KR102194318B1

KR102194318B1 - 아임계 수 처리된 감탄닌을 유효성분으로 함유하는 항염증, 주름개선 및 피부 재생용 조성물

Info

Publication number: KR102194318B1
Application number: KR1020190048710A
Authority: KR
Inventors: 김태완; 예정수; 김석진; 이승환; 김대옥; 이지혜; 서예희; 김민조
Original assignee: 농업회사법인주식회사 네이처팜; 주식회사 엠에스씨; 안동대학교 산학협력단; 경희대학교 산학협력단
Priority date: 2019-04-25
Filing date: 2019-04-25
Publication date: 2020-12-23
Also published as: KR20200125833A

Abstract

본 발명은 아임계 수 처리된 감탄닌을 유효성분으로 함유하는 항염증, 주름개선 및 피부 재생용 조성물에 관한 것으로, 아임계 수 처리된 감탄닌은 아임계 수 처리되지 않은 감탄닌 용해물에 비해 LPS에 의해 유도된 NO 생성을 억제하고, UV에 의해 감소된 피부 재생능을 회복시키며, 콜라겐을 붕괴시키는 인자인 MMP1 및 MMP9의 발현을 감소시키는 효과가 현저하므로, 아임계 수 처리된 감탄닌을 유효성분으로 함유하는 본 발명의 조성물은 항염증, 주름개선 및 피부 재생용 화장품의 소재로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

아임계 수 처리된 감탄닌을 유효성분으로 함유하는 항염증, 주름개선 및 피부 재생용 조성물{Composition for anti-inflammation, anti-wrinkle and skin regeneration containing subcritical water-treated persimmon tannin as effective component}

본 발명은 아임계 수 처리된 감탄닌을 유효성분으로 함유하는 항염증, 주름개선 및 피부 재생용 조성물에 관한 것이다.

염증반응은 외부자극에 대한 생체조직의 방어 반응의 하나로서 여러 가지 질병의 생리 및 병리학적인 과정에 관여하며 외부자극에 의해 손상된 조직을 수복하거나 재생하려는 기전이다. 이런 염증 반응의 특징은 피부 조직 및 관절조직 등 다른 여러 조직에 이화학적, 화학적, 세균학적 변화를 수반하는 것이다.

이런 염증으로 인하여 생기는 증상으로는 발열, 홍진, 부종 등이 있으며 지속적인 염증반응으로 인하여 치매, 심혈관질환, 암, 비만, 관절염, 당뇨병 등 다양한 난치병들을 일으킬 수 있다고 보고되었다. 염증 반응이 일어나게 되면 염증 매개물질들인 산화질소(NO), 프로스타글란딘 E₂(PGE₂), 염증성 사이토카인 등이 분비되며, 산화질소(NO)는 염증반응의 지표물질로서 L-아르기닌에서 산화질소 생성효소(NOS)에 의하여 합성된다. 산화질소(NO)의 형성은 면역반응의 역할도 하지만 리포폴리사카라이드(LPS) 또는 염증성 사이토카인 등에 의해 발현이 유도된 iNOS 에 의해 과다하게 생성된 산화질소(NO)는 염증 반응을 심화시켜 조직의 손상, 유전자 변이, 신경손상 등을 일으킨다.

기존의 항염증제는 크게 스테로이드성 및 비스테로이드성 항염증제로 구분되며, 이 중 대부분의 합성 항염증제는 주작용 이외에 여러 가지 부작용을 수반하는 경우가 많으므로 효과가 탁월하며 부작용이 적은 항염증제의 개발이 절실히 요구되고 있으며, 특히, 산화질소(NO) 발생의 억제를 통한 염증 초기 반응은 항염증제 개발의 주요한 타겟이 되고 있다.

한편, 피부의 노화는 시간의 흐름에 따른 호르몬 분비의 감소 및 세포들의 기능과 활성 저하에 의해 생체 구성 단백질들의 생합성이 감소하여 생기는 내재적 노화 과정과, 공기, 약물, 자외선에 의해 피부가 얇아지며, 주름이 증가되어 탄력이 감소하는 외재적 요인으로 나누어진다. 특히 자외선(ultra violet)은 각종 피부 트러블을 유발시키고 기미, 주근깨, 피부 색소 침착 등의 노화 현상 촉진 및 피부암 등 여러 가지 피부 질환의 원인이 되기도 하며, 주름을 유발시켜 표면을 거칠게 한다.

콜라겐은 피부에 강도와 장력을 부여함으로써, 외부의 자극이나 힘으로부터 피부를 보호하는 역할을 하며, 피부가 자외선에 노출되면서 다양한 기질 단백질 분해 효소인 MMP(matrix metalloproteinase)의 발현이 촉진되고, 증가된 MMP들에 의해 진피층의 콜라겐이 붕괴되면서 피부 노화가 진행되게 된다.

종래 기술에서 사용되고 있는 레티노이드와 같은 주름개선 물질은 안정성이 낮아 화장품의 원료로 이용하는 것에 한계가 있고, 피부 적용 시에 자극 및 발적이 일어날 수 있으므로 사용량이 제한되어 있다. 따라서, 우수한 주름 개선 효과는 물론 안전성이 우수한 물질의 개발이 필요한 실정이다.

