KR102211266B1 - 다능성 줄기 세포의 안정한 미분화 유지 증식을 실시하기 위한 배양 방법 - Google Patents

다능성 줄기 세포의 안정한 미분화 유지 증식을 실시하기 위한 배양 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 에탄올아민 및 에탄올아민 유연체 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나가 첨가되고, 또한, 배지 중에 β-머캅토에탄올을 실질적으로 함유하지 않거나 또는 β-머캅토에탄올의 농도가 9μM 이하인 것을 특징으로 하는 배지 중에서 다능성 줄기 세포를 배양하는 공정을 포함하는, 다능성 줄기 세포의 미분화 유지 증식을 위한 배양 방법 등을 제공한다.

Description

다능성 줄기 세포의 안정한 미분화 유지 증식을 실시하기 위한 배양 방법{CULTURE METHOD FOR STABLE UNDIFFERENTIATED PROLIFERATION OF PLURIPOTENT STEM CELLS}
본 발명은, 다능성 줄기 세포의 미분화 유지 증식을 위한 배양 방법 등에 관한 것이며, 특히, 인간 다능성 줄기 세포를, 무혈청·피더 프리 조건하·단일 파종 조건하에 있어서 안정적으로 미분화 유지 증식시키기 위한 배양 방법 등에 관한 것이다.
ES(Embryonic stem) 세포나 iPS(induced pluripotent stem) 세포 등의 다능성 줄기 세포는, 이의 우수한 증식성이나 다분화능에서, 재생 의료 등에서의 사용이 기대되고 있다. 특히 iPS 세포는, 작제·입수가 비교적 용이한 점, 작제시의 윤리적 제약이 적은 점, 또한, 이식시의 거절 반응의 관점에서, 매우 우수한 재생 의료의 재료로 주목받고 있다.
이들 다능성 줄기 세포는, 종래에는, 섬유 아세포 등의 지지 세포(이하, 피더 세포)와의 공동 배양에서, 혈청을 함유하는 배지를 사용하여 배양되어 왔다. 예를 들면, 비특허문헌 1에서는, 야마나카 등에 의한 세계 최초의 iPS 세포 작제에 관한 보고인데, 피더 세포, 혈청을 사용한 조건에서, iPS 세포의 수립, 유지 증식이 이루어지고 있다. 또한, 이들 다능성 줄기 세포는 개개의 세포가 밀집된 콜로니를 형성하면서 증식된다. 콜로니를 단일 세포로까지 해리하여 파종(이하, 단일 세포 파종(single cell-seeding))하면, 세포가 불안정해지기 때문에, 어느 정도 크기의 콜로니를 유지한 채 파종(이하, 콜로니 파종)을 실시하는 것이 일반적이다. 예를 들면, 비특허문헌 2에는, 단일 세포 파종의 경우에는, 콜로니 파종에 비해, 세포의 생육 상태가, 배양 환경의 영향을 받기 쉬운 것을 나타내는 예가 개시되어 있다. 즉, 단일 세포 파종은 콜로니 파종보다, 배양 난이도가 높다고 할 수 있다.
피더 프리 배양을 실시하기 위해서는, 피더 세포를 대신할 기질 또는 기반재를 배양 용기 저면에 도포할 필요가 있다. 기질로서는, 세포외 매트릭스의 성분이 사용되는 경우가 많다. 특허문헌 1에는, 라미닌 511의 활성 단편의 기질로서의 사용이, 인간 ES/iPS 세포의 증식에 적합하고, 단일 세포 파종도 가능한 것이 나타나 있다.
특허문헌 2 및 비특허문헌 3에는, 인간 다능성 줄기 세포용의 무혈청 배지 조성이 개시되어 있다. E8이라고 불리는 이 조성은, DMEM/F12를 기초 배지로 하고, bFGF나 인슐린 등의 몇가지 인자를 가한 것인데, 현재, 인간 다능성 줄기 세포를 배양함에 있어서의 최소 조성이라고 생각된다.
에탄올아민은, 배지의 첨가제로서 사용한 경우, 간엽계 줄기 세포의 증식 촉진에 기여하는 것이 알려져 있다. 예를 들면, 특허문헌 3에는, 에탄올아민이, 간엽계 줄기 세포의 증식을 촉진시키는 것을 시사하는 실시예가 개시되어 있다.
또한, 특허문헌 4에는, 에탄올아민, 2-머캅토에탄올, 지방산 제거한 소 알부민과 복합시킨 올레산, 및 헤파린 등을 함유하는 배지에 의해 영장류 배아성 줄기 세포를 유지하는 방법 등이 기재되어 있고, 특허문헌 5에는, 2-머캅토에탄올, 2-에탄올아민, 및 무지방산 소 혈청 알부민과 복합체화한 올레산 등을 함유하는 ES 세포 배양용 배지가 기재되어 있다. 특허문헌 6에는, 인간 알부민, 에탄올아민, 및 β-머캅토에탄올 등을 함유하는 ES 세포용 배지가 개시되어 있다.
상기 특허문헌 4, 5 및 6에는, 배지의 필수 성분으로서 일정량(차례대로 10μM, 10μM, 100μM)의 2-머캅토에탄올(β-머캅토에탄올)이 기재되어 있다. 또한, 특허문헌 4에서는, 지방산을 제거한 소 알부민에 올레산을 담지시키기 위해 올레산을 첨가하고 있는데, 알부민에 대한 올레산의 양으로서 9.4mg/g이 함유되어 있다.
한편, 지금까지, 황산화 다당류가, 성장 인자를 분해, 변성, 실활 등으로부터 보호하는 작용을 갖는 것이 보고되어 있다. 예를 들면, 특허문헌 7에는, 카라기난이 bFGF를 안정화하는 것이 개시되어 있고, 실시예에는 헤파린, 덱스트란황산, 카라기난 등의 황산화 다당류를 함유하는 보호제가 bFGF를 가수 분해나 열 변성으로부터 보호하는 것이 기재되어 있다. 그러나, 에탄올아민과 황산화 다당류의 조합에 의한 효과는 개시되어 있지 않다. 또한, 상기 특허문헌 4에는, 에탄올아민과 헤파린이 일체가 되어 함유된 배지가 개시되어 있지만, 각각의 상세한 효과는 지금까지 알려져 있지 않다.
일본 공개특허공보 제2011-78370호 국제공개 제2012/019122호 일본 공개특허공보 제2006-325445호 일본 국제공개특허공보 제2009-542247호 국제공개 제2005/063968호 미국특허 8569061호 공보 국제공개 제92/13526호
Cell, 2006, 126, 663-76 Nature Communications, 2012, 3:1236 Nature Methods, 2011, 8, 424-429
다능성 줄기 세포를 사용한 재생 의료를, 특히 산업 레벨로, 실시함에 있어서는, 상기 종래의 배양 방법에서는 다양한 문제가 있다. 피더 세포는 마우스 태자 유래 섬유 아세포 등, 이종(異種) 유래 세포가 사용되는 것이 일반적이며, 이식후의 안전성의 문제가 지적된다. 또한, 비용면, 세포의 품질 관리면에서도, 피더 세포를 사용하지 않는(이하, 피더 프리) 배양이 더 양호하다고 할 수 있다. 혈청은, 감염원의 문제, 및 로트간의 성능차에 의해 배양 성적에 불균일이 발생할 우려가 지적된다. 콜로니 파종은, 파종하는 세포수의 치밀한 조정을 할 수 없기 때문에, 배양 스케줄을 관리하기 어려우며, 또한, 배양 결과에 속인성이 발생한다. 산업 레벨로 재생 의료용의 다능성 줄기 세포를 생산하기 위해서는, 엄밀하게, 순서, 스케줄이 관리된 조건에서, 복수의 작업자에 의해 작업이 이루어질 필요가 있다. 또한, 통상 다능성 줄기 세포의 배지에 첨가되는 β-머캅토에탄올은 독물로 지정되어 있어, 취급의 번잡함 등의 이유에서 배지에 첨가하지 않거나 또는 첨가량을 가능한 한 감소시키는 것이 바람직하며, 이의 첨가량이 다능성 줄기 세포의 배양에 미치는 영향에 관해서는 상세하게는 밝혀져 있지 않다. 이상의 점에서, 종래의 배양 방법과는 상이한, 무혈청·피더 프리·단일 세포 파종에 의한 다능성 줄기 세포의 배양 방법의 개발이 요구되고 있다. 또한, 산업 레벨에서는 비용은 큰 문제이다. 따라서, 단순히 무혈청·피더 프리·단일 세포 파종 배양이 가능하기만 하면 되는 것이 아니라, 가능한 한 단위 시간당 수득되는 세포가 많은 편이, 즉 증식 효율이 우수한 배양을 할 수 있는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명자들은, 특허문헌 1에 기재된 라미닌 511의 활성 단편을 기질로 하고, E8 조성으로 이루어진 배지를 사용하는 종래의 배양 방법에서, 무혈청·피더 프리·단일 세포 파종 배양을 시도했지만, 장기간 안정적으로 유지 배양을 실시할 수 없었다. 이러한 배양의 불안정성의 원인의 해명과 극복, 및 증식 성능의 한층 향상이 필요하다.
그래서 본 발명은, 다능성 줄기 세포의 미분화 유지 증식을 실시하기 위한 수단을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은, 무혈청·피더 프리·단일 세포 파종 배양에 있어서, 안정적이고 효율적인 다능성 줄기 세포의 미분화 유지 증식을 실시하기 위한 수단을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 상기 목적을 달성하기 위해 예의 검토한 결과, 피더 세포가 에탄올아민을 방출하는 것, 에탄올아민이 다능성 줄기 세포의 증식을 촉진시키는 것을 밝혀내었다. 또한, E8은 해동·조제후에 현저한 성능 저하를 일으키고, 이것이 E8에 의한 배양의 불안정성의 원인일 가능성이 있는 것, 또한, 알부민에 의해 이러한 성능 저하를 억제할 수 있는 것을 밝혀내었다. 또한, 알부민에는, 배지 안정화 효과뿐만 아니라, 에탄올아민의 상기 세포 증식 효과를 증강시키는 작용이 있는 것을 밝혀내었다. 또한, 황산화 당류에는, 에탄올아민 존재하에서 증식 촉진, 배지 안정화 효과가 있는 것을 밝혀내었다. 또한, 본 발명자들은, β-머캅토에탄올, 및 알부민에 담지된 지방산의 양이, 다능성 줄기 세포의 미분화 유지 증식에 영향을 주는 것을 나타내었다. 본 발명자들은 이러한 지견에 기초하여 더욱 연구를 거듭한 결과, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하와 같다.
[1] 에탄올아민 및 에탄올아민 유연체(類緣體) 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 1개가 첨가되고, 또한, 배지 중에 β-머캅토에탄올을 실질적으로 함유하지 않거나 또는 β-머캅토에탄올의 농도가 9μM 이하인 것을 특징으로 하는 배지 중에서 다능성 줄기 세포를 배양하는 공정을 포함하는, 다능성 줄기 세포의 미분화 유지 증식을 위한 배양 방법.
[2] 배지 중의 에탄올아민 및 에탄올아민 유연체 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 1개의 농도가, 1μM 내지 1000μM인, [1]에 기재된 방법.
[3] 배지 중의 에탄올아민 및 에탄올아민 유연체 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 1개의 농도가, 5μM 내지 200μM인, [1]에 기재된 방법.
[4] 에탄올아민 유연체가, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물인, [1] 내지 [3] 중의 어느 하나에 기재된 방법.
Figure 112015083828436-pct00001
상기 화학식 1에 있어서,
X는, R1-N(R2)-[R1 및 R2는, 동일하거나 상이하며, 수소 원자 또는 아미노기의 보호기를 나타낸다] 또는 R3-CH=N-[R3-CH는, H-CH 또는 쉬프(Shiff) 베이스형 아미노기 보호기를 나타낸다]을 나타내고;
Y는, -P(=O)(OH)-O-R4[R4는, -CH2-CH(O-R5)-CH2-O-R6(R5 및 R6은, 동일하거나 상이하며, 탄소수 2 내지 30의 아실기 또는 수소 원자를 나타낸다) 또는 수소 원자를 나타낸다], 수소 원자 또는 하이드록시기의 보호기를 나타낸다.
[5] R1 및 R2가, 동일하거나 상이하며, 수소 원자, 할로겐 원자, 하이드록시기, 아릴기, 탄소수 2 내지 30의 아실기, 탄소수 1 내지 6의 알킬기, 탄소수 1 내지 6의 알콕실기, 탄소수 1 내지 6의 하이드록시알킬기, 탄소수 1 내지 6의 할로알킬기, 탄소수 1 내지 6의 할로알콕실기 또는 탄소수 1 내지 6의 하이드록시알킬기이고,
R3이, 수소 원자, 할로겐 원자, 하이드록시기, 아릴기, 탄소수 2 내지 30의 아실기, 탄소수 1 내지 6의 알킬기, 탄소수 1 내지 6의 알콕실기, 탄소수 1 내지 6의 하이드록시알킬기, 탄소수 1 내지 6의 할로알킬기, 탄소수 1 내지 6의 할로알콕실기 또는 탄소수 1 내지 6의 할로하이드록시알킬기인, [4]에 기재된 방법.
[6] 에탄올아민 유연체가, 포스포에탄올아민, 모노메틸에탄올아민, 디메틸에탄올아민, N-아실포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜에탄올아민, 및 리조포스파티딜에탄올아민으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 또는 복수인, [1] 내지 [3] 중의 어느 하나에 기재된 방법.
[7] 배지가, 알부민이 추가로 첨가된 배지인, [1] 내지 [6] 중의 어느 하나에 기재된 방법.
[8] 배지 중의 알부민의 농도가, 0.1g/l 내지 20g/l인, [7]에 기재된 방법.
[9] 배지 중의 알부민의 농도가, 1g/l 내지 8g/l인, [7]에 기재된 방법.
[10] 알부민이, 동물(인간을 포함함)의 혈장 또는 유전자 재조합 기술로 수득되는 알부민인, [7] 내지 [9] 중의 어느 하나에 기재된 방법.
[11] 배지 중의 알부민의 지방산 담지량이 9mg/g 이하인, [7] 내지 [10] 중의 어느 하나에 기재된 방법.
[12] 배지 중의 알부민의 지방산 담지량이 2.2mg/g 이하인, [7] 내지 [10] 중의 어느 하나에 기재된 방법.
[13] 배지가, 황산화 당류 및/또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 추가로 첨가된 배지인, [1] 내지 [12] 중의 어느 하나에 기재된 방법.
[14] 배지 중의 황산화 당류 및/또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 농도가 1 내지 1000ng/ml인, [13]에 기재된 방법.
