KR102209386B1

KR102209386B1 - 호모해링토닌을 유효성분으로 함유하는 대사질환 예방 또는 치료용 약학조성물

Info

Publication number: KR102209386B1
Application number: KR1020200003215A
Authority: KR
Inventors: 정한별; 김재룡; 박소영; 차혜나; 김억천
Original assignee: 영남대학교 산학협력단
Priority date: 2020-01-09
Filing date: 2020-01-09
Publication date: 2021-02-01

Abstract

본 발명은 호모해링토닌을 유효성분으로 함유하는 대사질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 상기 호모해링토닌이 유효성분으로 함유된 조성물이 투여된 고지방식이로 유도된 비만 생쥐에서 비만 억제와 인슐린 저항성 및 비알콜성 지방간이 개선되는 효과를 확인함에 따라, 상기 호모해링토닌을 유효성분으로 함유하는 조성물은 비만, 당뇨 및 비알콜성 지방간을 포함한 대사질환의 치료제로 제공될 수 있다.

Description

호모해링토닌을 유효성분으로 함유하는 대사질환 예방 또는 치료용 약학조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating metabolic diseases comprising homoharringtonine}

본 발명은 호모해링토닌을 유효성분으로 함유하는 대사질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

현대 생활의 편리함과 식생활 개선으로 비만이 전세계적으로 증가하고 있다. 국민보험공단의 자료에 따르면 2017년 한국인의 비만율은 36.9% 였으며, 특히 남성 비만율은 44%였다. 전세계적으로는 약 5 억명이 비만이라고 알려져 있다. 비만은 인슐린 저항성을 유발하는 가장 중요한 위험인자이며, 인슐린 저항성은 제2형 당뇨병의 원인인자이다. 따라서 비만율의 증가는 당뇨병 발생율의 증가로 이어진다. 당뇨병은 내분비 질환 중 가장 흔한 질환이면서 2017년 사망원인 중 남자에게는 7위, 여자에게는 5위를 차지하는 고위험 질환이다.

비만에 의한 인슐린 저항성은 지방조직에서 유리된 지방산 및 염증성 사이토카인이 인슐린에 의한 세포 내 인슐린 신호전달계를 억제하여 발생한다. 따라서 체중 감소에 의한 지방조직의 감소는 인슐린 저항성과 당뇨병을 호전시키는 것으로 알려져 있다.

현재 알려진 비만 치료는 크게 수술적 치료와 약물요법으로 크게 나눈다. 약물요법으로는 위장관의 지방분해 효소를 억제하여 체내의 지방 흡수를 저해하는 올리스타트 (Orlistat)와 뇌의 신경전달물질을 조절하는 약제인 펜터민 (phentermine), 부프로피온 (bupropion) 등과 최근에 승인된 리라글루티드 (liraglutide) 가 있다. 그러나 이들 약물들은 간 손상, 위장 출혈, 위장염, 신장결석을 비롯한 부작용들이 보고되고 있으며, 심장질환, 호흡기 질환 및 신경계 질환을 발생시킬 위험이 있다. 이러한 부작용이 보고되어 있는 약물들을 대신하여 인체에 안전하고 비만개선 효과가 우수한 비만 치료용 의약품의 개발이 필요한 실정이다.

호모해링토닌은 개비자나무 속 Cephalotaxus hainanensis 에서 분리된 천연물 단일성분으로 만성골수성백혈병 (chronic myeloid leukemia) 치료 보조제로 상용되고 있으며, 작용 기전으로 진핵세포에서 80S 리보솜과 결합하여 사슬연장을 저해함으로써 단백질 생성을 억제하는 것이 보고되어 있으나, 아직까지 항비만 및 항당뇨 효과에 대해서는 전혀 확인된 바 없다.

