbohidrato, lípido o glicolípido. De preferencia, el ácido nucleico es DNA o RNA.

La librerías combinatorias grandes de compuestos se puede construir por el método de librería sintéticas codificadas (ESL) descrito en Affymax, WO 95/12608, Affymax O 93/06121, Columbia University, WO 94/08051, Pharmacopeia, WO 95/35503 and Scripps, WO 95/30642 (cada una de las cuales es incorporada en la presente por referencia en su totalidad para todos los propósitos) . Las librerías de péptido también se pueden generar mediante los métodos de exhibición de fago. Ver, por ejemplo, Devlin, WO 91/18980. Los compuestos que son seleccionados también se pueden obtener de fuentes gubernamentales o privadas, incluyendo, por ejemplo, la libería DIVERSet E (16,320 compuestos) de ChemBridge Corporation (San Diego, CA) , de National Cáncer Institute' s (NCI) Natural Product Repository, Bethesda, MD, de NCI Open Synthetic Compound Collection, Bethesda, MD, NCI's Developmental Therapeutics Program, o los similares.

Adicionalmente , las librerías naturales y sintéticamente producidas y compuestos son fácilmente modificados a través de medios químicos, físicos y bioquímicos convencionales. Además, los agentes farmacológicos conocidos se pueden someter a modificaciones químicas dirigidas aleatorias, tales como acilación, alquilación, esterificación, amidificación, etc.

Para seleccionar los compuestos descritos en lo anterior para la habilidad para modular la transcripción y/o expresión de factores asociados con el crecimiento muscular, los compuestos de prueba deben de ser administrados al sujeto de prueba. En una modalidad el sujeto de prueba es un cultivo de células comprendido de tumor, cáncer y/o células madre de cáncer. Las células pueden ser un cultivo de células primarias, o una linea de células inmortalizadas de un tumor.

Los compuestos de prueba se pueden administrar, por ejemplo, al diluir los compuestos en el medio en donde las células se mantienen, al mezclar los compuestos de prueba con el alimento o liquido del animal con el músculo, administrar tópicamente el compuesto en un portador farmacéuticamente aceptable en el animal con el músculo, utilizando sustratos dimensionales empapados con el compuesto de prueba tales como cuentas de liberación lenta y los similares el incrustar tales sustratos en el animal, administrar intramuscularmente el compuesto, para administrar parenteralmente el compuesto.

Una variedad de otros reactivos también se pueden incluir en la mezcla. Estos incluyen reactivos tales como sales, soluciones reguladoras, proteínas neutras, por ejemplo, albúmina, detergente, etc. que se puede utilizar para facilitar el enlace de proteína-proteína y/o proteína-ácido nucleico óptimo y/o reducir las interacciones no específicas o antecedentes, etc. También, los reactivos que de otra manera mejoran la eficiencia del ensayo, tales como inhibidores de proteasa, inhibidores de nucleasa, agentes antimicrobiales , etc. se pueden utilizar.

También puede estar presentes conservadores y otros aditivos. Por ejemplo, agentes antimicrobianos, antioxidantes, quelantes y gases inertes se pueden adicionar (ver, generalmente, Remington' s Pharmaceutical Sciences, 16th Edition, Mack, 1980) . Como es mencionado en lo anterior, los ensayos de selección generalmente se llevan a cabo in vivo, por ejemplo, en células cultivadas.

A menos que se defina de otra manera en la presente, los términos científicos y técnicos utilizados en relación con la presente solicitud tendrán los significados que son comúnmente entendidos por aquellos de habilidad ordinaria en la técnica. Además, a menos que se requiera de otra manera por el contexto, términos singulares tendrán pluralidades y términos plurales incluirán lo singular.

Se debe entender que esta invención no esta limitada a la metodología particular, protocolos y reactivos, etc. descritos en la presente y tales pueden variar. La terminología utilizada en la presente es para el propósito de describir modalidades particulares solamente, y no se proponen para limitar el alcance de la presente invención, que es definido solamente por las reivindicaciones.

Diferente a los ejemplos de operación, o donde es indicado de otra manera, todos los números que expresan cantidades de ingredientes o condiciones de reacción utilizadas en la presente deben ser entendidos como modificados en todos los casos por el término "aproximadamente". El termino "aproximadamente" cuando se utiliza para describir la presente invención, en conexión con porcentaje significa ±1%.