[15] 황산화 당류 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 평균 분자량 2,500 내지 7,500의 덱스트란황산Na인, [13] 또는 [14]에 기재된 방법.
[16] 에탄올아민 및 에탄올아민 유연체 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나가 첨가되고, 또한, 황산화 당류 및/또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 첨가되는 것을 특징으로 하는 배지 중에서 다능성 줄기 세포를 배양하는 공정을 포함하는, 다능성 줄기 세포의 미분화 유지 증식을 위한 배양 방법.
[17] 배지 중의 황산화 당류 및/또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 농도가 1 내지 1000ng/ml인, [16]에 기재된 방법.
[18] 황산화 당류 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 평균 분자량 2,500 내지 7,500의 덱스트란황산Na인, [16] 또는 [17]에 기재된 방법.
[19] 배지가, 알부민이 추가로 첨가된 배지인, [16] 내지 [18] 중의 어느 하나에 기재된 방법.
[20] 배지 중의 알부민의 농도가 0.1g/l 내지 20g/l인, [19]에 기재된 방법.
[21] 배지 중의 알부민의 농도가 1g/l 내지 8g/l인, [19]에 기재된 방법.
[22] 알부민이, 동물(인간을 포함함)의 혈장 또는 유전자 재조합 기술로 수득되는 알부민인, [19] 내지 [21] 중의 어느 하나에 기재된 방법.
[23] 배양이 피더 세포 비존재하에서 실시되는, [1] 내지 [22] 중의 어느 하나에 기재된 방법.
[24] 배양이, 세포외 기질 또는 이의 활성 단편, 또는 이들의 기능을 모사(mimicking)하는 인공물을 사용하여 실시되는, [23]에 기재된 방법.
[25] 배양이, 라미닌 511 또는 이의 활성 단편 또는 매트리겔을 사용하여 실시되는, [23]에 기재된 방법.
[26] 배양이 단일 세포 파종에 의해 실시되는, [1] 내지 [25] 중의 어느 하나에 기재된 방법.
[27] 배양이 무혈청 조건하에서 실시되는, [1] 내지 [26] 중의 어느 하나에 기재된 방법.
[28] 배지가, 실질적으로 인간 이외의 동물 유래 성분을 함유하지 않는 배지인, [1] 내지 [27] 중의 어느 하나에 기재된 방법.
[29] 다능성 줄기 세포가 배아성 줄기 세포(ES 세포) 또는 인공 다능성 줄기 세포(iPS 세포)인, [1] 내지 [28] 중의 어느 하나에 기재된 방법.
[30] 다능성 줄기 세포가 영장류 유래인, [1] 내지 [29] 중의 어느 하나에 기재된 방법.
[31] 다능성 줄기 세포가 인간 iPS 세포인, [1] 내지 [30] 중의 어느 하나에 기재된 방법.
[32] 에탄올아민 및 에탄올아민 유연체 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나를 첨가하고, 또한, 황산화 당류 및/또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 첨가하는 것을 포함하는, 다능성 줄기 세포 증식용 배지의 보존 안정화 방법.
[33] 사용시의 황산화 당류 및/또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 최종 농도가 1 내지 1000ng/ml인, [32]에 기재된 방법.
[34] 또한, 알부민을 첨가하는 것을 포함하는, [32] 또는 [33]에 기재된 방법.
[35] 사용시의 알부민의 최종 농도가 0.1g/l 내지 20g/l인, [34]에 기재된 방법.
[36] 사용시의 알부민의 최종 농도가 1g/l 내지 8g/l인, [34]에 기재된 방법.
[37] 알부민이, 동물(인간을 포함함)의 혈장 또는 유전자 재조합 기술로 수득되는 알부민인, [34] 내지 [36] 중의 어느 하나에 기재된 방법.
[38] 알부민의 지방산 담지량이 9mg/g 이하인, [34] 내지 [37] 중의 어느 하나에 기재된 방법.
[39] 알부민의 지방산 담지량이 2.2mg/g 이하인, [34] 내지 [37] 중의 어느 하나에 기재된 방법.
[40] 배지가, β-머캅토에탄올이 실질적으로 함유되지 않거나, 최종 농도가 9μM 이하가 되도록 첨가되어 이루어지는, [32] 내지 [39] 중의 어느 하나에 기재된 방법.
[41] 당해 배지가 다능성 줄기 세포의 미분화 유지 증식용인, [32] 내지 [40] 중의 어느 하나에 기재된 방법.
[42] 에탄올아민 및 에탄올아민 유연체 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나를 함유하고, 또한, β-머캅토에탄올을 실질적으로 함유하지 않거나 또는 사용시의 농도가 9μM 이하가 되도록 β-머캅토에탄올을 함유하는, 다능성 줄기 세포의 미분화 유지 증식을 위한 배지 첨가제.
[43] 에탄올아민 유연체가, 하기 화학식 2로 표시되는 화합물인, [42]에 기재된 배지 첨가제.
Figure 112015083828436-pct00002
상기 화학식 2에 있어서,
X는, R1-N(R2)-[R1 및 R2는, 동일하거나 상이하며, 수소 원자 또는 아미노기의 보호기를 나타낸다] 또는 R3-CH=N-[R3-CH는, H-CH 또는 쉬프 베이스형 아미노기 보호기를 나타낸다]을 나타내고;
Y는, -P(=O)(OH)-O-R4[R4는, -CH2-CH(O-R5)-CH2-O-R6(R5 및 R6은, 동일하거나 상이하며, 탄소수 2 내지 30의 아실기 또는 수소 원자를 나타낸다) 또는 수소 원자를 나타낸다], 수소 원자 또는 하이드록시기의 보호기를 나타낸다.
[44] R1 및 R2가, 동일하거나 상이하며, 수소 원자, 할로겐 원자, 하이드록시기, 아릴기, 탄소수 2 내지 30의 아실기, 탄소수 1 내지 6의 알킬기, 탄소수 1 내지 6의 알콕실기, 탄소수 1 내지 6의 하이드록시알킬기, 탄소수 1 내지 6의 할로알킬기, 탄소수 1 내지 6의 할로알콕실기 또는 탄소수 1 내지 6의 할로하이드록시알킬기이고,
R3이, 수소 원자, 할로겐 원자, 하이드록시기, 아릴기, 탄소수 2 내지 30의 아실기, 탄소수 1 내지 6의 알킬기, 탄소수 1 내지 6의 알콕실기, 탄소수 1 내지 6의 하이드록시알킬기, 탄소수 1 내지 6의 할로알킬기, 탄소수 1 내지 6의 할로알콕실기 또는 탄소수 1 내지 6의 할로하이드록시알킬기인, [43]에 기재된 배지 첨가제.
[45] 에탄올아민 유연체가, 포스포에탄올아민, 모노메틸에탄올아민, 디메틸에탄올아민, N-아실포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜에탄올아민, 및 리조포스파티딜에탄올아민으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 또는 복수인, [42] 내지 [44] 중의 어느 하나에 기재된 배지 첨가제.
[46] 알부민을 추가로 함유하는, [42] 내지 [45] 중의 어느 하나에 기재된 배지 첨가제.
[47] 사용시의 알부민의 최종 농도가 0.1g/l 내지 20g/l인, [46]에 기재된 배지 첨가제.
[48] 사용시의 알부민의 최종 농도가 1g/l 내지 8g/l인, [46]에 기재된 배지 첨가제.
[49] 알부민의 지방산 담지량이 9mg/g 이하인, [46] 내지 [48] 중의 어느 하나에 기재된 배지 첨가제.
[50] 알부민의 지방산 담지량이 2.2mg/g 이하인, [46] 내지 [48] 중의 어느 하나에 기재된 배지 첨가제.
[51] 알부민이, 동물(인간을 포함함)의 혈장 또는 유전자 재조합 기술로 수득되는 알부민인, [46] 내지 [50] 중의 어느 하나에 기재된 배지 첨가제.
[52] 황산화 당류 및/또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 추가로 함유하는, [42] 내지 [51] 중의 어느 하나에 기재된 배지 첨가제.
[53] 사용시의 황산화 당류 및/또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 최종 농도가 1 내지 1000ng/ml인, [52]에 기재된 배지 첨가제.
[54] 황산화 당류가, 황산화 단당, 황산화 이당, 황산화 다당, 황산화 당알코올 및 황산화 시크리톨로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나인, [52] 또는 [53]에 기재된 배지 첨가제.
[55] 상기 황산화 당류 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이, 덱스트란황산Na, 셀룰로스SO3Na, 크산탄검SO3Na, 푸코이단, 아르긴산SO3Na, 이눌린SO3Na, 말토헵타오스SO3Na, 스타키오스SO3Na, 말토트리오스SO3Na, 말티톨SO3Na, 수크로스8SO3K, 글루코스SO3Na, myo-6이노시톨SO3K, α-사이클로덱스트린SO3Na, 만니톨SO3Na, 크실리톨SO3Na 및 에리스리톨SO3Na로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나인, [52] 내지 [54] 중의 어느 하나에 기재된 배지 첨가제.
[56] 상기 황산화 당류 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이, 덱스트란황산Na, 푸코이단, 말토헵타오스SO3Na, 말토트리오스SO3Na, 말티톨SO3Na 및 수크로스8SO3K로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나인, [55]에 기재된 배지 첨가제.
[57] 상기 황산화 당류 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 평균 분자량 2,500 내지 7,500의 덱스트란황산Na인, [52] 내지 [56] 중의 어느 하나에 기재된 배지 첨가제.
[58] 다능성 줄기 세포의 미분화 유지 증식이, 피더 세포를 사용하지 않는 조건하에서 실시되는, [42] 내지 [57] 중의 어느 하나에 기재된 배지 첨가제.
[59] 피더 세포를 사용하지 않는 조건이, 피더 세포를 사용하지 않고, 세포외 기질 또는 이의 활성 단편, 또는 이들의 기능을 모사하는 인공물을 사용하는 조건인, [58]에 기재된 배지 첨가제.
[60] 피더 세포를 사용하지 않는 조건이, 피더 세포를 사용하지 않고, 라미닌 511 또는 이의 활성 단편 또는 매트리겔을 사용하는 조건인, [58]에 기재된 배지 첨가제.
[61] 다능성 줄기 세포의 미분화 유지 증식이 단일 세포 파종에 의해 실시되는, [42] 내지 [60] 중의 어느 하나에 기재된 배지 첨가제.
[62] 다능성 줄기 세포의 미분화 유지 증식이 무혈청 조건하에서 실시되는, [42] 내지 [61] 중의 어느 하나에 기재된 배지 첨가제.
[63] 실질적으로 인간 이외의 동물 유래 성분을 함유하지 않는, [42] 내지 [62] 중의 어느 하나에 기재된 배지 첨가제.
[64] 다능성 줄기 세포가 배아성 줄기 세포(ES 세포) 또는 인공 다능성 줄기 세포(iPS 세포)인, [42] 내지 [63] 중의 어느 하나에 기재된 배지 첨가제.
[65] 다능성 줄기 세포가 영장류 유래인, [42] 내지 [64] 중의 어느 하나에 기재된 배지 첨가제.
[66] 다능성 줄기 세포가 인간 iPS 세포인, [42] 내지 [65] 중의 어느 하나에 기재된 배지 첨가제.
[67] [42] 내지 [66] 중의 어느 하나에 기재된 배지 첨가제를 함유하는, 다능성 줄기 세포의 미분화 유지 증식을 위한 배지.
[68] 에탄올아민 및 에탄올아민 유연체 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나가 첨가된 배지 중에서 인공 다능성 줄기 세포(iPS 세포)를 배양하는 공정을 포함하는, 인공 다능성 줄기 세포(iPS 세포)의 미분화 유지 증식을 위한 배양 방법.
[69] 배지 중의 에탄올아민 및 에탄올아민 유연체 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 농도가 1μM 내지 1000μM인, [68]에 기재된 방법.
[70] 배지 중의 에탄올아민 및 에탄올아민 유연체 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 농도가 5μM 내지 200μM인, [68]에 기재된 방법.
[71] 에탄올아민 유연체가, 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물인, [68] 내지 [70] 중의 어느 하나에 기재된 방법.
Figure 112015083828436-pct00003
상기 화학식 3에 있어서,
X는, R1-N(R2)-[R1 및 R2는, 동일하거나 상이하며, 수소 원자 또는 아미노기의 보호기를 나타낸다] 또는 R3-CH=N-[R3-CH는, H-CH 또는 쉬프 베이스형 아미노기 보호기를 나타낸다]을 나타내고;
Y는, -P(=O)(OH)-O-R4[R4는, -CH2-CH(O-R5)-CH2-O-R6(R5 및 R6은, 동일하거나 상이하며, 탄소수 2 내지 30의 아실기 또는 수소 원자를 나타낸다) 또는 수소 원자를 나타낸다], 수소 원자 또는 하이드록시기의 보호기를 나타낸다.
[72] R1 및 R2가, 동일하거나 상이하며, 수소 원자, 할로겐 원자, 하이드록시기, 아릴기, 탄소수 2 내지 30의 아실기, 탄소수 1 내지 6의 알킬기, 탄소수 1 내지 6의 알콕실기, 탄소수 1 내지 6의 하이드록시알킬기, 탄소수 1 내지 6의 할로알킬기, 탄소수 1 내지 6의 할로알콕실기 또는 탄소수 1 내지 6의 할로하이드록시알킬기이고,
R3이, 수소 원자, 할로겐 원자, 하이드록시기, 아릴기, 탄소수 2 내지 30의 아실기, 탄소수 1 내지 6의 알킬기, 탄소수 1 내지 6의 알콕실기, 탄소수 1 내지 6의 하이드록시알킬기, 탄소수 1 내지 6의 할로알킬기, 탄소수 1 내지 6의 할로알콕실기 또는 탄소수 1 내지 6의 할로하이드록시알킬기인, [71]에 기재된 방법.
[73] 에탄올아민 유연체가, 포스포에탄올아민, 모노메틸에탄올아민, 디메틸에탄올아민, N-아실포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜에탄올아민, 및 리조포스파티딜에탄올아민으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 또는 복수인, [68] 내지 [72] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[74] 배지가, 알부민이 추가로 첨가된 배지인, [68] 내지 [73] 중의 어느 하나에 기재된 방법.
[75] 배지 중의 알부민의 농도가 0.1g/l 내지 20g/l인, [74]에 기재된 방법.
[76] 배지 중의 알부민의 농도가 1g/l 내지 8g/l인, [74]에 기재된 방법.
[77] 알부민이, 동물(인간을 포함함)의 혈장 또는 유전자 재조합 기술로 수득되는 알부민인, [74] 내지 [76] 중의 어느 하나에 기재된 방법.
[78] 배지 중의 알부민의 지방산 담지량이 9mg/g 이하인, [74] 내지 [77] 중의 어느 하나에 기재된 방법.
