CN109641058A - 治疗胰腺癌的组合疗法 - Google Patents

Abstract

本文所述的主题涉及包含MEK抑制剂或其药学上可接受的盐和靶向PDGFRα、S6和STAT3的多激酶抑制剂或其药学上可接受的盐的组合物，及其在治疗胰腺癌中的用途。另一方面，本文公开了通过施用MEK抑制剂或其药学上可接受的盐和多激酶抑制剂或其药学上可接受的盐来治疗胰腺癌的方法。另一方面，考比替尼或其药学上可接受的盐与普纳替尼或其药学上可接受的盐的组合在所述组合物中施用，或者单独施用所述组合以治疗胰腺癌。

Description

治疗胰腺癌的组合疗法

技术领域

本文所述的主题涉及用MEK抑制剂和靶向RTK、S6和JAK/STAT的多靶剂的组合治疗胰腺癌。

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背景技术

胰腺导管腺癌(PDAC)是最恶性的癌症之一，并且已经基于在培养模型中试验的胰腺癌细胞的药物反应发现探索了许多治疗方法。大多数PDAC肿瘤通过KRAS突变驱动的MAPK信号传导激活而驱动(Jones S，Zhang X，Parsons DW，Lin JC，Leary RJ，Angenendt P，Core signaling pathways in human pancreatic cancers revealed by globalgenomic analyses，Science，2008；321(5897)：1801-6，Epub 2008/09/06；Biankin AV，Waddell N，Kassahn KS，Gingras MC，Muthuswamy LB，Johns AL，Pancreatic cancergenomes reveal aberrations in axon guidance pathway genes，Nature，2012；491(7424)：399-405，Epub 2012/10/30；Cid-Arregui A，Juarez V，Perspectives in thetreatment of pancreatic adenocarcinoma，World Journal of Gastroenterology，2015；21(31)：9297-316，Epub 2015/08/27)，从而强调MEK是PDAC患者治疗干预的重要候选靶标。然而，临床前和临床研究已经在很大程度上揭示单独的MAPK途径抑制缺乏疗效，这可能是由于通过各种代偿机制快速发展对MAPK抑制剂的抗性，从而限制了抑制剂的功效并导致耐药肿瘤的出现。(Baines AT，Xu D，Der CJ，Inhibition of Ras for cancertreatment：the search continues，Future Medicinal Chemistry，2011；3(14)：1787-808，Epub2011/10/19；McCubrey JA，Steelman LS，Chappell WH，Abrams SL，Franklin RA，Montalto G，Ras/Raf/MEK/ERK and PI3K/PTEN/Akt/mTOR cascade inhibitors：howmutations can result in therapy resistance and how to overcome resistance，Oncotarget，2012；3(10)：1068-111，Epub 2012/10/23；Junttila MR，Devasthali V，ChengJH，Castillo J，Metcalfe C，Clermont AC，Modeling targeted inhibition of MEK andPI3 kinase in human pancreatic cancer，Molecular Cancer Therapeutics，2015；14(1)：40-7，Epub 2014/11/08)。

增强对敏感性和MEK抑制剂抗性的潜在机制的理解可以鉴定与MEK抑制剂组合使用、有效靶向胰腺癌细胞的抑制剂。

发明内容

一方面，本文所述的主题涉及一种治疗有此需要的受试者的胰腺癌的方法，其包括：向所述受试者施用治疗有效量的活性剂组合，其中所述组合包含MEK抑制剂和靶向PDGFRα、S6和STAT3的多激酶剂。

另一方面，本文所述的主题涉及一种a)MEK抑制剂或其药学上可接受的盐和b)靶向PDGFRα、S6和STAT3的多激酶抑制剂或其药学上可接受的盐的组合，其用于治疗胰腺癌。

一方面，本文所述的主题涉及一种药物组合物，其包含有效量的MEK抑制剂或其药学上可接受的盐和靶向PDGFRα、S6和STAT3的多激酶剂或其药学上可接受的盐的组合和药学上可接受的赋形剂，其中所述组合物用于治疗胰腺癌。

另一方面，本文所述的主题涉及一种用于治疗胰腺癌的试剂盒，其包含：a)MEK抑制剂或其药学上可接受的盐和靶向PDGFRα、S6和STAT3的多激酶抑制剂或其药学上可接受的盐；和b)指示胰腺癌治疗的包装说明书或标签。

以下充分描述了这些和其他方面。

附图说明

图1描绘2D单层和3D球形培养中的KP4 PDAC细胞对MEK抑制的差异性反应：2D和3D培养物中的KP4癌细胞的小分子抑制剂筛选。

图2描绘2D单层和3D球形培养中的KP4 PDAC细胞对MEK抑制的差异性反应：磷酸激酶阵列布局，图C中差异性活化蛋白的位置颜色加深。

图3描绘2D单层和3D球形培养中的KP4 PDAC细胞对MEK抑制的差异性反应：2D和3D的KP4细胞的磷酸化激酶阵列。

图4描绘2D单层和3D球形培养中的KP4 PDAC细胞对MEK抑制的差异性反应：通过2D或3D中培养并用考比替尼(cobimetinib)处理24小时的KP4细胞的RT-PCR测定的蛋白激酶阵列。将样品针对经DMSO处理的KP42D对照标准化。

图5描绘2D单层和3D球形培养中的KP4 PDAC细胞对MEK抑制的差异性反应：2D或3D中培养并用考比替尼处理24小时的KP4细胞的荧光素酶报告基因测定。荧光素酶活性的倍数变化具有显著差异的转录因子以红色显示。

图6A-B描绘MEK抑制诱导PDGFRα、S6和STAT3活化：(图6A)免疫印迹确认在KP4细胞中进行考比替尼处理后PDGFRα、S6和STAT3活化。(图6B)通过蛋白质印迹确认在PDAC细胞系和KPP GEMM来源的细胞系中进行考比替尼处理后p-STAT3增加。

图7描绘MEK抑制诱导PDGFRα、S6和STAT3活化：在用考比替尼处理24小时的PDAC细胞系的2D培养物上清液中测量IL-6分泌水平。

图8描绘MEK抑制诱导PDGFRα、S6和STAT3活化：CTG测定法测量Dox诱导型STAT3敲减与考比替尼组合对KP4和MIA-PACA2细胞活力的影响。

图9描绘MEK抑制诱导PDGFRα、S6和STAT3活化：蛋白质印迹确认用Dox(1μg/ml)处理72小时后STAT3有效敲减。

图10描绘MEK抑制诱导PDGFRα、S6和STAT3活化：在Matrigel侵袭测定中量化2D和3D中培养的胰腺癌细胞响应于10％FBS的侵袭潜力。

图11描绘与考比替尼组合对S6和STAT3的抑制增加了胰腺癌细胞的死亡：通过蛋白质印迹确认了多RTK抑制剂普纳替尼(ponatinib)与考比替尼组合对信号传导受体和下游靶标活化的影响。

图12描绘与考比替尼组合对S6和STAT3的抑制增加了胰腺癌细胞的死亡：通过蛋白质印迹确认了考比替尼+/-普纳替尼或JAK抑制剂后对STAT3活化和诱导裂解PARP的影响。

图13描绘与考比替尼组合对S6和STAT3的抑制增加了胰腺癌细胞的死亡：在2D和3D培养中用考比替尼+/-普纳替尼预处理的KP4细胞的PathScan多重蛋白质印迹分析。

图14描绘与考比替尼组合对S6和STAT3的抑制增加了胰腺癌细胞的死亡：通过蛋白质印迹确认了考比替尼+/-普纳替尼/S6/PDGFRα抑制剂后对STAT3活化和诱导裂解PARP的影响。

图15描绘与考比替尼组合对S6和STAT3的抑制增加了胰腺癌细胞的死亡：使用CTG测定法测量PDGFR抑制剂克莱拉尼(crenolanib)与考比替尼和鲁索利替尼(ruxolitinib)组合对KP4细胞活力的影响。

图16和17描绘与考比替尼组合对S6和STAT3的抑制增加了胰腺癌细胞的死亡：使用Bliss分析在胰腺癌细胞系中分析考比替尼和普纳替尼之间的协同作用。

图18描绘与考比替尼组合对S6和STAT3的抑制增加了胰腺癌细胞的死亡：对考比替尼和S6抑制剂雷帕霉素(rapamycin)在KP4细胞中的协同作用的Bliss分析。

图19描绘与考比替尼组合对S6和STAT3的抑制增加了胰腺癌细胞的死亡：对考比替尼和GDC-0980在KP4细胞中的协同作用的Bliss分析。

图20A-B描绘对PDGFRα/S6/STAT3和MEK的抑制损害肿瘤生长并降低血清PDGFα：(图20A)每24小时用考比替尼(5mg/kg，口服，每天一次)和/或普纳替尼(30mg/kg，口服，每天一次)处理的KP4异种移植模型(每个群组n＝10)的肿瘤生长曲线(平均值±S.E.M)；(图20B)如(图20A)中处理的KPP异种移植模型的肿瘤生长曲线(平均值±±SEM)。

图21描绘对PDGFRα/S6/STAT3和MEK的抑制损害肿瘤生长并降低血清PDGFα：来自KP4异种移植物的通过IHC染色以检测p-STAT3、p-Erk和裂解的半胱天冬酶3，或用p-STAT3和F4/80或p-PDGFRα抗体通过IF共同染色的代表性肿瘤切片。比例尺：IHC载玻片20μm，IF载玻片50μm。

图22描绘对PDGFRα/S6/STAT3和MEK的抑制损害肿瘤生长并降低血清PDGFα：免疫印迹确认考比替尼/普纳替尼处理KP4异种移植肿瘤后PDGFRα、S6和STAT3活化。

图23描绘对PDGFRα/S6/STAT3和MEK的抑制损害肿瘤生长并降低血清PDGFα：KP4异种移植小鼠血浆样品的生长因子和细胞因子的Luminex测定。

图24描绘对来自PDAC患者样品的胰腺肿瘤和转移瘤中p-Erk和p-STAT3的分析：来自82名PDAC患者的原发性肿瘤和转移瘤的恶性肿瘤的不同阶段中p-Erk-和p-STAT3-阳性样品的分布。

图25描绘对来自PDAC患者样品的胰腺肿瘤和转移瘤中p-Erk和p-STAT3的分析：在PDAC患者样品中对p-Erk和p-STAT3染色的代表性原发性肿瘤和肝脏切片。比例尺：20μm。

图26描绘对来自PDAC患者样品的胰腺肿瘤和转移瘤中p-Erk和p-STAT3的分析：PDAC患者肿瘤样品中PDGFR和IL-6R表达的微阵列分析。

图27A-B描绘了具有微转移瘤的组织病理学特征的KP4来源的3D球状体对小分子抑制剂显示出差异敏感性：在含有10％正常FBS(用于2D培养)或10％预煮FBS(用于3D培养)的RPMI培养基中培养KP4细胞3天并且对于Ki67、p-STAT3和裂解的半胱天冬酶-3，在2D细胞团块或3D球状体上进行IHC。

图28描绘具有微转移瘤的组织病理学特征的KP4来源的3D球状体对小分子抑制剂显示出差异敏感性：使用10％预煮FBS形成的球状体显示出与用其他常规3D培养方法所见的相似的药物敏感性特性。

