KR102245325B1 - 구제역 바이러스 검출용 단일클론항체 및 이의 용도 - Google Patents

구제역 바이러스 검출용 단일클론항체 및 이의 용도 Download PDF

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KR102245325B1
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Abstract

본 발명은 구제역 바이러스의 혈청형 7종 중 O형에 특이적으로 결합 또는 모든 혈청형에 광범위하게 결합 가능한 소 유래 단일클론항체 및 이를 포함하는 구제역 바이러스 진단용 키트, 이를 이용한 구제역의 진단 방법, 구제역의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 단일클론항체는 구제역 바이러스에 특이적으로 결합하는 단일클론항체는 구제역 바이러스의 항원과 특이적으로 결합하여 구제역 바이러스의 검출용 항체로 사용될 수 있으며, 구제역 바이러스에 대한 중화능이 우수하고 소에서 유래되어 소의 면역 거부 반응 발생에 대한 우려가 없으므로 긴급시 구제역 예방용 및 치료용 백신으로 사용될 수 있다.

Description

구제역 바이러스 검출용 단일클론항체 및 이의 용도{Monoclonal Antibody for Detecting Foot and Mouth Disease Virus, and Uses Thereof}
본 발명은 구제역 바이러스의 혈청형 7종 중 O형에 특이적으로 결합 또는 모든 혈청형에 광범위하게 결합 가능한 소 유래 단일클론항체 및 이를 포함하는 구제역 바이러스 진단용 키트, 이를 이용한 구제역의 진단 방법, 구제역의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
구제역은 소, 돼지, 염소, 사슴, 낙타 등 발굽이 2개인 우제류 동물에 대해 전염성이 높고 치사율이 5~55%인 바이러스성 질병으로서 국제수역사무국(Office International des Epizooties)에서 정한 가축 전염병 중 가장 위험한 A급(List A) 질병이며, 국내에서도 제1종 법정 전염병으로 분류된다. 구제역 바이러스(Foot and Mouth Disease Virus; FMDV)는 피코나바이러스과 애프도바이러스(Picornaviridae aphthovirus)에 속하는 RNA 바이러스로, 전세계적으로 항원 구조에 따른 7종의 혈청형 (O, A, Asia1, C, SAT1, SAT2, SAT3)과 70여 종의 아형 바이러스가 분포하고 있다. 구제역 바이러스에 감염된 동물은 혀, 점막 등 입과 발굽 주변에 수포 및 가피가 형성되고, 증세가 심해지면 수포가 터져 궤양으로 진전되어 죽게된다.
국내에서는 구제역이 1934년 처음 발생하여 2000년 이후 경기도, 충청도 등 전국 각지에서 꾸준히 발생하고 있고, 최근 2017년에 9건, 2018년에 2건이, 2019년 1월에 3건이 보고되었다. 구제역 발생시 질병의 확산을 억제하거나 예방하기 위해 구제역 감수성 개체에 백신을 접종하지만, 여전히 살처분이 최선의 확산 방지책으로 사용되고 있어 구제역 발생 농가의 막대한 재산 피해가 불가피하다.
현재 구제역 바이러스를 진단하는 방법으로는 바이러스 유전자를 대량으로 증폭시키는 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction) 등의 유전자 검출 방법과 항원-항체 반응을 이용한 바이러스의 단백질 항원 검출 방법으로 나눌 수 있다. 단백질 항원 검출 방법은 유전자 검출 방법에 비해 검사 시간 및 비용이 적게 소요되며, 구제역 바이러스의 항원과 특이적으로 결합하는 항체를 이용하기 때문에 구제역 양성 판정과 동시에 혈청형까지 분석할 수 있는 장점이 있다. 그러나, 각 항원마다 구조가 뚜렷이 구분되어 해당 항원을 특이적으로 인식하는 항체가 없는 경우에는 구제역 확진 판정을 할 수 없다. 한편, 구제역 바이러스에 대한 항체는 구제역 예방 또는 치료 백신으로 사용할 수 있는데, 이때 백신 접종된 동물에 방어 면역이 형성되지만 혈청형 간의 상호 방어 면역이 이루어지지 않기 때문에 다른 혈청형의 바이러스가 침입하게 되면 방어하지 못하고 구제역이 발생하게 된다.
한국등록특허 제1960968호에는 A형 항원에 특이적으로 결합하는 단일클론항체가 개시되어 있고, 한국공개특허 제2019-0006154호에는 O형 항원에 특이적으로 결합하는 단일클론항체가 개시되어 있고, 일본공개특허 제2013-049645호에는 O형, A형 및 Asia 1형에 특이적으로 결합하지 않으면서 C형 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 개시되어 있다. 이와 같이 개별 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 꾸준히 개발되고 있으나, 구제역 바이러스의 검출 민감도가 높고 구제역 바이러스의 특정 단백질 항원 또는 모든 단백질 항원과 결합 가능하는 항체에 대해서는 여전히 연구 및 개발이 부족한 실정이다.