En un aspecto, la presente invención se relaciona a las composiciones descritas en la presente, métodos y componentes respectivos de los mismos, como esenciales para la invención, paro abierto a la inclusión de elementos no especificados, esenciales o no esenciales ("que comprenden"). En algunas modalidades, otros elementos que son incluidos en la descripción de la composición, método o componente respectivo del mismo son limitados a aquellos que no afectan materialmente las característica (s) básicas y novedosas de la invención ("que consiste esencialmente de") . Esto aplica igualmente a las etapas dentro de un método descrito así como las composiciones y componentes en el mismo. En otras modalidades, las invenciones, composiciones métodos y componentes respectivos de los mismos, descritos en la presente se proponen para ser exclusivos de cualquier elemento no considerado un elemento esencial para el componente, composición o métodos ("que consiste de").

Todas las patentes, solicitudes de patente y publicaciones identificadas se incorporan expresamente en la presente por referencia para el propósito de descripción y divulgación, por ejemplo, de las metodologías descritas en tales publicaciones que podrían ser utilizadas en relación con la presente invención. Estas publicaciones se proporcionan solamente para su descripción antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada a este respecto debe ser considerado como una admisión de que los inventores no están expuestos a la antefecha de tal descripción en virtud de la técnica previa o por cualquier otra razón. Todas las declaraciones en cuanto a la fecha o presentación en cuanto a los contenidos de estos documentos está basado en la información disponible al solicitante y no constituye cualquier admisión en cuanto a la capacidad de corrección de las fechas o contenidos de estos documentos.

La presente invención se puede definir en cualquiera de los siguientes párrafos numerados. 1. Un método para tratar un tumor en un sujeto en necesidad del mismo que comprende administrar una cantidad aumentada de metformina y una cantidad reducida de uno o más agentes quimioterapéuticos . 2. El método de párrafo 1, en donde la cantidad aumentada de metformina es 250 mg/dia. 3. Una composición que comprende una cantidad aumentada de metformina y una cantidad reducida de uno o más agentes quimioterapéuticos y un portador farmacéuticamente aceptable . 4. La composición del párrafo 3, en donde la cantidad aumentada de metformina es aproximadamente 25 mg . 5. La composición de párrafo 3, en donde la cantidad aumentada de metformina es aproximadamente 75 mg. 6. La composición del párrafo 3, en donde la cantidad aumentada de metformina es aproximadamente 250 mg. 7. Un equipo que comprende un frasquito de metformina, un frasquito de uno o más agentes quimioterapéuticos, instrucciones para el uso de la metformina y el agente (s) quimioterapéutico conjuntamente. 8. Un método para prevenir el cáncer o retardar la recurrencia de cáncer en un sujeto que comprende administrar una cantidad efectiva de metformina al sujeto. 9. El método del párrafo 8, en donde la cantidad de metformina es aproximadamente 75 mg/dia.

La invención además se ilustra por los siguientes ejemplos, que no deben ser considerados como limitantes adicionalmente .

EJEMPLOS Ejemplo 1 Aquí, se muestra que la metformina selectivamente extermina las células madre de cáncer en cuatro tipos genéticamente diferentes de cáncer de seno. La combinación de metformina y doxorubicina, un fármaco quimioterapéutico bien definido, extermina tanto las células madre de cáncer como las no células madre de cáncer en cultivo, y reduce la masa de tumor y prolonga la remisión mucho más efectivamente que cualquier fármaco solo en un modelo de ratón de xenoinjerto. Estas observaciones constituyen el soporte independiente para la hipótesis de células madre de cáncer, y proporciona una exposición razonada porque la combinación de metformina y fármacos quimioterapéuticos podrían mejorar el tratamiento de pacientes con cánceres de seno (y posiblemente otros).

