CN117858896A

CN117858896A - 特异性结合乙型肝炎病毒preS1抗原肝细胞受体结合基序的人抗体及其用途

Info

Publication number: CN117858896A
Application number: CN202280056403.0A
Authority: CN
Inventors: 洪孝贞; 赵京熙; 洪智秀; 崔荣珍; 李知佑
Original assignee: Aibitai Biology Co ltd
Current assignee: Aibitai Biology Co ltd
Priority date: 2021-06-15
Filing date: 2022-05-30
Publication date: 2024-04-09

Abstract

本发明涉及一种特异性结合乙型肝炎病毒(HBV)preS1抗原受体结合基序的抗体及其用途。本发明的抗体针对HBV的各种基因型，因此可有效地应用于需要中和HBV或抑制和治疗HBV感染的领域。

Description

特异性结合乙型肝炎病毒preS1抗原肝细胞受体结合基序的人抗体及其用途

技术领域

本发明涉及一种特异性结合乙型肝炎病毒preS1抗原的肝细胞受体结合基序的人抗体及其用途。

背景技术

乙型肝炎病毒(HBV)感染是公共卫生领域最严重和普遍的问题。2016年，全球慢性HBV感染患病人数约为2.9亿人。

迄今为止，共鉴定出了10种不同的HBV基因型(A至J)。基因型A和D主要在非洲和欧洲流行，基因型B和C主要在亚洲流行，基因型E到J频繁地在欧洲、美洲和亚洲出现。最普遍的基因型是A型至D型，约占乙型肝炎病例的90％。

HBV包膜包含三种结构相关的蛋白质，分别为S(小)、M(中)和L(大)蛋白。S蛋白是这些外壳蛋白中最丰富的蛋白质，M蛋白包含preS2和S结构域，L蛋白包含preS1、preS2和S结构域。

感染HBV的肝细胞产生传染性HBV颗粒(病毒粒子)以及非传染性球形和丝状亚病毒颗粒。这些亚病毒颗粒主要由S蛋白组成，其产生的数量通常高达病毒粒子的1,000到10,000倍。这些亚病毒颗粒被怀疑会降低病毒特异性免疫反应。

与S蛋白不同，L蛋白的preS1主要存在于传染性病毒粒子中。此外，preS1的20至26位氨基酸(适用于基因型A至C和F；基因型D为9至15位；基因型E为19至25位)通过与肝细胞受体NTCP(牛磺胆酸钠共转运多肽)结合从而介导HBV感染。该受体结合基序在HBV基因型中高度保守，因此可以作为治疗和预防HBV感染的靶点。

乙型肝炎免疫球蛋白(HBIG)用于意外或围产期HBV暴露后的预防性医学治疗。HBIG是通过收集具有高抗S蛋白抗体滴度的血清来产生的。然而，考虑到preS1区对HBV感染很重要，能够抑制HBV感染的preS1特异性单克隆抗体(mAb)可能是预防和治疗HBV感染的一种有前途的方法。临床上，抗preS1抗体的存在已被证明与乙型肝炎患者的康复有关。最近，Li等人已经证明，一种特异性结合31至38位氨基酸(基因型A至C和F)(这些氨基酸是preS1的肝细胞受体结合基序(基因型A至C和F的20至26位氨基酸)的下游部分)的人单克隆抗体(2H5-A14)不仅可以预防移植人肝细胞的小鼠模型中的HBV感染，也通过Fc介导的效应功能表现出治疗效果(Dan Li,Wenhui He,Ximing Liu,Sanduo Zheng,Yonghe Qi,Huiyu Li,Fengfeng Mao,Juan Liu,Yinyan Sun,Lijing Pan,Kaixin Du,Keqiong Ye,Wenhui Li,Jianhua Sui.2017.一种有效的人中和抗体Fc依赖性地减少已确诊的HBV感染.eLife 6:e26738.DOI:https://doi.org/10.7554/eLife.26738)。

许多具有HBV中和活性的抗preS1单克隆抗体已由用HBV颗粒或重组preS1抗原免疫的小鼠产生(Heermann K，Goldmann U，Schwartz W，Seyffarth T，Baumgarten H，Gerlich W.1984.含有pre-s序列的乙型肝炎病毒的大型表面蛋白.病毒学杂志.52:396-402；Pizarro JC，Vulliez-le Normand B，Riottot M-M，Budkowska A，Bentley GA.2001.对乙型肝炎病毒preS1区具有特异性的单克隆抗体的结构和功能表征.FEBS letters.509:463-468；Kim JH，Gripon P，Bouezzedine F，Jeong MS，Chi SW，Ryu SE，Hong HJ.2015.基于抗原-抗体复合物结构的增强人源化和亲和力成熟中和抗乙型肝炎病毒preS1抗体.FEBSletters.589:193-200；Wi J，Jeong MS，Hong HJ.2017.与关键受体结合位点结合的抗乙型肝炎病毒preS1人源化抗体的构建和表征.微生物学和生物技术杂志27，1336-1344；等)。然而，以这种方式产生的大多数抗体都存在一个问题，因为它们不能中和所有基因型的HBV。

公开

技术问题

在此背景下，为了更有效地预防或治疗，本发明人努力提供一种可以结合多种基因型HBV并且对preS1的肝细胞受体结合基序具有特异性的单克隆抗体，因此，本发明人开发了一种与所有基因型A到F(其占乙型肝炎病毒的大部分)结合的人单克隆抗体，并且其通过与肝细胞受体结合基序结合而表现出抑制HBV感染的功效，从而完成了本发明。

技术方案

本发明的一个目的是提供一种特异性结合乙型肝炎病毒preS1抗原受体结合基序的新型抗体。

本发明的另一目的是提供一种生产所述抗体的方法。

本发明的又一目的是提供编码所述抗体的多核苷酸、含有所述多核苷酸的表达载体以及将所述载体引入其中的宿主细胞。

本发明的又一目的是提供一种用于预防或治疗HBV感染的药物组合物，其含有所述抗体。

本发明的又一目的是提供一种利用所述抗体预防或治疗HBV感染的方法。

本发明的又一目的是提供一种提供HBV感染诊断信息的方法，其包括通过使用所述抗体进行抗原-抗体反应来检测从疑似感染HBV的受试者身上分离的生物样本中存在的preS1。

本发明的又一目的是提供一种用于检测HBV的组合物，其含有所述抗体。

本发明的又一目的是提供一种用于检测HBV的试剂盒，其含有所述抗体。

有益效果

本发明的抗体靶向不同基因型HBV的共有序列，可以与不同基因型的HBV结合，并表现出优异的HBV结合能力，因此不仅可以用于HBV感染的检测和诊断，而且可以用于需要治疗的领域。

附图说明

图1显示了HBV preS1 N端氨基酸序列(基因型A至F，根据HBV基因型A编号)的比对，其中20至26位氨基酸是preS1的关键受体结合基序，以灰色阴影表示，Bio-preS1-L肽中包含的序列带有下划线；

图2显示了从人合成Fab文库中分离抗preS1单克隆Fab的实验结果，图2A显示了每轮淘选的噬菌体的输入和输出滴度，其中pfu代表斑块形成单元，图2B显示了通过间接ELISA测定的阳性多克隆噬菌体扩增，其中选择了抗preS1扩增率最高的第四轮淘选进行单克隆Fab的分离，图2C显示了AbS0 Fab噬菌体的间接ELISA结果，在从第四轮淘选输出中选出的阳性Fab克隆中，其与bio-preS1-L肽的抗原结合活性最好；

图3显示了从AbS0 Fab转化为IgG1并纯化的AbS0 mAb的抗原结合活性分析，图3A显示了在非还原(NR，6％)和还原(R，10％)条件下纯化的AbS0的SDS-PAGE结果，其中M表示蛋白质分子量标记物，HC表示重链，LC表示轻链，图3B显示了纯化的AbS0 mAb与HBV基因型(A至D)的preS1的抗原结合活性ELISA评估，图3C显示了使用Octet RED384通过BLI对AbS0进行亲和力测试的结果，其中通过2倍连续稀释(25nM、12.5nM、6.25nM、3.125nM和1.5625nM)制备了HBV基因型A的重组preS1，所有值均从多个孔中获得，并表示为平均值±SEM，图3D显示了AbS0抗体不与人卵巢癌细胞系SKOV3结合的FACS分析结果，SKOV3表达L1CAM但不表达preS1，排除了AbS0抗体与preS1非特异性结合的可能性；