图29描绘具有微转移瘤的组织病理学特征的KP4来源的3D球状体对小分子抑制剂显示出差异敏感性：由不同3D培养方法形成的球状体的细胞活力测定和菌落计数测定。

图30描绘了考比替尼/普纳替尼共同处理损害肿瘤生长并减少肿瘤相关巨噬细胞浸润：来自KPP异种移植物的代表性肿瘤切片用p-Erk和p-STAT3抗体通过IHC检查或用抗p-STAT3和抗F4/80通过免疫荧光共同染色。比例尺：IHC载玻片20μm，IF载玻片50μm。

图31A-B描绘了考比替尼/普纳替尼共同处理损害肿瘤生长并减少肿瘤相关巨噬细胞浸润：在KP4和KPP异种移植模型中用考比替尼+/-普纳替尼处理的小鼠的体重变化。

图32描绘了考比替尼/普纳替尼共同处理损害肿瘤生长并减少肿瘤相关巨噬细胞浸润：KP4异种移植小鼠血浆样品的生长因子的Luminex测定。

图33描绘考比替尼/普纳替尼共同处理损害肿瘤生长并减少肿瘤相关巨噬细胞浸润：免疫印迹确认考比替尼/普纳替尼处理KPP异种移植肿瘤后PDGFRα、S6和STAT3活化。

图6-23中的数据表示为平均值±±S.E.M.。*P＜0.05，学生t检验。

具体实施方式

胰腺导管腺癌(PDAC)是最致命的人类疾病之一，并且大部分对于可用的药物治疗仍然很难治愈。KRAS驱动的MEK途径在大多数胰腺癌中突变活化，并且是治疗剂的重要靶标。然而，已知致癌驱动因子的靶向不足和补偿性反馈回路的活化以及无法预防转移性扩散导致该疾病的预后不良。

跨膜受体酪氨酸激酶(RTK)的活化导致许多生化级联反应，最终导致对细胞命运的调控。这种活化受细胞外环境中的分子调节，主要是生长因子、细胞外基质(ECM)蛋白和存在于相邻细胞表面的粘附分子。当分子与细胞表面存在的特定受体结合时，发生对这些信号的细胞应答。许多生长因子(GF)结合并激活受体酪氨酸激酶(RTK)家族的跨膜糖蛋白。

RTK含有细胞外配体结合结构域、单跨膜结构域和含有酪氨酸激酶结构域和几个调节酪氨酸的细胞内组分。RTK可以磷酸化和激活细胞质STAT家族转录因子。这些活化STAT易位至细胞核。一旦处于细胞核内部，STAT就会提升参与细胞增殖的基因的转录。

血小板衍生生长因子受体(PDGFR)是血小板衍生生长因子(PDGF)家族成员的细胞表面酪氨酸激酶受体。PDGFRα和PDGFRβ同种型是调节细胞增殖、细胞分化、细胞生长和发育的因子。结合后，两个同种型二聚化以激活激酶活性和PDGFR磷酸化。生长因子受体中的酪氨酸磷酸化位点控制激酶活性水平，并且是下游信号转导的结合位点，其在许多情况下也是激酶的底物。该信号级联反应，包括下游信号分子，例如S6核糖体蛋白，涉及许多疾病，包括癌症。

如本文所述，使用2维单层培养系统以及3维球形培养系统，已经发现用MEK抑制剂或其药学上可接受的盐和靶向PDGFRα、S6和STAT3的多靶剂或其药学上可接受的盐联合治疗有效靶向单层和球状体中的胰腺癌细胞。不受理论约束，该组合可以有效地阻止经由PDGFRα和MEK激酶进行信号传导，同时也防止激活癌细胞中STAT3和S6介导的补偿反馈回路。此外，如本文所述，使用异种移植模型，已发现用MEK抑制剂和普纳替尼共同治疗引起肿瘤消退并同时通过靶向胰腺肿瘤微环境中的肿瘤相关巨噬细胞抑制促进PDAC肿瘤进展的骨髓群，从而通过双重机制促进肿瘤消退。PDAC患者样本显示肿瘤中的STAT3活化和肝转移瘤中的Erk活化增加，分别暗示STAT3和Erk是PDAC肿瘤和肝转移瘤中的关键驱动因子。如本文所述，这些结果显示了用于有效治疗胰腺癌的联合药物治疗策略。另外，当单独施用时，活性剂可能不显示对胰腺癌的功效。

据报道，鉴定为PDGFRβ、MEK、S6和STAT3的存活途径涉及各种癌症模型中的肿瘤发生和转移(Lesina M，Kurkowski MU，Ludes K，Rose-John S，Treiber M，Kloppel G，Stat3/Socs3activation by IL-6transsignaling promotes progression of pancreaticintraepithelial neoplasia and development of pancreatic cancer，Cancer Cell，2011；19(4)：456-69，Epub2011/04/13；Yen TW，Aardal NP，Bronner MP，Thorning DR，Savard CE，Lee SP，Myofibroblasts are responsible for the desmoplastic reactionsurrounding human pancreatic carcinomas，Surgery，2002；131(2)：129-34，Epub 2002/02/21；Weissmueller S，Manchado E，Saborowski M，Morris JPt，Wagenblast E，Davis CA等人Mutant p53drives pancreatic cancer metastasis through cell-autonomousPDGF receptor beta signaling，Cell，2014；157(2)：382-94，Epub 2014/04/15；CorcoranRB，Rothenberg SM，Hata AN，Faber AC，Piris A，Nazarian RM，TORCl suppressionpredicts responsiveness to RAF and MEK inhibition in BRAF-mutant melanoma，Science Translational Medicine，2013；5(196)：196ra98，Epub 2013/08/02；CorcoranRB，Cheng KA，Hata AN，Faber AC，Ebi H，Coffee EM，Synthetic lethal interaction ofcombined BCL-XL and MEK inhibition promotes tumor regressions in KRAS mutantcancer models，Cancer Cell，2013；23(1)：121-8，Epub 2012/12/19；Deng J，Liu Y，LeeH，Herrmann A，Zhang W，Zhang C，S1PR1-STAT3signaling is crucial for myeloid cellcolonization at future metastatic sites，Cancer Cell，2012；21(5)：642-54，Epub2012/05/26；Corcoran RB，Contino G，Deshpande V，Tzatsos A，Conrad C，Benes CH，STAT3plays a critical role in KRAS-induced pancreatic tumorigenesis，CancerResearch，2011；71(14)：5020-9，Epub 2011/05/19)，现已发现在原发性胰腺肿瘤中的MEK抑制触发对通过PDGFRα、S6和STAT3的替代信号传导途径的激活，这促成对单一药剂MEK抑制的抗性。具体而言，已经证实单独的药剂单独对细胞活力没有影响，组合时抑制2D和3D培养物中的细胞生长。因此，与MEK组合抑制PDGFRα、S6和STAT3活化防止在胰腺肿瘤中诱导对MEK抑制剂考比替尼或其药学上可接受的盐的抗性。在实施例中，用多RTK和JAK2抑制剂普纳替尼或其药学上可接受的盐与考比替尼或其药学上可接受的盐组合治疗在靶向胰腺肿瘤方面高度有效，胰腺肿瘤是如上面所指出的那样，通常对于目前临床上正在探索的药物治疗方案很难治。

胰腺导管癌(PDAC)与各种基质元素的明显参与相关，这些基质元素有助于侵袭性肿瘤生长、转移、免疫抑制和抗药性。(Cid-Arregui A等人，(2015)；Hidalgo M.Pancreaticcancer，The New England Journal of Medicine，2010；362(17)：1605-17，Epub 2010/04/30；Korc M.Pancreatic cancer-associated stroma production，American Journal ofSurgery，2007；194(4Suppl)：S84-6，Epub 2007/12/06；Inman KS，Francis AA，MurrayNR.Complex role for the immune systemin initiation and progression ofpancreatic cancer，World Journal of Gastroenterology，2014；20(32)：11160-81，Epub2014/08/30；Wormann SM，Diakopoulos KN，Lesina M，Algul H，The immune network inpancreatic cancer development and progression，Oncogene，2014；33(23)：2956-67，Epub 2013/07/16；Moses AG，Maingay J，Sangster K，Fearon KC，Ross JA，Pro-inflammatory cytokine release by peripheral blood mononuclear cells frompatients with advanced pancreatic cancer：relationship to acute phase responseand survival，Oncology Reports，2009；21(4)：1091-5，Epub 2009/03/17；Tjomsland V，Niklasson L，Sandstrom P，Borch K，Druid H，Bratthall C，The desmoplastic stromaplays an essential role in the accumulation and modulation of infiltratedimmune cells in pancreatic adenocarcinoma，Clinical&Developmental Immunology，2011；2011：212810，Epub 2011/12/23；Silvestris N，Gnoni A，Brunetti AE，Vincenti L，Santini D，Tonini G等人Target therapies in pancreatic carcinoma，CurrentMedicinal Chemistry，2014；21(8)：948-65，Epub 2013/09/03；Vaccaro V，SperdutiI，Vari S，Bria E，Melisi D，Garufi C，Metastatic pancreatic cancer：Is there a lightat the end of the tunnel？World Journal of Gastroenterology，2015；21(16)：4788-801.Epub 2015/05/07；Tuveson DA，Neoptolemos JP，Understanding metastasis inpancreatic cancer：a call for new clinical approaches，Cell，2012；148(1-2)：21-3，Epub 2012/01/24)。肿瘤相关巨噬细胞是浸润胰腺肿瘤最普遍的基质细胞类型之一，并且与患者的不良结果相关。(Vonderheide RH，Bayne LJ，Inflammatory networks andimmune surveillance of pancreatic carcinoma，Current Opinion in Immunology，2013；25(2)：200-5，Epub 2013/02/21；Di Caro G，Cortese N，Castino GF，Grizzi F，Gavazzi F，Ridolfi C，Dual prognostic significance of tumour-associatedmacrophages in human pancreatic adenocarcinoma treated or untreated withchemotherapy，Gut，2015.Epub 2015/07/15；Chen SJ，Zhang QB，Zeng LJ，Lian GD，Li JJ，Qian CC，Distribution and clinical significance of tumour-associatedmacrophages in pancreatic ductal adenocarcinoma：a retrospective analysis inChina，Curr.Oncol.2015；22(1)：e11-9，Epub 2015/02/17)。最近的研究进一步表明TAM在肿瘤进展和转移中的重要作用。(Noy R，Pollard JW.Tumor-associated macrophages：from mechanisms to therapy，Immunity，2014；41(1)：49-61，Epub 2014/07/19；MeleroI，Gaudernack G，Gerritsen W，Huber C，Parmiani G，Scholl S，Therapeutic vaccinesfor cancer：an overview of clinical trials，Nature Reviews Clinical Oncology，2014；11(9)：509-24，Epub 2014/07/09；Drake CG.Combination immunotherapyapproaches，Annals of oncology：official journal of the European Society forMedical Oncology/ESMO，2012；23Suppl 8：viii41-6，Epub 2012/08/29；Weden S，KlempM，Gladhaug IP，Moller M，Eriksen JA，Gaudernack G，Long-term follow-up ofpatients with resected pancreatic cancer following vaccination against mutantK-ras，International Journal of Cancer，Journal International du Cancer，2011；128(5)：1120-8，Epub 2010/05/18；Bronte V，Murray PJ.Understandinglocalmacrophage phenotypes in disease：modulating macrophage function to treatcancer，Nature Medicine，2015；21(2)：117-9，Epub 2015/02/06)。我们的研究结果暗示了肿瘤细胞和PDAC中的TAM中STAT3信号轴响应于MEK抑制的作用。我们的结果进一步表明，MEK抑制剂例如考比替尼/靶向PDGFRα、S6和STAT3的多激酶抑制剂例如普纳替尼共同治疗可以靶向原发肿瘤内的骨髓细胞和癌细胞，导致细胞死亡增加和肿瘤消退。