[79] 배지 중의 알부민의 지방산 담지량이 2.2mg/g 이하인, [74] 내지 [77] 중의 어느 하나에 기재된 방법.
[80] 배양이 피더 세포 비존재하에서 실시되는, [68] 내지 [79] 중의 어느 하나에 기재된 방법.
[81] 배양이, 세포외 기질 또는 이의 활성 단편, 또는 이들의 기능을 모사하는 인공물을 사용하여 실시되는, [80]에 기재된 방법.
[82] 배양이, 라미닌 511 또는 이의 활성 단편 또는 매트리겔을 사용하여 실시되는, [80]에 기재된 방법.
[83] 배양이 단일 세포 파종에 의해 실시되는, [68] 내지 [82] 중의 어느 하나에 기재된 방법.
[84] 배양이 무혈청 조건하에서 실시되는, [68] 내지 [83] 중의 어느 하나에 기재된 방법.
[85] 배지가, 실질적으로 인간 이외의 동물 유래 성분을 함유하지 않는 배지인, [68] 내지 [84] 중의 어느 하나에 기재된 방법.
[86] 인공 다능성 줄기 세포가 영장류 유래인, [68] 내지 [85] 중의 어느 하나에 기재된 방법.
[87] 인공 다능성 줄기 세포가 인간 iPS 세포인, [68] 내지 [86] 중의 어느 하나에 기재된 방법.
[88] 에탄올아민 및 에탄올아민 유연체 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나를 첨가하는 것을 포함하는, 다능성 줄기 세포 증식용 배지의 보존 안정화 방법.
[89] 또한 황산화 당류 및/또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 첨가하는 것을 포함하는, [88]에 기재된 방법.
[90] 사용시의 황산화 당류 및/또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 최종 농도가 1 내지 1000ng/ml인, [89]에 기재된 방법.
[91] 또한, 알부민을 첨가하는 것을 포함하는, [88] 내지 [90] 중의 어느 하나에 기재된 방법.
[92] 사용시의 알부민의 최종 농도가 0.1g/l 내지 20g/l인, [91]에 기재된 방법.
[93] 사용시의 알부민의 최종 농도가 1g/l 내지 8g/l인, [91]에 기재된 방법.
[94] 알부민이, 동물(인간을 포함함)의 혈장 또는 유전자 재조합 기술로 수득되는 알부민인, [91] 내지 [93] 중의 어느 하나에 기재된 방법.
[95] 알부민의 지방산 담지량이 9mg/g 이하인, [91] 내지 [94] 중의 어느 하나에 기재된 방법.
[96] 알부민의 지방산 담지량이 2.2mg/g 이하인, [91] 내지 [94] 중의 어느 하나에 기재된 방법.
[97] 배지가, β-머캅토에탄올이 실질적으로 함유되지 않거나, 최종 농도가 9μM 이하가 되도록 첨가되어 이루어지는, [88] 내지 [96] 중의 어느 하나에 기재된 방법.
[98] 당해 배지가, 다능성 줄기 세포의 미분화 유지 증식용인, [88] 내지 [97] 중의 어느 하나에 기재된 방법.
[99] 에탄올아민 및 에탄올아민 유연체 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나를 함유하는, 다능성 줄기 세포의 미분화 유지 증식을 위한 배지 첨가제.
[100] 에탄올아민 유연체가, 하기 화학식 4로 표시되는 화합물인, [99]에 기재된 배지 첨가제.
Figure 112015083828436-pct00004
상기 화학식 4에 있어서,
X는, R1-N(R2)-[R1 및 R2는, 동일하거나 상이하며, 수소 원자 또는 아미노기의 보호기를 나타낸다] 또는 R3-CH=N-[R3-CH는, H-CH 또는 쉬프 베이스형 아미노기 보호기를 나타낸다]을 나타내고;
Y는, -P(=O)(OH)-O-R4[R4는, -CH2-CH(O-R5)-CH2-O-R6(R5 및 R6은, 동일하거나 상이하며, 탄소수 2 내지 30의 아실기 또는 수소 원자를 나타낸다) 또는 수소 원자를 나타낸다], 수소 원자 또는 하이드록시기의 보호기를 나타낸다.
[101] R1 및 R2가, 동일하거나 상이하며, 수소 원자, 할로겐 원자, 하이드록시기, 아릴기, 탄소수 2 내지 30의 아실기, 탄소수 1 내지 6의 알킬기, 탄소수 1 내지 6의 알콕실기, 탄소수 1 내지 6의 하이드록시알킬기, 탄소수 1 내지 6의 할로알킬기, 탄소수 1 내지 6의 할로알콕실기 또는 탄소수 1 내지 6의 할로하이드록시알킬기이고,
R3이, 수소 원자, 할로겐 원자, 하이드록시기, 아릴기, 탄소수 2 내지 30의 아실기, 탄소수 1 내지 6의 알킬기, 탄소수 1 내지 6의 알콕실기, 탄소수 1 내지 6의 하이드록시알킬기, 탄소수 1 내지 6의 할로알킬기, 탄소수 1 내지 6의 할로알콕실기 또는 탄소수 1 내지 6의 할로하이드록시알킬기인, [100]에 기재된 방법.
[102] 에탄올아민 유연체가, 포스포에탄올아민, 모노메틸에탄올아민, 디메틸에탄올아민, N-아실포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜에탄올아민, 및 리조포스파티딜에탄올아민으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 또는 복수인, [99] 내지 [101] 중의 어느 하나에 기재된 배지 첨가제.
[103] 알부민을 추가로 함유하는, [99] 내지 [102] 중의 어느 하나에 기재된 배지 첨가제.
[104] 알부민이 동물(인간을 포함함)의 혈장 또는 유전자 재조합 기술로 수득되는 알부민인, [103]에 기재된 배지 첨가제.
[105] 황산화 당류 및/또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 추가로 함유하는, [99] 내지 [104] 중의 어느 하나에 기재된 배지 첨가제.
[106] 사용시의 황산화 당류 및/또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 최종 농도가 1 내지 1000ng/ml인, [105]에 기재된 배지 첨가제.
[107] 황산화 당류가, 황산화 단당, 황산화 이당, 황산화 다당, 황산화 당알코올 및 황산화 시크리톨로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나인, [105] 또는 [106]에 기재된 배지 첨가제.
[108] 상기 황산화 당류 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이, 덱스트란황산Na, 셀룰로스SO3Na, 크산탄검SO3Na, 푸코이단, 아르긴산SO3Na, 이눌린SO3Na, 말토헵타오스SO3Na, 스타키오스SO3Na, 말토트리오스SO3Na, 말티톨SO3Na, 수크로스8SO3K, 글루코스SO3Na, myo-6이노시톨SO3K, α-사이클로덱스트린SO3Na, 만니톨SO3Na, 크실리톨SO3Na 및 에리스리톨SO3Na로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나인, [105] 내지 [107] 중의 어느 하나에 기재된 배지 첨가제.
[109] 상기 황산화 당류 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이, 덱스트란황산Na, 푸코이단, 말토헵타오스SO3Na, 말토트리오스O3Na, 말티톨SO3Na 및 수크로스8SO3K로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나인, [108]에 기재된 배지 첨가제.
[110] 상기 황산화 당류 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 평균 분자량 2,500 내지 7,500의 덱스트란황산Na인, [105] 내지 [109] 중의 어느 하나에 기재된 배지 첨가제.
[111] 다능성 줄기 세포의 미분화 유지 증식이, 피더 세포를 사용하지 않는 조건하에서 실시되는, [99] 내지 [110] 중의 어느 하나에 기재된 배지 첨가제.
[112] 피더 세포를 사용하지 않는 조건이, 피더 세포를 사용하지 않고, 세포외 기질 또는 이의 활성 단편, 또는 이들의 기능을 모사하는 인공물을 사용하는 조건인, [111]에 기재된 배지 첨가제.
[113] 피더 세포를 사용하지 않는 조건이, 피더 세포를 사용하지 않고, 라미닌 511 또는 이의 활성 단편 또는 매트리겔을 사용하는 조건인, [111]에 기재된 배지 첨가제.
[114] 다능성 줄기 세포의 미분화 유지 증식이 단일 세포 파종에 의해 실시되는, [99] 내지 [113] 중의 어느 하나에 기재된 배지 첨가제.
[115] 다능성 줄기 세포의 미분화 유지 증식이 무혈청 조건하에서 실시되는, [99] 내지 [114] 중의 어느 하나에 기재된 배지 첨가제.
[116] 실질적으로 인간 이외의 동물 유래 성분을 함유하지 않는, [99] 내지 [115] 중의 어느 하나에 기재된 배지 첨가제.
[117] 다능성 줄기 세포가 배아성 줄기 세포(ES 세포) 또는 인공 다능성 줄기 세포(iPS 세포)인, [99] 내지 [116] 중의 어느 하나에 기재된 배지 첨가제.
[118] 다능성 줄기 세포가 영장류 유래인, [99] 내지 [117] 중의 어느 하나에 기재된 배지 첨가제.
[119] 다능성 줄기 세포가 인간 iPS 세포인, [99] 내지 [118] 중의 어느 하나에 기재된 배지 첨가제.
[120] [99] 내지 [119] 중의 어느 하나에 기재된 배지 첨가제를 함유하는, 다능성 줄기 세포의 미분화 유지 증식을 위한 배지.
본 발명에 의하면, 다능성 줄기 세포를 안정적이고 효율적으로 증식시킬 수 있고, 무혈청·피더 프리·단일 세포 파종 배양에 있어서도 장기간 안정적으로 미분화 유지 증식시킬 수 있다.
도 1은, 알부민에 의한 4℃ 보존 조건하에서의 배지 안정화 효과를 도시하는 도면이다.
도 2는, 에탄올아민의 세포 증식 촉진 효과 및 알부민의 조합 효과를 도시하는 도면이다.
도 3은, 에탄올아민과 덱스트란황산나트륨의 조합에 의한 세포 증식 촉진 효과를 누적 생세포 증가율(배)로 도시하는 도면이다.
도 4는, E8 최소 조성 배지에 알부민, 에탄올아민, 덱스트란황산나트륨을 첨가한 배지에서의 장기 배양후의 iPS 세포의 콜로니를 알칼리포스파타제 염색한 결과를 도시하는 도면이다.
도 5는, 기저막 매트릭스로서 매트리겔을 사용한 배양에 있어서의 에탄올아민의 세포 증식 촉진 효과를 도시하는 도면이다.
도 6은, 알부민 및 에탄올아민을 함유하는 배지에 덱스트란황산나트륨을 첨가함으로써, iPS 세포의 배양에 있어서 배지 교환을 생략할 수 있음을 도시하는 도면이다.
도 7은, 에탄올아민과 덱스트란황산나트륨의 조합에 의한 상온 보존 조건하에서의 배지 안정화 효과를 도시하는 도면이다.
도 8은, O-포스포릴에탄올아민의 세포 증식 촉진 효과를 도시하는 도면이다.
도 9는, 2-(메틸아미노)에탄올의 세포 증식 촉진 효과를 도시하는 도면이다.
도 10은, 2-디메틸아미노에탄올의 세포 증식 촉진 효과를 도시하는 도면이다.
도 11은, 에탄올아민염산염의 세포 증식 촉진 효과를 도시하는 도면이다.
도 12는, 알부민의 올레산 담지량의 증가에 따른 세포 증식 억제 효과를 도시하는 도면이다.
(다능성 줄기 세포의 미분화 유지 증식을 위한 배양 방법)
본 발명은, 에탄올아민 및 에탄올아민 유연체 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나가 첨가되고, 또한, 배지 중에 β-머캅토에탄올을 실질적으로 함유하지 않거나 또는 β-머캅토에탄올의 농도가 9μM 이하인 것을 특징으로 하는 배지 중에서 다능성 줄기 세포를 배양하는 공정을 포함하는, 다능성 줄기 세포의 미분화 유지 증식을 위한 배양 방법(이하, 본 발명의 배양 방법이라고도 칭한다)을 제공한다.
본 발명은, 피더 세포가 에탄올아민을 방출하는 것을 새롭게 밝혀내고, 피더 프리의 배양에 있어서도 에탄올아민을 첨가함으로써 다능성 줄기 세포의 미분화 유지 증식을 촉진시키는 것이 가능함을 밝혀낸 것에 기초한다. 피더 세포는 이종 유래 세포가 사용되는 것이 일반적이며, 또한, 피더 세포 유래의 바이러스에 의한 감염예도 알려져 있다. 따라서, 본 발명은, 이러한 문제를 해소하는 것이 가능하며, 재생 의료의 분야에 있어서 매우 유용하다.
또한, 본 발명은, 배지 중의 β-머캅토에탄올의 농도를 감소시켜도, 다능성 줄기 세포의 미분화 유지 증식을 양호하게 실시할 수 있음을 밝혀낸 것에도 기초한다. 본 발명의 배양 방법에 있어서는, 배지 중에 β-머캅토에탄올이 실질적으로 함유되지 않거나 또는 함유되지 않는 것이 바람직하다. 배지 중에 β-머캅토에탄올이 함유되는 경우라도, 그 농도는 9μM 이하인 것이 바람직하다.
본 명세서 중,「β-머캅토에탄올이 실질적으로 함유되지 않는다」란, β-머캅토에탄올의 함유량이 검출 한계 미만의 농도인 것을 의미한다.
본 발명에 있어서,「다능성 줄기 세포」란, 자기 복제능 및 분화/증식능을 갖는 미성숙한 세포로서, 생체를 구성하는 모든 조직이나 세포로 분화될 수 있는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 다능성 줄기 세포로서는, 배아성 줄기 세포(ES 세포), 배아성 생식 세포(EG 세포), 인공 다능성 줄기 세포(iPS 세포) 등을 들 수 있다. 체세포의 핵을 핵이식함으로써 작제된 초기 배아를 배양함으로써 수립된 줄기 세포도, 다능성 줄기 세포에 포함된다(Nature, 385, 810(1997); Science, 280, 1256(1998); Nature Biotechnology, 17, 456(1999); Nature, 394, 369(1998); Nature Genetics, 22, 127(1999); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 14984(1999); Nature Genetics, 24, 109(2000)). 또한, 본 발명에 있어서의 다능성 줄기 세포에는, 복능성 줄기 세포(multipotent stem cell)는 포함되지 않는다. 복능성 줄기 세포란, 모든 종류는 아니지만, 복수종의 조직이나 세포로 분화될 수 있는 능력을 갖는 세포를 의미하고, 간엽계 줄기 세포 등의 체성 줄기 세포가 포함된다.
본 발명의 배양 방법은, 어느 다능성 줄기 세포에도 적합하게 사용할 수 있는데, 바람직하게는, 배아성 줄기 세포(ES 세포) 또는 인공 다능성 줄기 세포(iPS 세포)의 미분화 유지 증식을 위해 사용된다.