图4显示了评估AbS0与HBV基因型D的病毒粒子结合活性(图4A)和体外HBV中和活性(图4B)的结果，图4A显示了AbS0对HBV基因型D颗粒的免疫沉淀，其中HzKR127-3.2(参考：Kim JH等人.基于抗原-抗体复合物结构的增强人源化和亲和力成熟的中和抗乙型肝炎病毒preS1抗体.FEBS Lett.589：193-200)已被用作阳性对照，小鼠IgG作为阴性对照，RC DNA表示松弛的环状DNA，DSL DNA表示双链线性DNA，图4B显示了从收获的细胞中提取HBV DNA并进行Southern印迹杂交的结果，其中HBV基因型D颗粒已与AbS0(10μg，1μg或0.1μg)或小鼠IgG(10μg)提前共孵育，然后加入到培养后的HepG2-NTCP细胞中，每2天更换一次培养基，感染后7天收获细胞；

图5显示了对GST-preS1(aa 1-56)-链霉素的19至34位氨基酸的丙氨酸取代突变体进行表达、纯化和SDS-PAGE的结果，以绘制AbS0抗体的表位；

图6显示了间接ELISA分析AbS0抗体与GST-preS1(aa 1-56)-链霉素氨基酸19至34的丙氨酸取代突变体的结合活性的结果；

图7显示了通过间接ELISA(7A和7B)和定量ELISA(7C和7D)确定将AbS0抗体的LCDR3(图7A和7C)和HCDR3(图7B和7D)各残基替换为丙氨酸的抗体突变体的抗原结合活性的分析，以确定AbS0抗体与preS1抗原的结合位点(互补位)；

图8显示了通过间接ELISA确定AbS0抗体HCDR1的Ala33(图8A至8C)和HCDR2的Ser50(图8D)被其他残基取代的抗体突变体的抗原结合活性的分析结果，以确定AbS0抗体与preS1抗原的结合位点(互补位)；

图9显示了间接ELISA检测的AbS1和AbS0抗体对基因型A的GST-preS1(1-56位氨基酸)-链霉素蛋白的抗原结合活性分析结果，该基因型A具有保守的(NPLGFFP；WT)受体结合基序或另一个序列的受体结合基序(NPLGFLP；preS1-L25)；和

图10显示了通过定量ELISA(图10A)和间接ELISA(图10B)分析AbS1抗体与基因型E和F的GST-preS1(1-56位氨基酸)-链霉素蛋白的抗原结合活性的结果。

发明详述

下文将更详细地描述此申请。同时，本文公开的各描述和各实施例也可以应用于其它描述和实施例。也就是说，本申请中公开的各种元素的所有组合都属于本申请的范围。此外，本申请的范围不受以下具体描述的限制。此外，本说明书还引用了许多论文和专利文件，并注明了引文。引用的论文和专利文件公开的内容全文并入本文，以更清楚地解释本发明的内容和本发明所属技术领域的水平。

此外，本领域技术人员将识别或能够使用不超过常规实验来确定与本申请中描述的本发明的特定方面的许多等价物。此外，这些等价物旨在包括在本发明中。

在本说明书中，使用天然存在的氨基酸惯用的单字母和三字母代码。此外，本文缩写的氨基酸根据IUPAC-IUB命名法进行描述。

为实现本发明的目的，本发明的一个方面提供了一种与乙型肝炎病毒preS1抗原特异性结合的新型抗体。

在本发明中，术语“抗体”是指作为特异性识别抗原的受体的蛋白质分子，包括与特定抗原具有免疫反应性的免疫球蛋白分子，包括多克隆抗体、单克隆抗体、全抗体和抗体片段。

该术语还包括嵌合抗体、人源化抗体、人抗体和二价或双特异性分子(例如双特异性抗体)、双价抗体、三价抗体和四价抗体。该术语还包括具有与FcRn结合功能的单链抗体、Scap、抗体恒定区衍生物和基于蛋白质骨架的人工抗体。全抗体具有两条全长轻链和两条全长重链的结构，每条轻链通过二硫键与重链相连。全抗体包括IgA、IgD、IgE、IgM和IgG，IgG包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型。抗体片段是指具有抗原结合功能的片段，包括Fd、Fab、Fab′、F(ab′)₂和Fv。所述Fd是指Fab片段中包含的重链部分。所述Fab的结构包括轻链和重链的可变区、轻链的恒定区和重链的第一恒定区(CH1结构域)，并具有一个抗原结合位点。Fab′与Fab的不同之处在于，它在重链CH1结构域的C末端有包含一个或多个半胱氨酸残基的铰链区。F(ab′)₂抗体是Fab′铰链区中的半胱氨酸残基形成二硫键而产生的。Fv(可变片段)是指仅包含一个重链可变区和一个轻链可变区的最小抗体片段。在双二硫键Fv(dsFv)中，重链可变位点和轻链可变位点通过二硫键连接。在单链Fv(scFv)中，重链的可变区和轻链的可变区通常通过肽接头通过共价键连接。这些抗体片段可以通过蛋白水解酶获得(例如，Fab可以通过用木瓜蛋白酶限制性酶切整个抗体获得，F(ab′)₂片段可以通过胃蛋白酶消化获得)，并且可以通过基因重组技术具体构建。

本发明的抗体可以是单克隆抗体。

在本发明中，术语“单克隆抗体”是指从基本相同的抗体群中获得的单分子成分的抗体分子，并且所述单克隆抗体对特定表位表现出单结合特异性和亲和力。

通常，免疫球蛋白具有重链和轻链，每个重链和每个轻链都包含一个恒定区和一个可变区(这些位点也被称为结构域)。轻链和重链的可变区域包括三个称为互补决定区(以下简称“CDR”)的高变区和四个骨架区。CDR的主要功能是与抗原的表位结合。典型地，每条链的CDR通常从N端开始依次称为CDR1、CDR2和CDR3，并且由特定CDR所在的链标识。

本发明的抗体可以是人抗体。

在本发明中，术语“人抗体”是指来源于人免疫球蛋白的分子，并且意味着包括互补决定区和骨架区在内的构成抗体的所有氨基酸序列均由人免疫球蛋白的氨基酸序列组成。人抗体通常用于治疗人类疾病，并且可能至少具有三个潜在优势。首先，人抗体能更好地与人体免疫系统相互作用，并更有效地破坏靶细胞，例如，通过补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)途径。其次，人抗体的优点是人体免疫系统不会将其识别为外来的。第三，人抗体的优点是，即使药物的给药量较小且频率较低，其在人体循环系统中的半衰期与天然存在的抗体的半衰期相似。

当如上所述的本发明的抗体含有恒定区时，所述抗体可以含有源自IgG、IgA、IgD、IgE或IgM的恒定区，或者它们的组合或杂交。

在本发明中，术语“组合”是指编码同来源的单链免疫球蛋白恒定区的多肽在形成二聚体或多聚体时与不同来源的单链多肽形成键。例如，二聚体或多聚体可以由两个或多个选自下组的恒定区形成：IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的恒定区。

在本发明中，术语“杂交”是指对应于两个或多个不同来源的免疫球蛋白重链恒定区的序列存在于单链免疫球蛋白重链恒定区内，例如，可以是由选自下组的1至4个结构域组成的杂交结构域：IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的CH1、CH2、CH3、以及CH4。

在本发明中，术语“乙型肝炎病毒”与HBV可互换使用，指在感染后由于免疫反应而可引起乙型肝炎的病毒。

在本发明中，术语“preS1抗原”是指由HBV DNA的S、C、X和P四个基因之一的S基因编码的蛋白质。具体地，S基因是编码表面抗原的基因，前面有一个Pre-S区，Pre-S分为PreS1区和PreS2区。它们编码表面蛋白、S(小)蛋白、M(中)蛋白和L(大)蛋白。所述S蛋白由S基因编码，M蛋白由preS2和S蛋白组成，L蛋白由preS1、preS2和S蛋白组成并且主要存在于传染性病毒颗粒(病毒粒子)中。因此，preS1构成病毒的表面蛋白，并主要存在于传染性病毒粒子中。