当前公开的主题下文将更加充分地进行描述。然而，当前公开的主题所属领域的技术人员将会想到本文描述的当前公开的主题的许多修改和其他实施方案，其具有前面的描述中呈现的教导的益处。因此，应理解当前公开的主题不限于所公开的具体实施方案，并且旨在将修改和其他实施方案包括在所附权利要求的范围内。换言之，本文中所描述的主题涵盖所有备选方案、修改和等同项。如果所并入的文献、专利和类似材料中的一个或多个与本申请不同或相矛盾，包括但不限于定义的术语、术语用法，所描述的技术等，则以本申请为准。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同含义。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都通过引用整体并入。

I.定义

术语“胰腺癌”是指起源于胰腺中的赘生物。胰腺癌包括外分泌和内分泌癌。大多数胰腺癌是外分泌肿瘤。胰腺内分泌肿瘤也称为胰岛细胞瘤。不幸的是，目前胰腺癌的预后即使早期检测到也很差。可用本文所述的方法治疗的胰腺癌包括但不限于外分泌胰腺癌和内分泌胰腺癌。外分泌胰腺癌包括但不限于腺癌、腺泡细胞癌、腺鳞癌、胶样癌、具有破骨细胞样巨细胞的未分化癌、肝样癌、导管内乳头状粘液性肿瘤、粘液性囊性肿瘤、胰母细胞瘤、浆液性囊腺瘤、印戒细胞癌、实性和假性乳头状肿瘤、胰腺导管癌和未分化癌。在一些实施方案中，外分泌胰腺癌是胰腺导管癌。内分泌胰腺癌包括但不限于胰岛素瘤和胰高血糖素瘤。

在一些实施方案中，胰腺癌是早期胰腺癌、非转移性胰腺癌、原发性胰腺癌、可切除性胰腺癌、晚期胰腺癌、局部晚期胰腺癌、转移性胰腺癌、不可切除性胰腺癌、缓解期胰腺癌、复发性胰腺癌、辅助治疗中的胰腺癌或新辅助治疗的胰腺癌中的任一种。在一些实施方案中，胰腺癌是局部晚期胰腺癌、不可切除性胰腺癌或转移性胰腺导管癌。在一些实施方案中，胰腺癌对基于吉西他滨的疗法具有抗性。在一些实施方案中，胰腺癌对基于吉西他滨的疗法是难治的。

本文所述的方法可用于以下任何一种或多种目的：缓解胰腺癌的一种或多种症状，延迟胰腺癌的进展，缩小胰腺癌肿瘤大小，破坏(例如毁坏)胰腺癌基质，抑制胰腺癌肿瘤生长，延长总生存期，延长无病生存期，延长胰腺癌疾病进展时间，预防或延迟胰腺癌肿瘤转移，减少(例如根除)预先存在的胰腺癌肿瘤转移，减少预先存在的胰腺癌肿瘤转移的发生或负担，预防胰腺癌复发，和/或改善胰腺癌患者的临床益处。

本文所述的胰腺癌治疗方法包括向受试者(人或动物)施用治疗有效量的MEK抑制剂或其药学上可接受的盐和靶向PDGFRα、S6和STAT3的多激酶抑制剂或其药学上可接受的盐的组合以抑制、减缓或逆转胰腺癌(包括原发性肿瘤和转移性肿瘤)的生长、发展或扩散。此类施用构成了治疗或预防由一种或多种激酶介导的疾病和/或由一种施用的活性剂抑制的存活途径的方法。如本文所公开的化合物的“施用”包括使用本文所讨论的任何合适的制剂或施用途径向受体递送活性剂或其前药或其它药学上可接受的衍生物。MEK抑制剂和多激酶抑制剂可以按任何顺序相继、依次或以两者的组合施用。

术语“受试者”是指动物，例如哺乳动物，包括但不限于灵长类动物(例如人)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠等。在某些实施方案中，受试者是人。

术语“预防”或“预防性”是指持续不存在未施用所述组合时预期的疾病或病症的症状。

如本文所用的术语“协同”是比两种或更多种单一药剂的相加作用更有效的指治疗性组合。测定MEK抑制剂和靶向PDGFRα、S6和STAT3的多激酶抑制剂之间的协同相互作用可以基于从本文描述的测定获得的结果。例如，本文公开的体内或体外方法。可以使用Chou和Talalay组合方法和用CalcuSyn软件的剂量效应分析来分析这些测定的结果，以获得组合指数(Chou和Talalay，1984，Adv.Enzyme Regul.22：27-55)。可以在一个或多个测定系统中评估所提供的组合，并且可以使用标准程序分析数据，以量化抗癌剂之间的协同作用、相加作用和拮抗作用。示例程序是Chou和Talalay在New Avenues in Developmental CancerChemotherapy，Academic Press，1987，第2章中描述的程序。组合指数值小于0.8表示协同作用，值大于1.2表示拮抗作用，值在0.8至1.2之间表示相加作用。组合疗法可提供“协同作用”并证明是“协同的”，即活性剂一起使用时达到的效果大于单独使用化合物所产生的效果的总和。当活性剂：(1)共同配制和施用或在组合的单位剂量制剂中同时递送；(2)作为单独制剂交替或并行递送；或(3)通过其他方案时可以获得协同效应。当在交替治疗中递送时，当化合物依次施用或递送，例如通过在单独的注射器中不同注射时，可以获得协同效应。一般而言，在交替疗法期间，每种活性剂的有效剂量依次施用，即连续施用，而在组合疗法中，两种或多种活性剂的有效剂量一起施用。可以使用BLISS独立模型和最高单一药剂(HSA)模型(Lehar et al.，Molecular Systems Biology，3：80(2007))来评估组合效应。BLISS评分使单一药剂的强化程度量化，BLISS评分为正(大于0)表明高于简单相加。累积为正的BLISS评分大于250被认为是在试验浓度范围内观察到的强协同作用。HSA评分(大于0)表明组合效应大于相应浓度下单一药剂反应的最大值。

“球状体”是指细胞培养物，因为在本领域中已知为人工环境中的三维(3D)细胞培养物，其中生物细胞在所有三个维度上生长或与其周围环境相互作用。与2D环境，例如培养皿不同，3D细胞培养允许体外细胞在所有方向上生长，与它们在体内生长的方式类似。人工环境包含提供某些营养素和允许细胞生长的其他因素的培养基。本文描述的培养基提供了用于快速细胞培养的环境。术语“快速”是指小于对比培养基中相同细胞扩增所需的时间段。

术语“接触”是指允许活性剂足够紧密接近的酶靶标或存活途径，使得活性剂能够结合并抑制、减少或降低靶标活性。

如本文所用，术语“哺乳动物”是指人以及所有其他哺乳动物。如本文所用，术语“哺乳动物”包括“受试者”或“患者”并且指温血动物。可以理解，豚鼠、狗、猫、大鼠、小鼠、马、山羊、牛、绵羊、动物园动物、牲畜、灵长类动物和人都是该术语含义范围内的动物实例。

如本文所用，“有此需要的哺乳动物”是已经诊断为患有预期要治疗的特定病状，例如胰腺癌或特定类型的胰腺癌的受试者。

术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防治性措施，其中目的是预防或减缓(减轻)有害生理变化或病症，例如癌症的发展或扩散。出于本公开的目的，有益或期望的临床结果包括但不限于症状缓和，疾病程度减轻，疾病状态稳定(即，不恶化)，疾病进展延迟或减缓，疾病状态改善或缓解，减轻(无论是部分还是全部)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”还意指与不接受治疗时的预期生存期相比延长生存期。需要治疗的那些包括已经患有病状或病症的那些以及易于患所述病状或病症的那些或者要预防所述病状或病症的那些。

本文中“抑制剂”一词的使用意指抑制靶酶活性的分子。本文用“抑制”意指与不存在抑制剂时酶的活性相比，降低靶酶的活性。在一些实施方案中，术语“抑制”意指MEK活性降低或癌细胞的特定存活途径减少至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约95％。在其他实施方案中，抑制意指活性降低约5％至约25％，约25％至约50％，约50％至约75％，或约75％至100％。在一些实施方案中，抑制意指活性降低约95％至100％，例如活性降低95％、96％、97％、98％、99％或100％。可以使用本领域技术人员可识别的各种技术，包括体外激酶测定，测量这种降低。

如本文所用，“MEK抑制剂”是减少、抑制或以其他方式削弱MEK(MEK1和/或MEK2)的一种或多种生物活性的分子。活性可以降低统计学上显著的量，包括例如与合适的对照相比，MEK活性减少至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、63％、70％、75％、80％、85％、95％或100％。

如本文所用，“多激酶抑制剂”是降低、抑制或以其他方式削弱PDGFRα、S6和STAT3的生物学活性的分子。合适的多激酶抑制剂对这三种靶标中的每一种都显示出活性，并且可能对其他靶标具有活性。例如，在实施方案中，多激酶抑制剂另外作用于与胰腺肿瘤相关的肿瘤相关巨噬细胞。当与MEK抑制剂组合时，多激酶抑制剂作用于这些靶标中的每一种的能力提供了针对胰腺癌的优异功效。活性可以降低统计学上显著的量，包括例如与合适的对照相比，靶标活性减少至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、95％或100％。

当前公开的化合物可以是或可以不是特异性抑制剂。“特异性抑制剂”是指减少、抑制或以其他方式削弱限定靶标高于无关靶标的活性的试剂。例如，MEK特异性拮抗剂将MEK的至少一种生物学活性降低一定量，该量在统计学上高于拮抗剂对任何其他蛋白质(例如，其他丝氨酸/苏氨酸激酶)的抑制作用。在一些实施方案中，靶标拮抗剂的IC₅₀为非靶标拮抗剂IC₅₀的约90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、1％、0.1％、0.01％、0.001％或更少。特异性MEK抑制剂降低MEK一个或多个家族成员的生物活性，其量在统计学上高于拮抗剂对任何其他蛋白质(例如，其他丝氨酸/苏氨酸激酶)的抑制作用。在这些实施方案的一些中，RAF的MEK抑制剂的IC₅₀为另一种丝氨酸/苏氨酸激酶、其他MEK家族成员或其他类型的激酶(例如，酪氨酸激酶)的MEK抑制剂的IC₅₀的约90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、0.1％、0.01％、0.001％或更少。

术语“靶向”是指活性剂特异性作用于特异性MEK酶或与存活途径相关的特异性酶的能力。活性剂靶向酶的能力可通过本文所述的常规实验或使用其他已知方法确定。

如本文所用，“存活途径”是指癌细胞的适应性机制或促进其存活和增殖并且对活性剂具有抗性的能力。如本文所用，存活途径与PDGFRα、S6和STAT3相关。

短语“治疗有效量”意指(i)治疗或预防胰腺癌，(ii)减轻、改善或消除胰腺癌的一种或多种症状，或(iii)预防或延迟胰腺癌的一种或多种症状发作的活性剂的量。治疗有效量的药物可以减少癌细胞数量；减小肿瘤尺寸；抑制(即，在某种程度上减缓并且优选地终止)癌细胞浸润到外周器官中；抑制(即，在某种程度上减缓并且优选地终止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上缓解与癌症相关的一种或多种症状。在药物可以阻止生长和/或杀伤现有癌细胞的程度上，它可以是细胞抑制性的和/或细胞毒性的。对于癌症治疗，可以例如通过评估疾病进展时间(TTP)和/或确定反应率(RR)来测量功效。