또한, 본 발명의 배양 방법은, 어느 동물 유래의 다능성 줄기 세포에도 적합하게 사용할 수 있다. 본 발명의 배지를 사용하여 배양될 수 있는 다능성 줄기 세포는, 예를 들면, 마우스, 래트, 햄스터, 몰모트 등의 설치류, 토끼 등의 토끼목, 돼지, 소, 염소, 말, 양 등의 유제목, 개, 고양이 등의 고양이목, 인간, 원숭이, 히말라야 원숭이, 마모셋, 오랑우탄, 침팬지 등의 영장류 등 유래의 다능성 줄기 세포이고, 바람직하게는 영장류 유래의 다능성 줄기 세포이다. 재생 의료에 사용되는 경우에는, 바람직하게는 인간 iPS 세포이다.
본 발명에 있어서, 다능성 줄기 세포의「미분화 유지 증식」이란, 다능성 줄기 세포가 다분화능을 유지한 채 미분화 상태로 증식하는 것을 의미한다. 즉, 본 발명의 배양 방법은, 다능성 줄기 세포를 다분화능을 유지한 채 미분화 상태에서 증식시키는 방법이라고도 할 수 있다. 다능성 줄기 세포가 미분화 상태로 유지되어 있는 것은, 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이 알칼리포스파타제 염색을 실시함으로써 확인된다. 염색된 세포는 미분화 상태로 유지되고 있는 것으로 평가된다.
본 발명에 있어서 사용되는「에탄올아민」(2-아미노에탄올, 모노에탄올아민이라고도 불린다)은, 천연물이나 그 가공품으로부터 단리·정제한 것이라도 좋고, 합성품이라도 좋다. 에탄올아민은, 산화에틸렌과 암모니아를 반응시켜 제조할 수 있다. 또한, 에탄올아민은, 용매 추출, 각종 크로마토그래피 등의 공지의 기술을 사용하여 천연물이나 그 가공품으로부터 단리·정제할 수도 있다. 에탄올아민은, 시판품이라도 좋고, 예를 들면, 시그마알드리치사 등으로부터 입수가능하다.
본 발명에 있어서 사용되는「에탄올아민 유연체」로서는,
하기 화학식 5로 표시되는 화합물이 열거된다.
Figure 112015083828436-pct00005
상기 화학식 5에 있어서,
X는, R1-N(R2)-[R1 및 R2는, 동일하거나 상이하며, 수소 원자 또는 아미노기의 보호기를 나타낸다] 또는 R3-CH=N-[R3-CH는, H-CH 또는 쉬프 베이스형 아미노기 보호기를 나타낸다]을 나타내고;
Y는, -P(=O)(OH)-O-R4[R4는, -CH2-CH(O-R5)-CH2-O-R6(R5 및 R6은, 동일하거나 상이하며, 탄소수 2 내지 30의 아실기 또는 수소 원자를 나타낸다) 또는 수소 원자를 나타낸다], 수소 원자 또는 하이드록시기의 보호기를 나타낸다.
「아미노기의 보호기」에 관해서는, 예를 들면, Green 외, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Edition, 1999, John Wiley & Sons, Inc. 등의 성서를 참조할 수 있고, 적당한 보호기를 선택하여 도입 및 제거하는 것이 가능하다. 「아미노기의 보호기」로서는, 할로겐 원자, 하이드록시기, 아릴기, 탄소수 2 내지 30의 아실기, 탄소수 1 내지 6의 알킬기, 탄소수 1 내지 6의 알콕실기, 탄소수 1 내지 6의 하이드록시알킬기, 탄소수 1 내지 6의 할로알킬기, 탄소수 1 내지 6의 할로알콕실기 또는 탄소수 1 내지 6의 할로하이드록시알킬기가 열거된다. 또한, 프로드럭화를 위해 아미노기에 결합할 수 있는 탈리기도 열거된다.
「할로겐 원자」란, 불소 원자, 염소 원자, 브롬 원자, 요오드 원자를 의미한다.
「아릴기」로서는, 예를 들면, 페닐, 1-나프틸, 2-나프틸 등이 열거된다.
「탄소수 2 내지 30의 아실기」로서는, 포화 카복실산아실기 및 불포화 카복실산아실기가 열거된다. 포화 카복실산아실기로서는, 아세틸(에타노일), 프로파노일, 부타노일, 펜타노일, 헥사노일, 헵타노일, 옥타노일, 노나노일, 데카노일, 운데카노일, 도데카노일, 트리데카노일, 테트라데카노일, 펜타데카노일, 헥사데카노일, 헵타데카노일, 옥타데카노일, 노나데카노일, 이코사노일, 에이코사노일, 헨이코사노일, 헨에이코사노일, 도코사노일, 트리카사노일, 테트라코사노일, 펜타코사노일, 헥사코사노일, 헵타코사노일, 옥타코사노일, 노나코사노일 및 트리아콘타노일 등이 열거된다. 불포화 카복실산아실기로서는, 아크릴로일, 메타크릴로일, 크로토노일, 이소크로토노일, 부테노일, 부타디에노일, 펜테노일, 헥세노일, 헵테노일, 옥테노일, 노네노일, 데세노일, 운데세노일, 도데세노일, 테트라데세노일, 올레로일, 에라이디노일, 사이클로펜타노일, 사이클로헥사노일, 사이클로헵타노일, 메틸사이클로펜타노일, 메틸사이클로헥사노일, 메틸사이클로헵타노일, 사이클로펜테노일, 2,4-사이클로펜타디에노일, 사이클로헥세노일, 2,4-사이클로헥사디에노일, 사이클로헵테노일, 메틸사이클로펜테노일, 메틸사이클로헥세노일 및 메틸사이클로헵테노일 등이 열거된다.
「탄소수 1 내지 6의 알킬기」란, 탄소수 1 내지 6의 직쇄 또는 분기 알킬기를 의미하고, 구체적으로는, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, tert-펜틸, 네오펜틸, 2-펜틸, 3-펜틸, n-헥실, 2-헥실 등이 열거된다.
「탄소수 1 내지 6의 알콕실기」란, 탄소수 1 내지 6의 직쇄 또는 분기 알콕실기를 의미하고, 구체적으로는, 메톡시기, 에톡시기, 프로폭시기, 부톡시기, 펜틸옥시기, 헥실옥시기, 메톡시메톡시기, 메톡시에톡시기, 메톡시프로폭시기, 에톡시에톡시기, 에톡시프로폭시기 등이 열거된다.
「탄소수 1 내지 6의 하이드록시알킬기」란, 알킬기 중의 수소 원자의 일부가 수산기로 치환된, 탄소수 1 내지 6의 직쇄 또는 분기 하이드록시알킬기를 의미하고, 구체적으로는, 하이드록시메틸기, 2-하이드록시에틸기, 3-하이드록시프로필기, 2-하이드록시프로필기, 2-하이드록시-2-메틸프로필기, 4-하이드록시부틸기, 3-하이드록시부틸기, 2-하이드록시부틸기 등이 열거된다.
「탄소수 1 내지 6의 할로알킬기」란, 알킬기 중의 수소 원자의 일부가 할로겐 원자로 치환된, 탄소수 1 내지 6의 직쇄 또는 분기 할로알킬기를 의미하고, 할로겐 원자는, 불소 원자, 염소 원자, 불소 원자 또는 요오드 원자이다. 구체적으로는, 트리플루오로메틸기, 클로로메틸기, 브로모메틸기, 디클로로메틸기, 디플루오로메틸기, 트리클로로메틸기, 2-플루오로에틸기, 2-클로로에틸기, 2-브로모에틸기, 1,1-디플루오로에틸기, 2,2,2-트리플루오로에틸기, 3-클로로프로필기 또는 3-요오드프로필기 등이 열거된다.
「탄소수 1 내지 6의 할로알콕실기」란, 알콕실기 중의 수소 원자의 일부가 할로겐 원자로 치환된, 탄소수 1 내지 6의 직쇄 또는 분기 할로알콕실기를 의미하고, 구체적으로는, 트리플루오로메톡시기, 펜타플루오로에톡시기, 2-클로로에톡시기, 2,2,2-트리플루오로에톡시기, 헵타플루오로-n-프로폭시기, 헵타플루오로-i-프로폭시기, 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로폭시기, 3-플루오로-n-프로폭시기, 1-클로로사이클로프로폭시기, 2-브로모사이클로프로폭시기, 3,3,4,4,4-펜타플루오로-2-부톡시기, 노나플루오로-n-부톡시기, 노나플루오로-2-부톡시기, 5,5,5-트리플루오로-n-펜틸옥시기, 4,4,5,5,5-펜타플루오로-2-펜틸옥시기, 3-클로로-n-펜틸옥시기, 4-브로모-2-펜틸옥시기, 4-클로로부틸옥시기, 2-요오드-n-프로필옥시기 등이 열거된다.
「탄소수 1 내지 6의 할로하이드록시알킬기」란, 하이드록실알킬기 중의 수소 원자의 일부가 할로겐 원자로 치환된, 탄소수 1 내지 6의 직쇄 또는 분기 할로하이드록시알킬기를 의미하고, 구체적으로는, 디플루오로하이드록시메틸, 1,1-디플루오로-2-하이드록시에틸, 2,2-디플루오로-2-하이드록시에틸, 1,1,2,2-테트라플루오로-2-하이드록시에틸기 등이 열거된다.
「프로드럭화를 위해 아미노기에 결합할 수 있는 탈리기」에 있어서의「프로드럭화」란, 그 자체로는 본 발명의 효과가 작거나 또는 발휘되지 않지만, 배지 중에서 및/또는 배양 중에 탈리기가 탈리되어 본 발명의 효과가 발휘되도록 대상 화합물을 변환해 두는 것이며, 본 발명의 효과가 발휘되는 화합물 중의 아미노기와 탈리기 사이에서 배지 중에서 및/또는 배양 중에 탈리기가 탈리되도록 일시적 결합을 형성해 두는 것이다.
「프로드럭화를 위해 아미노기에 결합할 수 있는 탈리기」로서는, 유기 합성 화학 분야에서 사용되는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 할로겐 원자(예, 염소 원자, 브롬 원자, 요오드 원자 등), 설포닐옥시기(예, 메탄설포닐옥시기, 트리플루오로메탄설포닐옥시기, 벤젠설포닐옥시기, p-톨루엔설포닐옥시기 등) 등이 열거된다.
R3-CH가 쉬프 베이스형 아미노기 보호기인 경우, R3은, 할로겐 원자, 하이드록시기, 아릴기, 탄소수 2 내지 30의 아실기, 탄소수 1 내지 6의 알킬기, 탄소수 1 내지 6의 알콕실기, 탄소수 1 내지 6의 하이드록시알킬기, 탄소수 1 내지 6의 할로알킬기, 탄소수 1 내지 6의 할로알콕실기 또는 탄소수 1 내지 6의 할로하이드록시알킬기이다.
「하이드록시기의 보호기」는, 유기 합성 화학 분야에서 사용되는 하이드록시기의 보호기이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 탄소수 1 내지 6의 알킬기(예, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, tert-부틸), 페닐기, 트리틸기, 탄소수 7 내지 10의 아르알킬기(예, 벤질, p-메톡시벤질), 포르밀기, 탄소수 1 내지 6의 알킬-카르보닐기(예, 아세틸, 프로피오닐), 벤조일기, 탄소수 7 내지 10의 아르알킬-카르보닐기(예, 벤질카르보닐), 메톡시메틸, 에톡시에틸, 2-테트라하이드로피라닐기, 2-테트라하이드로푸라닐기, 치환 실릴기(예, 트리메틸실릴, 트리에틸실릴, 디메틸페닐실릴, tert-부틸디메틸실릴, tert-부틸디에틸실릴), 탄소수 2 내지 6의 알케닐기(예, 1-알릴) 등이 열거된다. 또한, 프로드럭화를 위해 하이드록시기에 결합할 수 있는 탈리기도 열거된다.
「프로드럭화를 위해 하이드록시기에 결합할 수 있는 탈리기」에 있어서의「프로드럭화」란, 그 자체로는 본 발명의 효과가 작거나 또는 발휘되지 않지만, 배지 중에서 및/또는 배양 중에 탈리기가 탈리되어 본 발명의 효과가 발휘되도록 대상 화합물을 변환해 두는 것이며, 본 발명의 효과가 발휘되는 화합물 중의 하이드록시기와 탈리기 사이에서 배지 중에서 및/또는 배양 중에 탈리기가 탈리되도록 일시적 결합을 형성해 두는 것이다.
「프로드럭화를 위해 하이드록시기에 결합할 수 있는 탈리기」로서는, 유기 합성 화학 분야에서 사용되는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 할로겐 원자(예, 염소 원자, 브롬 원자, 요오드 원자 등), 설포닐옥시기(예, 메탄설포닐옥시기, 트리플루오로메탄설포닐옥시기, 벤젠설포닐옥시기, p-톨루엔설포닐옥시기 등) 등이 열거된다.
에탄올아민 유연체는, 바람직하게는, 포스포에탄올아민(별명 포스포릴에탄올아민), 모노메틸에탄올아민, 디메틸에탄올아민, N-아실포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜에탄올아민, 및 리조포스파티딜에탄올아민으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 또는 복수이다.
본 발명에 있어서 사용되는 에탄올아민 및/또는 에탄올아민 유연체는, 약학적으로 허용가능한 염의 형태라도 좋다. 이러한 염으로서는, 예를 들면, 화합물 중에 카르복실기 등의 산성기가 존재하는 경우의 산성기에 대해서는, 암모늄염, 나트륨, 칼륨 등의 알칼리 금속과의 염, 칼슘, 마그네슘 등의 알칼리 토금속과의 염, 알루미늄염, 아연염, 트리에틸아민, 모르폴린, 피페리딘, 디사이클로헥실아민 등의 유기 아민과의 염, 아르기닌, 리신 등의 염기성 아미노산과의 염이 열거된다. 화합물 중에 염기성기가 존재하는 경우의 염기성기에 대해서는, 염산, 황산, 인산, 질산, 브롬화수소산 등의 무기산과의 염, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 시트르산, 벤조산, 말레산, 푸말산, 타르타르산, 석신산, 탄닌산, 부티르산, 히벤즈산, 파모산, 에난트산, 데칸산, 테오클산, 살리실산, 락트산, 옥살산, 만델산, 말산 등의 유기 카복실산과의 염, 메탄설폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산 등의 유기 설폰산과의 염을 들 수 있다. 특히 염산염이 바람직하다.