대한민국 공개특허 제10-2012-0133516호 (2012.12.11. 공개)

본 발명은 종래 백혈병 치료제로 알려진 호모해링토닌을 유효성분으로 함유하는 조성물을 비만, 당뇨병 및 비알콜성 지방간을 포함한 대사질환 예방 또는 치료용 약학조성물로 제공하고자 한다.

본 발명은 호모해링토닌을 유효성분으로 함유하는 대사질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 호모해링토닌을 유효성분으로 함유하는 대사질환 예방 또는 개선용 건강식품을 제공할 수 있다.

본 발명에 따르면 호모해링토닌이 유효성분으로 함유된 조성물을 투여한 고지방식이로 유도된 비만 생쥐에서 비만 억제와 인슐린 저항성 및 비알콜성 지방간이 개선되는 효과를 확인함에 따라, 상기 호모해링토닌을 유효성분으로 함유하는 조성물은 비만, 당뇨 및 비알콜성 지방간을 포함한 대사질환의 치료제로 제공될 수 있다.

도 1은 실험 과정을 나타낸 모식도로, 고지방식이 급여 후 6주부터 복강으로 일주일에 세 번 0.2 mM/100 μl 호모해링토닌을 투여하였으며, 6 주간 약물 주입 후 대사율 측정, 복강 내 당부하 검사 및 hyperinsulinemic-euglycemic clamp 실험을 수행하였다.
도 2는 고지방식이와 호모해링토닌 투여에 따른 축적된 식이섭취량과 체중 변화를 확인한 결과로, 도 2A는 시간에 따른 축적된 식이섭취량, 도 2B는 체중의 변화를 나타낸 결과이다. 정상식이군(chow diet)에 비하여 고지방식이군에서 섭취량이 적은 것은 고지방식이의 단위 g당 칼로리가 정상식이에 비하여 높기 때문이라 생각된다. 고지방식이 약물대조군과 약물투여군 사이에 식이섭취량은 유의한 차이가 없었다. 고지방식이 섭취 일주일 후에 정상식이군과 비교하여 고지방식이군의 체중이 유의하게 증가하기 시작하였으며 이 결과로 고지방식이에 의해 비만이 유도됨을 알 수 있었다. 약물 주입 3 주후에 고지방식이 약물대조군에 비하여 약물투여군의 체중이 유의하게 감소되었으며, 약물 주입 7주까지 이러한 경향이 유지되었다 (t-test). 고지방식이 약물투여군은 고지방식이 섭취에도 불구하고 체중 증가가 미미하였다. 결과는 평균±표준오차로 나타내었으며, 그룹 당 샘플의 수는 정상식이군 9마리, 고지방식이 약물대조군 19 마리, 고지방식이 약물투여군 20 마리였다. CHOW, chow diet; HF, High-fat; HHT, homoherringtonine; PBS, phosphate buffered saline. *p<0.05, ***p<0.001, and ****p<0.0001.
도 3은 각 조직의 무게를 확인한 결과로, 도 3A는 후복막 지방량, 도 3B는 피하지방량, 도 3C는 갈색 지방량, 도 3D는 오른쪽과 왼쪽의 비복근과 가자미근의 무게를 합한 골격근의 무게, 도 3E는 신장의 무게, 도 3F는 심장의 무게이다. 후복막 지방량과 피하 지방량은 정상식이군에 비하여 고지방식이 약물대조군과 약물투여군에서 모두 증가하였으나 고지방식이 약물대조군에 비하여 약물투여군에서 유의하게 낮게 나타났다. 갈색 지방량은 정상식이군과 비교하여 고지방식이 약물대조군에서 증가하였으나 고지방식이 약물투여군에서는 유의한 증가가 없었으며 고지방식이 약물대조군과 비교하여 약물투여군에서 낮은 경향이었다. 골격근과 신장, 심장의 무게는 실험군 사이에 유의한 차이가 없었다. 이 결과로 약물 주입 후 체중 감소가 지방량의 감소에 의한 것임을 알 수 있었다. 