术语“药学上可接受的盐”表示并非在生物学上或其他方面不合需要的盐。药学上可接受的盐包括酸加成盐和碱加成盐。短语“药学上可接受的”表示该物质或组合物必须在化学和/或毒理学上与构成制剂的其他成分和/或用其治疗的哺乳动物相容。本文所用的短语“药学上可接受的盐”是指分子的药学上可接受的有机或无机盐。示例性盐包括但不限于硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、丹宁酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐(即1，1′-亚甲基双-(2-羟基-3-萘甲酸盐))。药学上可接受的盐可包括包含另一种分子，例如乙酸根离子、琥珀酸根离子或其他抗衡离子。抗衡离子可以是稳定母体化合物上的电荷的任何有机或无机部分。此外，药学上可接受的盐在其结构中可具有多于一个带电原子。多个带电原子是药学上可接受的盐的一部分的实例可具有多个抗衡离子。因此，药学上可接受的盐可具有一个或多个带电原子和/或一个或多个抗衡离子。实例包括但不限于考比替尼和普纳替尼HCl的富马酸盐或半富马酸盐。

下面视情况提供了其他定义。

II.体内方法

当前公开的MEK抑制剂和靶向PDGFRα、S6和STAT3的多激酶抑制剂的组合可用于治疗胰腺癌。

在本文公开的实施方案中是一种治疗有此需要的受试者的胰腺癌的方法，其包括：向所述受试者施用治疗有效量的活性剂组合，其中所述组合包含MEK抑制剂或其药学上可接受的盐和靶向PDGFRα、S6和STAT3的多激酶剂或其药学上可接受的盐。该实施方案还可包括抑制肿瘤相关巨噬细胞的增殖。

可以使用的MEK抑制剂的实例包括考比替尼、GDC-0623、曲美替尼(trametinib)、比美替尼(binimetinib)、司美替尼(selumetinib)、匹马替尼(pimasertinib)、瑞法替尼(refametinib)、PD-0325901和BI-847325，或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，MEK抑制剂是考比替尼或其药学上可接受的盐。考比替尼具有以下结构：

考比替尼作为出售，并且作为半富马酸盐存在于商业制剂中。

靶向PDGFRα、S6和STAT3的有用多激酶剂是普纳替尼。普纳替尼具有以下结构：

普纳替尼以出售，并且作为盐酸盐存在于商业制剂中。

胰腺癌包括内分泌和外分泌癌。在实施方案中，胰腺癌选自下组：腺癌、腺泡细胞癌、腺鳞癌、胶样癌、具有破骨细胞样巨细胞的未分化癌、肝样癌、导管内乳头状粘液性肿瘤、粘液性囊性肿瘤、胰母细胞瘤、浆液性囊腺瘤、印戒细胞癌、实性和假性乳头状肿瘤、胰腺导管癌和未分化癌。在一个实施方案中，胰腺癌是胰腺导管腺癌。

在实施方案中，MEK抑制剂或其药学上可接受的盐和靶向PDGFRα、S6和STAT3的多激酶抑制剂或其药学上可接受的盐是协同的。也就是说，该组合提供的功效水平高于两种药剂的相加作用。在实施方案中，单独的一种或两种活性剂未显示出针对胰腺癌的预期功效。在考比替尼或其药学上可接受的盐和普纳替尼或其药学上可接受的盐的实例中，已知单独的药剂都不能有效对抗胰腺癌。

在实施方案中，MEK抑制剂或其药学上可接受的盐和所述多激酶抑制剂或其药学上可接受的盐作为组合制剂施用。在实施方案中，组合疗法可以作为同时或依次方案施用。当依次施用时，该组合可以分两次或多次施用。联合施用包括共同施用，使用单独的制剂或单一药物制剂，以及按任一顺序连续施用，其中优选存在一段两种(或所有)活性剂同时发挥其生物活性的时间段。

治疗胰腺癌的方法减少、抑制或以其他方式削弱一种或多种靶酶或存活途径的活性。也可以靶向与胰腺肿瘤相关的肿瘤相关巨噬细胞。本领域已知的用于测量MEK活性或PDGFRα、S6、STAT3和肿瘤相关巨噬细胞活化水平的任何方法均可用于测定所述组合的活性，包括体外激酶测定，用对磷酸化靶标具有特异性的抗体的免疫印迹，或测量活性下游生物效应。

胰腺癌可为早期或晚期，也可能已经转移。本文所述的组合可用于治疗任何阶段的癌症，包括已经转移的癌症。

用有效量的组合MEK抑制剂和靶向PDGFRα、S6和STAT3的多激酶抑制剂对受试者的治疗可包括单一治疗，或者可包括一系列治疗。

活性剂的有用量如本文其他地方所述。在特定实施方案中，MEK抑制剂按约5mg至约100mg，或约45mg至约75mg的量施用，并且多激酶抑制剂按约5mg至约100mg，或约30mg至约60mg的量施用。在实施方案中，MEK抑制剂按约60mg的量施用，并且多激酶抑制剂按约45mg的量施用。在实施方案中，组合疗法的施用是每日口服施用一次。在实施方案中，优选MEK抑制剂为考比替尼或其药学上可接受的盐，并且多激酶抑制剂为普纳替尼或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，每种活性剂按介于约0.001μg/kg至约1000mg/kg的剂量施用给受试者，包括但不限于约0.001μg/kg、0.01μg/kg、0.05μg/kg、0.1μg/kg、0.5μg/kg、1μg/kg、10μg/kg、25μg/kg、50μg/kg、100μg/kg、250μg/kg、500μg/kg、1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg、100mg/kg和200mg/kg。待施用的组合组合物中存在的每种活性剂的量可以为约1mg至约1000mg，或约5mg至约100mg，或约10mg至约80mg，或约45mg至约75mg，或约30mg至约60mg。应理解，活性化合物的适当剂量取决于普通技术医师或兽医知识范围内的许多因素。活性剂的剂量可以变化，例如，取决于受试者的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食，施用时间、施用途径、排泄率和任何药物组合。还应理解，在特定治疗过程中用于治疗的有效剂量可增加或减少。剂量变化可能导致并且从诊断测定的结果变得明显。

在一些实施方案中，本文描述了一种治疗有此需要的受试者的胰腺癌的方法，其包括：向所述受试者施用治疗有效量的组合MEK抑制剂或其药学上可接受的盐和靶向PDGFRα、S6和STAT3的多激酶剂或其药学上可接受的盐，其还包括施用附加疗法。附加疗法可以是放射疗法，手术(例如，乳房肿瘤切除术和乳房切除术)、化学疗法、基因疗法、DNA疗法、病毒疗法、RNA疗法、免疫疗法、骨髓移植、纳米疗法、单克隆抗体疗法或前述的组合。附加疗法可以呈佐剂或新辅助疗法的形式。在一些实施方案中，附加疗法是施用抗转移剂。在一些实施方案中，附加疗法是施用副作用限制剂(例如，旨在减轻治疗副作用的发生和/或严重性的药剂，例如抗恶心剂等)。在一些实施方案中，附加疗法是放射疗法。在一些实施方案中，附加疗法是手术。在一些实施方案中，附加疗法是放射疗法和手术的组合。在一些实施方案中，附加疗法是γ辐射。

在一些实施方案中，治疗在停止治疗后引起受试者的持续反应。“持续反应”是指在停止治疗后对减少肿瘤生长的持续作用。例如，与施用阶段开始时的尺寸相比，肿瘤尺寸可以保持相同或更小。在一些实施方案中，持续反应的持续时间至少与治疗持续时间相同，是治疗持续时间长度的至少1.5倍、2.0倍、2.5倍或3.0倍。

本文公开的治疗方法可以导致部分或完全反应。如本文所用，“完全反应”或“CR”是指所有目标病变消失；“部分反应”或“PR”是指以基线SLD为参考，目标病变的最长直径(SLD)之和至少减少30％；并且“稳定疾病”或“SD”是指以治疗开始以来最小的SLD作为参考，目标病变的既无充分减缩符合PR的要求，也没有足够的增加以符合PD的要求。如本文所用，“总反应率”(ORR)是指完全反应(CR)率和部分反应(PR)率之和。

本文公开的治疗方法可以导致施用组合疗法的受试者的无进展存活率和总存活率的增加。如本文所用，“无进展存活率”(PFS)是指治疗期间和治疗后的时间长度，在此期间所治疗的疾病(例如，癌症)不会恶化。无进展生存率可包括患者经历完全反应或部分反应的时间量，以及患者经历稳定疾病的时间量。

如本文所用，“总存活率”是指在特定持续时间后组中可能存活的受试者的百分比。

在一些实施方案中，施用所述组合的受试者为哺乳动物，例如家养动物(例如，牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物，例如猴子)、兔子和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。在一些实施方案中，所治疗的受试者是人。

需要治疗胰腺癌的受试者可以是表现出癌症症状的人，已经诊断患有癌症的人，处于胰腺癌缓解中的受试者，或者发展癌症(例如，遗传易感性、某些饮食或环境暴露)的风险增加的受试者。

本文所述的许多组合将被确定为是协同的。

本文所述的体外方法使用制备球形细胞培养物的方法，其包括在含有血清的培养基中培养细胞，血清在添加到培养基中进行所述培养之前已经煮沸。已经发现可以改良培养基以快速培养3-D球状体。通过在胎牛血清(FBS)与待培养的细胞接触之前将其煮沸来制备改良培养基。在实施方案中，FBS在95-100℃煮沸10分钟，此时血清的颜色变黄。然后将煮沸的FBS在8000xg下离心20分钟并通过无菌康宁真空过滤器装置过滤，过滤器孔径为0.22μm。有用的培养基包含约5％至约20％(v/v)的胎牛血清。用于球形培养的培养基是通过将10％(v/v)的煮沸FBS添加到补充有2mM L-谷氨酰胺、100单位ml^-1青霉素和链霉素的RPMI培养基中制备的。球形培养基需要在使用前新鲜制备。煮沸的FBS可以在4℃下储存2-3个月。用于单层培养的培养基是通过将10％(v/v)的正常FBS添加到补充有2mM L-谷氨酰胺、100单位ml^-1青霉素和链霉素的RPMI培养基中制备的。用于迁移测定的培养基是通过将20％(v/v)的正常FBS添加到补充有2mM L-谷氨酰胺、100单位ml^-1青霉素和链霉素的RPMI培养基中制备的。

III.组合药物组合物

在实施方案中，本文所述的主题涉及一种a)MEK抑制剂或其药学上可接受的盐和b)靶向PDGFRα、S6和STAT3的多激酶抑制剂或其药学上可接受的盐的组合，其用于胰腺癌的预防或治疗性治疗。

在实施方案中，本文所述的主题涉及一种药物组合物，其包含有效量的MEK抑制剂或其药学上可接受的盐和靶向PDGFRα、S6和STAT3的多激酶剂或其药学上可接受的盐的组合和药学上可接受的赋形剂。在一个特定实施方案中，该药物组合物用于治疗胰腺癌。