本发明提供的抗体可以与HBV的不同基因型结合，并且具体地可以与所有基因型A、B、C、D、E和F结合。在一个实施方案中，本发明提供的抗体可以与preS1的基因型A、B、C、D、E和F共同的受体结合基序序列结合，但不限于此。

在本发明中，术语“与乙型肝炎病毒preS1抗原结合的抗体”是指与HBV表面抗原preS1结合并能表现出中和活性和/或HBV感染抑制活性的抗体。

在一个实施方案中，本发明提供的抗体可以与preS1抗原特定位点的氨基酸结合，所述位点可以是与SEQ ID NO:19的位点22、23和25相对应的位点。

SEQ ID NO:19只是用于说明本发明抗体在任何preS1抗原中的结合位点的参考序列，本发明的preS1抗原不限于SEQ ID NO:19。在任何preS1抗原蛋白中，对应于SEQ ID NO:19的位点22、23和25的位点可以通过序列比对来确认。对于所述序列比对，可以使用Needleman-Wunsch算法、EMBOSS包的Needle程序、多序列比对等，但不局限于此。

preS1抗原的氨基酸序列可以从已知的数据库中获得，可以包括例如SEQ ID NO:17或18的序列。氨基酸位点22、23和25可以是SEQ ID NO:17或18的氨基酸序列中分别由位点3、4和6表示的氨基酸，但不限于此。

基于SEQ ID NO:19的氨基酸位点22、23和25是本发明抗体结合的位点，本发明抗体识别的preS1抗原的“表位”可以表示为对应于SEQ ID NO:19的位点22、23和25的位点。同时，对应于SEQ ID NO:19的位点22、23和25的位点可能包含在preS1抗原与肝细胞受体结合的位点中。因此，本发明的抗体可以抑制preS1抗原与肝细胞受体的结合。

在根据上述任一实施方案所述的实施方案中，抗体可以结合对应于SEQ ID NO:19的位点22的亮氨酸(Leu22)、对应于位点23的甘氨酸(Gly23)和对应于位点25的苯丙氨酸(Phe25)或亮氨酸(Leu25)。

在根据上述任一实施方案所述的实施方案中，所述抗体可以是具有SEQ ID NO:5的LCDR3序列的第8位酪氨酸和SEQ ID NO:9的HCDR3序列的第6位亮氨酸作为互补位的抗体。

在根据上述任一实施方案所述的实施方案中，所述抗体可以是具有SEQ ID NO:8的HCDR2序列的氨基酸1作为互补位的抗体。SEQ ID NO:8的氨基酸1可以是丙氨酸或亮氨酸。

在本发明中，术语“互补位”是指抗体或抗体片段上与抗原特异性结合的区域，即抗体或抗体片段与抗原物理接触的区域。

在根据上述任一实施方案所述的实施方案中，所述抗体可以是与preS1特异性结合的抗体，其包含轻链可变区，包括SEQ ID NO:3的轻链CDR1(LCDR1)、SEQ ID NO:4的轻链CDR2(LCDR2)和SEQ ID NO:5的轻链CDR3(LCDR3)；以及重链可变区，包括SEQ ID NO:7的重链CDR1(HCDR1)、SEQ ID NO:8的重链CDR2(HCDR2)和SEQ ID NO:9的重链CDR3(HCDR3)。

在根据上述任一实施方案所述的实施方案中，该抗体可以是与preS1特异性结合的抗体，其包含轻链可变区，包括SEQ ID NO:3的轻链CDR1(LCDR1)、SEQ ID NO:4的轻链CDR2(LCDR2)和SEQ ID NO:6的轻链CDR3(LCDR3)；以及重链可变区，包括SEQ ID NO:10的重链CDR1(HCDR1)、SEQ ID NO:11或12的重链CDR2(HCDR2)和SEQ ID NO:13的重链CDR3(HCDR3)。

在根据上述任一实施方案所述的实施方案中，所述抗体的轻链可变区可以由SEQID NO:1表示的氨基酸序列组成。所述抗体的轻链可变区可以特异性地由SEQ ID NO:14表示的氨基酸序列组成，但不限于此。

在根据上述任一实施方案所述的实施方案中，所述抗体的重链可变区可以由SEQID NO:2表示的氨基酸序列组成。所述抗体的重链可变区可以特异性地由SEQ ID NO:15或16表示的氨基酸序列组成，但不限于此。

在根据上述任一实施方案的实施方案中，抗体可以包含由SEQ ID NO:1所示的轻链可变区和由SEQ ID NO:2所示的重链可变区，但不限于此。所述抗体可以特异性地包含以SEQ ID NO:14所示的轻链可变区；以及SEQ ID NO:15或16所示的重链可变区，但不限于此。

在本发明的一个实施方案中，特异性结合preS1区的抗体被命名为AbS0，其包含SEQ ID NO:14的轻链可变区和SEQ ID NO:15的重链可变区，并且已证明AbS0对所有HBV基因型A、B、C和D表现出优异的结合能力。

已经证明，SEQ ID NO:6所示的LCDR3序列的第8位酪氨酸、SEQ ID NO:13所示的HCDR3序列的第6位亮氨酸和SEQ ID NO:11所示的HCDR2序列的第1位丝氨酸是AbS0抗体的互补位。通过用另一种氨基酸(丙氨酸)取代AbS0抗体中HCDR2的第1位丝氨酸，已经证明具有SEQ ID NO:12所示的HCDR2序列的抗体在结合能力上优于AbS0，并且具有SEQ ID NO:12所示的HCDR2序列的抗体被命名为AbS1抗体。

与现有抗体相比，这种与本发明的preS1结合的人抗体具有更高的亲和力和更低的免疫原性，并且可以表现出对HBV的优异的中和和抑制感染活性能力。因此，本发明的抗体可用于任何识别preS1抗原、中和HBV和抑制HBV感染能够被有效利用的应用。

本发明的另一方面提供一种生产抗体的方法。

本发明的抗体可以很容易地使用已知的抗体生产技术进行生产。例如，产生单克隆抗体的方法可以通过使用从免疫动物获得的B淋巴细胞(Koeher和Milstein，1976，Nature，256:495)产生杂交瘤来进行，通过使用噬菌体展示技术等，但不限于此。本发明的抗体可以很容易地使用其它已知的抗体生产技术进行生产。

利用噬菌体展示技术产生抗体库是一种直接从B淋巴细胞中获取抗体基因的方法，无需构建杂交瘤，而在噬菌体表面表达抗体。通过使用噬菌体展示技术，可以克服通过B细胞无限增殖化产生单克隆抗体相关的一些现有困难。一般来说，噬菌体展示技术可以包括以下步骤：1)将随机序列的寡核苷酸插入到与噬菌体的外壳蛋白pIII的N端相对应的基因位点中；2)表达一部分天然外壳蛋白与由随机序列的寡核苷酸编码的多肽的融合蛋白；3)施用能够与寡核苷酸编码的多肽结合的材料；4)使用低pH值或结合竞争性分子洗脱与材料结合的抗体-噬菌体颗粒；5)在宿主细胞内扩增通过淘选洗脱的噬菌体；6)重复该方法以获得所需的量；7)从通过淘选的噬菌体克隆的DNA序列中确定活性抗体的序列。

本发明的单克隆抗体的制备方法可采用噬菌体展示技术进行。本领域技术人员可以通过参考已知的噬菌体展示技术进行本发明方法的各个步骤，例如在论文中已知的方法，例如Barbas等人(METHODS：A Companion to Methods in Enzymology 2：119，1991和J.Virol.2001Jul；75(14)：6692-9)和Winter等人(Ann.Rev.Immunol.12：433，1994)。可用于构建抗体库的噬菌体包括例如丝状噬菌体，例如fd、M13、f1、If1、Ike、Zj/Z、Ff、Xf、Pf1或Pf3噬菌体，但不限于此。可用于在丝状噬菌体表面表达异源基因的载体包括，例如噬菌体载体，如fUSE5、fAFF1、fd-CAT1或fdtetDOG，或噬菌粒载体，如pHEN1、pComb3、pComb8或pSEX，但不限于此。可利用辅助噬菌体提供成功再感染重组噬菌体扩增所需的野生型外壳蛋白，包括例如M13K07或VSCM13，但不限于此。