결과는 평균±표준오차로 나타내었으며, 그룹 당 샘플의 수는 정상식이군 5마리, 고지방식이 약물대조군 9 마리, 고지방식이 약물투여군 10 마리였다. BAT, brown adipose tissue; HF, High-fat; HHT, homoherringtonine; PBS, phosphate buffered saline; rWAT, retroperitoneal white adipose tissue; sWAT, subcutaneous white adipose tissue, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, and ****p<0.0001.
도 4는 복강 내 당부하 검사에서 당 주입 후 시간에 따른 혈당과 혈장 인슐린 농도 및 곡선하 면적을 확인한 결과로, 도 5A는 혈당, 도 5B는 혈당의 곡선하 면적, 도 5C는 혈장 인슐린, 도 5D는 혈장 인슐린의 곡선하 면적을 확인한 결과이다. 혈당은 정상식이군에 비하여 고지방식이 약물대조군에서는 모든 시간대에서 증가하였으며 고지방식이 약물투여군은 0분에서만 증가하였다. 고지방식이군 약물대조군에 비하여 고지방식이 약물투여군에서는 모든 시간대에서 유의하게 감소되었으며, 곡선하면적 역시 유사한 결과를 나타내었다. 혈장 인슐린의 변화는 정상식이군에 비하여 고지방식이 두 군에서 모두 유의하게 증가하였으나 고지방식이 약물대조군과 약물투여군 사이에 유의한 차이는 없었다. 인슐린의 곡선하 면적에서도 유사한 결과를 나타내었다. 위의 결과로 고지방식이에 의한 당불내성이 호모해링토닌의 처치에 의하여 개선되고 이는 인슐린 분비와는 연관이 없음을 알 수 있었다. 결과는 평균±표준오차로 나타내었으며, 그룹 당 샘플의 수는 정상식이군 4마리, 고지방식이 약물대조군 10 마리, 고지방식이 약물투여군 9 마리였다. AUC, area under the curve; HF, High-fat; HHT, homoherringtonine; PBS, phosphate buffered saline. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, and ****p<0.0001.
도 5는 hyperinsulinemic-euglycemic clamp를 이용하여 인슐린 민감도를 측정한 결과이다. 혈당은 고지방식이 약물대조군 및 약물투여군에서 각각 112.6±1.8과 116.9±3.8 mg/dl에 고정하였으며 이때 혈장인슐린은 각각 11.6±0.14 와 10.42±0.38 ng/ml이었다. 도 5A는 당주입율(glucose infusion rate;GIR), 도 5B는 전신 당 순환율(whole body glucose turnover rate;WBGT), 도 5C는 간당생성율(hepatic glucose production rate;HGP), 도 5D는 골격근 당섭취율(skeletal muscle glucose uptake rate), 도 5E와 5F는 clamp 중의 혈장 유리지방산과 중성지방을 측정한 결과이다. 혈당을 일정하게 유지하기 위하여 외부에서 주입한 당의 주입율은 약물투여군에서 유의하게 높았으며 전신 당 순환율도 약물투여군에서 유의하게 높았다. 하지만 간에서의 당생성율은 두 군 사이에 차이가 없었다. 골격근에서의 당섭취률도 약물주입군에서 유의하게 높았다. 인슐린을 주입했을 때 혈장의 유리지방산농도가 약물투여군에서 감소되어 있었다. 위의 결과로 호모해링토닌 처치에 의하여 고지방식이에 의한 인슐린 저항성이 개선되었으며 이는 골격근에서의 인슐린 저항성 개선이 주요 기전이었음을 알 수 있다. 결과는 평균±표준오차로 나타내었으며, 그룹 당 샘플의 수는 고지방식이 약물대조군 9 마리, 고지방식이 약물투여군 10 마리였다. HF, High-fat; HHT, homoherringtonine; PBS, phosphate buffered saline. *p<0.05 and **p<0.01.