배지 중의 에탄올아민 및/또는 에탄올아민 유연체 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염의 최종 농도(사용시의 농도)는, 피더 프리의 조건하에서, 다능성 줄기 세포의 미분화 유지 증식의 촉진에 작용할 수 있는 한, 임의의 범위로 설정할 수 있다. 그 종류에 따라 상이할 수 있지만, 통상 1μM 내지 1000μM, 바람직하게는 5μM 내지 200μM, 또는 11μM 내지 200μM이다. 1μM 미만이면, 다능성 줄기 세포의 미분화 유지 증식을 촉진시키는 효과가 약해지는 경향이 있다. 또한, 1000μM을 초과하면, 다능성 줄기 세포의 증식 억제를 야기하는 경우가 있다. 배지 중의 에탄올아민 및 에탄올아민 유연체 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 농도는, 통상 1μM 내지 1000μM, 바람직하게는 5μM 내지 200μM, 또는 11μM 내지 200μM이다. 복수종을 사용하는 경우에는 이들의 합계량이 상기 범위내에 있도록 설정되지만, 종류에 따라서는 적절히 증감할 수 있다.
본 발명에 있어서, 에탄올아민 및/또는 에탄올아민 유연체 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나가「피더 프리의 조건하에서, 다능성 줄기 세포의 미분화 유지 증식의 촉진에 작용한다」란, 에탄올아민 및/또는 에탄올아민 유연체 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 함유하지 않는 것 이외에는 동일한 조건으로, 피더 세포의 비존재하에서 배양한 다능성 줄기 세포의 세포수를 기준(100%)으로 하여, 에탄올아민 및/또는 에탄올아민 유연체 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나를 배지에 함유시킨 경우에, 100%를 초과하는 세포수가 수득되는 것을 말한다. 피더 프리의 조건하에서 다능성 줄기 세포의 미분화 유지 증식의 촉진에 작용하는지 여부는, 실시예에 기재된 방법 등의 공지의 세포 증식계를 사용하는 방법으로 평가할 수 있다.
β-머캅토에탄올은 이의 농도가 높으면 독성이 우려된다. 따라서, 본 발명에 있어서 사용되는, β-머캅토에탄올의 농도는 사용시의 최종 농도로서 9μM 이하이다. 보다 바람직하게는 7μM 이하, 더욱 바람직하게는 5μM 이하이다. 또한, β-머캅토에탄올이 실질적으로 함유되어 있지 않거나 또는 함유되지 않는 것이 바람직하다. 본원 발명에서는, 실질적으로 β-머캅토에탄올을 함유하고 있지 않더라도 다능성 줄기 세포의 안정된 미분화 유지 증식이 가능하다.
「β-머캅토에탄올이 실질적으로 함유되지 않는다」의 정의는 상기에 준한다.
본 발명에 있어서 사용되는 배지는, 알부민이 추가로 첨가된 배지라도 좋다. 알부민의 첨가에 의해, 배지의 보존 안정화 효과가 수득됨과 동시에, 에탄올아민에 의한 다능성 줄기 세포의 미분화 유지 증식의 촉진 효과가 증강된다.
여기서, 배지의「보존 안정화」란, 배지의 보존시(통상, -80℃ 정도 내지 40℃ 정도) 및 사용시에 있어서의 배지의 경시 열화가 완화되는 것을 의미한다. 본 발명에 있어서의「배지의 열화」란, 다능성 줄기 세포를 미분화 유지 증식시키는 기능이 저하되는 것이고, 이의 정도는, 후술하는 실시예에 기재되는 바와 같이, 다능성 줄기 세포를 당해 배지 중에서 소정 기간 배양한 후, 세포수를 측정함으로써 평가할 수 있다. 조제 직후의 배지를 사용한 경우를 기준으로 하여, 배양후의 세포수가 적을수록, 배지가 보다 열화되었다고 평가된다.
본 발명에 있어서 사용되는 알부민은, 동물 유래의 혈청 알부민이다. 동물로서는, 예를 들면, 마우스, 래트, 햄스터, 몰모트 등의 설치류 및 토끼 등의 실험 동물, 개 및 고양이 등의 애완 동물, 소, 돼지, 염소, 말 및 양 등의 가축, 인간, 원숭이, 오랑우탄 및 침팬지 등의 영장류 등이 열거되고, 특별히 한정되지 않는다. 재생 의료에 사용되는 세포를 배양하는 경우, 본 발명에 있어서 사용되는 알부민은, 바람직하게는 인간 알부민이다. 또한,「동물 유래」란, 알부민의 아미노산 배열이 동물의 것임을 의미한다.
본 발명에 있어서 사용되는 알부민은, 동물의 생체 시료(예를 들면, 혈액, 혈장, 혈청 등)로부터 단리·정제한 것이라도 좋고, 유전자 재조합 기술에 의해 제조되어 단리·정제된 것이라도 좋다. 알부민의 조제 방법은 공지이다. 또한, 알부민은, 시판품이라도 좋고, 예를 들면, 시그마알드리치사 등으로부터 입수가능하다.
본 발명에 있어서 사용되는 알부민은, 바람직하게는, 동물(인간을 포함함)의 혈장 또는 유전자 재조합 기술로 수득되는 알부민이다.
본 발명에 있어서 사용되는 알부민은, 이의 지방산 담지량이 바람직하게는 9mg/g 이하, 보다 바람직하게는 7mg/g 이하, 더욱 바람직하게는 2.2mg/g 이하이다.
본 발명에 있어서 알부민이 첨가된 배지를 사용하는 경우, 배지 중의 알부민의 최종 농도(사용시의 농도)는, 배지의 안정화 효과가 수득되고, 또한, 에탄올아민 및 에탄올아민 유연체 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나에 의한 다능성 줄기 세포의 미분화 유지 증식의 촉진 효과를 증강시키는 한, 특별히 한정되지 않지만, 통상 0.1g/l 내지 20g/l, 바람직하게는 1g/l 내지 8g/l이다.
본 발명에 있어서 사용되는 배지는, 황산화 당류 및/또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 추가로 첨가된 배지라도 좋다. 황산화 당류를 에탄올아민과 조합하여 배지에 첨가함으로써, 배지의 안정화 효과가 수득되는 동시에, 에탄올아민에 의한 다능성 줄기 세포의 미분화 유지 증식의 촉진 효과가 증강된다. 황산화 당류 및/또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 원하는 바에 따라 복수종을 사용해도 좋다.
본 발명에 있어서,「황산화 당류」는, 당류의 황산화물이다. 「당류」로서는, 당해 기술 분야에서 공지된 것이면 특별히 한정되지 않으며, 또한, 신규의 것이라도 좋다. 당류는, 천연물이라도 합성품이라도 좋다. 본 발명의 배지에 첨가되는 황산화 당류는, 바람직하게는, 황산화 단당, 황산화 이당, 황산화 다당, 황산화 당알코올 또는 황산화 시크리톨이다.
「단당」은, 당해 기술 분야에서 공지된 것이라도, 신규의 것이라도 좋다. 당을 구성하는 탄소의 수는 한정되지 않으며, 예를 들면, 4탄당, 5탄당, 6탄당, 7탄당 등 어느 것이라도 좋다. 단당으로서는, 구체적으로는, 예를 들면, 글루코스, 갈락토스, 만노스, 탈로스, 이도스, 알트로스, 알로스, 글로스, 크실로스, 아라비노스, 람로스, 푸코스, 프락토스, 리보스, 데옥시리보스, 글루코사민, 갈락토사민, 글루크론산, 갈락트론산 등이 열거된다. 황산화 단당은, 이들 단당의 황산화물이다.
「이당」은, 상기 단당 이분자가 글리코시드 결합에 의해 결합하여 1분자가 된 당이며, 당해 기술 분야에서 공지된 것이라도, 신규의 것이라도 좋다. 글리코시드 결합의 양식은 특별히 한정되지 않으며, α-1,2 결합, β-1,2 결합, α-1,3 결합, β-1,3 결합, α-1,4 결합, β-1,4 결합, α-1,5 결합, β-1,5 결합, α-1,6 결합, β-1,6 결합, α-1, α-1 결합, α-1, β-1 결합, α-1, β-2 결합 등 어느 것이라도 좋다. 이당으로서는, 구체적으로는, 예를 들면, 수크로스, 락토스, 말토스, 트레할로스, 셀로비오스, 말티톨 등이 열거된다. 황산화 이당은, 이들 이당의 황산화물이다.
다당은, 상기 단당 3분자 이상이 글리코시드 결합에 의해 결합하여 1분자가 된 당이며, 당해 기술 분야에서 공지된 것이라도, 신규의 것이라도 좋다. 다당은, 상기 당류 중 1종류만으로 구성되는 것이라도 좋고, 2종류 이상이 조합되어 구성되는 것이라도 좋다. 다당은, 직쇄상, 분기상 및 환상의 어느 것이라도 좋다. 다당으로서는, 예를 들면, 아밀로스, 아밀로펙틴, 글리코겐, 덱스트린, α-사이클로덱스트린, β-사이클로덱스트린, γ-사이클로덱스트린, 덱스트란, 말토헵타오스, 스타키오스, 말토트리오스, 플루란, 셀룰로스 및 이의 유도체(예를 들면, 하이드록시에틸셀룰로스, 하이드록시프로필셀룰로스 등), 라미나란, 카드란, 칼로스, 만난, 글루코만난, 갈락토만난, 크실란, 글루크로노크실란, 아라비노크실란, 아라반, 갈락탄, 갈락트로난, 키틴, 키토산, 크실로글루칸, 펙틴산 및 펙틴, 아르긴산, 아라비노갈락탄, 글리코사미노글루칸(예를 들면, 덱스트란황산, 헤파란황산, 헤파린, 히알루론산, 콘드로이틴4-황산, 콘드로이틴6-황산, 델마탄황산, 케타란황산 등), 구아검, 크산탄검, 푸코이단, 이눌린 등이 열거된다. 황산화 다당은, 이들 다당의 황산화물이고, 상기 당류 중 이미 황산화되어 있는 것(예를 들면, 덱스트란황산, 헤파란황산, 헤파린, 콘드로이틴4-황산, 콘드로이틴6-황산, 델마탄황산, 케타란황산, 푸코이단 등)에 관해서는, 당해 당류 자체도 포함된다. 황산화 다당으로서는, 덱스트란황산, 셀룰로스의 황산화물(즉, 셀룰로스SO3H), 크산탄검의 황산화물(즉, 크산탄검SO3H), 푸코이단, 아르긴산의 황산화물(즉, 아르긴산SO3H), 이눌린의 황산화물(즉, 이눌린SO3H), α-사이클로덱스트린의 황산화물(즉, α-사이클로덱스트린SO3H), 말토헵타오스의 황산화물(즉, 말토헵타오스SO3H), 스타키오스의 황산화물(즉, 스타키오스SO3H) 및 말토트리오스의 황산화물(즉, 말토트리오스SO3H)이 바람직하며, 덱스트란황산이 특히 바람직하다.
「당알코올」은, 상기 단당의 카르보닐기가 환원되어 생성되는 화합물이고, 당해 기술 분야에서 공지된 것이라도, 신규의 것이라도 좋다. 당알코올로서는, 예를 들면, 글리세린, 에리스리톨, 트레이톨, 아라비니톨, 크실리톨, 소르비톨, 만니톨, 보레미톨, 페르세이톨 등이 열거되고, 에리스리톨, 크실리톨 및 만니톨이 바람직하다. 황산화 당알코올은, 이들 당알코올의 황산화물이다.
「시크리톨」은, 폴리하이드록시사이클로알칸이고, 환상 당알코올 또는 시클릿이라고도 불린다. 시크리톨은, 당해 기술 분야에서 공지된 것이라도, 신규의 것이라도 좋다. 또한, 시크리톨에는 많은 이성체가 알려져 있지만, 어느 이성체라도 좋다. 환을 구성하는 탄소의 수도 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 6원환이다. 시크리톨로서는, 예를 들면, 이노시톨(1,2,3,4,5,6-사이클로헥산헥사올), 이노시톨의 유도체(하이드록시기를 아미노기, 케톤기, 카르복실기 등으로 치환한 유도체) 등이 열거된다. 황산화시크리톨은, 이들 시크리톨의 황산화물이다.
본 발명에 있어서 배지에 첨가되는 황산화 당류는, 약학적으로 허용가능한 염의 형태라도 좋다. 이러한 염으로서는, 황산화 당류 중에 존재하는 황산기 등과 염기의 염이 열거된다. 구체적으로는, 나트륨염, 칼륨염 등의 알칼리 금속염; 칼슘염, 마그네슘염 등의 알칼리 토금속염; 알루미늄염, 암모늄염 등의 무기 염기염; 트리메틸아민, 트리에틸아민, 피리딘, 피콜린, 2,6-루티딘, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 사이클로헥실아민, 디사이클로헥실아민, N,N'-디벤질에틸렌디아민 등과의 유기 염기염이 열거되고, 프리체로부터 통상적인 방법에 의해 조제할 수 있다. 황산화 당류의 약학적으로 허용가능한 염으로서는, 황산기의 나트륨염 또는 칼륨염이 바람직하며, 예를 들면, 수크로스8SO3K, 덱스트란황산Na(분자량 5,000, 25,000, 50만 등), 셀룰로스SO3Na, 크산탄검SO3Na, 아르긴산SO3Na, 이눌린SO3Na, α-사이클로덱스트린SO3Na, 에리스리톨SO3Na, 만니톨SO3Na, myo-이노시톨6SO3K 등이 열거되고, 덱스트란황산Na가 특히 바람직하다.
본 발명에 있어서, 황산화 당류 및/또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 첨가된 배지를 사용하는 경우, 배지 중의 황산화 당류 및/또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 최종 농도(사용시의 농도)는, 배지의 안정화 효과가 수득되고, 또한, 에탄올아민 및 에탄올아민 유연체 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나에 의한 다능성 줄기 세포의 미분화 유지 증식의 촉진 효과를 증강시키는 한, 특별히 한정되지 않지만, 통상 1 내지 1000ng/ml, 바람직하게는 10 내지 250ng/ml이다. 복수종을 사용하는 경우에는, 이들의 합계량이 상기 범위내에 있도록 설정되지만, 종류에 따라 적절히 증감할 수 있다.
황산화 당류 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 평균 분자량은, 특별히 한정되지 않으며, 채용하는 황산화 당류의 종류와 염의 종류에 따라 상이하지만, 통상 50 내지 100만, 바람직하게는 100 내지 700만, 보다 바람직하게는 300 내지 50만, 가장 바람직하게는 500 내지 10만이다. 평균 분자량이 100만을 초과하면, 일정 농도 이상의 첨가에 의해 독성 또는 세포 접착 저해 등에 의한 것으로 보여지는 세포 증식 억제가 나타나는 경향이 있다. 평균 분자량은, 겔 침투 크로마토그래피 등을 사용하여 측정할 수 있다.