본 발명의 일 양상은 구제역 바이러스 혈청형 O형에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 다른 양상은 구제역 바이러스 혈청형 O, A, Asia1, C, SAT1, SAT2 및 SAT3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 혈청형에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또 다른 양상은 상기 단일클론항체를 포함하는 구제역 진단용 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 다른 양상은 상기 단일클론항체를 인간을 제외한 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 구제역 바이러스 감염의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 양상은 구제역 바이러스 혈청형 O형에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 제공한다.
본 발명의 다른 양상은 구제역 바이러스 혈청형 O, A, Asia1, C, SAT1, SAT2 및 SAT3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 혈청형에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 제공한다.
구제역 바이러스는 항원 구조에 따라 혈청형이 O, A, Asia1, C, SAT1, SAT2 및 SAT3으로 구분되며, 특히 국내에서는 주로 O형 구제역이 발생한다. 구제역 바이러스의 항원은 구조가 서로 뚜렷이 구분되기 때문에 하나의 혈청형에 대한 특이적인 항체를 사용하여 다른 혈청형을 검출하거나, 또는 면역을 형성시키는 것이 불가능하다. 즉, 구제역 진단시 O형 FMDV에 대한 항체를 포함하는 진단 키트를 이용할 경우, O형이 아닌 다른 혈청형의 구제역 감염 동물로부터 구제역 확진 판정을 할 수 없다. 또한, 구제역 의심 동물에 O형 FMDV 에 대한 백신(항체)을 접종할 경우, O형에 대한 방어 면역만 형성할 뿐 다른 혈청형에 대한 면역이 형성되지 않아 A형 바이러스가 침입하면 구제역이 발생하게 된다. 따라서, 본 발명에서는 국내에서 주로 발생되는 O형에 특이적으로 결합하거나, 또는 모든 혈청형에 광범위하게 결합하는 구제역 바이러스에 대한 단일클론항체를 개발하였다.
본 명세서에서, "단일클론항체"는 하나의 항원 결정기(epotope)만을 인식하여 반응하는 특이성을 가지며, 단일 항체 형성세포로 형성되어 하나의 분자 구조로 이루어진 항체를 의미한다. 완전한 항체는 전체적으로 Y 모양을 하며, 2개의 긴 중쇄(heavy chain; H)과 2개의 짧은 경쇄(light chain; L)로 구성된다. 각 중쇄와 경쇄는 서로 황화결합으로 연결되며, 항원과 반응하는 부위인 가변영역(variable region; V)와 효과기능을 발현하는 부위인 불변영역(constant region; C)로 구분된다. 가변영역에는 항원과 특이적인 결합을 형성할 수 있도록 가변영역의 구조를 결정하며 항체결합세기를 조절하는 상보성 결정 부위(complementarity-determining region; CDR)가 존재한다. 일례로, O형 FMDV의 항체는 O형에 대해 특이적으로 결합하며, 완전한 형태의 항체뿐만 아니라 CDR을 포함하는 항체 분자의 항원 결합 단편(antigen binding fragment; Fab)일 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 구제역 바이러스 혈청형 O형에 특이적으로 결합하는 단일클론항체의 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 구제역 바이러스 혈청형 O형에 특이적으로 결합하는 단일클론항체의 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양상은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 다른 양상은 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 구제역 바이러스 혈청형 O, A, Asia1, C, SAT1, SAT2 및 SAT3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 혈청형에 특이적으로 결합하는 단일클론항체의 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 구제역 바이러스 혈청형 O, A, Asia1, C, SAT1, SAT2 및 SAT3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 혈청형에 특이적으로 결합하는 단일클론항체의 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양상은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공한다.
상기 단일클론항체는 당 업계에 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 일례로, 소의 혈액에서 분리된 말초 혈액 림프구(peripheral blood lymphocyte)에서 총 RNA를 추출하여 cDNA를 합성하고, 그 cDNA와 소 항체의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역에 특이적인 프라이머를 이용하여 발현 벡터를 제조한 후 그 발현 벡터를 숙주세포에 형질전환시키고, 그 중에서 O형 FMDV에 특이적으로 결합 또는 모든 혈청형에 광범위하게 결합하는 항체만을 선택함으로써 FMDV 단일클론항체를 제조할 수 있다.
상기 발현 벡터는 하나의 벡터에서 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역이 동시에 발현되는 벡터 시스템이거나, 또는 각각의 벡터에서 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역이 발현되는 벡터 시스템일 수 있다. 각각의 벡터를 이용하는 시스템인 경우에는 두 벡터를 동시 형질전환(co-transfomation) 또는 표적 형질전환(targeted transformation)하여 숙주세포에 도입시킬 수 있다.