도 6은 간의 효소농도 및 지방량을 확인한 결과로, 도 6A는 헤마톡실린 에오신 염색을 한 간의 그림, 도 6B는 간의 지방량. 도 6C와 6D는 각각 혈장 glutamic oxaloacetic transaminase (GOT) 농도와 glutamic pyruvic transaminase (GPT) 농도이다. 고지방식이 약물대조군에서는 간세포의 세포질에 염색이 되지 않은 기공이 확인되었으나 호모해링토닌이 처리된 약물투여군에서 기공이 거의 발견되지 않았다. 간조직에서 지방을 추출하여 측정한 결과 중성지방량이 호모해링토닌을 처리한 군에서 유의하게 감소하였다. 혈장 GOT는 정상식이군과 비교하여 고지방식이 약물대조군과 약물투여군에서 모두 증가하였으나 고지방식이 약물대조군과 약물투여군 사이에 유의한 차이는 없었다. GPT는 정상식이군에 비하여 고지방식이군에서 증가하였으나, 호모해링토닌이 처리된 약물투여군에서는 유의하게 감소하는 효과가 확인되었다. 결과는 평균±표준오차로 나타내었으며 그룹 당 샘플의 수는 정상식이군 4 마리, 고지방식이 약물대조군 8~10 마리, 고지방식이 약물투여군 8 마리였다. GOT, glutamic oxalacetic transaminase; GPT, glutamic pyruvate transaminase; HF, High-fat; HHT, homoherringtonine; PBS, phosphate buffered saline. *p<0.05.
도 7은 지방 세포 크기를 확인한 결과로, 지방조직을 헤마톡실린 에오신으로 염색한 후 지방세포의 크기를 측정하였으며, 평균 지방세포의 크기가 고지방식이 약물투여군에서 고지방식이 약물대조군보다 유의하게 작은 것을 확인한 결과이다. 결과는 평균±표준오차로 나타내었으며 그룹 당 샘플의 수는 고지방식이 약물대조군 4 마리, 고지방식이 약물투여군 4 마리였다. HF, High-fat; HHT, homoherringtonine; PBS, phosphate buffered saline. *p<0.05.
도 8은 대사율을 확인한 결과로, 도 8A는 24시간 동안의 산소 소모량, 도 8B는 이산화탄소 생산량, 도 8C는 에너지 소비량을 측정한 것이다. 고지방식이 약물투여군에서 약물대조군에 비하여 산소 소모량, 이산화탄소 생산량, 에너지 소비량이 증가되는 것을 확인하였으며, 위의 결과로 호모해링토닌에 의한 체중 및 지방량 감소가 에너지 소비 증가에 의한 것이라는 것을 알게 되었다. 상기 결과는 평균±표준오차로 나타내었으며 그룹 당 샘플의 수는 고지방식이 약물대조군 7 마리, 고지방식이 약물투여군 8 마리이다. HF, High-fat; HHT, homoherringtonine; PBS, phosphate buffered saline, TG, triglyceride. *p<0.05 and **p<0.01.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