在实施方案中，组合物包含选自下组的MEK抑制剂：考比替尼、GDC-0623、曲美替尼、比美替尼、司美替尼、匹马替尼、瑞法替尼、PD-0325901和BI-847325，或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，MEK抑制剂是考比替尼或其药学上可接受的盐。在一个特定实施方案中，MEK抑制剂是考比替尼半富马酸盐。

在实施方案中，多激酶剂是普纳替尼或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，多激酶抑制剂是盐酸普纳替尼。

在实施方案中，组合物包含考比替尼或其药学上可接受的盐和普纳替尼或其药学上可接受的盐。在实施方案中，组合物包含考比替尼半富马酸盐和盐酸普纳替尼。

组合中存在的每种活性剂的量可以为约1mg至约1000mg，或约5mg至约100mg，或约10mg至约80mg，或约45mg至约75mg，或约30mg至约60mg。在实施方案中，MEK抑制剂存在的量为约45mg至约75mg，并且所述多激酶抑制剂存在的量为约30mg至约60mg。

组合疗法可提供“协同作用”并证明是“协同的”，即当活性剂一起使用时所达到的效果大于分别使用活性剂所产生的效果的总和。当活性剂：(1)共同配制和施用或在组合的单位剂量制剂中同时递送；(2)作为单独制剂交替或并行递送；或(3)通过其他方案时可以获得协同效应。当在交替治疗中递送时，当活性剂依次施用或递送，例如通过在单独的注射器中不同注射，单独的丸剂或胶囊，或单独输注时，可以获得协同效应。一般而言，在交替疗法期间，每种活性剂的有效剂量依次施用，即连续施用，而在组合疗法中，两种或多种活性剂的有效剂量一起施用。

MEK抑制剂和/或多激酶抑制剂，各自均在本文中也称为活性剂，可以根据标准药学实践的配制为药物组合物。一种示例性的多激酶抑制剂，普纳替尼可以按15mg、30mg和45mg强度用作口服施用的片剂。示例性MEK抑制剂考比替尼可以按20mg强度用作口服施用的片剂。然而，根据该方面，提供了包含MEK抑制剂或多激酶抑制剂或两者以及药学上可接受的赋形剂，例如载体或稀释剂的其他药物组合物。

通过混合活性剂和一种或多种赋形剂来制备典型制剂。合适的赋形剂是本领域技术人员公知的，包括诸如碳水化合物、蜡、水溶性和/或可溶胀聚合物、亲水或疏水性物质、明胶、油、溶剂、水等物质。使用的特定赋形剂将取决于施用活性剂的方式和目的。通常基于本领域技术人员认为对哺乳动物施用安全(GRAS)的溶剂来选择溶剂。一般而言，安全溶剂是无毒的水性溶剂，例如水和其它在水中可溶或可混溶的无毒溶剂。合适的水性溶剂包括水、乙醇、丙二醇、聚乙二醇(例如，PEG 400、PEG 300)等及其混合物。制剂还可包括一种或多种缓冲剂、稳定剂、表面活性剂、润湿剂、润滑剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂、抗氧化剂、避光剂、助流剂、加工助剂、着色剂、甜味剂、芳香剂、调味剂和其它已知的添加剂以提供活性剂的精致呈现或有助于制造药物产品(即药剂)。

可以使用常规的溶解和混合程序来制备制剂。例如，在上述一种或多种赋形剂的存在下将散装原料药(即活性剂或稳定形式的活性剂(例如，与环糊精衍生物或其它已知络合剂的络合物)溶解在合适的溶剂中。通常将活性剂配制成药物剂型以提供易于控制的药物剂量并使患者能够遵守规定的方案。

用于施用的药物组合物(或制剂)可以以多种方式包装，这取决于用于施用药物的方法。通常，用于分配的制品包括其中以适当的形式沉积药物制剂的容器。合适的容器是本领域技术人员公知的，包括诸如瓶子(塑料和玻璃)、小袋、安瓿、塑料袋、金属圆筒等材料。容器还可以包括防干扰组件，以防不慎接触包装内容物。另外，容器上沉积有描述容器内容物的标签。标签还可能包含适当的警告。在一个实施方案中，容器是泡罩包装。

可以制备药物制剂用于各种途径和类型的施用。例如，具有所需纯度的活性剂可任选地与药学上可接受的赋形剂混合(Remington’s Pharmaceutical Sciences(1980)第16版，Osol，A.Ed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA)，呈冻干制剂、研磨粉末或水溶液的形式。配制可以通过在环境温度下在适当的pH和所需的纯度下与生理学上可接受的载体混合来进行，所述载体即在所用剂量和浓度下对受者无毒的载体。制剂的pH主要取决于具体用途和化合物浓度，但范围可为约3至约8。在pH 5的乙酸盐缓冲液中配制是合适的实施方案。

活性剂可以是无菌的。具体而言，用于体内施用的制剂必须是无菌的。通过无菌过滤膜过滤可以容易地完成这种灭菌。

活性剂通常可以作为固体组合物、冻干制剂或水溶液储存。

包含活性剂的药物组合物可以以一定的方式配制、给药和施用，即量、浓度、时间表、疗程、媒介物和施用途径，与良好的医疗实践一致。在这种情况下考虑的因素包括所治疗的特定病症、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床状况、病症原因、药剂的递送部位、施用方法、施用方案以及医师所知的其他因素。待施用的化合物的“治疗有效量”将受这些考虑因素的支配。在所用的剂量和浓度下，可接受的赋形剂对受者无毒，并且可包括缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲基氯化铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)的多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子如钠；金属络合物(例如，锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂如聚山梨醇酯(例如TWEEN^TM)、泊洛沙姆(例如PLURONICS^TM)或聚乙二醇(PEG)。活性剂也可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中，例如分别在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)或在粗乳液中的羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。在Remington’s Pharmaceuticαl Sciences中公开了这些技术。

可以制备活性剂的持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有活性剂的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质是成型制品的形式，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(US3773919)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，如由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林(LUPRON DEPOT^TM)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸组成的可注射微球。

制剂包括适用于本文详述的施用途径的制剂。制剂可以方便地以单位剂型存在，并且可以通过药学领域熟知的任何方法制备。通常在Remington′s PharmaceuticalSciences中找到技术和制剂。此类方法包括使活性剂与构成一种或多种辅助成分的载体缔合的步骤。一般而言，通过将活性剂与液体载体或细碎固体载体或两者均匀且紧密地缔合，然后，如果需要，使产品成形，制备制剂。

适于口服施用的活性剂的制剂可以制备成离散单位，例如丸剂、胶囊剂、扁囊剂或片剂，其各自含有预定量的活性剂。

压缩片剂可以通过在合适的机器中压制自由流动形式如粉剂或粒剂，任选地与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂混合的活性剂来制备。模制片剂可以通过在合适的机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉末状活性剂的混合物来制备。片剂可任选地有包衣或刻痕，并任选地配制，以便从中提供缓释或控释活性剂。

可以制备片剂、糖锭、锭剂、水性或油性悬浮液、可分散粉剂或粒剂、乳液、硬或软胶囊(例如明胶胶囊)、糖浆或酏剂用于口服使用。旨在用于口服使用的活性剂的制剂可以根据本领域已知的用于制造药物组合物的任何方法制备，并且此类组合物可以含有一种或多种试剂，包括甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂，以便提供可口制剂。含有与适合制造片剂的无毒药学上可接受的赋形剂混合的活性剂的片剂是可接受的。这些赋形剂可以是，例如，惰性稀释剂，如碳酸钙或碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；造粒和崩解剂，如玉米淀粉或海藻酸；粘合剂，如淀粉、明胶或阿拉伯胶；和润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以是未包衣的，或者可以通过已知技术包衣，包括微囊化以延迟在胃肠道中的崩解和吸附，从而提供更长时间的持续作用。例如，可以使用延时材料，例如单独的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯或与蜡一起使用。

活性剂的水性悬浮液含有与适于制造水性悬浮液的赋形剂混合的试剂。这些赋形剂包括悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、交联羧甲基纤维素、聚维酮、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯树胶，以及分散剂或润湿剂，例如天然存在的磷脂(例如，卵磷脂)，烯化氧与脂肪酸的缩合产物(例如，聚氧乙烯硬脂酸酯)，环氧乙烷与长链脂族醇(例如，十七亚乙氧基十六烷基醇)的缩合产物，环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物(例如，聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)。水性悬浮液还可含有一种或多种防腐剂(例如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯)、一种或多种着色剂、一种或多种调味剂和一种或多种甜味剂(例如蔗糖或糖精)。

活性剂的药物组合物可以是无菌可注射制剂的形式，例如无菌可注射水性或油性悬浮液。这种悬浮液可以根据已知技术使用上面提到的那些合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂配制。无菌注射制剂还可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂例如1，3-丁二醇中的无菌注射溶液或悬浮液。无菌注射制剂也可以制备成冻干粉末。可以使用的可接受的媒介物和溶剂是水、林格氏溶液(Ringer's solution)和等渗氯化钠溶液。另外，无菌不挥发性油通常可用作溶剂或悬浮介质。为此，可以使用任何温和的不挥发性油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。另外，脂肪酸如油酸同样可用于制备注射剂。

可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性剂的量将根据所治疗的宿主和特定的施用模式而变化。例如，用于人口服施用的定时释放制剂可含有约1至1000mg活性剂，其与适当且方便量的载体材料化合，其可在总组合物的约5至约95％(重量∶重量)之间变化。可以制备药物组合物以提供易于测量的施用量。例如，旨在用于静脉内输注的水溶液可以含有每毫升溶液约3至500μg的活性剂，以便可以按约30mL/小时的速率输注合适的体积。

适于肠胃外施用的制剂包括水性和非水性无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质，使制剂与预期受者的血液等渗；水性和非水性无菌悬浮液，其可包括悬浮剂和增稠剂。

用于直肠施用的制剂可以作为栓剂存在，其具有包含例如可可脂或水杨酸酯的合适基质。

适于肺内或鼻内施用的制剂的粒度例如在0.1至500微米范围内(包括粒度在0.1至500微米范围内，微米增量为例如0.5、1、30微米、35微米等)，其通过鼻腔快速吸入或通过口腔吸入以便到达肺泡囊来施用。合适的制剂包括活性剂的水性或油性溶液。适于气溶胶或干粉施用的制剂可以根据常规方法制备，并且可以与其他治疗剂一起递送，例如迄今为止用于治疗或预防下述病症的化合物。

适于阴道施用的制剂可以作为阴道栓、棉塞、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾制剂提供，除活性剂外其还含有本领域已知的适当载体。

制剂可以包装在单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿和小瓶，并且可以在冷冻干燥(冻干)条件下储存，仅需在使用前立即添加无菌液体载体(例如水)进行注射。临时注射溶液和悬浮液由前述类型的无菌粉剂、粒剂和片剂制备。优选的单位剂量制剂是含有如上所述的每日剂量或单位每日亚剂量或其适当分数的活性剂的那些。

该主题还提供了兽用组合物，其包含至少一种如上定义的活性剂以及兽用载体。兽用载体是可用于施用组合物的材料，并且可以是固体、液体或气体材料，其是惰性的或在兽医领域中可接受的并且与活性剂相容。这些兽用组合物可以经胃肠外、口服或任何其他所需途径施用。