상기 숙주세포는 발현 벡터를 안정화시켜 연속적으로 클로닝 또는 발현시킬 수 있는 세포로서 당 업계에 공지된 숙주세포를 제한 없이 사용할 수 있다. 일례로, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X1776, E. coli W3110, 바실러스 속 균주, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포, Sp2/0, CHO(chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN, MDCK 등의 동물 세포일 수 있다.
최종 얻어진 FMDV 단일클론항체는 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA, IgM 타입일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 혈청형 O형에 특이적으로 결합하는 단일클론항체는 서열번호 1로 이루어진 중쇄 CDR1(complementarity determining region 1), 서열번호 2로 이루어진 중쇄 CDR2(complementarity determining region 2) 및 서열번호 3으로 이루어진 중쇄 CDR3(complementarity determining region 3)을 포함하는 중쇄 가변영역; 및
서열번호 4로 이루어진 경쇄 CDR1(complementarity determining region 1), 서열번호 5로 이루어진 경쇄 CDR2(complementarity determining region 2) 및 서열번호 6으로 이루어진 경쇄 CDR3(complementarity determining region 3)을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있으며, 바람직하게는, 상기 단일클론항체는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에 따르면, 상기 혈청형 O, A, Asia1, C, SAT1, SAT2 및 SAT3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 혈청형에 결합하는 단일클론항체는 서열번호 9로 이루어진 중쇄 CDR1(complementarity determining region 1), 서열번호 10으로 이루어진 중쇄 CDR2(complementarity determining region 2) 및 서열번호 11로 이루어진 중쇄 CDR3(complementarity determining region 3)을 포함하는 중쇄 가변영역; 및
서열번호 12로 이루어진 경쇄 CDR1(complementarity determining region 1), 서열번호 13으로 이루어진 경쇄 CDR2(complementarity determining region 2) 및 서열번호 14로 이루어진 경쇄 CDR3(complementarity determining region 3)을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있으며, 바람직하게는, 상기 단일클론항체는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
본 명세서에서, "항체(antibody)"는 구제역 바이러스 혈청형 O형 또는 혈청형 O, A, Asia1, C, SAT1, SAT2 및 SAT3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 혈청형에 대한 특이 항체로서, 상기 혈청형에 대해 특이적으로 결합하며, 완전한 항체 형태뿐만 아니라 항체 분자의 항원 결합 단편을 포함하는 것으로 해석된다. 완전한 항체에 대한 설명은 상기 언급한 바와 같다.
본 명세서에서, "중쇄(heavy chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VH 및 3개의 불변영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3를 포함하는 전장 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석되며, "경쇄(light chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VL 및 불변영역 도메인 CL을 포함하는 전장 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.
본 명세서에서, "CDR(complementarity determining region)"은 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 고가변영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다. 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR을 포함할 수 있다(CDRH1, CDRH2, CDRH3 및 CDRL1, CDRL2, CDRL3). 상기 CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공할 수 있다.
본 명세서에서, "항원 결합 단편"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩티드의 일부를 의미한다. 예를 들어, F(ab')2, Fab', Fab, Fv 또는 scFv일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 상기 항원 결합 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 단쇄의 가변영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고 (예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 상기 단일클론항체를 포함하는 구제역 진단용 키트 및 이를 이용하여 구제역 바이러스를 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 구제역의 진단 방법을 제공한다.
상기 키트는 FMDV 단일클론항체를 사용하여 구제역 바이러스의 감염 여부를 정량적으로 측정하는데 사용될 수 있으며, 항원-항체 반응을 이용한 효소 면역분석법(enzyme immunoassay), 방사선 면역분석법(radio immunoassay), 형광 면역분석법(fluorescence immunoassay) 등의 방법을 이용할 수 있다.
상기 진단 방법은 FMDV 단일클론항체를 직접 사용하거나, 또는 FMDV 단일클론항체를 이용한 진단용 키트를 사용하여 구제역을 진단할 수 있다. 구체적으로, 소 또는 돼지 등의 구제역 의심 동물로부터 분리된 생물학적 시료를 FMDV 단일클론항체와 반응시켜 항원-항체 반응으로 검출할 수 있다. 이때, 생물학적 시료는 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 눈물, 침, 젖 등일 수 있으며, 채취가 용이하도록 체외로 분비되는 체액을 이용하는 것이 바람직하다.