종래의 비만 치료제로 알려진 약물에 대하여 많은 부작용이 보고되어 있어, 본 발명의 연구자들은 보다 안전하고 효과적인 대사질환 치료제를 연구하던 중 Cephalotaxus hainanensis에서 분리된 천연물 단일성분인 호모해링토닌이 고지방식이로 유도된 비만 생쥐에서 인슐린 민감성을 향상시키고, 비만 억제 및 비알콜성 지방간을 개선시키는 효과를 확인함에 따라, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 호모해링토닌을 유효성분으로 함유하는 대사질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공할 수 있다.

상기 대사질환은 당뇨병, 비만, 인슐린저항성 및 비알콜성 지방간으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

상기 호모해링토닌은 인슐린 저항성을 개선시키고, 에너지 소비량 향상을 통하여 체중 및 지방을 감소시킬 수 있다.

상기 약학조성물은 약학조성물 총 100 중량부에 대하여, 호모해링토닌을 0.001 내지 10 중량부로 함유하는 것일 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 호모해링토닌을 유효성분으로 함유하는 약학조성물은 통상적인 방법에 따라 주사제, 과립제, 산제, 정제, 환제, 캡슐제, 좌제, 겔, 현탁제, 유제, 점적제 또는 액제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형을 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.

구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면 상기 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.

상기 호모해링토닌의 바람직한 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 이에 제한되는 것은 아니지만 1일 투여량이 0.01 내지 200 mg/kg, 구체적으로는 0.1 내지 200 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 '대상체'는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

상기 건강식품은 상기 호모해링토닌 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를 들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

상기 건강식품에 함유된 화합물의 유효용량은 상기 치료제의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.

상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제등을 들 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

하기의 참고예는 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 참고예를 제공하기 위한 것이다.

<참고예> 통계분석

실험결과는 평균치와 표준오차로 표기하였고, 통계분석은 GraphPad Prism 7 통계 프로그램 (San Diego, CA, USA)을 이용하였다. 실험군간 차이는 두 군인 경우 t-test를, 세 군인 경우 별다른 언급이 없는 경우 one-way ANOVA 및 Tucky’s post hoc을 이용하여 분석하였다. 통계학적 유의성은 P값이 0.05 미만인 경우로 하였다.

<실시예1> 비만동물 모델에 호모해링토닌 투여 및 체중변화 확인

1. 실험동물 및 비만 유도

8주된 C57BL/6N 생쥐를 코아텍에서 구입하여 무작위로 정상식이군과 고지방식이군으로 나누었다. 고지방식이군은 총 칼로리의 60.3%가 지방, 21.3%가 탄수화물, 18.4%가 단백질로 이루어진 식이를 (#TD.06414, R&D systems, Minneapolis, MN, USA), 정상군은 chow diet를 섭취시켰다. 실험 종료 시까지 22 ± 2℃의 실내온도와 12시간의 명암주기를 조절한 환경에서 사육되었으며, 1주 간격으로 체중과 식사량을 측정하여 발육상태를 확인하였다.

2. 호모해링토닌 투여

도 1과 같은 과정으로 고지방식이 섭취 6주 후에 생쥐를 무작위로 약물대조군과 약물투여군으로 나누고, 투여군에는 호모해링토닌을 대조군에는 인산완충식염수를 복강으로 투여하였다.

호모해링토닌은 영국 TOCRIS사의 제품 10 mg을 다이메틸설폭사이드에 10 mM로 용해시켜 마리 당 0.2 mM (100 μl)을 8주간 주 3회씩 복강으로 투여하였다. 정상군에도 같은 용량의 인산완충식염수를 복강으로 투여하였다.

3. 호모해링토닌 투여에 의한 체중감소 확인

도 2A와 같이 식이섭취량은 단위 그램당 칼로리가 낮은 정상식이(Chow diet)를 고지방식이 보다 양적으로 더 많이 섭취하였으며, 고지방식이 약물투여군과 대조군 사이에 유의한 차이는 나타나지 않았다.

반면, 도 2B를 참고하면 적은 식이섭취량에도 불구하고 정상식이군에 비하여 고지방식이 약물대조군과 고지방식이 약물투여군에서 체중이 더 많이 증가하였다. 고지방식이 6주 후부터 복강으로 호모해링토닌을 투여하였으며, 약물 투여 3주 후부터 약물대조군에 비하여 약물투여군에서 체중이 유의하게 감소하였다.

4. 호모해링토닌 투여에 의한 지방량 감소 확인

도 3A의 후복막 지방량, 도 3B의 피하지방은 백색지방조직으로 정상식이군에 비하여 고지방식이 약물대조군과 약물투여군 모두 증가하였으나 대조군에 비하여 약물투여군에서 유의하게 감소하였다. 도 3C는 갈색지방으로 고지방식이 약물대조군은 정상식이군에 비하여 유의하게 무게가 증가하였으나 호모해링토닌을 투여한 약물투여군은 통계적으로 유의한 변화는 없었다. 도 3D의 뒷다리 골격근량은 모든 실험군 간에 유의한 차이는 없었으며 도 3E와 도 3F의 신장과 심장무게도 실험군 간에 유의한 차이는 없었다.