Para examinar las propiedades anti-cáncer de la metformina, los inventores primero utilizaron un modelo de transformación inducible que consiste de células epiteliales mamarias humanas no transformadas (MCF-10A) que contiene ER-Src, una fusión de la oncoproteína v-Src con el dominio de enlace de ligando del receptor de estrógeno. Cuando estas células se tratan con tamoxifen, ellas llegan a ser transformadas dentro de 24-36 horas. La población de células transformadas contienen el 10% de células madre de cáncer, como es definido por la expresión del marcador CD44 y la habilidad para formar mamósferas, "micro-tumores" multicelulares que se generan en condiciones no adherentes y no diferenciantes (18). Además, los inventores analizaron tres de otras líneas de células de adenocarcinoma mamario derivado de tumores genéticamente y fenotípicamente diferentes que se tratan con diferentes fármacos: MCF7 positivos de ER (13); SKBR3 positivo de HER (14); MDA-MB-468 triple-negativo (15). Estas líneas de células también contienen una población minoritaria de células madre de cáncer capaces de formación de mamósfera. En todos los experimentos, metformina se utilizó en una concentración que no afecta el crecimiento de células no transformadas (0.1 o 0.3 rciM; Fig. 1A) . Los experimentos previos en lineas de células de cáncer (7-9) utilizaron concentraciones mucho más altas de metformina (típicamente 10-30 mM) , condiciones que también son toxicas para la células no transformadas.

En el modelo MCF-10A inducible, la metformina fuertemente inhibió la transformación morfológica, como se observa en las imágenes de contraste de fases de células cultivadas en la presencia o ausencia de metformina 0.1 mM y/o TA durante 36 horas (datos mostrados), crecimiento invasivos en ensayos de sanación de herida, como se observa en el ensayo de respuesta de sanación de herida/invasión de células cultivadas en la presencia o ausencia de metformina 0.1 mM y/o TAM (datos no mostrados), formación de foco, formación de colonias en agar blando y generación de mamósferas (Fig. IB) . Además, el tratamiento de metformina de las mamósferas derivadas de todas la cuatro líneas de células de cáncer de seno causó una reducción dramática en el número de mamósferas dentro de 48 horas (Fig. 2) como una consecuencia de la muerte celular. Como las mamósferas están compuestas principalmente de células de cáncer (18), esta última observación sugiere que la metformina puede exterminar las células madre de cáncer.

Acentuadamente, la metformina preferencialmente exterminó las células madre de cáncer (CD44alto/CD24baj o) dentro de una población de células MCF-10A o MCF-7 transformadas (Fig. 3A) . De manera similar, cuando todas las cuatro lineas de células de cáncer se clasificaron, las células madre de cáncer fueron muy susceptibles a la metformina, mientras que la población de células de cáncer estándar permanece esencialmente no afectada (Fig. 3B) . Además, el tratamiento de las células madre de cáncer MCF-10A con metformina por solo 1 hora bloquea la habilidad a estas células para formar tumores en ratones desnudos, aunque el fármaco no estuvo presente durante el mes después de la inyección (Fig. 3C) . La habilidad de la metformina para exterminar selectivamente células madre de cáncer estuvo en marcado contraste a la doxorubicina , un agente quimioterapéutico que extermina células de cáncer, pero no las células madre de cáncer. Como es esperado de sus distintas propiedades, las metformina trabajó conjuntamente con doxorubicina para reducir tanto las no células madre de cáncer como las células madre de cáncer en la población transformada mezclada (Fig. 3A) .

De acuerdo con los resultados anteriores en las lineas de células, la sinergia entre la metformina y doxorubicina se observó en el tratamiento de tumores que surgen 10 días después de la inyección de células MCF-10A-ER-Src en ratones desnudos. Después de 15 días de tratamiento (3 ciclos cada 5 días), esta combinación de fármaco virtualmente eliminó los tumores, mientras que la doxorubicina sola causó solamente una disminución de 2 veces en el volumen de tumor y la metformina sola tuvo poco efecto (Fig. 4A) . Los ratones tratados con doxorubicina mostraron una reducción adicional en el volumen de tumor después de 10 días adicionales (día 35) . El efecto mínimo de la metformina sola estuvo en contraste a efectos más significantes observados en un reporte independiente (8), pero hubo muchas diferencias en el protocolo experimental entre estos estudios.

Para determinar la base porque la combinación de metformina y doxorubicina es más efectiva que la doxorubicina sola, los inventores examinaron la población de células recuperadas de tumores después de 3 ciclos de tratamiento (día 25) . De acuerdo con los resultados de los inventores en líneas de células, las células madre de cáncer estuvieron virtualmente ausentes de los ratones tratados con la combinación de fármaco, mientras que fueron fácilmente detectadas en tumores de ratones tratados con doxorubicina sola (Fig. 4B) . Así, la ventaja terapéutica de la metformina en el contexto de quimioterapia convencional está ligada a su habilidad para exterminar células madre de cáncer.