이때, 사용되는 FMDV 단일클론항체에 따라 혈청형을 분석할 수 있다. O형 FMDV에 특이적으로 결합하는 항체 (O-serotype) 또는 이를 포함한 키트를 사용할 경우에는 O형 구제역을 진단할 수 있으나, O형이 아닌 다른 혈청형 구제역을 진단할 수 없다. 반면, 광범위 혈청형 FMDV에 결합하는 항체 (Pan-serotype) 또는 이를 포함하는 키트를 사용할 경우에는 O형, A형 등의 혈청형에 관계없이 모든 혈청형에 대한 구제역을 진단할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 전술한 단일클론항체를 인간을 제외한 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 구제역의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
상기 예방 또는 치료 방법은 이미 구제역 바이러스에 감염되었거나, 감염 가능성이 높은 우제류를 대상으로 FMDV 단일클론항체를 투여하여 구제역 바이러스에 대한 면역을 형성시킬 수 있다. 이때, 사용되는 FMDV 단일클론항체에 따라 해당 혈청형에 대한 면역을 형성시킬 수 있다. O형 FMDV에 특이적으로 결합하는 항체 (O-serotype)를 투여할 경우에는 O형 FMDV에 대해 면역이 형성되어 O형 구제역에 대한 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있으나, O형이 아닌 다른 혈청형 구제역에 대해서는 예방 또는 치료 효과를 기대할 수 없다. 반면, 광범위 혈청형 FMDV에 결합하는 항체 (Pan-serotype)를 투여할 경우에는 O형, A형 등의 혈청형에 관계없이 모든 혈청형 구제역에 대해 면역이 형성되어, 구제역의 예방 또는 치료 효과를 기대할 수 있다.
본 발명에 따른 구제역 바이러스에 특이적으로 결합하는 단일클론항체는 구제역 바이러스의 항원과 특이적으로 결합하여 구제역 바이러스의 검출용 항체로 사용될 수 있으며, 구제역 바이러스에 대한 중화능이 우수하고 소에서 유래되어 소의 면역 거부 반응 발생에 대한 우려가 없으므로 긴급시 구제역 예방용 및 치료용 백신으로 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따른 실험 결과로, O형 FMDV (O manisa) 및 A형 FMDV (A22 Iraq)에 대해 FMDV 단일클론항체의 혈청형 특이성을 분석한 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 구체예에 따른 실험 결과로, FMDV 단일클론항체를 생산하는 Bv22 클론 및 Bv7 클론의 혈청형을 분석한 그래프이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하며 본 발명에 따른 FMDV 단일클론항체를 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이러한 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시적으로 제시된 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이러한 예시적인 설명에 의하여 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. FMDV 단일클론항체의 제조
국내 도축장에서 확보한 한우의 혈액으로부터 원심분리하여 PBL를 분리하였다. RNA 추출 키트 (TRIzol, Invitrogen)를 이용하여 PBL에서 total RNA를 추출한 후 이로부터 RT-PCR 키트 (SuperScript IV First-Strand Synthesis System, Invitrogen)를 이용하여 cDNA를 합성하였다.
합성된 cDNA로부터 소 항체 가변영역에 특이적인 프라이머 세트 (하기 표 1 참조)를 이용하여 VH, Vk, Vλ 유전자를 각각 증폭하였고, 중쇄 가변영역 유전자 (VH)와 경쇄 가변영역 유전자 (Vk, Vλ)를 G4S linker 서열을 이용하여 scFv 형태로 연결하였다. 합성된 library scFv 서열은 제한효소 SfiI를 이용하여 자르고 동일한 SfiI로 잘라진 pDR-D1 벡터에 T4 Ligase를 이용하여 연결하였다. 이 ligate DNA를 electrocompetent ER2738 E. coli에 Electroporator (Bio-rad)를 이용하여 도입하였다. 항체 라이브러리가 도입된 대장균으로부터 항체가 디스플레이된 재조합 파지(phage)를 얻기 위해 Helper phage (VCSM13, Stratagene)를 superinfection시키고 밤새 배양하였고, 최종적으로 PEG8000 (Sigma)을 이용하여 상등액에 존재하는 파지를 농축하였다.
농축된 scFv가 표면발현된 라이브러리 파지를 BSA가 코팅된 immunotube에서 30분간 반응시켜서 비특이적 결합의 파지를 제거하고, 남은 파지를 FMDV 항원이 코팅된 immunotube에서 2시간 동안 반응시켰다. 5회의 반복적인 PBST 세척을 통해 결합하지 않은 파지를 제거하고, 최종적으로 결합하고 있는 파지를 0.1M Glycin HCl (pH 2.7)을 이용하여 용출하였다. 1M Tris-Cl (pH 8.0)으로 중화시킨 파지를 대장균에 감염시켜 다시 파지를 증폭한 후, 다음 회차의 패닝을 진행하였다. 패닝 회차가 진행될수록 세척 횟수를 증가시켜 특이적이고 강한 결합의 파지만 선택적으로 증폭되도록 하였다.
4차 패닝 후 96개의 클론을 무작위로 선정하여 96well deep well plate (Bioneer)에서 배양한 후 helper phage를 이용하여 각 클론에 대한 재조합 파지를 얻었다. 이를 FMDV 항원과 BSA가 코팅된 microtiter plate의 well에 결합시키고, 개별 재조합 파지 클론들의 결합능을 anti-M13-HRP 항체를 이용하여 확인하였다. 대조군 (BSA)에 결합하지 않고 FMDV에만 특이적으로 결합하는 항체 클론들을 확인하였고, 서열 분석을 통해 Unique한 서열의 항체 클론들을 선별하였다. 선별된 항체 (O-serotype: Bv 22, Pan-serotype: Bv7)의 서열은 하기 표 2와 같다.