IV.制品

另一方面，本文描述了制品，例如含有可用于治疗胰腺癌的材料的“试剂盒”。该试剂盒包含容器，其包含MEK抑制剂或其药学上可接受的盐和靶向PDGFRα、S6和STAT3的多激酶抑制剂或其药学上可接受的盐的组合，用于治疗胰腺癌。该试剂盒还可包含在容器上或与容器相关的标签或包装说明书。术语“包装说明书”用于指通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书，其含有关于使用此类治疗产品的适应症、用法、剂量、施用、禁忌症和/或警告的信息。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、泡罩包装等。容器可以由多种材料形成，例如玻璃或塑料。容器可以容纳MEK抑制剂或其药学上可接受的盐与多激酶抑制剂或其药学上可接受的盐的组合或其制剂，其有效治疗病状并且可以具有无菌进入口(例如，容器可以是静脉溶液袋或具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。标签或包装说明书表明该组合物用于治疗胰腺癌。替代性地或另外地，制品还可包含第二容器，其包含药学上可接受的缓冲液，例如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。它还可以包括从商业和用户角度满足需要的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头和注射器。

所述试剂盒还可包括施用MEK抑制剂或其药学上可接受的盐的说明，并且如果单独配制，则包括多激酶抑制剂或其药学上可接受的盐的制剂。例如，如果试剂盒包含含有MEK抑制剂或其药学上可接受的盐的第一组合物，和含有多激酶抑制剂或其药学上可接受的盐的第二药物制剂，则该试剂盒还可包含向有需要的患者同时、依次或单独施用第一和第二药物组合物的说明。

在另一个实施方案中，所述试剂盒适于递送固体口服形式的MEK抑制剂或其药学上可接受的盐与多激酶抑制剂或其药学上可接受的盐的组合。此类试剂盒优选包括许多单位剂量。此类试剂盒可包括具有按其预期用途的顺序定向的剂量的卡片。此类试剂盒的一个实例是“泡罩包装”。泡罩包装在包装工业中是众所周知的，并且广泛用于包装药物单位剂型。如果需要，可以例如以数字、字母或其他标记的形式或随日历插页提供记忆辅助物，指定可以施用剂量的治疗计划中的日期。

根据一个实施方案，试剂盒可包含(a)其中含有MEK抑制剂或其药学上可接受的盐的第一容器；和任选地(b)其中合有多激酶抑制剂或其药学上可接受的盐的制剂的第二容器。替代性地或另外地，试剂盒还可包含第三容器，其包含药学上可接受的缓冲液，例如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。它还可以包括从商业和用户角度满足需要的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头和注射器。

在其中试剂盒包含MEK抑制剂或其药学上可接受的盐和多激酶抑制剂或其药学上可接受的盐的组合物的某些其他实施方案中，试剂盒可包含用于容纳单独的组合物的容器，例如分开的瓶子或分开的箔包，然而，单独的组合物也可以容纳在单个未分开的容器中。通常，试剂盒包括用于施用单独组分的说明。当单独的组分优选以不同的剂型(例如，口服和肠胃外)施用，以不同的剂量间隔施用时，或者当处方医师需要滴定组合的各个组分时，所述试剂盒形式是特别有利的。

在再一个实施方案中，本文所述的主题涉及使用已经预先煮沸，即在其用于培养基之前煮沸一定时间的血清的培养基。与使用未煮沸的正常血清的培养基相比，该培养基提供了球状体的快速形成。在实施方案中，用于培养细胞的培养基包含约10％煮沸的胎牛血清，其中所述血清在将其添加到培养基中之前在95-100℃下煮沸10分钟。

本文描述的主题包括以下具体实施方案：

1.一种治疗有此需要的受试者的胰腺癌的方法，其包括：向所述受试者施用有效量的活性剂组合，其中所述组合包含MEK抑制剂或其药学上可接受的盐和靶向PDGFRα、S6和STAT3的多激酶剂或其药学上可接受的盐。

2.根据权利实施方案1所述的方法，其中所述MEK抑制剂选自下组：考比替尼、GDC-0623、曲美替尼、比美替尼、司美替尼、匹马替尼、瑞法替尼、PD-0325901和BI-847325，或其药学上可接受的盐。

3.根据任何上述实施方案所述的方法，其中所述MEK抑制剂选自考比替尼和曲美替尼或其药学上可接受的盐。

4.根据任何上述实施方案所述的方法，其中所述MEK抑制剂是考比替尼或其药学上可接受的盐。

5.根据任何上述实施方案所述的方法，其中所述多激酶剂是普纳替尼或其药学上可接受的盐。

6.根据任何上述实施方案所述的方法，其中所述胰腺癌为内分泌型。

7.根据任何上述实施方案所述的方法，其中所述胰腺癌为外分泌型。

8.根据任何上述实施方案所述的方法，其中所述胰腺癌是腺癌、腺泡细胞癌、腺鳞癌、胶样癌、具有破骨细胞样巨细胞的未分化癌、肝样癌、导管内乳头状粘液性肿瘤、粘液性囊性肿瘤、胰母细胞瘤、浆液性囊腺瘤、印戒细胞癌、实性和假性乳头状肿瘤、胰腺导管癌和未分化癌。

9.根据任何上述实施方案所述的方法，其中所述胰腺癌为胰腺导管腺癌。

10.根据任何上述实施方案所述的方法，其中所述组合是协同作用的。

11.根据任何上述实施方案所述的方法，其中所述活性剂依次施用。

12.根据任何上述实施方案所述的方法，其中所述活性剂同时施用。

13.根据任何上述实施方案所述的方法，其中所述MEK抑制剂和所述多激酶抑制剂作为组合制剂施用。

14.根据任何上述实施方案所述的方法，其中所述MEK抑制剂的施用量为约45mg至约75mg，所述多激酶抑制剂的施用量为约30mg至约60mg。

15.根据任何上述实施方案所述的方法，其中所述量每天施用一次。

16.根据任何上述实施方案所述的方法，其中所述MEK抑制剂为考比替尼或其药学上可接受的盐如考比替尼半富马酸盐，并且所述多激酶抑制剂为普纳替尼或其药学上可接受的盐如普纳替尼HCl。

17.一种a)MEK抑制剂或其药学上可接受的盐和b)靶向PDGFRα、S6和STAT3的多激酶抑制剂或其药学上可接受的盐的组合，其用于胰腺癌的预防或治疗性治疗。

18.一种药物组合物，其包含有效量的MEK抑制剂或其药学上可接受的盐和靶向PDGFRα、S6和STAT3的多激酶剂或其药学上可接受的盐的组合和药学上可接受的赋形剂，其中所述组合物用于治疗胰腺癌。

19.根据任何上述实施方案所述的组合物，其中所述MEK抑制剂选自下组：考比替尼、GDC-0623、曲美替尼、比美替尼、司美替尼、匹马替尼、瑞法替尼、PD-0325901和BI-847325，或其药学上可接受的盐。

20.根据任何上述实施方案所述的组合物，其中所述MEK抑制剂选自考比替尼和曲美替尼或其药学上可接受的盐。

21.根据任何上述实施方案所述的组合物，其中所述MEK抑制剂是考比替尼或其药学上可接受的盐。

22.根据任何上述实施方案所述的组合物，其中所述多激酶剂是普纳替尼或其药学上可接受的盐。

23.根据任何上述实施方案所述的组合物，其包含考比替尼或其药学上可接受的盐和普纳替尼或其药学上可接受的盐。

24.根据任何上述实施方案所述的组合物，其中所述MEK抑制剂或其药学上可接受的盐存在的量为约45mg至约75mg，所述多激酶抑制剂或其药学上可接受的盐存在的量为约30mg至约60mg。

25.一种试剂盒，其包含MEK抑制剂或其药学上可接受的盐，和靶向PDGFRα、S6和STAT3的多激酶剂或其药学上可接受的盐，容器和包装说明书或标签。

提供以下实施例是为了说明而不是为了限制。

实施例

材料和方法

细胞系和试剂：

所有细胞系均来自ATCC，除了PA-TU-8988T细胞来自DSMZ和SUIT-2细胞来自JCRB外。所有细胞系都在Genentech细胞系核心设施中进行存储，该核心设施按常规进行SNP和STR分析以确认细胞系身份。所有细胞系按常规在补充有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺、100单位ml^-1青霉素和链霉素的RPMI培养基(Gibco)中培养。雷帕霉素(Rapamycin)和普纳替尼来自Selleckchem，克莱拉尼来自Arog Pharmaceuticals，并且考比替尼、GDC-0941和GDC-0980是在Genentech合成的。人磷酸激酶阵列试剂盒来自R&D Systems(ARY003B)，Cignal-45-Pathway报告基因阵列来自Qiagen(CCA-901L)，人酪氨酸激酶RT²Profiler PCR阵列来自Qiagen(PAHS-161Z)，MDSC分离试剂盒来自Miltenyi Biotec。使用这些试剂盒的所有测定均根据制造商的说明书进行。

蛋白质印迹和细胞活力测定：

将细胞接种于10cm培养皿中，并用1μM小分子抑制剂处理24小时。在含有蛋白酶抑制剂混合物(Thermo Scientific)的RIPA裂解缓冲液(Thermo Scientific)中制备细胞裂解物，进行SDS-PAGE并将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。使用标准方法进行免疫印迹。使用ImageJ软件为蛋白质条带定量。一抗：p-Erk、p-STAT3、p-S6、总S6、p-PDGFRα、p-PDGFRβ、p-RSK3、裂解的PARP、Bcl-xL、Mcl、存活素、Rab11、p-Akt、β-肌动蛋白、GAPDH(细胞信号传导)、总STAT3、总-PDGFRα(Santa Cruz Biotechnology)、p-EphA7(Gene Tex)和p-EphA2/3、EphA2/5(MyBioscource)。

细胞存活力测定法通过用剂量滴定(0.001至10μM)或固定剂量(1μM)的各种药理学抑制剂处理细胞72小时，并使用的CellTiter Glo(Promega)测量存活率来进行。如前所述计算Bliss评分。(Borisy AA，Elliott PJ，Hurst NW，Lee MS，Lehar J，Price ER，Systematic discovery of multicomponent therapeutics，Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America，2003；100(13)：7977-82，Epub 2003/06/12)。

慢病毒感染：

如前所述产生sh STAT3的慢病毒粒子。(Moffat J，Grueneberg DA，Yang X，KimSY，Kloepfer AM，Hinkle G，A lentiviral RNAi library for human and mouse genesapplied to an arrayed viral high-content screen，Cell，2006；124(6)：1283-98.Epub2006/03/28)。在Dox诱导型系统中的shSTAT3从LakePharma公司获得。用于shSTAT3的靶序列是AATCTTAGCAGGAAGGTGCCT。KP4和MIA-PACA2细胞用优化滴度的慢病毒转导并用1μg/ml嘌呤霉素进行选择。

Luminex测定和ELISA：

根据制造商的说明，使用多重试剂盒(Bio-Rad)对来自培养72小时的癌细胞的培养物上清液或在动物研究的终点收集的血浆样品进行Luminex测定。使用来自R&D Systems的试剂盒进行PDGFα ELISA。