La hipótesis de células madre de cáncer para la progresión de la enfermedad humana está basada en las propiedades formadoras de tumor diferenciales y respuesta a la quimioterapia bien definida de células madre de cáncer y no células madre de cáncer. Una predicción de este modelo, hasta ahora no probado, es que los fármacos que selectivamente inhiben las células madre de cáncer deben funcionar sinergísticamente con fármacos quimioterapéuticos para retardar la recurrencia. Acentuadamente, los ratones tratados con la combinación de metformina y doxorubicina permanecieron en remisión durante por lo menos 60 días después de que se finalizó el tratamiento (Fig. 4A) . En contraste, el crecimiento de tumor se reasumió 20 días después de que los ratones se trataron con doxorubicina sola, y la velocidad de crecimiento de tumor después de la recurrencia fue comparable a aquella observada en la enfermedad inicial (es decir en la ausencia de tratamiento) . Asi, la terapia combinatoria tuvo un efecto notable en prolongar la remisión, y en realidad aún puede representar una cura de estos tumores generados de xenoinjerto. Además de su significancia médica potencial, estas observaciones proporcionan soporte independiente y adicional para la hipótesis de células madre de cáncer.

Para el conocimiento de los inventores, la habilidad de la metformina para exterminar selectivamente células madre de cáncer y para funcionar sinergísticamente con doxorubicina para bloquear tanto las células madre de cáncer como la-s no células madre transformadas es única. En el caso de cáncer de seno, herceptina y tamoxifen son fármacos útiles para tipos de cáncer que, respectivamente, expresan el HER2 y receptores de estrógeno, pero algunas formas de cáncer de seno que carecen de estos receptores resisten estos tratamientos. Para todos estos tipos de cáncer de seno, la merfomina selectivamente inhibe el crecimiento de células madre de cáncer, y por consiguiente es probable que funcione sinergisticamente con fármacos quimioterapéuticos . Además, como la metformina inhibió la transformación de célula MCF10A-ER-Src, sugiriendo que este tiene la habilidad para prevenir el desarrollo de cáncer, como es opuesto al tratamiento de cáncer que ya ha ocurrido. En realidad, la habilidad de la metformina para inhibir la transformación celular podría depender de la observación epidemiológica de que los diabéticos tratados con metformina tienen una incidencia menor de cáncer (5, 6) . Como un preventivo de cáncer, la metformina se administra de preferencia como una base a largo plazo, y a este respecto, la concentración de metformina necesaria para los efectos anticáncer observados aquí esta considerado entre abajo de aquella utilizada para el tratamiento de diabetes. Por ultimo, la selectividad de metformina y doxorubicina para distintos tipos de células en el tumor puede explicar los efectos combinatorios acentuados en reducir la masa de tumor y prolongar la remisión en ratones desnudos, y proporcionan la exposición razonada para combinar metformina con la quimioterapia como un nuevo tratamiento para cáncer de seno u otros cánceres.

Métodos de la Invención Lineas de Células Las células MCFIOA son células epiteliales mamarias derivadas de tejido de seno fibrocistico que se obtuvo de una mastectomía de una mujer de 36 años sin historia familiar de cáncer de seno y sin evidencia de enfermedad (12). El análisis genético no reveló cualquier amplificación del oncogén HER2/neo o mutaciones en los oncogenes H-Ras, y estas células no expresan receptor de estrógeno. Los experimentos aquí usan un derivado de MCFIOA que contiene una fusión integrada de la oncoproteina v-Src con el dominio de enlace de ligando del receptor de estrógeno. Las células MCF7 son células de adenocarcinoma mamario que expresan muy altos niveles del receptor de estrógeno, son negativos para HER2/neu, y no tienen fuertes propiedades independientes de fijación (13). Las células SKBR3 son células de adenocarcinoma mamario que sobreexpresan el receptor HER2/neu, tienen propiedades independientes de fijación, y forman tumores en xenoinjertos (14). Las células MDA-MB-468 se derivan de un carcinoma de seno triple negativo que muestra muchas de las anormalidades moleculares similares a basal recurrente incluyendo el estatus negativo de ER-PR-HER2 , deficiencia de p53, sobreexpresion de EGFR, pérdida de PTEN y activación constitutiva de la ruta MEK/ERK (15) . Las células DA-MB- 68 son muy agresivas y forman tumores grandes en experimentos de xenoinjerto que resisten el tratamiento con tamoxifen o herceptina.