编码本发明的单克隆抗体或噬菌体展示克隆的多核苷酸可以很容易地使用常规程序进行分离和测序。例如，可以使用设计用于特异性扩增噬菌体模板DNA中的重链和轻链编码区的寡核苷酸引物。一旦分离出多核苷酸，就可以将其置于表达载体中，然后将表达载体引入适当的宿主细胞中，并从转化的宿主细胞(即转化体)中产生所需的单克隆抗体。因此，本发明的人单克隆抗体的制备方法可以是包括在含有编码人单克隆抗体的多核苷酸的表达载体中扩增编码人单克隆抗体的多核苷酸的人单克隆抗体的制备方法，但不限于此。

本发明的又一方面提供了编码抗体的多核苷酸、含有多核苷酸的表达载体以及引入所述载体的宿主细胞。

所述抗体如上所述。

本发明提供的含有编码抗体的多核苷酸的表达载体可以是能够在真核或原核细胞中复制和/或表达多核苷酸的载体，细胞包括哺乳动物细胞(例如，人、猴子、兔、大鼠、仓鼠和小鼠细胞)、植物细胞、酵母细胞、昆虫细胞或细菌细胞(例如大肠杆菌)，但并不特别局限于此。具体地，表达载体可以是可操作地连接到适当启动子的载体，以便于核苷酸在宿主细胞中表达，并包含至少一个选择标记。例如，所述表达载体可以是将多核苷酸引入噬菌体、质粒、粘粒、微型染色体、病毒或逆转录病毒载体的形式。

含有编码抗体的多核苷酸的表达载体可以是含有编码抗体重链的多核苷酸或编码抗体轻链的多核苷酸的表达载体，或者同时含有编码抗体重链的多核苷酸和编码抗体轻链的多核苷酸的表达载体。

将本发明提供的表达载体引入的宿主细胞可以是细菌，例如大肠杆菌、链霉菌或鼠伤寒沙门氏菌；酵母细胞；可以是真菌细胞，如毕赤酵母；可以是昆虫细胞，如果蝇和草地贪夜蛾Sf9细胞；可以是动物细胞，如CHO(中国仓鼠卵巢细胞)、SP2/0(小鼠骨髓瘤)、人淋巴母细胞、COS、NSO(小鼠骨髓瘤)、Bowes黑色素瘤细胞、HT-1080、BHK(小仓鼠肾细胞)、HEK(人胚胎肾细胞)和PERC.6(人视网膜细胞)；或植物细胞，它们通过引入表达载体进行转化，但并不特别限于此。

在本发明中，术语“引入”是指将含有编码抗体的多核苷酸的载体递送至宿主细胞的方法。所述引入可以通过本领域已知的各种方法进行，例如磷酸钙-DNA共沉淀法、DEAE-葡聚糖介导的转染法、凝聚胺介导的转染法、电击法、显微注射法、脂质体融合法以及脂质体和原生质体融合法。转导是指使用病毒颗粒通过感染将靶标递送至细胞中。此外，还可以通过基因枪轰击等方式将载体引入宿主细胞。在本发明中，引入可以与转化互换使用。

本发明的又一方面提供了一种用于预防或治疗HBV感染的药物组合物，其含有所述抗体。具体地，所述组合物可以用于预防或治疗乙型肝炎。

在本发明中，术语“乙型肝炎”是指当肝脏感染HBV时由于免疫反应而发生肝脏炎症的疾病。本发明的抗体对HBV表现出优异的中和和抑制感染能力，因此可用于预防或治疗乙型肝炎。

在本发明中，术语“预防”可以指通过施用组合物来抑制或延缓HBV感染发作的任何作用，而术语“治疗”可以指通过施用组合物来改善或有益地改变由HBV感染引起的症状的任何作用。

所述药物组合物还可以含有药学上可接受的载体。

在本发明中，术语“药学上可接受的载体”是指不刺激生物体且不抑制所施用化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。组合物中可接受的药物载体配制成液体溶液、生理盐水、无菌水、林格氏液、缓冲盐水溶液、白蛋白注射液、葡萄糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油和乙醇，它们是无菌的和生物相容性的，并且这些组分中的一种或多种可用于混合物。如有必要，可以添加其他常见的添加剂，如抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂。此外，还可以添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂来制备可注射制剂，如水溶液、悬浮液和乳液、药丸、胶囊、颗粒剂或片剂。

所述药物组合物可以是各种口服或肠胃外制剂。当药物组合物配制成制剂时，使用稀释剂或赋形剂如常用的填料、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂和表面活性剂来制备。口服用固体制剂包括片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂等，这些固体制剂是通过将一种或多种化合物与至少一种或多种赋形剂(如淀粉、碳酸钙、蔗糖或乳糖、明胶)混合而制备的。除了简单的赋形剂外，还使用硬脂酸镁和滑石粉等润滑剂。口服给药的液体制剂包括混悬液、口服溶液、乳剂和糖浆。除了常用的简单稀释剂如水和液体石蜡外，还可能含有各种赋形剂，如润湿剂、甜味剂、香料和防腐剂。肠胃外给药的制剂包括灭菌水溶液，非水溶液，悬浮液，乳剂，冻干制剂和栓剂。作为非水溶剂和悬浮液，可以使用丙二醇、聚乙二醇、橄榄油等植物油和油酸乙酯等注射酯。作为栓剂的基料，可以使用半合成脂肪酸酯(Witepsol)，聚乙二醇(Macrogol)，吐温61，可可油，月桂油，甘油明胶等。

所述药物组合物可以是选自下组的剂型：片剂、丸剂、粉末剂、颗粒剂、胶囊剂、悬浮液、口服溶液、乳剂、糖浆、灭菌水溶液、非水溶剂、悬浮液、乳剂、冻干制剂和栓剂。

本发明的组合物以药学有效量给药。

在本发明中，术语“药学有效量”是指足以以适用于药物治疗的合理获益/风险比治疗疾病的量，有效剂量水平可以基于包括受试者的类型和严重程度、年龄、性别、癌症类型、药物活性、对药物的敏感性、给药时间、给药途径和排泄率、治疗持续时间、同时使用的药物等医学领域公知的因素确定。本发明的组合物可以作为单独的治疗剂或与其它治疗剂组合给药，并且可以与常规治疗剂连续或同时给药。本发明的组合物可以单独或多次给药。考虑到所有因素，重要的是以最小的量实现最大效果而没有副作用的量施用组合物，并且该量可以很容易地由本领域技术人员确定。

本发明的又一方面提供了一种使用所述抗体预防或治疗HBV感染的方法。

具体地，所述方法可以包括对疑似感染HBV的受试者施用所述抗体。

该方法可以是预防或治疗HBV感染的方法，其包括向将感染或感染HBV的受试者施用含有所述抗体和药学上可接受的载体的药物组合物。所述药学上可接受的载体如上所述。

所述受试者包括哺乳动物，包括牛、猪、羊、鸡、狗、人等、鸟类等，并且包括施用本发明的组合物进行治疗的HBV感染的受试者，而不受限制。此时，所述抗体可以以药学有效量单独或多次给药。此时，所述抗体可以以液体、粉末、气雾剂、胶囊、肠溶片或胶囊或栓剂的形式给药。给药途径包括腹腔给药、静脉给药、肌内给药、皮下给药、内皮给药、口服给药、局部给药、鼻内给药、肺内给药、直肠内给药等，但不限于此。

所述方法还可用于预防或治疗乙型肝炎，并且可以专门用于治疗选自HBV基因型A、B、C、D、E和F中的任意一种或多种的HBV感染，但不限于此。

本发明的又一方面是所述抗体用于制造用于预防或治疗HBV感染的药物的用途。所述药物还可用于预防或治疗乙型肝炎，并可用于治疗选自HBV基因型A、B、C、D、E和F中的任意一种或多种的HBV感染，但不限于此。抗体和HBV感染的预防或治疗如前所述。

本发明的又一方面提供了一种为HBV感染诊断提供信息的方法，其包括通过使用所述抗体的抗原-抗体反应检测从疑似感染HBV的受试者中分离的生物样品中存在的preS1。

所述方法可以是诊断HBV感染的方法。此外，所述方法还可用于乙型肝炎的诊断。

所述抗体和HBV如前所述。

为HBV诊断提供信息的方法可以通过将本发明的preS1特异性抗体与从疑似感染HBV的受试者中分离的生物样品反应并检测抗原-抗体复合物的形成来检测preS1蛋白，通过这种方法可以提供用于诊断HBV感染的信息。