예를 들면, 덱스트란황산Na의 평균 분자량으로서는, 통상 1000 내지 70만, 바람직하게는 1000 내지 30만, 보다 바람직하게는 1000 내지 10만, 가장 바람직하게는 2,500 내지 7,500이다.
본 발명에 있어서 사용되는 배지는, 혈청을 함유하고 있어도, 함유하고 있지 않아도 좋지만, 재생 의료에 사용되는 세포를 배양하는 경우, 혈청이 바이러스 감염원이 될 가능성, 로트 간의 성능차에 의해 배양 결과에 불균일이 발생할 가능성 등이 있기 때문에, 배양을 무혈청 조건하에서 실시하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서 사용되는 배지는, 배양되는 세포와는 상이한 종에 유래하는 성분을 함유하고 있어도, 함유하고 있지 않아도 좋지만, 재생 의료에 사용되는 인간의 세포를 배양하는 경우, 이식후의 안전성의 관점에서, 인간 이외의 동물에 유래하는 성분을 함유하지 않는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서 사용되는 기초 배지로서는, 다능성 줄기 세포의 종류에 따라 자체 공지된 것을 사용할 수 있고, 다능성 줄기 세포의 미분화 유지 증식을 저해하지 않는 한 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, DMEM, EMEM, IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), GMEM(Glasgow's MEM), RPMI-1640, α-MEM, Ham's Medium F-12, Ham's Medium F-10, Ham's Medium F12K, Medium 199, ATCC-CRCM30, DM-160, DM-201, BME, Fischer, McCoy's 5A, Leibovitz's L-15, RITC80-7, MCDB105, MCDB107, MCDB131, MCDB153, MCDB201, NCTC109, NCTC135, Waymouth's MB752/1, CMRL-1066, Williams' medium E, Brinster's BMOC-3 Medium, E8 medium(Nature Methods, 2011, 8, 424-429), 및 이들의 혼합 배지 등이 열거된다. 또한, 다능성 줄기 세포 배양용으로 개변된 배지나, 상기 기초 배지와 다른 배지의 혼합물 등을 사용해도 좋다.
본 발명에 있어서 사용되는 배지는, 자체 공지의 첨가물을 추가로 함유할 수 있다. 첨가물로서는, 다능성 줄기 세포의 미분화 유지 증식을 저해하는 것이 아닌 한 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 성장 인자(예를 들면, 인슐린 등), 철원(예를 들면, 트랜스페린 등), 폴리아민류(예를 들면, 프토레신 등), 미네랄(예를 들면, 세렌산나트륨 등), 당류(예를 들면, 글루코스 등), 유기산(예를 들면, 피루브산, 락트산 등), 아미노산(예를 들면, L-글루타민 등), 환원제(예를 들면, 티오글리콜산나트륨), 비타민류(예를 들면, 아스코르브산, d-비오틴 등), 스테로이드(예를 들면, β-에스트라디올, 프로게스테론 등), 항생 물질(예를 들면, 스트렙토마이신, 페니실린, 겐타마이신 등), 완충제(예를 들면, HEPES 등) 등이 열거된다. 또한, 종래부터 다능성 줄기 세포의 배양에 사용되어 온 첨가물도 적당히 함유할 수 있다. 첨가물은, 각각 자체 공지의 농도 범위 내에서 함유되는 것이 바람직하다.
본 발명의 배양 방법에 있어서는, 피더 세포를 사용해도, 사용하지 않아도 좋다. 재생 의료에 사용되는 세포를 배양하는 경우에는, 이식후의 안전성의 관점에서, 피더 세포를 사용하지 않는 것(피더 프리)이 바람직하다. 어떠한 이론에도 구속되지 않지만, 본 발명의 배양 방법에서는, 통상 피더 세포로부터 배지 중으로 분비되는 에탄올아민을 배지에 첨가하기 때문에, 피더 세포 비존재하에서도 다능성 줄기 세포의 미분화 유지 증식을 촉진시킬 수 있다.
피더 세포를 사용하지 않는 경우, 세포외 기질 또는 이의 활성 단편, 또는 이들의 기능을 모사하는 인공물을 사용하여, 배양을 실시하는 것이 바람직하다.
세포외 기질은, 배양기의 표면과 세포의 접착을 개선할 목적으로 세포의 배양에 통상 사용되는 것이면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, 라미닌(라미닌 511, 라미닌 332 등), 피브로넥틴, 비트로넥틴, 콜라겐, 엘라스틴, 애드헤사민 등의 공지된 것을 사용할 수 있다. 또한, 세포외 기질의 활성 단편은, 당해 세포외 기질과 동등한 세포 접착 활성을 갖는 이의 단편이면 좋으며, 이들도 공지의 것을 사용할 수 있다. 예를 들면, 일본 공개특허공보 제2011-78370호에 개시되어 있는, 라미닌 511의 E8 프래그먼트, 라미닌 332의 E8 프래그먼트 등이 열거된다. 세포외 기질 및 이의 활성 단편은, 시판품이라도 좋고, 예를 들면, (라이프테크놀로지즈, BD 팔콘, 바이오라미나) 등으로부터 입수가능하다. 이들 세포외 기질 및 이의 활성 단편은, 2종류 이상을 조합하여 사용해도 좋다. 또한, 기저막을 과잉 산생하는 마우스 EHS 육종으로부터 추출, 정제한, 단백질이나 다당류를 함유하는 복잡한 기저막 성분의 혼합물인 매트리겔(상품명)을 사용해도 좋다. 세포외 기질 및 이의 활성 단편은, 적당한 용액 중에 현탁하여, 세포를 배양하는데 적합한 용기에 도포하면 좋다.
세포외 기질의 기능을 모사하는 인공물도, 세포의 배양에 통상 사용되는 것이면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, 코닝사의 신세맥스(등록상표)나 울트라웹(등록상표), 시그마알드리치사의 Hy-STEM 시리즈, 폴리리신, 폴리오르니틴 등의 공지의 것을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서 사용되는 세포외 기질 또는 이의 활성 단편, 또는 이들의 기능을 모사하는 인공물은, 바람직하게는 매트리겔, 또는 라미닌 511 또는 라미닌 511의 활성 단편이고, 보다 바람직하게는 라미닌 511의 활성 단편(즉, 라미닌 511의 E8 프래그먼트)이다.
본 발명의 배양 방법에 있어서, 세포 파종 방법은 특별히 한정되지 않으며, 콜로니 파종이라도 단일 세포 파종이라도 좋지만, 산업 레벨로 재생 의료용의 다능성 줄기 세포를 제조하기 위해서는, 엄밀하게 순서 및 스케줄이 관리된 조건에서, 복수의 작업자에 의해 작업이 이루어질 필요가 있다. 이로 인해, 파종하는 세포수의 엄밀한 조정이 가능한 단일 세포 파종이 바람직하다.
단일 세포 파종을 실시하는 경우, 다능성 줄기 세포의 콜로니를 단일 세포로까지 해리된 후, 배지 중에 파종한다. 단일 세포 파종은, 자체 공지의 방법에 의해 실시하면 좋다. 예를 들면, 세포 박리액(트립신 용액 등)으로 세포간 접착, 세포-기질간 접착을 약하게 한 후, 스크레이퍼(IWAKI사, 9000-220 등) 등으로 세포를 기질로부터 박리하고(이 상태에서 세포는 세포 덩어리를 형성한 상태로 용액 중에 부유하고 있어, 완전한 단일 세포가 아니다), 그 후 피펫팅에 의해 세포를 단일 세포로까지 해리시킨 후, 배지에 파종하면 된다. 파종시에는, 다능성 줄기 세포의 생존을 위해, Y-27632(나카라이테스크사: 08945-84) 등의 ROCK 저해제를 배지에 첨가해 두는 것이 바람직하다. ROCK 저해제는, 파종 다음날 이후에는, 다능성 줄기 세포의 증식에 필요없기 때문에, 배지로부터 제거하는 것이 바람직하다.
기타 배양 조건은, 적당히 설정할 수 있다. 예를 들면, 배양 온도는, 특별히 한정되는 것은 아니지만 약 30 내지 40℃, 바람직하게는 약 37℃일 수 있다. CO2 농도는, 약 1 내지 10%, 바람직하게는 2 내지 5%일 수 있다. 산소 분압은, 1 내지 10%일 수 있다.
세포 배양에 있어서는, 배양 성분의 열화, 세포로부터 배출되는 노폐물의 축적 등의 이유에 의해, 배양 중에 배지 교환을 필요로 하는 경우가 있는데, 본 발명의 배양 방법에 있어서는, 실시예에 나타내는 바와 같이, 배지 교환을 생략하는 것도 가능하다. 예를 들면, 배지 교환을 실시하지 않고 연속적으로 4일간 이상(4일, 5일, 6일 등), 다능성 줄기 세포를 배양할 수 있다.
일 형태에 있어서, 본 발명은, 에탄올아민 및 에탄올아민 유연체 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나가 첨가되고, 또한, 황산화 당류 및/또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 첨가되는 것을 특징으로 하는 배지 중에서 다능성 줄기 세포를 배양하는 공정을 포함하는, 다능성 줄기 세포의 미분화 유지 증식을 위한 배양 방법을 제공한다. 당해 배양 방법에 있어서의 에탄올아민, 에탄올아민 유연체 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염, 및 황산화 당류 및 이의 약학적으로 허용가능한 염의 정의는 상기와 같으며, 이들의 사용 농도도 상기에 준한다. 또한, 당해 배양 방법에 관한 다른 조건도 상기와 같다.
(다능성 줄기 세포 증식용 배지의 보존 안정화 방법)
본 발명은, 또한, 에탄올아민 및 에탄올아민 유연체 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나를 첨가하고, 또한, 황산화 당류 및/또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 첨가하는 것을 포함하는, 다능성 줄기 세포 증식용 배지의 보존 안정화 방법(이하, 본 발명의 안정화 방법이라고도 칭한다)을 제공한다.
본 발명에 있어서, 배지의「보존 안정화」란, 배지의 보존시(통상, -80 내지 40℃)에 있어서의 배지의 경시 열화가 완화되는 것을 의미한다. 여기서, 「배지의 열화」란, 다능성 줄기 세포를 미분화 유지 증식시키는 기능이 저하되는 것이며, 그 정도는, 후술하는 실시예에 기재되는 바와 같이, 다능성 줄기 세포를 당해 배지 중에서 소정 기간 배양한 후, 세포수를 측정함으로써 평가할 수 있다. 조제 직후의 배지를 사용한 경우를 기준으로 하여, 배양후의 세포수가 적을 수록, 배지가 보다 열화된 것으로 평가된다.
본 발명에 있어서의 다능성 줄기 세포 증식용 배지는, 상기 본 발명의 배양 방법에 있어서 사용되는 배지와 같으며, 바람직하게는, 다능성 줄기 세포의 미분화 유지 증식용 배지이다.
배지의 보존 안정화를 위해 배지에 첨가되는, 에탄올아민 및 에탄올아민 유연체 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염은, 상기 본 발명의 배양 방법에 있어서 사용되는 것과 같다. 배지 중으로의 첨가 농도도, 상기 본 발명의 배양 방법에 있어서의 첨가 농도와 같다. 배지에 에탄올아민 및 에탄올아민 유연체 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 첨가함으로써, 첨가후의 배지를 안정화할 수 있다.
본 발명의 안정화 방법은, 또한, 황산화 당류 및/또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 첨가하는 공정을 포함한다. 황산화 당류 및/또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은, 상기 본 발명의 배양 방법에 있어서 사용되는 것과 같다. 배지 중으로의 첨가 농도도, 상기 본 발명의 배양 방법에 있어서의 첨가 농도와 같다. 에탄올아민 및 에탄올아민 유연체 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나와 황산화 당류 및/또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 조합하여 배지에 첨가함으로써, 더욱 배지의 안정성을 높이는 것이 가능하다.
본 발명에 의하면, 배지 조제후, 예를 들면, 상온(통상 15 내지 25℃ 정도)에서 8일간 정도까지 보존한 경우, 배지의 열화를 완화할 수 있다. 이로 인해 종래보다도 장기간 배지를 보존하는 것이 가능해져, 본 발명은 다능성 줄기 세포의 제조 등에 있어서 유용하다.
(다능성 줄기 세포의 미분화 유지 증식을 위한 배지 첨가제)
상기 본 발명의 배양 방법에 있어서 기초 배지에 첨가되는 성분은, 배지 첨가제로 할 수 있다. 즉, 본 발명은, 에탄올아민 및 에탄올아민 유연체 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나를 함유하고, 또한, β-머캅토에탄올을 실질적으로 함유하지 않거나 또는 사용시의 농도가 9μM 이하가 되도록 β-머캅토에탄올을 함유하는 다능성 줄기 세포의 미분화 유지 증식을 위한 배지 첨가제(이하, 본 발명의 배지 첨가제라고도 칭한다)를 제공한다.
에탄올아민 및 에탄올아민 유연체 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염은, 상기 본 발명의 배양 방법에 있어서 사용되는 것과 같다.
본 발명의 배지 첨가제의 배지로의 첨가량은, 조제후의 배지를 사용하여 피더 프리의 조건하에서 배양한 경우에, 다능성 줄기 세포의 미분화 유지 증식의 촉진에 작용할 수 있는 한, 임의의 범위로 설정할 수 있지만, 배지 중의 에탄올아민 및 에탄올아민 유연체 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염의 최종 농도가, 통상 1μM 내지 1000μM, 바람직하게는 5μM 내지 200μM, 또는 11μM 내지 200μM이 되도록 첨가하면 좋다.
β-머캅토에탄올은 이의 농도가 높으면 독성이 우려된다. 따라서, 본 발명에 있어서 사용되는, β-머캅토에탄올의 농도는 사용시의 최종 농도로서 9μM 이하이다. 보다 바람직하게는 7μM 이하, 더욱 바람직하게는 5μM 이하이다. 또한, β-머캅토에탄올이 실질적으로 함유되어 있지 않거나 또는 전혀 함유되지 않는 것이 바람직하다. 본원 발명에서는, 실질적으로 β-머캅토에탄올을 함유하고 있지 않아도 다능성 줄기 세포의 안정된 미분화 유지 증식이 가능하다.
「β-머캅토에탄올이 실질적으로 함유되지 않는다」의 정의는 상기에 준한다.
본 발명의 배지 첨가제는, 알부민, 황산화 당류 및/또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 추가로 함유해도 좋다. 이들은, 상기 본 발명의 배양 방법에 있어서 사용되는 것과 같다.
본 발명의 배지 첨가제는, 필요에 따라, 상기 성분 이외의 다른 성분을 함유해도 좋다. 다른 성분으로서는, 배지의 조제시에 통상 사용되는 첨가물이 열거되고, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 상기 본 발명의 제조 방법에 있어서 사용되는 배지에 함유되는 첨가물이 열거된다.