侵袭测定：

将含有2％FBS的RPMI中的细胞接种在BD BioCoat Matrigel侵袭室(BDBiosciences)的倒置插入物上。下腔室填充有补充有10％FBS作为化学引诱物的RPMI，并且使用SpectraMax M5(Molecular Devices)测量孵育18小时后进入底部腔室的细胞数量。

动物研究：

所有动物研究均按照美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南进行。所有给药方案在异种移植物中都良好耐受。使用两种异种移植模型：人PDAC来源的细胞系KP4和源自分离自KPP GEMM小鼠的肿瘤的细胞。将5x10⁶个细胞皮下植入到免疫缺陷小鼠(CharlesRiver Laboratories)的右侧腹中，不使用任何Matrigel。在肿瘤达到～200mm³后将小鼠随机分组，然后用媒介物(MCT+25mM柠檬酸盐缓冲液，pH 2.75)、考比替尼(5mg/kg)+/-普纳替尼(30mg/kg)处理，口服每天一次。使用Ultra-Cal IV卡尺以指定的间隔测量肿瘤体积。为了适当地分析随时间对来自相同动物的肿瘤体积的重复测量，使用混合建模方法。(JosePinheiro DB，Saikat DebRoy，Deepayan Sarkar，R Core team.Linear and Nonlinearmixed effects models.Package′nlme′2008)。由于在研究结束前任何与治疗无关的动物死亡，该方法解决了重复测量和适度漏失。使用三次回归样条拟合每个剂量水平的log₂肿瘤体积的时间过程的非线性曲线。然后将这些非线性曲线与混合模型内的剂量相关联。使用以下公式计算肿瘤生长抑制作为媒介物的百分比(％TGI)，作为每天各剂量组相对于媒介物的拟合曲线下面积(AUC)的百分比：

％TGI＝100x(1-AUC_剂量/AUC_媒介物)。

为了测定％TGI的不确定性区间(UI)，使用拟合曲线和拟合协方差矩阵生成随机样本，作为％TGI分布的近似值。随机样本由拟合混合模型的1,000个模拟实现组成，其中为每个实现重新计算％TGI。报告的UI是在给定拟合模型的情况下，95％的时间重新计算的％TGI值将落在该区域内的值。模拟分布的2.5和97.5百分位用作上下UI。肿瘤生长抑制＞60％被认为是有意义的。(Wong H，Choo EF，Alicke B，Ding X，La H，McNamara E，Antitumor activity of targeted and cytotoxic agents in murine subcutaneoustumor models correlates with clinical response，Clinical Cancer Research：anofficial journal of the American Association for Cancer Research，2012；18(14)：3846-55.Epub 2012/06/01)。

使用R版本2.8.1(R Development Core Team 2008；R Foundation forStatistical Computing；Vienna，Austria)和Excel版本12.0.1(Microsoft Corporation)执行和生成绘图。使用R版本2.8.1分析数据，并使用nlme包版本3.1-89(41)将混合模型拟合到R中。

免疫组织化学和免疫荧光：

对从福尔马林固定的石蜡包埋的细胞团块、完整组织切片，以及TMA块(USBiomax，Inc)切割的4μm厚的切片进行免疫组织化学和免疫荧光法。将载玻片脱蜡并用具有靶标检索溶液(Dako)在PT模块(Thermo Scientific)上进行抗原暴露。用3％H₂O₂阻断内源过氧化物酶活性，并使用3％BSA阻断内源性免疫球蛋白。针对p-Erk和p-STAT3(细胞信号传导)的一抗以1μg/ml使用，p-PDGFRα(细胞信号传导)为0.4μg/ml，F4/80(Serotec)为10μg/ml，Gr-1(BD Pharmingen)为1μg/ml，裂解的半胱天冬酶3(细胞信号传导)为0.6μg/ml且CD8α(Genentech)为5μg/ml。使用Vecstatin ABC Elite辣根过氧化物酶(VectorLaboratories)或PowerVision Poly-HRP(Leica Biosystems)和金属增强的3，3′-二氨基联苯胺(Pierce)用于进行IHC染色和PowerVision Poly-HRP(Leica Biosystems)连同TSA试剂盒(Life Technologies)用于进行免疫荧光染色来检测抗体结合。使用Mayer苏木精(Rowley Biochemical)进行IHC载玻片的复染。

组织学：

用Nanozoomer XR自动载玻片扫描平台(Hamamatsu，Hamamatsu City，ShizuokaPref.，Japan)以200x最终放大倍数获得整个载玻片图像。

微阵列和RNA测序分析：

由Gene Logic使用Affymetrix HGU133P阵列测量正常和PDAC人组织中的基因表达。通过鲁棒多芯片平均(RMA)方法将基因表达数据标准化。表达探针集203131_at用于人PDGFRα，202273_at用于人PDGFRβ，205945_at用于人IL-6-R，并且204171_at用于PRS6KB1。

统计分析：

所有数据均表示为平均值±平均标准误差(S.E.M)。学生t检验(双尾)用于比较2组并用于使用Prism或Excel计算P值。P＜0.05被认为是显著的。使用Kaplan-Meier方法绘制存活曲线。

实施例1：胰腺癌细胞球形培养物中对MEK抑制的敏感性

为了比较在二维(2D)和三维(3D)培养物中培养的胰腺癌细胞如何响应各种癌症治疗剂，我们用一组203个癌症相关靶标的小分子抑制剂和已知的化学治疗剂(表1)治疗KRAS突变体PDAC癌细胞系KP4。

表1.小分子抑制剂

对于3D培养，本文描述了促进相对快速的“高通量”分析的方法。已经观察到在合有将其添加到培养基之前已经在95-100℃下预先煮沸10分钟的10％胎牛血清的培养基中培养癌细胞始终导致3D“球状体”快速形成。使用该方法形成的球状体显示出先前描述的球状体的所有典型特征，包括低水平增殖，外周层中Ki67染色的主要定位，以及到72小时具有以裂解的半胱天冬酶-3为标志的细胞凋亡的坏死/凋亡中心(图27)。它们的药物敏感性模式也类似于先前描述的球状体(图28和29)。

在2D和3D培养条件下用一组203种化合物处理KP4细胞显示出对几种药剂的不同敏感性(图1)。3D培养物通常对药物处理更具抗性，KP4球状体确实比2D培养物显著更强地抵抗来自该组的18种抑制剂的子集，其主要包括化学治疗剂(图1)。出乎意料的是，我们还鉴定出11种对3D培养比2D培养更有效的抑制剂(图1)。这11种抑制剂由多种分子组成，报告了靶向多种信号传导途径的活性。这些抑制剂中的四种(考比替尼、GDC-0623、AZD6244、PD901)靶向MEK途径，3种靶向PI3K途径(GDC-0941、GDC-0980、G38390)，一种靶向MET途径(G45203)。

实施例2：在胰腺癌细胞中2D与3D培养物中受差异性调节的多信号传导途径

为了鉴定可能促成2D与3D中观测到的胰腺癌细胞差异性处理敏感性的信号传导途径，我们进行了磷酸激酶阵列、基因表达阵列和荧光素酶表达报告基因测定，并比较了2D和3D条件下的KP4细胞中的信号传导蛋白表达水平的变化。磷酸激酶阵列显示与2D中培养的KP4细胞相比，在KP4球状体中的几种信号传导蛋白的酪氨酸磷酸化增加，包括p38、ERK、EGFR、MSK、Akt、TOR、CREB、HSP-27、STAT2、STAT5α、Hck、Chk-2、c-Jun、RSK1/2/3、eNOS、p27和PLC-γ1，表明3D条件下信号传导途径实质性“重新连接”(图2和3)。在KP4单层培养物中，MEK抑制下调ERK、RSK和PLC-γ1磷酸化，并增加STAT家族蛋白以及Akt的活化(图3)。相反，MEK抑制后除ERK、RSK和PLC-γ1外，KP4球状体显示Akt和STAT家族蛋白的活化减少。MEK抑制仅诱导KP4球状体中c-Jun的活化。

在KP4单层和球形培养物中对应于蛋白激酶的mRNA表达的qRT-PCR分析表明KP4球状体中几种RTK的表达升高；值得注意的是，FGFR3、EPHA1、EPHB6和INSR(图4)。MEK抑制引起KP4单层和球状体中这些RTK中的大多数下调。然而，在KP4单层培养物中在考比替尼处理后PDGFRα和PDGFRβ表达上调。相反，在KP4球状体中在MEK抑制后，EPHA1和EPHB1的表达选择性升高(图4)。总的来说，这些发现揭示了对于PDAC来源的细胞而言，对3D培养条件有特异性的药物反应特性，其可能促成观测到的相对于标准2D条件中观察到的对药物处理的差异敏感性。

使用大量荧光素酶报告基因测定法对考比替尼处理后转录因子途径活化的改变的进一步评估显示，KP4单层培养物表现出STAT3、c-Myc、GRE、KLF4、ISRE和GAS转录因子的活化增加(图5)。相反，KP4球状体未显示出这些转录因子的相似活化水平。这些结果暗示多种转录因子的差异调节，可能有助于激活替代的促存活信号传导途径以响应单层与球状体条件下的MEK途径抑制。

在考比替尼处理KP4细胞后通过p-PDGFRα、p-STAT3、p-Erk、p-S6和p-RSK的蛋白质印迹验证磷酸激酶阵列和基因表达阵列结果，并且观测到p-PDGFRα、p-STAT3和p-S6活化水平增加(图6A)。在多个PDAC人癌细胞系中考比替尼处理后也可重复检测到增加的p-STAT3(图6B)。显著地，在多个PDAC细胞系中也观测到IL-6配体的分泌增加，IL-6配体可以促进STAT3活化(图7)。与STAT3活化的要求一致，KP4和MIA-PACA2细胞中STAT3的RNAi敲减在考比替尼处理后诱导细胞死亡(图8和9)。另外，用多个PDAC细胞系和KPP GEMM肿瘤来源的细胞系的体外细胞侵袭测定证明在MEK抑制后癌细胞的侵袭潜力降低(图10)。这些结果表明虽然作为单一药剂的MEK抑制不足以引起原发性肿瘤消退，但它可以抑制癌细胞的侵袭潜力。总之，这些结果表明，PDGFRα、S6和STAT3介导的信号转导途径在胰腺癌细胞中MEK抑制后可以使癌细胞能够存活。

实施例3：PDGFRα、S6和STAT3抑制与MEK抑制一起有效地促进PDAC细胞凋亡

先前的研究已经报道，MEK抑制可以导致多种RTK以及作为“旁路”存活机制的IL6/JAK/STAT途径的上调和激活(Duncan JS，Whittle MC，Nakamura K，Abell AN，Midland AA，Zawistowski JS，Dynamic reprogramming of the kinome in response to targetedMEK inhibition in triple-negative breast cancer，Cell，2012；149(2)：307-21.Epub2012/04/17；Lee HJ，Zhuang G，Cao Y，Du P，Kim HJ，Settleman J，Drug resistance viafeedback activation of Stat3in oncogene-addicted cancer cells，Cancer Cell，2014；26(2)：207-21，Epub 2014/07/30；Dai B，Meng J，Peyton M，Girard L，Bornmann WG，Ji L，STAT3 mediates resistance to MEK inhibitor through microRNA miR-17，Cancer Research，2011；71(10)：3658-68，Epub2011/03/30)。然而，胰腺癌并未受到牵连。在肿瘤细胞生长测定中测试了靶向S6和JAK2/STAT3级联的多重RTK抑制剂普纳替尼单独或与考比替尼组合的有效性。考比替尼治疗促进DAC细胞系中的STAT3和S6活化(图6A)，并且用考比替尼/普纳替尼的联合治疗抑制PDGFRα、STAT3、S6、ERK1/2、Akt活化，降低促存活蛋白Bcl-XL、Mcl-1、存活素的表达和增加2D以及3D培养物中裂解的PARP的水平(图11、12和13)。虽然先前已报道普纳替尼抑制可能调节PDAC细胞下游信号传导途径的肝配蛋白(Ephrin)受体激酶活性，但考比替尼/普纳替尼联合治疗不影响PDAC模型中的肝配蛋白受体(EphA2/3、EphA2/5和EphA7)的活性(图11)。