具体而言，所述方法可以包括：(a)用所述抗体处理从疑似感染HBV的受试者身上分离的生物样本，并通过抗原-抗体反应检测preS1；以及(b)比较(a)中检出的preS1水平与对照组的水平，在preS1水平高于对照组时确定受试者为HBV感染患者。

在本发明中，术语“生物样品”包括组织、细胞、全血、血清、血浆、组织尸检样品(脑、皮肤、淋巴结、脊髓等)、细胞培养上清液、破裂的真核细胞和细菌表达系统，但不限于此。这些生物样品可以在有或没有操作的情况下与本发明的抗体反应，以检查是否存在preS1或HBV感染。

在本发明中，术语“抗原-抗体复合物”是指样品中的preS1抗原与根据本发明的识别抗原的抗体的组合，并且该抗原-抗体复合物的形成可以通过任何方法通过选自下组的任何方法进行检测：比色法、电化学法、荧光法、发光法、粒子计数法、视觉评估法、闪烁计数法。但是，检测方法不局限于这些，并且可以用于多种应用。

在本发明中，各种标记可用于检测抗原-抗体复合物。作为具体的例子，标记物可以选自下组：酶、荧光物质、配体、发光物质、微粒和放射性同位素，但不限于此。

用作检测标志物的酶包括乙酰胆碱酯酶、碱性磷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶、β-拉达麦酶(latamase)等，荧光物质包括荧光素、Eu³⁺、Eu³⁺螯合物或穴合物，配体包括生物素衍生物，发光物质包括吖啶酯和异鲁米诺衍生物，微粒包括胶体金和有色乳胶，放射性同位素包括⁵⁷Co,³H,¹²⁵I,¹²⁵I-Bonton Hunter试剂等，但检测标记并不局限于此。

具体而言，所述检测方法可以是使用酶联免疫吸附测定(ELISA)来检测抗原-抗体复合物的方法。酶联免疫吸附测定(ELISA)包括各种ELISA方法，例如使用标记抗体识别附着在固体载体上的抗原的直接ELISA，使用标记二抗识别附着在固体载体上的抗原的抗体复合物中的捕获抗体的间接ELISA，使用另一种标记抗体识别附着在固体载体上的抗原的抗体复合物中的抗原的直接夹心ELISA，以及间接夹心ELISA，其使用标记的二抗和另一抗体，该二抗在与另一抗体反应后识别该抗体，所述另一抗体识别抗体复合物中的抗原和附着在固体载体上的抗原。

所述抗体可能具有检测标记，抗原-抗体复合物可以通过使用另一种可以捕获这些单克隆抗体的抗体来确认，并且当抗体没有检测标记时，所述另一种抗体带上检测标记。

本发明的又一方面提供了一种用于检测HBV的组合物，含有本发明提供的抗体。抗体如上所述。

所述HBV检测可以是检测HBV的preS1。

在一个实施方案中，所述组合物还可以包含包在常规检测组合物中的工具、装置或试剂，用于通过抗体确认来自生物样品中的抗原的存在，例如用于收集待测样品或应用检测试剂的工具和用于确认抗原-抗体结合的试剂或装置。

本发明的又一方面提供一种用于检测HBV的试剂盒，该试剂盒含有所述抗体。乙型肝炎病毒检测如上所述。

在一个实施方案中，所述试剂盒也可以是肝炎诊断试剂盒的形式。组成、乙型肝炎和诊断如前所述。

本发明的又一方面是所述抗体用于生产用于检测HBV的组合物的用途。抗体和乙型肝炎病毒如上所述。

[实施例]

下面将通过实施例和实验例对本发明进行更详细的描述。然而，这些实施例和实验例仅用于说明目的，本发明的范围并不局限于这些实施例和实验例。

实施例1：PreS1抗原的构建

使用生物技术快报(Biotechnology letters.)17：871-876中公开的方法(KimHS，Hong HJ.1995.从大肠杆菌中进行乙型肝炎病毒preS1蛋白的高效表达、纯化和表征)和类似的方法，构建了HBV基因型C的GST-preS1(1-119)、GST-preS1(1-56)和preS1(1-119)。含有NTCP结合基序(20-NPLGFFP-26)的生物素化合成preS1肽(生物素-SGSGNPLGFFFPDHQLDP，Bio-preS1-L肽)由AnyGen公司(韩国)生产以供使用。以这种方式构建的重组preS1抗原和Bio-preS1-L肽被用作抗体库淘选的抗原。为了分析发现的抗体是否与不同HBV基因型的preS1抗原结合，在大肠杆菌中表达并纯化HBV基因型A至F的GST-preS1(1-56)-链霉素标签。基因型A至F的preS1(1-56)序列如图1所示。

实施例2：从噬菌体展示人合成Fab文库中筛选对preS1的肝细胞受体结合基序具有特异性的Fab

为了分离对HBV preS1的肝细胞受体结合基序具有特异性的Fab，对人合成Fab噬菌体展示文库进行了针对四种preS1抗原的淘选。

具体而言，根据标准淘选程序，将人合成Fab文库(多样性1.35×10⁹)分别针对实施例1中的四种preS1抗原GST-preS1(1-119)、GST-preS1(1-56)、Bio-preS1-L肽和preS1(1-119)进行第1轮、第2轮、第3轮和第4轮淘选。将每个preS1抗原包被在免疫管(对于Bio-preS1-L肽使用链霉亲和素包被板)上，并在4℃下储存过夜。将抗体库噬菌体与抗原一起孵育，并用0.1％PBST(0.1％吐温20的PBS)洗掉未结合的噬菌体。结合的噬菌体在37℃下使用10μg/mL胰蛋白酶溶液洗脱30分钟。用洗脱的噬菌体感染大肠杆菌TG1细胞，在37℃下生长1小时，并在37℃下孵育过夜。用扩增的噬菌体进行下一轮淘选，每轮洗涤程度逐渐加强。对于每一轮，通过稀释和CFU计算噬菌体数量的输入和输出(图2A)。

为了检查针对preS1抗原的抗体克隆是否随着淘选的进行而扩增，对每轮的输出噬菌体进行间接ELISA，结果证明，在第三轮淘洗后，与重组preS1抗原和Bio-preS1-L肽结合的Fab克隆被扩增(图2B)。

因此，为了筛选对preS1抗原活性最高的Fab克隆，在第四轮淘洗后随机选择188个噬菌体Fab克隆，并使用HBV基因型(A至D)的preS1抗原共有的Bio-preS1-L肽进行间接ELISA。

具体而言，在进行第四轮淘选后，共随机选择188个菌落，培养，然后用辅助噬菌体感染，以获得单克隆Fab噬菌体。之后对这些噬菌体进行间接ELISA以确认阳性克隆。在间接ELISA中，使用100ng BSA或Bio-PreS1-L肽作为固定化抗原，使用辣根过氧化物酶(HRP)偶联的抗M13(1：5000v/v，GE Healthcare)作为二抗。在定量ELISA中，抗M13抗体(100ng/孔，GE Healthcare)和抗人kappa HRP(1：2000v/v，Novex)分别用作固定化抗体和二抗。

筛选结果证明，AbS0 Fab噬菌体对Bio-PreS1-L肽表现出最高的抗原结合活性，并且对实施例1中的preS1(1-119)抗原也表现出高结合活性(图2C)。

实施例3：将AbS0 Fab转化为人IgG1并分析抗原结合活性

将AbS0 Fab转化为人IgG1并在HEK293F细胞中表达，培养上清液进行蛋白纯化。

3-1 AbS0 Fab向人IgG1的转化

为了将选定的Fab转化为IgG1形式，通过PCR扩增重链可变区(VH)和kappa轻链可变区(VK)序列，然后使用重组PCR分别与IgG重链和轻链前导序列结合。将得到的VH和VK序列亚克隆到含有人Cγ1和Cκ基因的pdCMV-dhfrC表达质粒的EcoRI-ApaI和HindIII-BsiWI位点中，以构建pdCMV-dhfrC-AbS0表达质粒。