프라이머 염기서열 (5'> 3')
VH BVH1
(서열번호 17)		 GCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGCGGGAGTC
BVH2
(서열번호 18)		 GCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTC
BVH3
(서열번호 19)		 GCGGCCCAGCCGGCCATGGCCAAGGTGCAGCTGCAGGAGTC
BJH1R
(서열번호 20)		 cgagccgccgccgccagatccacctccacctgaacctcctccaccTGAGGAGACGGTGACCAGG
BJH2R
(서열번호 21)		 cgagccgccgccgccagatccacctccacctgaacctcctccaccTGAGGAGACGGTGACCTCG
BJH3R
(서열번호 22)		 cgagccgccgccgccagatccacctccacctgaacctcctccaccTGAGGAGACGGTGACCCTG
Vk BVk1
(서열번호 23)		 ggatctggcggcggcggctcgGATGTTGTGCTGACCCAGAC
BVk2
(서열번호 24)		 ggatctggcggcggcggctcgGACATCCAGGTGACCCAGTC
BJk1R
(서열번호 25)		 CTGCTCGAGGCCTCCCGGGCCTTTGATCTCTACCTTGGTTCC
Vλ BVL1
(서열번호 26)		 ggatctggcggcggcggctcgCAGGCTGTGCTGACTCAGC
BVL2
(서열번호 27)		 ggatctggcggcggcggctcgCAGGATGTGCTGACTCAGC
BVL3
(서열번호 28)		 ggatctggcggcggcggctcgCAGTCTGGCCTGACTCAGC
BVL4
(서열번호 29)		 ggatctggcggcggcggctcgTCTTCTCAGCTGACTCAGC
BVL5
(서열번호 30)		 ggatctggcggcggcggctcgTCCTATGAACTGACCCAG
BVL6
(서열번호 31)		 ggatctggcggcggcggctcgCAGCCTGTGCTGACTCAGC
BVL7
(서열번호 32)		 ggatctggcggcggcggctcgCAGACTGTGATCCAGGAAC
BJL1R
(서열번호 33)		 CTGCTCGAGGCCTCCCGGGCCcaggacggtcactctggtcc
BJL2R
(서열번호 34)		 CTGCTCGAGGCCTCCCGGGCCcaggacggtcagtgtggtcc
scFv scFv-F
(서열번호 35)		 GACGACGACGACGACGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC
scFv-R
(서열번호 36)		 GACGACGACGACGACCTGCTCGAGGCCTCCCGGGCC
항체 염기서열 (5'> 3')
O-serotype VH
(서열번호 37)		 CAGGTGCAGCTGCGGGAGTCGGGCCCCAGCCTGGTGAAGCCCTCACAGACCCTCTCCCTCACCTGCACGGTCTCGGGATTCTCAGTGAACAACTATGCTGTAAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGCTCTGGAGTGGCTTGGGGGTATAAGCAGGAGTGGAAACAAAGGCTATAACCCAGCCCTGAAATCCCGGCTCAGCATCACCAAGGATAATTCCAAGAGCCAAGTCTCTCTGTCAATTAACAACGTATCACCTGAGGACACGGCCACATACTATTGTGCGAAGTGTAGTCACGAGTATGCTAATTATGCGTGCTATGATTTTGAAGATGAGTCCTACTTCGATGCCTGGGGCCAAGGACTTCGGGTCACCGTCTCCTCA
VL
(서열번호 38)		 CAGCCTGTGCTGACTCAGCCATCATCCGTGTCCGGGTCCCTGGGCCAGAGGGTCTCCATCACCTGCTCTGGAAGCAGCGGCAATGTTGGAAATGGATATGTGAGCTGGTACCAACTGATCCCAGGATCGGCCCCCAGAACCCTCATCTATGGTGACACCAGTCGAGCCTCGGGGGTCCCCGACCGATTCTCCGGCTCCAGGTCTGGGAACACAGCCACGCTGACCATCAACTCGCTCCAGGCCGAGGACGAGGCGGATTATTTCTGTGCAGCTCATGACAGTAGTATCAATAATGGTGTTTTCGGCAGCGGGACCACACTGACCGTCCTG
Pan-serotype VH
(서열번호 39)		 CAGGTGCAGCTGCGGGAGTCGGGCCCCAGCCTGGTGAAGCCCTCACAGACCCTCTCCCTCACCTGCACGGTCTCTGGATTCTCACTGAGAACGTATGGTGTGGACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGCGCCGGAGTGTCTTGGTGGAATAAGTACTAATGGAGTCCCAGACTATAACCCAGCCCTAAAATCCCGGCTCAGCATCACCAAGGACAACTCCAAGAATCAAGTGTCTCTGTCACTGAGCAGCCTGACAACTGAGGACACGGCCACATATTACTGTGCGAAGAATATGGGTGATATGGGTAGCTGTTATGCTTGGGCAAATGGTTACGTCGATGCCTGGGGCCCAGGACTCCAGGTCACCGTCTCCTCA
VL
(서열번호 40)		 CAGGCTGTGCTGACTCAGCCGTCCTCCGTGTCCGGCTCCCTGGGCCAGAGGGTCTCCATCACCTGCTCTGGAAGCAGAAGCAACATCGGTAGTTATGGCGTGGGCTGGTACCAGCAGGTCCCAGGATCGGGCCCCAGAACCCTCATCTATAGTGCGACCAGTCGAGCCTCTGGGGTCCCCGACCGATTCTCCGGCTCCAGGTCTGGGAACACAGCTACGCTGACCATCAGCTCGCTCCAGGCCGAGGACGAGGCGGATTATTTCTGTGCAGCTTATGACAGCAGTAGCAATGCTGTTTTCGGCAGCGGGACCACACTGACCGTCCTG
실험예 1. 단일클론항체가 결합하는 FMDV 혈청형 분석
선별된 단일클론항체의 FMDV 혈청형 특이성을 확인하기 위해, O형 FMDV 항원 (O manisa) 및 A형 FMDV 항원 (A22 Iraq)에 대하여 실시예 1에서 선별된 단일클론항체의 결합능을 분석하였다.
먼저, 정밀한 항체 결합능 분석을 위해 항체 클론들의 scFv 서열을 동물세포 발현벡터 pDR-OriP-Fc1에 클로닝하여 293E 세포에서 scFv-Fc형태로 발현하고, protein G affinity column (GE Healthcare)을 이용하여 정제하였다. scFv-Fc항체 2.5 ng 를 각각 O형, A형 항원이 코팅된 microtiter well에 반응시키고 결합된 scFv-Fc를 anti-human IgG (Fc specific)-HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratories)를 이용하여 측정하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에서 보는 바와 같이, O형 FMDV 항원에만 특이적으로 결합하는 클론과 O형 및 A형 FMDV 항원 모두에 결합하는 클론들이 존재함을 확인하였다.