상기 결과로부터 호모해링토닌 주입에 의한 체중 감소는 지방량 감소에 의한 것으로 확인되었다.

<실시예 2> 호모해링토닌 투여에 따른 당불내성 개선 확인

1. 당부하검사

실시예 1과 같은 과정으로 제작된 비만동물 모델에서 약물 주입 7주차에 당부하검사를 수행하였다.

실험 전날 저녁 7시부터 실험 당일 아침까지 식이 섭취를 중단시킨 후 당부하 검사를 실시하였다. 혈당과 혈장 인슐린은 꼬리에서 채취한 혈액으로 측정하였다. 공복 혈당 및 혈장 인슐린 측정을 위한 혈액을 채취한 후 포도당 1 g/kg 복강으로 투여하였다. 당 주입 후 15, 30, 60, 90 및 120분 째에 혈당을 측정하였고, 15, 30 및 60분 째의 혈장은 인슐린 측정을 위하여 -80℃ 초저온 냉동고에 보관하였다. 혈당은 혈당 측정용 스트립 (Accu-check Active. Roche, Germany)으로 측정하였으며, 인슐린은 ELISA Kit (Millipore, Burlington, ma, USA)을 이용하여 측정하였다.

2. 결과

도 4A는 당을 복강으로 주입 후 시간에 따른 혈당의 변화를 나타낸 것으로 정상식이에 비하여 고지방식이 약물대조군은 측정한 모든 시간에서 유의하게 증가하였다; 유의 수준은 각각 0, 15, 30, 60, 90 및 120분에서 p<0.001, p<0.01, p<0.0001, p<0.0001, p<0.0001 및 p<0.001 이었다. 그러나 고지방식이 약물투여군은 0분을 제외하고 정상식이와 통계적으로 유의한 차이가 없었다. 고지방식이 약물대조군과 약물투여군을 비교할 때 호모해링토닌을 투여한 약물투여군에서 0, 15, 30, 60, 90 및 120분에서 모두 유의하게 낮았다. 또한, 도 4B와 같이 혈당의 곡선아래면적을 나타낸 값은 정상식이군에 비하여 고지방식이 약물대조군에서 유의하게 높았으나 고지방식이 약물투여군에서는 유의한 차이가 나타나지 않았으며, 약물대조군보다 약물투여군에서 유의하게 낮은 것으로 확인되었다.

도 4C의 시간에 따른 혈장 인슐린의 변화는 정상식이군에 비하여 고지방식이 약물대조군과 약물투여군의 모든 시간대에서 유의하게 증가하였으나 고지방식이 약물대조군과 약물투여군 사이에 유의한 차이는 나타나지 않았다. 도 4D의 인슐린의 곡선 아래 면적도 정상식이군에 비하여 고지방식이 약물대조군과 약물투여군 모두 증가하였으나 약물대조군과 투여군 사이에 유의한 차이는 확인되지 않았다.

상기 결과로부터 호모해링토닌의 투여로 당불내성이 개선되었으며, 이는 인슐린의 분비 증가와 관계없는 것으로 확인되었다.

<실시예 3> 호모해링토닌 투여에 의한 인슐린 저항성 개선 확인

1. 인슐린 민감도 측정

실시예 1과 같은 과정으로 제작된 비만동물 모델에서 인슐린 민감도를 hyperinsulinemic-euglycemic clamp로 측정하였다. 상기 방법은 살아있는 생체에서 마취를 하지 않고 인슐린 민감도를 측정하는 방법으로 인슐린 저항성의 원인 조직을 알 수 있는 방법이며 실험적으로 인슐린 민감도를 측정하는 최적의 표준방법으로 알려져 있다.