3-2抗体纯化

使用聚乙烯亚胺(PEI)将3-1中构建的表达质粒以1:4(30μg：120μg)的比例引入30mL HEK293F细胞中。将转化的细胞培养7天，使用蛋白A对培养上清液进行亲和层析，然后使用紫外-可见分光光度计测定抗体的浓度。通过SDS-PAGE验证纯化抗体的纯度(图3A)。

3-3结合活性分析

为了分析纯化的AbS0 mAb与不同HBV基因型的preS1抗原的抗原结合活性，每个孔都包被有基因型A至D的GST-preS1(1-56)-链霉素(30nM/孔)(图1)，然后与连续稀释的AbS0抗体一起孵育。使用抗人IgG Fc-HRP(1:10,000v/v，Jackson)作为二抗检测结合的AbS0抗体。

结果证明，纯化的AbS0抗体与基因型A至D的所有重组preS1结合良好(图3B)。由此证实，AbS0抗体与基因型A至D的preS1抗原具有结合活性。

3-4AbS0抗原结合亲和力分析

使用Octet RED384(ForteBio)通过生物层干涉测量法测定抗体的亲和力。具体而言，通过在0.1％PBA(0.1％BSA在PBS中)中以1000rpm搅拌96孔微量滴定板(GreinerBio-One)20分钟来激活抗人Fc包被的生物传感器尖端(AHC，ForteBio)。加入AbS0抗体(1μg/mL，200μL)并捕获10min，并用0.1％PBA洗涤2分钟。HBV基因型A的GST-preS1(1-56)-链霉素抗原用0.1％PBA进行2倍连续稀释(25nM、12.5nM、6.25nM、3.125nM和1.5625nM)，并分别与尖端结合的抗体进行5分钟结合步骤和10分钟解离步骤。对于基线漂移，通过减去仅暴露于不含抗体的运行缓冲液的对照传感器(抗体捕获的AHC传感器)的值来校正测量值。工作温度保持在30℃。使用ForteBio数据分析软件7.1版1:1交互模型(拟合全局，Rmax无传感器链接)分析数据。

结果证明，AbS0抗体的亲和力为0.5nM。

[表1]

使用Octet RED384(ForteBio)通过生物层干涉测量法测量的抗体亲和力

抗体	K_D	K_on(1/Ms)	K_dis(1/s)	全R²
					AbS0	0.50nM	3.92×10⁵	1.94×10^-4	0.9969

*K_on，结合率；K_dis，解离率；全R²，曲线拟合优度估计

3-5评估AbS0抗体的抗原结合特异性

为了排除AbS0抗体与preS1抗原非特异性结合的可能性，使用表达L1CAM但不表达preS1的人卵巢癌细胞系SKOV3(Min，J.-K.等人，临床癌症研究.16(14)；3571-80，2010)进行流式细胞术。

具体而言，将1μg(在100μL 0.1％PBA中)的AbS0或作为阳性对照的Ab417(L1CAM特异性人抗体：ChoS.等人，MABS8(2)，414-425,2016)加入培养的SKOV3细胞(2×10⁵)，在4℃下进行反应1小时，然后用0.1％PBA洗涤两次。向这些细胞中加入抗人IgG Fc-荧光素异硫氰酸酯(FITC)偶联物(1:2000v/v，BD Pharmingen)，在4℃下反应1小时，然后加入碘化丙啶(1:200v/v，Sigma)。最后，使用FACSCalibur(Becton Dickinson)对细胞进行分析。实验结果，Ab417与SKOV3结合，但AbS0抗体未与SKOV3细胞结合(FIG.3D)。

由此已经证明AbS0抗体与preS1抗原特异性结合。

实施例4：AbS0抗体的HBV中和活性评价

4-1免疫沉淀分析

为了检测AbS0抗体是否与HBV病毒粒子结合，使用HBV基因型D进行免疫沉淀分析。

现有的具有HBV中和功效的抗preS1人源化抗体HzKR127-3.2作为HBV基因型D的阳性对照，小鼠IgG作为阴性对照。免疫沉淀后，提取病毒DNA，采用Southern印迹杂交法测定。

具体而言，为了产生HBV基因型D的HBV颗粒，将HepG2细胞以密度6×10⁵接种在6孔板中，并在37℃下培养。第二天，用pHBV1.2(HBV基因型D)转染HepG2细胞，孵育4天。收获培养上清液，与1μg/mLAbS0、HzKR127-3.2(阳性对照)或小鼠IgG(阴性对照)在4℃下孵育过夜，然后用20μL蛋白A珠在4℃下进行免疫沉淀6小时。将免疫沉淀的复合物用PBS洗涤3次，然后检测病毒DNA，如下所示。具体地，为了去除转染的质粒DNA，在37℃下用DNaseI(Sigma)和绿豆核酸酶(Takara，日本滋贺县草津市)处理免疫复合物20分钟。接下来，为了获得核心相关的HBV DNA，通过在0.5％SDS存在下在37℃加入蛋白酶K(20mg/mL，罗氏)2至3小时来消化沉淀的免疫复合物，然后使用苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)(Sigma)提取HBV DNA，并使用乙醇和3M乙酸钠纯化。在1％琼脂糖凝胶上分离纯化的DNA，并通过Southern印迹杂交检测HBV DNA。

结果，在AbS0或HzKR127-3.2抗体沉淀物中检测到RC(松弛环状)和DSL(双链线性)形式的HBV DNA，而在小鼠IgG免疫沉淀中未检测到HBV DNA(图4A)。

由此已经证明AbS0抗体可以与HBV基因型D的病毒粒子结合。

4-2AbS0的HBV中和活性评价

为了测试AbS0是否能中和HBV感染，将基因型D的HBV颗粒与不同浓度的抗体预孵育，并加入到过表达细胞受体NTCP的HepG2-NTCP细胞中。

具体而言，使用过表达NTCP的HepG2(称为HepG2-NTCP)细胞系分析AbS0的HBV中和活性。将HepG2-NTCP细胞以密度6×10⁵接种在的6孔板中，并在37℃下培养。第二天，在含有4％聚乙二醇(PEG)和2.5％DMSO的原代肝细胞维持培养基(PMM)中，用基因型D的HBV颗粒感染HepG2-NTCP细胞(每个细胞约2000个病毒基因组当量)。

对于中和试验，将HBV颗粒与稀释的AbS0抗体(10μg，1μg或0.1μg)或小鼠IgG(10μg)在室温下预孵育1小时，加入培养的HepG2-NTCP细胞中，培养细胞7天，同时每2小时更换一次含有2.5％DMSO的PMM培养基。从感染的HepG2-NTCP细胞中提取细胞内HBV DNA，并进行Southern印迹杂交。

结果证明，AbS0抗体以剂量依赖性方式表现出HBV中和活性，而小鼠IgG则没有(图4B)。

由此证明，AbS0具有中和HBV感染的能力。

上述结果表明，本发明的新型抗体AbS0可以结合并中和所有HBV基因型A-D，并表明该新型AbS0抗体可有效预防病毒基因型感染或治疗病毒感染引起的肝炎患者。此外，这表明也可以特异性地检测HBV基因型A至D的感染。

本发明新型抗体AbS0的轻链可变区如SEQ ID NO:14所示，重链可变区如SEQ IDNO:15所示。

实施例5：AbS0抗体精细表位的测定

为了解AbS0抗体HBV中和活性的机制，精准确定AbS0抗体在preS1中的结合位点(精细表位)，并分析该精细表位的氨基酸序列在HBV基因型中是否保守。

5-1PreS1(19-34)的丙氨酸扫描诱变

由于AbS0抗体是通过使用基因型C的preS1(20-32)肽对人抗体库进行淘选发现的，为了确定preS1(20-32)区域内的哪些残基与AbS0抗体结合，构建了基因型C的preS1(19-34)的每个残基被丙氨酸取代的突变体，分析AbS0抗体与各突变体的抗原结合活性。

具体而言，使用含有突变序列的引物，通过重组PCR方法合成preS1(19-34)中各个残基替换为丙氨酸的DNA，用BamHI和EcoRI(NEB)限制性内切酶消化，然后亚克隆到包含野生型preS1序列的pGST-preS1(1-56)-链霉素表达质粒的BamHI-EcoRI位点中，从而构建携带丙氨酸取代突变体而不是野生型preS1(1-56)的表达质粒。之后，为了表达每个突变体，将重组大肠杆菌DH5α在含有0.2mM IPTG的培养基中在18℃下培养19小时。通过超声处理破坏细胞后，使用谷胱甘肽珠(Genscript)通过亲和层析纯化GST-preS1(1-56)-链霉素蛋白，并通过12％SDS-PAGE分析纯化蛋白的纯度(图5)。