또한, FMDV O형, A형 이외에 Asia1형, SAT1형, SAT2형, SAT3형, C형에 대해서도 실시예 1에서 선별된 단일클론항체의 결합능을 분석하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에서 보는 바와 같이, Bv22 클론은 O형 FMDV에 특이적으로 결합 (O-serotype)하며, Bv7 클론은 광범위 혈청형 FMDV 결합성을 갖는 것 (Pan-serotype)으로 확인되었다.
실험예 2. Competition ELISA 측정
기존 FMDV 진단 키트 (예: PrioCHECK?? FMDV Type O Antibody ELISA Kit)는 competitive ELISA 방식으로, 마우스 유래의 FMDV 특이 단일클론항체가 동물에서 분리된 혈청에 존재하는 FMDV 항체와 경쟁하여 ELISA 플레이트에 코팅된 FMDV 항원과 결합하지 못하는 것을 탐지한다.
실시예 1에서 제조된 Bv22 클론의 단일클론항체를 이용하여 FMDV 진단 키트에 적용 가능한지를 테스트하였고, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
PI 값 PI 값 (대조군)
소1 99% 89%
소2 98% 92%
돼지1 94% 56%
돼지2 96% 62%
돼지3 86% 83%
돼지4 84% 38%
상기 표 3과 같이, 진단 키트 내 마우스 유래의 FMDV 특이 단일클론항체 대신 실시예 1의 FMDV 단일클론항체를 사용한 결과, 기존 키트 (대조군)와 유사한 값을 갖는 것으로 확인되었다. 또한, 소뿐만 아니라 돼지 혈청에 대해서도 기존 키트에 비해 개선된 결과를 나타내는 것으로 확인되었다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Monoclonal Antibody for Detecting Foot and Mouth Disease Virus, and Uses Thereof <130> PN190098 <160> 40 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> O-serotype heavy chain CDR1 <400> 1 Asn Tyr Ala Val Asn 1 5 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> O-serotype heavy chain CDR2 <400> 2 Gly Ile Ser Arg Ser Gly Asn Lys Gly Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 3 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> O-serotype heavy chain CDR3 <400> 3 Cys Ser His Glu Tyr Ala Asn Tyr Ala Cys Tyr Asp Phe Glu Asp Glu 1 5 10 15 Ser Tyr Phe Asp Ala 20 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> O-serotype light chain CDR1 <400> 4 Ser Gly Ser Ser Gly Asn Val Gly Asn Gly Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> O-serotype light chain CDR2 <400> 5 Gly Asp Thr Ser Arg Ala Ser 1 5 <210> 6 <211> 11 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Arg Val Ser Ile Thr Cys Ser Gly Ser Ser Gly Asn Val Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Leu Ile Pro Gly Ser Ala Pro Arg Thr Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Asp Thr Ser Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Arg Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln 65 70 75 80 Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Ala Ala His Asp Ser Ser Ile 85 90 95 Asn Asn Gly Val Phe Gly Ser Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 9 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pan-serotype heavy chain CDR1 <400> 9 Thr Tyr Gly Val Asp 1 5 <210> 10 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pan-serotype heavy chain CDR2 <400> 10 Gly Ile Ser Thr Asn Gly Val Pro Asp Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 11 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pan-serotype heavy chain CDR3 <400> 11 Asn Met Gly Asp Met Gly Ser Cys Tyr Ala Trp Ala Asn Gly Tyr Val 1 5 10 15 Asp Ala <210> 12 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pan-serotype light chain CDR1 <400> 12 Ser Gly Ser Arg Ser Asn Ile Gly Ser Tyr Gly Val Gly 1 5 10 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pan-serotype light chain CDR2 <400> 13 Ser Ala Thr Ser Arg Ala Ser 1 5 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pan-serotype light chain CDR3 <400> 14 Ala Ala Tyr Asp Ser Ser Ser Asn Ala Val 1 5 10 <210> 15 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pan-serotype heavy chain <400> 15 Gln Val Gln Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Arg Thr Tyr 20 25 30 Gly Val Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Pro Glu Cys Leu 35 40 45 Gly Gly Ile Ser Thr Asn Gly Val Pro Asp Tyr Asn Pro Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu 65 70 75 80 Ser Leu Ser Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Lys Asn