생쥐를 마취시키고 경정맥으로 관을 삽입한 후 수술에서 회복한 4-5일 후 16시간 굶긴 후 hyperinsulinemic-euglycemic clamp를 수행하였다. 관으로 인슐린과 당을 주입하면서 혈당이 일정하게 유지되도록 주입되는 당의 양을 조절하였다.

이때 ³H-glucose와 ¹⁴C-deoxy glucose를 이용하여 생체 전체의 당 대사와 골격근 및 간의 당대사 변화를 확인하였다. 실험에 종료된 후 마취를 하고 생쥐에서 혈액과 조직을 채취하였다.

2. 결과

도 5A의 당주입율은 인슐린 주입 후 혈당을 110 ~ 120 mg/dl로 유지하기 위하여 주입하는 당의 양으로, 주입 양이 많을수록 인슐린에 민감한 경우이며 고지방식이 약물대조군에 비하여 약물투여군에서 당주입율이 유의하게 높은 것을 확인할 수 있었다. 도 5A와 마찬가지로 도 5B에서는 전신 당 순환율이 약물투여군에서 유의하게 높은 것으로 확인되었다.

상기 결과로부터 호모해링토닌 투여가 생체 전반에서 인슐린 저항성을 개선시켰음이 확인되었다.

또한, 도 5D를 참고하면 약물투여군에서 골격근의 당 섭취율이 증가하였으며, 이에 따라 호모해링토닌에 의한 인슐린 저항성의 개선 이유가 골격근에서의 당섭취 증가에 기인함을 확인하였다.

한편, 도 5C와 같이 간의 당생성율은 두 그룹 간에 차이가 나타나지 않았다. 인슐린은 지방조직의 지방분해를 억제하여 지방산의 농도를 감소시키는데, 도 5E를 참고하면 호모해링토닌 투여에 의하여 지방분해가 억제되었음을 확인할 수 있었으며, 상기 결과로부터 지방조직의 인슐린 저항성이 개선된 것이 확인되었다. 또한, 도 5F와 같이 호모해링토닌 투여에 의해 혈장 중성농도가 감소하는 경향을 확인할 수 있었다.

<실시예 4> 호모해링토닌 투여에 따른 간과 지방 조직 변화 확인

1. 간 조직에서의 중성 지방 농도 측정

실시예 1과 같은 과정으로 제작된 비만동물 모델에 호모해링토닌 투여 후 8주차에 아버틴 (Avertin, 99% 2-2-2 tribromoethanol 1g, 99% tert-amyl alcohol 1ml, saline 39ml)으로 마취시켜 복강 절개 후 간 조직을 적출하였다. 조직은 액체 질소로 급속 냉동시켜 -80℃ 에 보관하였다. 보관한 조직을 0.01% BHT (butylated hydroxyl toluene)를 함유한 20배의 클로로포름:메탄올 (2:1) 용액에서 분쇄하여 약 30초동안 vortex 한 후 4℃ 냉장고에 밤새 보관하였다. 조직을 분쇄한 용액의 3/4 용량만큼의 증류수를 첨가하고 원심분리 한 후 아래 클로로포름 층을 분리하여 동량의 1% 트리톤 (triton) X-100이 포함된 클로로포름을 첨가하였다. 클로로포름을 증발시킨 후 증류수로 녹이고 Triglyceride Reagent와 Free Glycerol Reagent (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 이용하여 550nm 파장의 흡광도로 중성지방의 양을 측정하였으며, 표준용액으로 농도를 계산하였다.

2. 혈장 간 효소의 활성 측정

혈장에서의 간 효소인 GOT (glutamic oxaloacetic transaminase)와 GPT (glutamic pyruvic transaminase) 측정은 GOT/GPT kit (아산셋트, 서울, 대한민국)를 사용하였으며 492nm 파장의 흡광도로 분석하여 Karmen unit로 나타내었다.