5-2.抗体对preS1丙氨酸取代突变体的抗原结合活性分析

通过间接ELISA分析AbS0抗体与每个丙氨酸取代突变体的抗原结合活性(图6)。

具体而言，每个孔都包被有突变的GST-preS1(1-56)-链霉素抗原(200ng)，然后与连续稀释的AbS0抗体一起孵育。使用抗人IgG Fc-HRP(1:10,000v/v，Thermo)作为二抗检测结合的AbS0抗体。

结果证实，L22A、G23A或F25A突变体完全丧失了抗体结合活性，而其他突变体表现出与野生型抗原相同的活性。该结果表明AbS0抗体直接与preS1抗原的Leu22、Gly23和Phe25结合。

实施例6：AbS0抗体表位结合位点(互补位)的测定和亲和力增加的突变体的鉴定

为了鉴定AbS0抗体中直接与抗原结合的氨基酸残基，对CDR残基进行丙氨酸扫描诱变和定点诱变，然后分析这些突变体的抗原结合活性。

6-1.AbS0抗体HCDR3和LCDR3的丙氨酸扫描诱变

为了构建将AbS0抗体的HCDR3(基于SEQ ID NO:15的V95、I96、Y97、S99和L100)和LCDR3(基于SEQ ID NO:14的S91、Y92、S93、S94和Y96)的每个残基替换为丙氨酸的突变体，突变的VH或VL基因使用含有突变残基的引物通过重组PCR方法合成(表2)。在HCDR3突变体的情况下，每个合成的VH基因都用EcoRI和ApaI限制性内切酶消化，然后亚克隆到含有AbS0抗体重链基因的表达载体(pCMV-dhfr-AbS0H)的EcoRI-ApaI位点。在LCDR3突变体的情况下，每个合成的VL基因都用HindIII和BsiWI限制性内切酶消化，然后亚克隆到含有AbS0抗体轻链基因的表达载体(pCMV-dhfr-AbS0k)的HindIII-BsiWI位点。构建了总共10个丙氨酸取代突变体的表达质粒，如下所示。

[表2]

L3-v1	S91A	H3-v1	V95A
				L3-v2	Y92A	H3-v2	I96A
L3-v3	S93A	H3-v3	Y97A
				L3-v4	S94A	H3-v4	S99A
L3-v5	Y96A	H3-v5	L100A

为了产生各突变抗体，将构建的表达质粒以1:4(30μg:120μg)的比例与聚乙烯亚胺(PEI)混合，然后引入HEK293F细胞中。将转化后的细胞培养7天表达突变抗体，然后得到培养上清液，通过间接ELISA分析其抗原结合活性。具体而言，每个孔都包被有HBV基因型C的重组GST-preS1(1-56)-链霉素蛋白(100ng)，然后加入连续稀释的AbS0抗体或AbS0突变体，并加入抗人IgG Fc-HRP(1:10,000v/v，Thermo)作为反应的二抗。

通过定量ELISA测定用于间接ELISA的AbS0抗体或AbS0突变体的浓度。每个孔都包被有抗人IgG kappa抗体(100ng，Thermo)，然后加入连续稀释的AbS0抗体或突变体，并加入抗人IgG Fc-HRP(1：10,000v/v，Thermo)作为反应的二抗。

结果，HCDR3突变体L100A和LCDR3突变体Y96A没有表现出抗原结合活性或抗原结合活性极低，但其他6个突变体(HCDR3的V95A和S99A；LCDR3的S91A、Y92A、S93A和S94A)表现出与野生型AbS0相同的抗原结合活性(图7)。CDR3突变体I96A和Y97A未表达，因此未进行分析。从这些结果中，已经证实AbS0的HCDR3的Leu100和LCDR3的Tyr96在抗原结合中至关重要。

6-2AbS0抗体HCDR1和HCDR2的定点诱变

一般来说，在抗体中，HCDR1中的氨基酸位点33和HCDR2中的位点50因抗体而异，因此已知参与抗原结合。在AbS0抗体的情况下，进行定点诱变以分析残基33和50是否参与抗原结合。(位点33和50是基于SEQ ID NO:15的位点。)

在AbS0抗体的情况下，由于HCDR1中的第33位是丙氨酸，因此用其他八个残基(S、P、V、T、G、D、L和N)取代丙氨酸，以研究该残基是否参与抗原结合，且HCDR2中50位的丝氨酸(Ser50)用其他六个残基取代(A、Y、E、F、V和P)。为了构建突变基因，使用简并引物进行重组PCR。合成的VH基因用EcoRI和ApaI限制性内切酶消化，然后亚克隆到pdCMV-dhfr-AbS0的EcoRI-ApaI位点，获得突变体的表达质粒。经测序证实，获得了上述14个突变体。将各表达质粒导入HEK293F细胞中，通过间接ELISA和定量ELISA分析培养7天后得到的培养上清液，如实施例6-1所述。

结果，对于HCDR1第33位，当丙氨酸被天冬酰胺(A33N，图8A)、亮氨酸(A33L，图8B)或天冬氨酸(A33D，图8C)取代时，突变体没有表现出任何抗原结合活性，甘氨酸取代的突变体(A33G，图8C)也表现出与野生型AbS0抗体相比显著降低的抗原结合活性。该结果表明Ala33参与抗原结合。另一方面，3个突变体A33S(图8A)、A33V和A33P(图8B)表现出与野生型抗体相似的抗原结合活性。

对于HCDR2的Ser50突变体，与AbS0抗体相比，S50A突变体的抗原结合活性略有增加，而S50Y突变体的抗原结合活性大大降低，S50F和S50E突变体的抗原结合活性完全丧失(图8D)。对于S50V和S50P突变体，未检测到表达，因此未分析抗原结合活性。结果表明，HCDR2中的50位对抗原结合很重要，并且Ala50比Ser50更适合抗原结合。

为了分析AbS0抗体HCDR2的Gln52a(基于SEQ ID NO:11的位点4)是否也参与抗原结合，构建了谷氨酰胺被其他四种氨基酸(Y、A、F和M)取代的突变体并在HEK293F细胞中瞬时表达。结果，突变体(Q52aA、A52aF和A52aM)表现出与AbS0抗体相同的抗原结合活性，并且未分析Q52aY突变体的抗原结合活性，因为未检测到其表达。这些结果表明，HCDR2的Gln52a不参与与preS1抗原的相互作用。

根据实施例5和6的结果，可以得出结论，在AbS0抗体中，HCDR1的Ala33、HCDR2的Ser50、HCDR3的Leu100和LCDR3的Tyr96直接与preS1的Leu22、Gly23和Phe25结合。此外，通过实施例6的实验，获得了与AbS0相比具有更好的抗原结合活性的突变体S50A，并将该突变体抗体命名为“AbS1”。

实施例7：AbS1抗体的抗原结合特性分析

7-1AbS1和AbS0与基因型A和C的preS1抗原结合活性比较

实施例6-2中，采用HBV基因型C的重组GST-preS1(1-56)-链霉素抗原分析AbS0抗体与突变体的抗原结合能力，对基因型A的重组GST-preS1(1-56)-链霉素抗原进行间接ELISA分析，分析AbS1抗体与其他基因型的preS1抗原的结合活性是否高于AbS0。结果证实，AbS1对基因型A的preS1表现出比AbS0更高的抗原结合活性(图9)。

7-2AbS1抗体与具有不同受体结合基序序列的preS1抗原的结合活性分析

由于AbS1抗体的表位(preS1的Leu22、Gly23和Phe25)位于HBV受体结合基序内，因此分析了HBV数据库(https://hbvdb.lyon.inserm.fr/HBVdb/)中注册的9639个(截至2021年4月30日)preS1基因受体结合基序(aa 20-26，基因型A)的序列，以估计AbS1抗体是否可以广泛结合地球上存在的HBV。结果，96.6％的preS1序列含有NPLGFFP序列作为受体结合基序，2.6％的preS1序列具有在25位包含亮氨酸(Leu25)而不是苯丙氨酸(Phe25)的NPLGFLP(表3)。