Cultivo de Células Las células MCF-7, SKBR3, y MDA-MB-486 se cultivaron en el medio DMEM ( Invitrogen ) , suero bovino fetal al 10% (Atlanta Biologicals) y penicilina/estreptomicina (Invitrogen) a 37°C con 5% de C02. Las células MCF10A ER-Src se cultivaron como es descrito previamente (16) y se indujeron para transformarse con 40H-tamoxifen (TAM) 1 µ? disuelto (Sigma) en EtOH. Los cambios morfológicos, transformación fenotipica y formación de focos ocurrió 24-36 h después de la adición de TAM, y se monitorearon mediante la microscopía de contraste de fase. La metformina (Sigma) disuelta en agua típicamente se adicionó a 0.1 mM a menos que se indique de otra manera.

Ensayo de motilidad de sanación de herida Las células se sembraron en placas de seis cavidades en lxloVcavidad. Una herida de un solo rasguño se creó utilizando una punta de micropipeta plO en las células confluentes. Las células se lavaron tres veces con PBS para remover los restos celulares, se suplementaron con el medio de ensayo y se monitorearon. Las imágenes se capturaron mediante la microscopía de contraste de fase en 0 y 12 h de las post aplicación de herida.

Ensayo de formación de colonia Muestras triplicadas de 5xl04 células de MCF10A ER-Src se mezclaron 4:1 (v/v) con agarosa al 2.0% en el medio de crecimiento MCF-10A para una concentración final de agarosa 0.4%. La mezcla de células se colocó en la parte superior de una capa solidificada de agarosa de 0.5% en el medio de crecimiento. Las células se alimentaron cada 6 a 7 días con el medio de crecimiento que contiene agarosa al 0.4%. El número de colonias se contó después de 15 días.

Cultivo de mamósfera Las mamosferas se cultivaron en suspensión (1000 células/ml) en medio de DMEM/F12 libre de suero, suplementado con B27 (1:50, Invitrogen) , BSA al 0.4%, 20 ng/ml de EGF (Preprotech) y 4 pg/ml insulina (Sigma) como es descrito previamente (17). La formación de mamósfera se probó al colocar poblaciones de células transformadas en presencia o ausencia de metformina bajo estas condiciones, mientras que el crecimiento de mamósfera se examinó al adicionar metformina a mamosferas de 6 días de edad y al contar el número de mamosferas 2 y 4 días después de tratamiento.

Aislamiento y análisis de células madre de cáncer La clasificación de células citométrica de flujo de poblaciones de células transformadas se realizó en suspensiones de células individuales. Las células se mancharon con el anticuerpo CD44 ( FITC-conjugado) (555478, BD Biosciences) y con el anticuerpo CD24 ( PE-con ugado ) (555428, BD Biosciences) . Las células madre de cáncer (CD44alto/CD24bajo) y las no células madre transformadas (CD44bajo/CD24alto) de MCF10A ER-Src (tratado con TAM) y células MCF7, SKBR3 y MDA-MD-486 se trataron con metformina 0.1 mM y el crecimiento celular se estimó en diferentes puntos de tiempo (12, 24, 48h) . Los experimentos se realizaron por triplicado, y los datos representan la media ± SD.

Crecimiento de tumor y recurrencia en xenoin ertos 5x106 células MCF10A ER-Src se inyectaron en el flanco derecho de 16 ratones nu/nu hembras (Charles River Laboratories), todos los cuales desarrollaron tumores en 10 días con tamaño ~50mm3. Los ratones se distribuyeron aleatoriamente en 4 grupos que fueron no tratados, o tratados mediante inyecciones intraperitoneales cada 5 días (3 ciclos) con 4 mg/kg de doxorubicina, 100 pg/ml de metformina, o la combinación. El volumen de tumor (valores medios y 95% de intervalos de confidencia) se midieron en varios tiempos después de la inyección inicial. Todos los experimentos de ratón se realizaron de acuerdo con los procedimientos y guías del Comité de Cuidado y Uso de Animal Institucional.

Las referencias citadas en la presente se incorporan por referencia.