3. 조직 표본 제작 및 염색

쥐를 희생시킬 때 간과 지방 조직을 각각 포르말린에 즉각적으로 고정시켰으며 고정시킨 조직을 적당한 크기로 절단하여 파라핀 블럭을 만들었다. Microtome (Leica, Wetzlar, Germany)을 이용하여 5 μm로 블럭을 절단하였다. 슬라이드글라스에 절편을 2-3장씩 부착한 후 건조시키고 헤마톡실린 (hematoxylin), 에오신 (eosin) 염색을 단계별로 진행하였다.

염색된 시료를 40×, 100×의 배율 현미경 (Olympus, Tokyo, Japan)으로 관찰하였으며, DIXI eXcope image S/W 프로그램 (딕씨사이언스, 대전, 대한민국)으로 사진을 도출하였고 지방 조직의 경우 도출한 사진으로 지방세포의 크기를 측정하였다.

4. 결과

헤마톡실린&에오신 염색으로 간 조직을 염색한 결과, 도 6A와 같이 고지방식이 약물대조군에서 약물투여군에 비하여 간세포에 빈 공간이 많이 확인되었으며, 조직의 지방량을 측정한 결과, 도 6D와 같이 고지방식이 약물투여군에서 대조군과 비교하여 유의하게 감소되는 것이 확인되었다.

한편, 혈장에서 간 효소의 활성을 확인한 결과, 도 6C 및 도 6D와 같이 혈장 내 GOT(AST)양은 약물대조군과 투여군 사이에 차이가 나타나지 않은 반면, GPT(ALT)는 고지방식이 약물대조군에 비하여 투여군에서 유의하게 감소되었다.

또한, 지방조직을 염색한 결과 도 7과 같이 지방세포의 크기가 고지방식이 약물대조군에 비하여 약물투여군에서 유의하게 감소되었다.

상기 결과들로부터 호모해링토닌 투여에 의해 비만이 유도된 동물모델의 간의 지방양이 감소되어 간 손상이 억제되었으며, 지방세포의 크기도 감소된 것이 확인되었다.

<실시예 5> 산소 소모량 및 이산화탄소 소모량과 에너지 대사 확인

실시예 1과 같은 과정으로 제작된 비만동물 모델에 호모해링토닌 투여 6주 후에 쥐를 밀폐된 대사분석 시스템 (metabolic cage, Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA)에서 1 마리씩 48 시간동안 사육하였다. 이 때 식이와 식수는 자유롭게 공급하였다. 산소소모량과 이산화탄소 소모량, 에너지 소비량을 METABOLISM software (Harvard Apparatus)로 측정하였으며 각 분석 값을 체중으로 보정하여 대사율을 확인하였다.

그 결과, 도 8A와 같이 산소 소모량은 고지방식이 약물대조군에 비하여 약물투여군에서 증가하였으며, 8B와 같이 이산화탄소 생산량도 유의하게 증가하였다. 마찬가지로 도 8C를 참고하면 에너지 소모량 역시 고지방식이 약물투여군에서 대조군에 비하여 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 호모해링토닌 투여에 의한 비만 억제는 에너지 소모량 증가에 의한 것임이 확인되었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

호모해링토닌을 유효성분으로 함유하는 대사질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 대사질환은 당뇨병, 비만, 인슐린저항성 및 비알콜성 지방간으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 대사질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 호모해링토닌은 인슐린 저항성을 개선시키고, 에너지 소비량 향상을 통하여 체중 및 지방을 감소시키는 것을 특징으로 하는 대사질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 약학조성물은 약학조성물 총 100 중량부에 대하여, 호모해링토닌을 0.001 내지 10 중량부로 함유하는 것을 특징으로 하는 대사질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
호모해링토닌을 유효성분으로 함유하는 대사질환 예방 또는 개선용 건강식품.