본 발명의 배지 첨가제는, 배양되는 세포와는 상이한 종에 유래하는 성분을 함유하고 있어도, 함유하고 있지 않아도 좋지만, 재생 의료에 사용되는 인간의 세포를 배양하는 경우, 인간 이외의 동물에 유래하는 성분을 함유하지 않는 것이 바람직하다.
본 발명의 배지 첨가제를 사용함으로써, 무혈청·피더 프리·단일 세포 파종 배양에 있어서도 장기간 안정적으로 미분화 유지 증식시키는 것이 가능한 배지를 조제하는 것이 가능하다.
이하, 실시예에 의해, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
이하의 실시예에서는, 각종 피험 화합물에 의한 인간 다능성 줄기 세포의 증식 효과를 평가하였다. 인간 다능성 줄기 세포로서, 특별히 언급이 없는 경우에는, iPS 아카데미아재팬사로부터 구입한 인공 다능성 줄기 세포(iPS 세포) 201B7주를 사용하였다. 세포 배양은, 기저막 매트릭스를 코트한 배양 용기(니혼벡톤디킨슨사, Falcon 배양 샤알레 또는 Falcon 배양 플레이트)를 사용하여, 5% CO2/37℃의 조건으로 실시하였다.
각종 피험 화합물은, 현재 인간 다능성 줄기 세포를 배양하기 위한 최소 조성이라고 생각되는「E8」조성(Nature Methods, 2011, 8, 424-429에서 개시된다)의 배지에, 소정의 농도로 첨가하고, 배양에 사용함으로써, 이의 효과를 검토하였다. 배지는, 「E8」조성으로 이루어진 것으로 여겨지는 Essential 8(라이프테크놀로지즈사: A14666SA)을 사용하여 조제하거나, 동등한 조성이 되도록 조합한 것을 사용하여 조제하였다.
참고예 1 알부민의 배지 안정화 효과
인간 혈청 유래 알부민(시그마알드리치사: A1887)을 최종 농도 2.6g/l로 첨가하고, 조제후 즉시 배양에 사용한 경우와, 조제후 4℃로 3주간 둔 후에 사용한 경우에, 배양후의 세포수를 검토함으로써 알부민의 효과를 검토하였다. 배양 기간은 1주간이다. 1웰당, 13,000개의 생세포를 단일 세포 파종하였다. 기저막 매트릭스로서 오사카대학으로부터 구입한, 라미닌 511의 활성 도메인을 포함하는 단편을 1웰당 5㎍ 코트하였다. 파종시에 사용하는 배지에는 Y-27632를 첨가(최종 농도 10μM, 나카라이테스크사: 08945-84)하였다. 다음날 이후에는 Y-27632를 첨가하고 있지 않은 배지에서 배양하였다. 생세포수 측정은, 트리판블루(라이프테크놀로지즈사: 15250-061) 염색과 혈구 계산반으로 실시하였다.
각각의 배지별로 실험을 3연속으로 실시한 결과의 평균값을 도 1에 도시한다. 조제후 즉시 사용한 경우에는, 알부민 첨가 있음과 없음에서 동등한 세포 증식을 나타내었다. 조제후 3주간 경과한 배지를 사용한 경우에는, 알부민 무첨가의 배지에서는, 거의 세포 증식이 나타나지 않은 것에 대해, 알부민 첨가 배지에서는, 명확한 세포 증식이 확인되었다. 이상의 결과로부터, E8 최소 조성 배지는 통상 사용(보존) 조건하에 3주간 놓여짐으로써, 현저한 성능 저하를 일으키지만, 알부민을 첨가함으로써, 이러한 열화 현상을 개선할 수 있는 것을 알 수 있었다. 따라서, 알부민은, 4℃ 보관에서의 배지의 안정화에 기여하는 것을 알 수 있었다.
실시예 1 에탄올아민의 증식 촉진 효과 및 알부민과의 조합 효과
에탄올아민(시그마알드리치사: E0135)을 최종 농도 6, 30, 150, 750 또는 3,750μM이 되도록 첨가하고, 조제후 즉시 배양에 사용하여, 배양후 세포수를 검토함으로써 에탄올아민의 효과를 검토하였다. 배양 기간은 1주간으로 하였다. 또한, 알부민과의 조합의 효과를 검토하기 위해, 상기 에탄올아민 첨가 배지에, 추가로 인간 혈청 유래 알부민(시그마알드리치사: A1887)을 최종 농도 2.6g/l로 첨가한 것에서도, 같은 검토를 실시하였다. 1웰당, 13,000개의 생세포를 단일 세포 파종하였다. 기저막 매트릭스로서 오사카대학으로부터 구입한, 라미닌 511의 활성 도메인을 포함하는 단편을 1웰당 5㎍ 코트하였다. 파종시에 사용하는 배지에는 Y-27632를 첨가(최종 농도 10μM, 나카라이테스크사: 08945-84)하였다. 다음날 이후에는 Y-27632를 첨가하고 있지 않은 배지에서 배양하였다. 생세포수 측정은, 트리판블루(라이프테크놀로지즈사: 15250-061) 염색과 혈구 계산반으로 실시하였다.
각각의 배지별로 실험을 3연속으로 실시한 결과의 평균값을 도 2에 도시한다. 값은 에탄올아민 무첨가군(0μM)의 평균값에 대한 상대값으로서 나타낸다. 에탄올아민에는 비교적 폭넓은 농도역에서 증식 촉진 효과가 있는 것을 알 수 있었다. 고농도역에서는, 반대로 증식 억제 효과가 나타나는 것을 알 수 있었다. 알부민과의 조합에 의해, 에탄올아민의 증식 촉진 효과가 보다 증강되어, 고농도역에서도 증식 억제 효과가 나타나기 어려워, 증식 촉진 효과를 나타내는 것을 알 수 있었다.
실시예 2 덱스트란황산의 효과
인간 혈청 유래 알부민(시그마알드리치사: A1887)을 첨가(최종 농도 2.6g/l)한 배지에, 에탄올아민(최종 농도 30μM)을 단독으로 첨가하고, 추가로 이 배지에 덱스트란황산나트륨(와코쥰야쿠, 최종 농도 50ng/ml)을 첨가하고, 에탄올아민과 덱스트란황산나트륨의 조합에 의한 가일층의 증식 촉진 효과를 검증하였다. 약 3주간의 배양을 실시하고, 그 동안 2번의 계대를 실시하여, 전 배양 기간에서의 누적 생세포 증가율을 산출하였다. 1웰당, 13,000개의 생세포를 단일 세포 파종하였다. 기저막 매트릭스로서 오사카대학으로부터 구입한, 라미닌 511의 활성 도메인을 함유하는 단편을 1웰당 5㎍ 코트하였다. 파종시에 사용하는 배지에는 Y-27632를 첨가(최종 농도 10μM, 나카라이테스크사: 08945-84)하였다. 다음날 이후에는 Y-27632를 첨가하고 있지 않은 배지에서 배양하였다. 계대시에는, 트리플셀렉트(라이프테크놀로지즈사: 12563-011)로 세포를 박리하고, 다시 Y-27632 첨가 배지에 13,000개의 생세포를 파종하고, 그 다음날 이후에는 Y-27632를 첨가하고 있지 않은 배지에서 배양하였다. 생세포수 측정은, 트리판블루(라이프테크놀로지즈사: 15250-061) 염색과 혈구 계산반으로 실시하였다.
각각의 배지별로 실험을 3연속으로 실시한 결과의 평균값을 도 3에 도시한다. 에탄올아민 단독 첨가의 경우보다, 덱스트란황산나트륨과 조합한 편이, 세포 증가율이 높은 것을 알 수 있었다.
또한, 가장 증가율이 높았던, 에탄올아민과 덱스트란황산나트륨의 양자를 첨가한 배지에서, 약 1개월의 배양을 실시한 후, 알칼리포스파타제 염색을 실시하여, 미분화능 유지의 확인을 실시하였다. 알칼리포스파타제 염색 키트(시그마알드리치사: 86-R)를 사용하여 염색한 결과를 도 4에 도시한다. 웰 전체의 iPS 세포의 콜로니가 염색되었다. 이것에 의해, E8 최소 조성 배지에 알부민, 에탄올아민, 덱스트란황산나트륨을 첨가한 배지에서의 장기 배양에서, iPS 세포는 미분화능을 유지한 상태로 증식되는 것이 확인되었다.
실시예 3 에탄올아민의 증식 촉진 효과- 매트리겔을 사용한 배양의 결과
에탄올아민(시그마알드리치사: E0135)을 최종 농도 6, 30, 150, 750 또는 3,750μM이 되도록 첨가하고, 조제후 즉시 배양에 사용하여, 배양후 세포수를 검토함으로써 에탄올아민의 효과를 검토하였다. 배양 기간은 8일간으로 하였다. 1웰당, 100,000개의 세포를 단일 세포 파종하였다. 기저막 매트릭스로서 매트리겔(니혼벡톤디킨슨사)을 코트하였다. 파종시에 사용하는 배지에는 Y-27632를 첨가(최종 농도 10μM, 나카라이테스크사: 08945-84)하였다. 다음날 이후에는 Y-27632를 첨가하고 있지 않은 배지에서 배양하였다.
각각의 배지별로 실험을 3연속으로 실시한 결과의 평균값을 도 5에 도시한다. 실시예 1과 같이, 에탄올아민이 폭넓은 농도역에서 증식 촉진 효과를 나타내는 것을 보여주는 결과가 수득되었다. 따라서, 에탄올아민의 증식 촉진 효과는, 라미닌 511을 사용한 배양에 한정되는 것은 아님을 알 수 있었다.
실시예 4 에탄올아민과 덱스트란황산나트륨의 조합 효과- 매트리겔을 사용한 배양의 결과
(1) 알부민을 함유한 배지에서의 효과
Essential8에 인간 혈청 유래 알부민(최종 농도 2.6g/l) 및 에탄올아민(최종 농도 30μM)을 함유한 배지(컨트롤), 및, 여기에 덱스트란황산나트륨을 소정의 농도가 되도록 첨가한 배지를 각각 조제하고, 에탄올아민과 덱스트란황산나트륨의 조합 효과를 검증하였다. 배양 기간은 6 내지 12시간으로 하였다. 단일 세포 파종의 경우, 매트리겔을 코트한 12웰 배양 플레이트에 1웰당, 40,000개의 세포를 파종하였다. 파종시에 사용하는 배지에는 Y-27632를 첨가(최종 농도 10μM, 나카라이테스크사: 08945-84)하였다. 다음날 이후에는 Y-27632를 첨가하고 있지 않은 배지에서 배양하였다. 콜로니 상태로 파종하는 경우에는, 매트리겔을 코트한 6웰 배양 플레이트에 1웰당, 본래 배양의 2.5 내지 3.5배 희석이 되는 세포를 파종하였다. 이 경우, 파종시에 사용하는 배지에는 Y-27632를 첨가하지 않았다. 배지 교환을 2 내지 3일마다 실시하였다.
세포 증식의 평가 기준은 이하와 같다.
◎: 세포수가 컨트롤의 그것에 대해 120% 이상
○: 세포수가 컨트롤의 그것에 대해 100% 이상 120% 미만
-: 세포수가 컨트롤의 그것에 대해 50% 이상 100% 미만
×: 세포수가 컨트롤의 그것에 대해 50% 이하
각각의 배지별로 실험을 3연속 실시한 결과를 표 1에 기재한다. 덱스트란황산나트륨을 첨가한 편이, 높은 세포 증식이 나타났다. 따라서, 에탄올아민과 덱스트란황산나트륨의 조합에 의한 세포 증식 촉진 효과도 또한, 라미닌 511을 사용한 배양에 한정되는 것은 아님을 알 수 있었다. 또한, 콜로니 상태로 파종한 경우에도 본 효과는 나타나, 단일 세포 파종한 경우에 한정되는 것도 아님을 알 수 있었다.
Figure 112015083828436-pct00006
(2) 배지 교환을 생략할 수 있는 효과
상기 (1)의 평가에 있어서, 덱스트란황산나트륨(최종 농도 10ng/ml)을 첨가한 배지에서 배지 교환을 실시하지 않고 배양을 실시하여, 에탄올아민과 덱스트란황산나트륨을 조합하여 배지에 첨가함으로써 배지 교환을 생략할 수 있는지 여부를 검증하였다. 배양 기간을 6일간으로 하였다.
각각의 배지별로 실험을 3연속으로 실시한 결과를 도 6에 도시한다. 배지 교환을 실시하지 않는 경우, 덱스트란황산나트륨을 첨가한 편이, 높은 세포 증식이 나타났다. 그 효과는, 덱스트란황산나트륨을 함유하지 않는 배지에서 배지 교환한 경우에 가까운 것이었다. 따라서, 에탄올아민과 덱스트란황산나트륨의 조합에 의해, 배지 교환을 생략할 수 있는 효과를 갖는 것을 알 수 있었다.
(3) 알부민을 함유하지 않는 배지에서의 안정화 효과
Essential8에, 에탄올아민(최종 농도 30μM)을 단독으로 첨가한 배지, 에탄올아민(최종 농도 30μM) 및 덱스트란황산나트륨(와코쥰야쿠, 최종 농도 50ng/ml)을 첨가한 배지, 인간 혈청 유래 알부민(최종 농도 2.6g/l)을 단독으로 첨가한 배지를 각각 조제하고, 에탄올아민과 덱스트란황산나트륨의 조합에 의한 배지 안정화 효과를 검증하였다. 각 배지를 조제후 상온에 8일간 방치한 후에 배양에 사용하였다. 배양 기간은 8일간으로 하였다. 매트리겔을 코트한 6웰 배양 플레이트에 1웰당, 100,000개의 세포를, 단일 세포 파종하였다. 파종시에 사용하는 배지에는 Y-27632를 첨가(최종 농도 10μM, 나카라이테스크사: 08945-84)하였다. 다음날 이후에는 Y-27632를 첨가하고 있지 않은 배지에서 배양하였다.
각각의 배지별로 실험을 3연속으로 실시한 결과의 평균값을 도 7에 도시한다. 에탄올아민과 덱스트란황산나트륨의 양자를 첨가한 경우의 효과는, 알부민을 첨가한 경우와 동등하였다. 따라서, 에탄올아민과 덱스트란황산나트륨의 조합에는, 상온에서의 배지의 안정화 효과가 있는데다가, 배지에 범용되는 알부민을 대체 또는 삭감할 수 있는 가능성이 있음을 알 수 있었다.