Referencias 1. Allies LE, Weissman IL. Cáncer stem cells in solid tumors. Curr Opin Biotechnol 2007;18:460-6. 2. Polyak , Weinberg RA. Transitions between epithelial and mesenchymal states: acquisition of malignant and stem cells traits. Nat Rev Cáncer 2009;9:265-73. 3. Larsson SC, Mantzoros CS, Wolk A. Diabetes mellitus and risk of breast cáncer: a meta-analysis . International journal of cáncer 2007;121:856-62. 4. Hsu IR, Kim SP, Kabir M, Bergman RN. Metabolic syndrome, hyperinsulinemia, and cáncer. Am J Clin Nutr 2007;86:867-71. 5. Evans JM, Donnelly LA, Emslie-Smith AM, Alessi DR, Morris AD. Metformin and reduced risk of cáncer in diabetic patients. BMJ (Clinical research ed 2005 ;330: 1304- 5. 6. Jiralerspong S, Palla SL, Giordano SH, y colaboradores Metformin and pathologic complete responses a neoadjuvant chemotherapy in diabetic patients with breast cáncer. J Clin Oncol 2009;27:3297-302. 7. Alimova IN, Liu B, Fan Z, y colaboradores Metformin inhibits breast cáncer cell growth, colony formation and induces cell cycle arrest in vivo. Cell Cycle 2009;8:909-15. 8. Liu B, Fan Z, Edgerton SM, y colaboradores Metformin induces unique biological and molecular responses in triple negative breast cáncer cells. Cell Cycle 2009;8:2031-40. 9. Zakikhani M, Dowling R, Fantus IG, Sonenberg N, Pollak M. Metformin is an AMP kinase-dependent growth inhibitor for breast cáncer cells. Cáncer research 2006; 66: 10269-73. 10. Cazzaniga M, Bonanni B, Guerrieri-Gonzaga A, Decensi A. Is it time a test metformin in breast cáncer clinical triáis? Cáncer Epidemiol Biomarkers Prev 2009;18:701-5. 11. Goodwin PJ, Ligibel JA, Stambolic V. Metformin in breast cáncer: Time for action. J Clin Oncol 2009;27:3271-3. 12. Soule HD, Maloney TM, olman SR, y colaboradores Isolation and characterization of a spontaneously immortallized human breast epithelial cell line, MCF10. Cáncer research 1990;50:6075-86. 13. Brooks SC, Locke ER, Soule HD. Estrogen receptor in a human cell line (MCF-7) from breast carcinoma. J Biol Chem 1973;248: 6251-3. 14. Bergman I, Barmada MA, Griffin JA, Slamon DJ. Treatment of meningeal breast cáncer xenografts in the rat using an anti-pl85/HER2 antibody. Clin Cáncer Res 2001;7:2050-6. 15. Oliveras-Ferraros C, Vazquez-Martin A, Lopez-Bonet E, y colaboradores Growth and molecular interactions of the anti-EGFR antibody cetuximab and the DNA crosslinking agent cisplatin in gefitinib-resistant MDA-MB-468 cells: new prospects in the treatment of triple-negative/basal-like breast cáncer. Int J Oncol 2008;33:1165-76. 16. Debnath J, Muthuswamy SK, Brugge JS. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods 2003;30 (3) :256-68. 17. Dontu G, Abdallah WM, Foley JM, y colaboradores In vivo propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev 2003;17:1253-70. 18. Grimshaw MJ, Cooper L, Papazisis K, y colaboradores Mammosphere culture of metastatic breast cáncer cells enriches for tumorigenic breast cáncer cells. Breast Cáncer Res 2008;10:R52.

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Un método para tratar un tumor en un sujeto en necesidad del mismo, caracterizado porque comprende administrar una cantidad aumentada de metformina y una cantidad reducida de uno o más agentes quimioterapéuticos .

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la cantidad aumentada de metformina es 250 mg/dia.

3. Una composición, caracterizada porque comprende una cantidad aumentada de metformina, y una cantidad reducida de uno o más agentes quimioterapéuticos y un portador farmacéuticamente aceptable.

. La composición de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque la cantidad aumentada de metformina es aproximadamente 25 mg.

5. La composición de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque la cantidad aumentada de metformina es aproximadamente 75 mg.

6. La composición de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque la cantidad aumentada de metformina es aproximadamente 250 mg.

7. Un equipo, caracterizado porque comprende un frasquito de metformina, un frasquito de uno o más agentes quimioterapéuticos, instrucciones para el uso de la metformina y el agente (s) quimioterapéutico conjuntamente.

8. Un método para prevenir cáncer o retardar la recurrencia de cáncer en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar una cantidad efectiva de metformina al sujeto.

9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la cantidad de metformina es aproximadamente 75 mg/dia.