Met Gly Asp Met Gly Ser Cys Tyr Ala Trp Ala Asn Gly Tyr 100 105 110 Val Asp Ala Trp Gly Pro Gly Leu Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 16 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pan-serotype light chain <400> 16 Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ser Leu Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Ser Ile Thr Cys Ser Gly Ser Arg Ser Asn Ile Gly Ser Tyr 20 25 30 Gly Val Gly Trp Tyr Gln Gln Val Pro Gly Ser Gly Pro Arg Thr Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Ala Thr Ser Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Arg Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Ala Ala Tyr Asp Ser Ser Ser 85 90 95 Asn Ala Val Phe Gly Ser Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 17 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BVH1 primer <400> 17 gcggcccagc cggccatggc ccaggtgcag ctgcgggagt c 41 <210> 18 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BVH2 primer <400> 18 gcggcccagc cggccatggc ccaggtgcag ctgcaggagt c 41 <210> 19 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BVH3 primer <400> 19 gcggcccagc cggccatggc caaggtgcag ctgcaggagt c 41 <210> 20 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BJH1R primer <400> 20 cgagccgccg ccgccagatc cacctccacc tgaacctcct ccacctgagg agacggtgac 60 cagg 64 <210> 21 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BJH2R primer <400> 21 cgagccgccg ccgccagatc cacctccacc tgaacctcct ccacctgagg agacggtgac 60 ctcg 64 <210> 22 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BJH3R primer <400> 22 cgagccgccg ccgccagatc cacctccacc tgaacctcct ccacctgagg agacggtgac 60 cctg 64 <210> 23 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BVk1 primer <400> 23 ggatctggcg gcggcggctc ggatgttgtg ctgacccaga c 41 <210> 24 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BVk2 primer <400> 24 ggatctggcg gcggcggctc ggacatccag gtgacccagt c 41 <210> 25 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BJk1R primer <400> 25 ctgctcgagg cctcccgggc ctttgatctc taccttggtt cc 42 <210> 26 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primer <400> 33 ctgctcgagg cctcccgggc ccaggacggt cactctggtc c 41 <210> 34 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BJL2R primer <400> 34 ctgctcgagg cctcccgggc ccaggacggt cagtgtggtc c 41 <210> 35 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv-F primer <400> 35 gacgacgacg acgacgcggc ccagccggcc atggcc 36 <210> 36 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv-R primer <400> 36 gacgacgacg acgacctgct cgaggcctcc cgggcc 36 <210> 37 <211> 387 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> O-serotype VH <400> 37 caggtgcagc tgcgggagtc gggccccagc ctggtgaagc cctcacagac cctctccctc 60 acctgcacgg tctcgggatt ctcagtgaac aactatgctg taaactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ctctggagtg gcttgggggt ataagcagga gtggaaacaa aggctataac 180 ccagccctga aatcccggct cagcatcacc aaggataatt ccaagagcca agtctctctg 240 tcaattaaca acgtatcacc tgaggacacg gccacatact attgtgcgaa gtgtagtcac 300 gagtatgcta attatgcgtg ctatgatttt gaagatgagt cctacttcga tgcctggggc 360 caaggacttc gggtcaccgt ctcctca 387 <210> 38 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> O-serotype VL <400> 38 cagcctgtgc tgactcagcc atcatccgtg tccgggtccc tgggccagag ggtctccatc 60 acctgctctg gaagcagcgg caatgttgga aatggatatg tgagctggta ccaactgatc 120 ccaggatcgg cccccagaac cctcatctat ggtgacacca gtcgagcctc gggggtcccc 180 gaccgattct ccggctccag gtctgggaac acagccacgc tgaccatcaa ctcgctccag 240 gccgaggacg aggcggatta tttctgtgca gctcatgaca gtagtatcaa taatggtgtt 300 ttcggcagcg ggaccacact gaccgtcctg 330 <210> 39 <211> 378 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pan-serotype VH <400> 39 caggtgcagc tgcgggagtc gggccccagc ctggtgaagc cctcacagac cctctccctc 60 acctgcacgg tctctggatt ctcactgaga acgtatggtg tggactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg cgccggagtg tcttggtgga ataagtacta atggagtccc agactataac 180 ccagccctaa aatcccggct cagcatcacc aaggacaact ccaagaatca agtgtctctg 240 tcactgagca gcctgacaac tgaggacacg gccacatatt actgtgcgaa gaatatgggt 300 gatatgggta gctgttatgc ttgggcaaat ggttacgtcg atgcctgggg cccaggactc 360 caggtcaccg tctcctca 378 <210> 40 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pan-serotype VL <400> 40 caggctgtgc tgactcagcc gtcctccgtg tccggctccc tgggccagag ggtctccatc 60 acctgctctg gaagcagaag caacatcggt agttatggcg tgggctggta ccagcaggtc 120 ccaggatcgg gccccagaac cctcatctat agtgcgacca gtcgagcctc tggggtcccc 180 gaccgattct ccggctccag gtctgggaac acagctacgc tgaccatcag ctcgctccag 240 gccgaggacg aggcggatta tttctgtgca gcttatgaca gcagtagcaa tgctgttttc 300 ggcagcggga ccacactgac cgtcctg 327

Claims (17)

  1. 구제역 바이러스 혈청형 O형에 특이적으로 결합하며,
    서열번호 1로 이루어진 중쇄 CDR1(complementarity determining region 1), 서열번호 2로 이루어진 중쇄 CDR2(complementarity determining region 2) 및 서열번호 3으로 이루어진 중쇄 CDR3(complementarity determining region 3)을 포함하는 중쇄 가변영역; 및
    서열번호 4로 이루어진 경쇄 CDR1(complementarity determining region 1), 서열번호 5로 이루어진 경쇄 CDR2(complementarity determining region 2) 및 서열번호 6으로 이루어진 경쇄 CDR3(complementarity determining region 3)을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 단일클론항체.
  2. 삭제
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 단일클론항체는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 것인 단일클론항체.
  4. 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 구제역 바이러스 혈청형 O형에 특이적으로 결합하는 단일클론항체의 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  5. 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 구제역 바이러스 혈청형 O형에 특이적으로 결합하는 단일클론항체의 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  6. 청구항 4 또는 청구항 5의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
  7. 청구항 6의 재조합 벡터를 포함하는 숙주세포.
  8. 구제역 바이러스 혈청형 O, A, Asia1, C, SAT1, SAT2 및 SAT3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 혈청형에 특이적으로 결합하며,
    서열번호 9로 이루어진 중쇄 CDR1(complementarity determining region 1), 서열번호 10으로 이루어진 중쇄 CDR2(complementarity determining region 2) 및 서열번호 11로 이루어진 중쇄 CDR3(complementarity determining region 3)을 포함하는 중쇄 가변영역; 및
    서열번호 12로 이루어진 경쇄 CDR1(complementarity determining region 1), 서열번호 13으로 이루어진 경쇄 CDR2(complementarity determining region 2) 및 서열번호 14로 이루어진 경쇄 CDR3(complementarity determining region 3)을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 단일클론항체.
  9. 삭제
  10. 청구항 8에 있어서,
    상기 단일클론항체는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 것인 단일클론항체.
  11. 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 구제역 바이러스 혈청형 O, A, Asia1, C, SAT1, SAT2 및 SAT3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 혈청형에 특이적으로 결합하는 단일클론항체의 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  12. 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 구제역 바이러스 혈청형 O, A, Asia1, C, SAT1, SAT2 및 SAT3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 혈청형에 특이적으로 결합하는 단일클론항체의 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  13. 청구항 11 또는 청구항 12의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
  14. 청구항 13의 재조합 벡터를 포함하는 숙주세포.
  15. 청구항 1 또는 청구항 8의 단일클론항체를 포함하는 구제역 진단용 키트.
  16. 청구항 15에 있어서,
    상기 키트는 소 구제역 또는 돼지 구제역을 진단하는 것인 구제역 진단용 키트.
  17. 청구항 1 또는 청구항 8의 단일클론항체를 인간을 제외한 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 구제역의 예방 또는 치료 방법.
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