[表3]

HBV基因型A至H中具有NPLGFFP或NPLGFLP的受体结合基序的比例

*不同的序列

因此，为了分析AbS1抗体是否也与NPLGFLP结合，表达并纯化了具有NPLGFLP序列的基因型A的GST-preS1(1-56)-链霉素抗原，并进行了间接ELISA检测。结果证实，AbS1抗体与NPLGFLP结合良好，尽管结合活性略低于与NPLGFFP的结合活性(图9)。

从以上结果可以看出，AbS1抗体对基因型A型和C型preS1抗原的结合活性高于AbS0，预计两种抗体都能很好地与具有肝细胞受体结合基序NPLGFLP序列的HBV结合。

7-3AbS1抗体与E型、F型preS1抗原结合活性分析

通过上述实施例，证实了AbS1抗体可以与HBV基因型A至D型的preS1抗原和突变体结合。因此，为了检查AbS1抗体是否也能与基因型E和F的preS1抗原结合，使用基因型E和F的重组GST-preS1(1-56)-链霉素抗原(图1)进行定量ELISA(图10A)和间接ELISA(图10B)。此时，将实施例5中基因型C的F25A突变体preS1抗原作为阴性对照。

结果证实，AbS1与基因型E和F的preS1结合良好(图10)。

综上所述，上述结果表明，本发明的新型抗体AbS0和AbS1可以与所有HBV基因型A-F结合，并与preS1的肝细胞受体结合基序结合，因此具有HBV进入抑制剂的作用效果，不仅可以中和HBV，而且可以通过阻断HBV进入肝细胞来有效抑制HBV感染，并可用于预防和治疗HBV感染。

从上述描述中，本发明所涉领域的技术人员将理解，本发明可以在不改变其技术思想或基本特征的情况下以其他特定形式实现。因此，应该理解，实施方式不是限制性的，而是在各个方面进行说明性的。本发明的范围由所附权利要求书定义，而不是由其前面的描述定义，因此，所有落入权利要求书范围或该范围的等同形式的更改和修改都旨在包括于权利要求书内。

<110> 爱必泰生物有限公司

<120> 特异性结合乙型肝炎病毒preS1抗原肝细胞受体结合基序的人抗体及其用途

<130> OPA22048

<150> KR 10-2021-0077615

<151> 2021-06-15

<150> KR 10-2021-0093625

<151> 2021-07-16

<160> 19

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (24)..(34)

<223> LCDR1

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (50)..(56)

<223> LCDR2

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (89)..(97)

<223> LCDR3, X可为任意氨基酸

<400> 1

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ala Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Thr Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 2

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (31)..(35)

<223> HCDR1

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (33)

<223> X可为任意氨基酸 (优选地S, P, V 或 A)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (50)..(66)

<223> HCDR2

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (50)

<223> X是Ser或Ala

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (53)

<223> X可为任意氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (99)..(106)

<223> HCDR3, X可为任意氨基酸

<400> 2

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Xaa Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Xaa Ile Ser Gln Ser Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Val Ile Tyr Ala Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链 CDR1 (LCDR1)

<400> 3

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ala Ser Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链 CDR2 (LCDR2)

<400> 4

Ala Thr Ser Arg Leu Gln Ser

1 5

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链 CDR3 (LCDR3)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(6)

<223> X可为任意氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)

<223> 互补位

<400> 5

Gln Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Tyr Thr

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LCDR3

<400> 6

Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Pro Tyr Thr

1 5

<210> 7

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HCDR1

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)

<223> X可为任意氨基酸 (优选地S, P, V或A)

<400> 7

Thr Tyr Xaa Met Ser

1 5

<210> 8

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HCDR2

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)

<223> X是Ser或Ala

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)

<223> 互补位

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)

<223> X可为任意氨基酸

<400> 8

Xaa Ile Ser Xaa Ser Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 9

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HCDR3

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)

<223> X可为任意氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)

<223> X可为任意氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)

<223> 互补位

<400> 9

Xaa Ile Tyr Ala Xaa Leu Asp Tyr

1 5

<210> 10

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HCDR1

<400> 10

Thr Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 11

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HCDR2_AbS0

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)

<223> 互补位

<400> 11

Ala Ile Ser Gln Ser Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 12

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HCDR2_AbS1

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)

<223> 互补位

<400> 12

Ser Ile Ser Gln Ser Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 13

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HCDR3

<400> 13

Val Ile Tyr Ala Ser Leu Asp Tyr

1 5

<210> 14

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链

<400> 14

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ala Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Thr Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 15

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链_AbS0

<400> 15

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gln Ser Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Val Ile Tyr Ala Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 16

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链_AbS1

<400> 16

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gln Ser Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Val Ile Tyr Ala Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 17

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> preS1_表位1

<400> 17

Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro

1 5

<210> 18

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> preS1_表位2

<400> 18

Asn Pro Leu Gly Phe Leu Pro

1 5

<210> 19

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> preS1

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (20)..(26)

<223> 受体结合基序

<400> 19

Met Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Gln Gly Met Gly Thr Asn Leu

1 5 10 15

Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro

20 25 30

Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn

35 40 45

Lys Asp His Trp Pro Asp Gly Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly

50 55 60

Pro Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln

65 70 75 80

Ala Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Pro Ala Ala Pro Pro Pro Ala Ser

85 90 95

Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu

100 105 110

Arg Asp Ser His Pro Gln Ala

115

Claims

1.一种与HBV(乙型肝炎病毒)的preS1抗原特定位点的氨基酸结合的抗体，所述preS1抗原特定位点对应于SEQ ID NO:19的22、23和25位。

2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体具有SEQ ID NO:5所示的LCDR3序列的第8位酪氨酸和SEQ ID NO:9所示的HCDR3序列的第6位亮氨酸，作为互补位。

3.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体具有SEQ ID NO:8所示的HCDR2序列的第1位氨基酸，作为互补位。

4.如权利要求3所述的抗体，其特征在于，所述SEQ ID NO:8所示的HCDR2序列的第1位氨基酸残基为丙氨酸或丝氨酸。

5.如权利要求1所述的抗体，包括：

(a)轻链可变区，包括SEQ ID NO:3的轻链CDR1、SEQ ID NO:4的轻链CDR2和SEQ ID NO:5的轻链CDR3；和

(b)重链可变区，包括SEQ ID NO:7的重链CDR1、SEQ ID NO:8的重链CDR2和SEQ ID NO:9的重链CDR3。

6.如权利要求1所述的抗体，包括：

(a)轻链可变区，包括SEQ ID NO:3的轻链CDR1、SEQ ID NO:4的轻链CDR2和SEQ ID NO:6的轻链CDR3；和

(b)重链可变区，包括SEQ ID NO:10的重链CDR1、SEQ ID NO:11或12的重链CDR2和SEQID NO:13的重链CDR3。

7.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体特异性结合选自HBV基因型A、B、C、D、E或F的一种或多种基因型。

8.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体轻链可变区由SEQ ID NO:1组成。

9.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体重链可变区由SEQ ID NO:2组成。

10.如权利要求1所述的抗体，包括由SEQ ID NO:14所示的轻链可变区；以及由SEQ IDNO:15或16所示的重链可变区。

11.一种编码如权利要求1-10中任一项所述的抗体的多核苷酸。

12.一种包含如权利要求11所述的多核苷酸的表达载体。

13.一种包含如权利要求12所述的表达载体的宿主细胞。

14.一种用于预防或治疗HBV感染的药物组合物，包含如权利要求1-10中任一项所述的抗体。

15.如权利要求14所述的组合物，其特征在于，所述组合物用于预防或治疗乙型肝炎。

16.一种诊断HBV感染的方法，所述方法包括使用如权利要求1-10中任一项所述的抗体进行抗原-抗体反应，从而检测从疑似感染HBV的受试者中分离的生物样品中的preS1蛋白。

17.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述方法用于乙型肝炎的诊断。

18.一种用于检测HBV的组合物，包含如权利要求1-10中任一项所述的抗体。

19.如权利要求18所述的组合物，其特征在于，所述组合物用于诊断乙型肝炎。

20.一种用于检测HBV的试剂盒，包含如权利要求18所述的组合物。