실시예 5 에탄올아민 유연체의 효과
(1) O-포스포릴에탄올아민(별명 포스포에탄올아민)의 효과
인간 혈청 유래 알부민(시그마알드리치사: A1887)을 최종 농도 2.6g/l로 첨가한 배지에, O-포스포릴에탄올아민(시그마알드리치사: P0503-25G)을 최종 농도 6, 30, 150 또는 750μM이 되도록 첨가하고, 조제 다음날부터 배양에 사용하여, 배양후 세포수를 검토함으로써 O-포스포릴에탄올아민의 효과를 검토하였다. 배양 기간은 1주간으로 하였다. 1웰당, 13,000개의 생세포를 단일 세포 파종하였다. 기저막 매트릭스로서 오사카대학으로부터 구입한, 라미닌 511의 활성 도메인을 포함하는 단편을 1웰당 4.8㎍ 코트하였다. 파종시에 사용하는 배지에는 Y-27632를 첨가(최종 농도 10μM, 나카라이테스크사: 08945-84)하였다. 다음날 이후에는 Y-27632를 첨가하고 있지 않은 배지에서 배양하였다. 생세포수 측정은, 생사 세포 오토애널라이저 ViCELLTM XR(BECKMAN COULTER사)을 사용하여 실시하였다.
각각의 배지별로 실험을 3연속으로 실시한 결과의 평균값을 도 8에 도시한다. 값은 O-포스포릴에탄올아민 무첨가군(0μM)의 평균값에 대한 상대값으로서 나타낸다. O-포스포릴에탄올아민에는 비교적 폭넓은 농도역에서 증식 촉진 효과가 있는 것을 알 수 있었다.
(2) 2-(메틸아미노)에탄올의 효과
인간 혈청 유래 알부민(시그마알드리치사: A1887)을 최종 농도 2.6g/l로 첨가한 배지에, 2-(메틸아미노)에탄올(시그마알드리치사: 471445-25ML)을 최종 농도 6, 30, 150 또는 750μM이 되도록 첨가하고, 조제 다음날부터 배양에 사용하여, 배양후 세포수를 검토함으로써 2-(메틸아미노)에탄올의 효과를 검토하였다. 배양 기간은 1주간으로 하였다. 1웰당, 13,000개의 생세포를 단일 세포 파종하였다. 기저막 매트릭스로서 오사카대학으로부터 구입한, 라미닌 511의 활성 도메인을 포함하는 단편을 1웰당 4.8㎍ 코트하였다. 파종시에 사용하는 배지에는 Y-27632를 첨가(최종 농도 10μM, 나카라이테스크사: 08945-84)하였다. 다음날 이후에는 Y-27632를 첨가하고 있지 않은 배지에서 배양하였다. 생세포수 측정은, 생사 세포 오토애널라이저 ViCELLTM XR(BECKMAN COULTER사)을 사용하여 실시하였다.
각각의 배지별로 실험을 3연속으로 실시한 결과의 평균값을 도 9에 도시한다. 값은 2-(메틸아미노)에탄올 무첨가군(0μM)의 평균값에 대한 상대값으로서 나타낸다. 2-(메틸아미노)에탄올에는 비교적 폭넓은 농도역에서 증식 촉진 효과가 있는 것을 알 수 있었다.
(3) 2-디메틸아미노에탄올의 효과
인간 혈청 유래 알부민(시그마알드리치사: A1887)을 최종 농도 2.6g/l로 첨가한 배지에, 2-디메틸아미노에탄올(시그마알드리치사: 471453-100ML)을 최종 농도 6, 30, 150 또는 750μM이 되도록 첨가하고, 조제 다음날부터 배양에 사용하여, 배양후 세포수를 검토함으로써 2-디메틸아미노에탄올의 효과를 검토하였다. 배양 기간은 1주간으로 하였다. 1웰당, 13,000개의 생세포를 단일 세포 파종하였다. 기저막 매트릭스로서 오사카대학으로부터 구입한, 라미닌 511의 활성 도메인을 포함하는 단편을 1웰당 4.8㎍ 코트하였다. 파종시에 사용하는 배지에는 Y-27632를 첨가(최종 농도 10μM, 나카라이테스크사: 08945-84)하였다. 다음날 이후에는 Y-27632를 첨가하고 있지 않은 배지에서 배양하였다. 생세포수 측정은, 생사 세포 오토애널라이저 ViCELLTM XR(BECKMAN COULTER사)을 사용하여 실시하였다.
각각의 배지별로 실험을 3연속으로 실시한 결과의 평균값을 도 10에 도시한다. 값은 2-디메틸아미노에탄올 무첨가군(0μM)의 평균값에 대한 상대값으로서 나타낸다. 2-디메틸아미노에탄올은, 비교적 폭넓은 농도역에서 증식 촉진 효과를 나타내지만, 고농도역에서는, 증식 억제 효과가 나타나는 것을 알 수 있었다.
(4) 에탄올아민염산염의 효과
인간 혈청 유래 알부민(시그마알드리치사: A1887)을 최종 농도 2.6g/l로 첨가한 배지에, 에탄올아민염산염(도쿄가세이사: A0298)을 최종 농도 6, 30, 150 또는 750μM이 되도록 첨가하고, 조제 다음날부터 배양에 사용하여, 배양후 세포수를 검토함으로써 에탄올아민염산염의 효과를 검토하였다. 배양 기간은 1주간으로 하였다. 1웰당, 13,000개의 생세포를 단일 세포 파종하였다. 기저막 매트릭스로서 오사카대학으로부터 구입한, 라미닌 511의 활성 도메인을 포함하는 단편을 1웰당 4.8㎍ 코트하였다. 파종시에 사용하는 배지에는 Y-27632를 첨가(최종 농도 10μM, 나카라이테스크사: 08945-84)하였다. 다음날 이후에는 Y-27632를 첨가하고 있지 않은 배지에서 배양하였다. 생세포수 측정은, 생사 세포 오토애널라이저 ViCELLTM XR(BECKMAN COULTER사)을 사용하여 실시하였다.
각각의 배지별로 실험을 3연속으로 실시한 결과의 평균값을 도 11에 도시한다. 값은 에탄올아민염산염 무첨가군(0μM)의 평균값에 대한 상대값으로서 나타낸다. 에탄올아민염산염에는 비교적 폭넓은 농도역에서 증식 촉진 효과가 있는 것을 알 수 있었다.
실시예 6 올레산의 영향
인간 혈청 알부민(Nova Biologics사)의 생리식염수 용액(25%) 40ml에 인산 완충액(pH 7.2)을 40ml 가하였다. 또한, 미리 200℃에서 30분간 가열한 활성탄(5g, 와코쥰야쿠사 제조)을 인산 완충액 20ml로 현탁한 액을 합하여 100ml로 하였다. 4℃에서 3시간 교반한 후, 4℃에서 11,900rpm으로 20분간 원심 분리하였다. 침강된 활성탄을 디켄테이션(decantation)으로 나누고, 반응액을 0.22㎛의 실린지 필터로 여과하였다. 이렇게 하여 탈지방산 처리한 인간 혈청 알부민을 수득하였다. 다음에, 수득된 탈지방산 처리한 인간 혈청 알부민에 올레산을 첨가함으로써, 지방산 담지량이 2.2, 6.5, 21.7mg/g이 되도록 인간 혈청 유래 알부민을 조제하고, 각각의 알부민은, 최종 농도 2.6g/l이 되도록 배지에 첨가하였다(그 경우의 배지 중의 올레산의 최종 농도는 각각 20, 60, 200μM이 된다). 각 배지에는 에탄올아민(최종 농도 30μM)을 첨가하였다. 각 배지를 사용하여 세포를 1주간 배양하고, 배양후의 세포수를 확인함으로써 올레산의 영향을 검토하였다. 1웰당, 13,000개의 생세포를 단일 세포 파종하였다. 기저막 매트릭스로서 오사카대학으로부터 구입한, 라미닌 511의 활성 도메인을 포함하는 단편을 1웰당 4.8㎍ 코트하였다. 파종시에 사용하는 배지에는 Y-27632를 첨가(최종 농도 10μM, 나카라이테스크사: 08945-84)하였다. 다음날 이후에는 Y-27632를 첨가하고 있지 않은 배지에서 배양하였다. 생세포수 측정은, 생사 세포 오토애널라이저 ViCELLTM XR(BECKMAN COULTER사)를 사용하여 실시하였다.
각각의 배지를 사용하여 배양한 결과를 도 12에 도시한다. 알부민의 올레산 담지량이 증가함에 따라 세포 증식이 억제되는 것을 알 수 있었다.
[산업상의 이용가능성]
본 발명에 의하면, 다능성 줄기 세포를 안정적으로 효율적으로 증식시킬 수 있어, 무혈청·피더 프리·단일 세포 파종 배양에 있어서도 장기간 안정적으로 미분화 유지 증식시킬 수 있기 때문에, 재생 의료 등의 분야에 있어서 유용하다.
본원은 일본에서 출원된 특허출원 2013-016592(출원일: 2013년 1월 31일)를 기초로 하고 있고, 그 내용은 본 명세서에 모두 포함되는 것이다.

Claims (120)

  1. 에탄올아민, 및 포스포에탄올아민, 모노메틸에탄올아민, 디메틸에탄올아민, N-아실포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜에탄올아민 및 리조포스파티딜에탄올아민으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 에탄올아민 유연체(類緣體), 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나가 첨가되고, β-머캅토에탄올을 함유하지 않거나 β-머캅토에탄올을 9μM 이하의 농도로 함유하는 배지 중에서 다능성 줄기 세포를 배양하는 공정을 포함하는, 다능성 줄기 세포의 미분화 유지 증식을 위한 배양 방법으로서,
    상기 배지 중의 에탄올아민, 에탄올아민 유연체 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 농도가 11μM ~ 200μM이고, 상기 배지가 알부민이 추가로 첨가된 배지이고,
    상기 배지 중의 알부민의 지방산 담지량이 7mg/g 이하인, 배양 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 배지 중의 알부민의 지방산 담지량이 2.2mg/g 이하인, 배양 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 배지가, 황산화 당류 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 추가로 첨가된 배지인, 배양 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 배양이 피더 세포 부재하에서 실시되는, 배양 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 배양이 단일 세포 파종(single cell-seeding)에 의해 실시되는, 배양 방법.
  6. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 배양이 무혈청 조건하에서 실시되는, 배양 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 다능성 줄기 세포가 배아 줄기 세포(ES 세포) 또는 유도된 다능성 줄기 세포(iPS 세포)인, 배양 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 다능성 줄기 세포가 인간 iPS 세포인, 배양 방법.
  9. 에탄올아민, 및 포스포에탄올아민, 모노메틸에탄올아민, 디메틸에탄올아민, N-아실포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜에탄올아민 및 리조포스파티딜에탄올아민으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 에탄올아민 유연체, 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나를 첨가하고, 알부민을 첨가하고, 황산화 당류 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 첨가하는 것을 포함하는, 다능성 줄기 세포의 미분화 유지 증식을 위한 배지의 보존 안정화 방법으로서,
    상기 배지 중의 에탄올아민, 에탄올아민 유연체 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 농도가 11μM ~ 200μM이고, 상기 배지가 β-머캅토에탄올을 함유하지 않거나, β-머캅토에탄올을 9μM 이하의 농도로 함유하고,
    상기 배지 중의 알부민의 지방산 담지량이 7mg/g 이하인, 배지의 보존 안정화 방법.
  10. 제9항에 있어서, 사용시의 황산화 당류 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 최종 농도가 1 ~ 1000ng/ml인, 배지의 보존 안정화 방법.
  11. 제9항에 있어서, 알부민의 지방산 담지량이 2.2mg/g 이하인, 배지의 보존 안정화 방법.
  12. 에탄올아민, 및 포스포에탄올아민, 모노메틸에탄올아민, 디메틸에탄올아민, N-아실포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜에탄올아민 및 리조포스파티딜에탄올아민으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 에탄올아민 유연체, 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하고, β-머캅토에탄올을 함유하지 않거나 β-머캅토에탄올을 9μM 이하의 농도로 함유하는, 다능성 줄기 세포의 미분화 유지 증식을 위한 배양 배지로서,
    상기 배지 중의 에탄올아민, 에탄올아민 유연체 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 농도가 11μM ~ 200μM이고, 상기 배지가 알부민이 추가로 첨가된 배지이고,
    상기 배지 중의 알부민의 지방산 담지량이 7mg/g 이하인, 배양 배지.
  13. 제12항에 있어서, 알부민의 지방산 담지량이 2.2mg/g 이하인, 배양 배지.
  14. 제12항에 있어서, 상기 배지가, 황산화 당류 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 추가로 첨가된 배지인, 배양 배지.
  15. 제12항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 다능성 줄기 세포의 미분화 유지 증식이 피더 세포를 사용하지 않는 조건하에서 실시되는, 배양 배지.
  16. 제12항에 있어서, 상기 다능성 줄기 세포가 배아 줄기 세포(ES 세포) 또는 유도된 다능성 줄기 세포(iPS 세포)인, 배양 배지.
  17. 제12항에 있어서, 상기 다능성 줄기 세포가 인간 iPS 세포인, 배양 배지.
  18. 에탄올아민, 및 포스포에탄올아민, 모노메틸에탄올아민, 디메틸에탄올아민, N-아실포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜에탄올아민 및 리조포스파티딜에탄올아민으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 에탄올아민 유연체, 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하고, β-머캅토에탄올을 함유하지 않거나 사용시 β-머캅토에탄올을 9μM 이하의 농도로 함유하고, 알부민을 추가로 포함하는, 다능성 줄기 세포의 미분화 유지 증식을 위한 배지 첨가제로서,
    상기 배지 중의 에탄올아민, 에탄올아민 유연체 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 사용시의 농도가 11μM ~ 200μM이고,
    상기 배지 중의 알부민의 지방산 담지량이 7mg/g 이하인, 배지 첨가제.
  19. 제18항에 있어서, 알부민의 지방산 담지량이 2.2mg/g 이하인, 배지 첨가제.
  20. 제18항에 있어서, 황산화 당류 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 추가로 포함하는, 배지 첨가제.
  21. 제20항에 있어서, 사용시의 황산화 당류 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 최종 농도가 1 ~ 1000ng/ml인, 배지 첨가제.
  22. 제18항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 다능성 줄기 세포의 미분화 유지 증식이 피더 세포를 사용하지 않는 조건하에서 실시되는, 배지 첨가제.
  23. 제18항에 있어서, 실질적으로 인간 이외의 동물 유래 성분을 포함하지 않는, 배지 첨가제.
  24. 제18항에 있어서, 상기 다능성 줄기 세포가 배아 줄기 세포(ES 세포) 또는 유도된 다능성 줄기 세포(iPS 세포)인, 배지 첨가제.
  25. 제18항에 있어서, 상기 다능성 줄기 세포가 인간 iPS 세포인, 배지 첨가제.
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