由于普纳替尼除了FGFR、VEGFR、肝配蛋白受体，以及S6和JAK2/STAT3信号传导以外还抑制PDGFRα，我们通过检查的其他PDGFRα、S6和JAK2抑制剂与考比替尼组合的效果来进一步探讨普纳替尼的选择性活性。与EGFR抑制剂厄洛替尼或PDGFR抑制剂的作用不同，通过与考比替尼和S6抑制剂，雷帕霉素或GDC-0980的联合治疗下调S6活化促进KP4细胞中的细胞死亡(图14、18和19)。在用PDGFRα抑制剂克莱拉尼、JAK2抑制剂鲁索利替尼和考比替尼三重联合治疗后，PDGFRα和STAT3活化的同时下调也抑制KP4细胞生长和导致显著细胞死亡(图15)。然而，我们用考比替尼/普纳替尼处理观察到最强的协同作用，其共同靶向RTK，S6和JAK/STAT，并有效抑制PDAC细胞的生长(图11、12、13、14、16和17)。用考比替尼和/或普纳替尼作为单一药剂处理PDAC细胞系对细胞存活率没有影响，但在2D和3D培养中在联合抑制细胞生长方面具有协同性，揭示了考比替尼/普纳替尼组合是PDAC潜在有效的治疗策略(图12、16和17)。

实施例4：考比替尼/普纳替尼共同处理在小鼠模型中诱导肿瘤消退

为了测试考比替尼/普纳替尼组合在体内的有效性，我们用KP4和KPP GEMM来源的肿瘤细胞进行异种移植研究。考比替尼和普纳替尼作为单一药剂在KP4异种移植物中均无效，但是用考比替尼和普纳替尼共同处理引起肿瘤生长的显著抑制并且随着裂解的半胱天冬酶3的增加而增加细胞死亡(图20(KP4细胞)、21和22)。使用KPP GEMM来源的细胞系异种移植肿瘤获得了类似的结果，尽管我们主要观察到与肿瘤消退相反的肿瘤生长的显著延迟(图20(KPP细胞))。考比替尼/普纳替尼联合治疗还在KP4异种移植物中产生103％TGI(％肿瘤生长抑制)和在KPP异种移植物中产生71％TGI(表2)。在KP4异种移植研究中，考比替尼/普纳替尼联合治疗确实在小鼠中驱动了一些组合性体重减轻，但在KPP GEMM来源的异种移植研究中没有。在KP4异种移植研究中，由于体重减轻＞20％，必须在研究早期去掉两只小鼠。然而，在联合治疗过程中，在剩余小鼠中未观察到超过可接受阈值的显著体重减轻(图31A)。移植肿瘤的组织病理学分析、IHC染色和免疫印迹证实了考比替尼治疗后预期的p-PDGFRα、p-STAT3和pS6诱导，其在用考比替尼和普纳替尼共同治疗后显著下调(图21、22、30和33)。在经考比替尼处理的小鼠中也观察到显著升高的血清PDGFα、PDGFβ水平和增加的IL-6水平(图23)。考比替尼/普纳替尼共同处理降低血清PDGFα和PDGFβ水平，但不降低VEGF或FGF水平，通过普纳替尼在PDAC癌症模型中突出了PDGFRα途径的特定相关性(图23和图32)。

对PDAC肿瘤内的骨髓细胞区室的分析显示F4/80+肿瘤相关巨噬细胞(TAM)是最主要的骨髓细胞群(图21)。考比替尼/普纳替尼共同处理显著减少了肿瘤中TAM的数量，诱导了巨噬细胞抑制因子GCSF的血清水平，并降低了巨噬细胞活化因子GM-CSF和MCSF的水平(图22和23)。这些结果表明，考比替尼/普纳替尼共同处理通过除了下游MEK、S6和STAT3存活途径外还靶向PDGFRα途径而有效废除肿瘤细胞和骨髓细胞群体。另外，研究结果表明，这种联合治疗可以促进肿瘤消退。

表2.KP4和KPP异种移植物的肿瘤生长抑制(％TGI)

AUC＝曲线下面积

UI＝不确定性区间

TTP＝肿瘤进展时间(2X原始体积)

实施例5：PDAC患者肝转移中Erk和STAT3的差异性活化

为了检验这些发现的潜在临床相关性，我们对76份人PDAC组织样品和4份肝转移瘤进行了p-Erk和p-STAT3的IHC分析。Erk在13％的PDAC组织样品(10/76)中活化，主要是在I期和II期恶性肿瘤患者中，在26％的样品(20/76)中观察到STAT3活化，并且6.5％的样品(5/76)表现出活化的Erk和STAT3，主要是在I期恶性肿瘤中(图24和25)。此外，50％的肝转移瘤展示出Erk活化(2/4)，并且在25％的样品(1/4)中观察到STAT3活化(图24和25)。另外，基因表达分析进一步揭示来自人类患者的PDAC肿瘤相对于正常组织表达的RTK PDGFRα、PDGFRβ以及IL6-R的水平增加(图26、表3)。

表3.基因表达分析数据

表3中的数据表明PDAC肿瘤可以受PDGFR、IL-6和STAT3信号传导驱动，并且这些途径可以限制对MEK途径抑制的反应。这些发现还表明，MEK途径可能在肝转移瘤中的肿瘤细胞存活中起重要作用，其在人胰腺癌患者转移后不转换为STAT3介导的存活级联。

本文使用的所有技术和科学术语具有相同的含义。已经努力确保关于所用数字(例如，量、温度等)的准确性，但是应该考虑一些实验误差和偏差。

在本说明书和权利要求书全篇，除非上下文另有要求，否则词语“包含”以非排他性的意义使用。应理解，本文描述的实施方案包括“由......组成”和/或“基本上由......组成”的实施方案。

如本文所用，术语“约”在提及值时意在涵盖与指定量的在一些实施方案中±50％，在一些实施方案中±20％，在一些实施方案中±10％，在一些实施方案中±5％，在一些实施方案中±1％，在一些实施方案中±0.5％，及在一些实施方案中±0.1％的差异，因为此类差异适合于执行所公开的方法或使用所公开的组合物。

在提供一系列值的情况下，应理解，除非上下文另有明确规定，否则涵盖介于该范围上限和下限之间的每个中间值，至下限单位的十分之一，以及该规定值范围内的任何其他规定值或中间值。这些小范围的上限和下限，可以独立地包括在更小的范围中，也被涵盖在内，以规定范围内任何特别排除的限值为条件。如果规定范围包括一个或两个限值，则还包括排除这些限值中的一个或两个的范围。

该主题所属领域的技术人员将会想到本文阐述的许多修改和其他实施方案，其具有前面的描述和附图中呈现的教导的益处。因此，应理解该主题不限于所公开的具体实施方案，并且旨在将修改和其他实施方案包括在所附权利要求的范围内。尽管本文采用了特定术语，但它们仅用于一般性和描述性意义，而不是用于限制的目的。

Claims (27)

1.一种治疗有此需要的受试者的胰腺癌的方法，其包括：向所述受试者施用治疗有效量的活性剂组合，其中所述组合包含MEK抑制剂和靶向PDGFRα、S6和STAT3的多激酶剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述MEK抑制剂选自下组：考比替尼、GDC-0623、曲美替尼、比美替尼、司美替尼、匹马替尼、瑞法替尼、PD-0325901和BI-847325，或其药学上可接受的盐。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述MEK抑制剂选自考比替尼和曲美替尼或其药学上可接受的盐。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述MEK抑制剂是考比替尼或其药学上可接受的盐。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述多激酶剂是普纳替尼或其药学上可接受的盐。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述胰腺癌为内分泌型。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述胰腺癌为外分泌型。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述胰腺癌是腺癌、腺泡细胞癌、腺鳞癌、胶样癌、具有破骨细胞样巨细胞的未分化癌、肝样癌、导管内乳头状粘液性肿瘤、粘液性囊性肿瘤、胰母细胞瘤、浆液性囊腺瘤、印戒细胞癌、实性和假性乳头状肿瘤、胰腺导管癌或未分化癌。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述胰腺癌是胰腺导管腺癌。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合是协同作用的。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述活性剂依次施用。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述活性剂同时施用。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述MEK抑制剂和所述多激酶抑制剂作为组合制剂施用。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述MEK抑制剂的施用量为约45mg至约75mg，所述多激酶抑制剂的施用量为约30mg至约60mg。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述量每天施用一次。

16.根据权利要求1所述的方法，其中所述MEK抑制剂为考比替尼或其药学上可接受的盐，并且所述多激酶抑制剂为普纳替尼或其药学上可接受的盐。

17.一种a)MEK抑制剂或其药学上可接受的盐和b)靶向PDGFRα、S6和STAT3的多激酶抑制剂或其药学上可接受的盐的组合，其用于治疗胰腺癌。

18.一种药物组合物，其包含有效量的MEK抑制剂或其药学上可接受的盐和靶向PDGFRα、S6和STAT3的多激酶剂或其药学上可接受的盐的组合和药学上可接受的赋形剂，其中所述组合物用于治疗胰腺癌。

19.根据权利要求18所述的组合物，其中所述MEK抑制剂选自下组：考比替尼、GDC-0623、曲美替尼、比美替尼、司美替尼、匹马替尼、瑞法替尼、PD-0325901和BI-847325，或其药学上可接受的盐。

20.根据权利要求19所述的组合物，其中所述MEK抑制剂选自考比替尼和曲美替尼或其药学上可接受的盐。

21.根据权利要求20的组合物，其中所述MEK抑制剂是考比替尼或其药学上可接受的盐。

22.根据权利要求18所述的组合物，其中所述多激酶剂是普纳替尼或其药学上可接受的盐。

23.根据权利要求18所述的组合物，其包含考比替尼或其药学上可接受的盐和普纳替尼或其药学上可接受的盐。

24.根据权利要求18所述的组合物，其中所述MEK抑制剂或其药学上可接受的盐存在的量为约45mg至约75mg，所述多激酶抑制剂或其药学上可接受的盐存在的量为约30mg至约60mg。

25.一种试剂盒，其包含MEK抑制剂或其药学上可接受的盐，和靶向PDGFRα、S6和STAT3的多激酶剂或其药学上可接受的盐，容器和包装说明书或标签。

26.根据权利要求1所述的方法，其中所述MEK抑制剂按约1mg/kg至约50mg/kg的剂量施用，并且所述多激酶抑制剂按约1mg/kg至约50mg/kg的剂量施用。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述MEK抑制剂按约1mg/kg至约10mg/kg的剂量施用，并且所述多激酶抑制剂按约10mg/kg至约40mg/kg的剂量施用。