또한, 피부는 인체의 일차 방어막으로서 체내의 기관들을 온도와 습도 변화, 자외선, 공해물질 등 외부환경의 자극으로부터 보호해 주며, 체온조절 등의 생체 항상성 유지에 중요한 역할을 한다. 이러한 피부의 표면에 상처가 생길 경우, 피부의 재생 능력은 상처의 회복을 촉진하여 상처를 통한 추가 감염을 방지하며, 피부 표면의 흉터를 줄여주는 역할을 할 수 있다. 따라서 피부 표면의 상처 치료 및 흉터 발생 억제에 효과가 우수하고 인체에 무해하며 제형 안정성이 우수한 피부 재생 촉진용 물질의 개발이 요구되고 있다.

한편, 감의 탄닌은 품종에 관계없이 미숙과에서는 수용성 탄닌으로 존재하며 떫은맛을 낸다. 감이 성숙도가 높아져서 감의 당도가 증가함에 따라 수용성 탄닌 함량은 점차 감소하며 단감의 경우 나뭇가지에 달린 채로 탈삽된다. 탄닌(tannin)은 카키 탄닌(Kaki tannin) 또는 시부올(shibuol)이라 불리는 카테킨(catechin)류로 구성된 축합형 탄닌으로 분류된다. 한편, 감으로부터 얻은 탄닌은 소취(消臭), 통풍예방 효과, 피부미용 효과, 항균작용과 같은 효과가 있음이 알려지고 있다.

한편, 최근 아임계 수를 이용하여 기능성 성분을 추출하는 방법이 알려져 있으나, 감탄닌과 관련된 연구는 거의 없는 실정이다. 아임계 수 추출(subcritical water extraction)은 물의 임계점(374℃, 22.1MPa) 이하의 온도와 압력 조건에서 이온화된 물을 이용하여 물질을 분해하고 추출하는 방법으로 PHWE(pressurized hot water extraction) 또는 PLPW(pressurized low polarity water extraction)라고도 한다. 이러한 아임계 추출의 장점은 사용 용매가 물이라는 점과, 추출에 소요되는 시간이 5~30분 정도로 짧다는 것이며, 페놀 화합물 같은 비극성 물질을 추출하는데 효율적인 것으로 알려져 있다.

한편, 한국공개특허 제2009-0084159호에는 감 추출물 또는 탄닌을 유효성분으로 함유하는 면역관련 질환 치료용 조성물이 개시되어 있지만, 본 발명의 아임계 수 처리된 감탄닌을 유효성분으로 함유하는 항염증, 주름개선 및 피부 재생용 조성물에 대하여 개시된 바 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로, 아임계 수 처리된 감탄닌을 유효성분으로 함유하는 항염증, 주름개선 및 피부 재생용 조성물을 제공하고, 상기 아임계 수 처리된 감탄닌, 특히 160℃의 온도에서 아임계 수 처리된 감탄닌의 항염증, 주름개선 및 피부 재생 효과가 아임계 수 처리되지 않은 감탄닌에 비해 현저하다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 아임계 수 처리된 감탄닌을 유효성분으로 함유하는 항염증, 주름개선 및 피부 재생용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은

1) 떫은 감을 파쇄한 후 물과 혼합하고 실온에서 3~7시간 동안 교반한 후 착즙하는 단계;

2) 상기 단계 1) 이후에, 착즙액을 여과하여 여과액을 획득하는 단계;

3) 상기 단계 2)의 여과액을 효모를 이용하여 45~55℃에서 3~5시간 동안 분해하는 단계;

4) 상기 단계 3)의 효모 분해물을 감압 농축한 후 85~95℃에서 10~20분 동안 살균한 다음 동결건조하는 단계;

5) 상기 단계 4)의 동결건조된 감탄닌 분말을 아임계 추출기에 투입한 후, 물을 주입한 다음 150~170℃가 될 때까지 가열하는 단계; 및

6) 상기 단계 5)에서 가열된 아임계 추출기에 1500~2000psi의 압력을 가해 5~15분 동안 추출하는 단계;를 포함하는 항염, 주름개선 및 피부 재생 효과가 증진된 감탄닌의 제조 방법을 제공한다.

본 발명은 아임계 수 처리된 감탄닌을 유효성분으로 함유하는 항염증, 주름개선 및 피부 재생용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 제조방법으로 제조된 아임계 수 처리된 감탄닌은 아임계 수 처리되지 않은 감탄닌(물 용해물)에 비해 LPS에 의해 유도된 NO 생성을 억제하고, UV 처리에 의해 감소된 피부 재생능을 회복시키며, 콜라겐을 붕괴시키는 인자인 MMP1 및 MMP9의 발현을 감소시키는 효과가 현저하므로, 아임계 수 처리된 감탄닌을 유효성분으로 함유하는 본 발명의 조성물은 항염증, 주름개선 및 피부 재생용 화장료 조성물로 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 아임계 수 처리된 감탄닌의 세포 독성(A) 및 NO(nitric oxide) 생성 억제효과(B)를 마우스 대식세포인 RAW 264.7 세포에서 확인한 결과이다. LPS는 NO 생성 유도 물질이다. CON은 아무것도 처리하지 않은 음성 대조군이고, 각각의 조건으로 제조된 감탄닌은 400㎍/mL 처리하였다. 도면 내 서로 다른 문자 a~h는 서로 유의미한 차이가 있다는 것을 의미하며, p<0.05이다.
도 2는 본 발명의 아임계 수 처리된 감탄닌의 세포 독성(A) 및 세포 재생능(B)을 인간 피부 섬유아세포인 Hs68 세포에서 확인한 결과이다. UV는 세포 재생능 감소 물질이다. CON은 아무것도 처리하지 않은 음성 대조군이고, 각각의 조건으로 제조된 감탄닌은 400㎍/mL 처리하였다. 도면 내 서로 다른 문자 a~e는 서로 유의미한 차이가 있다는 것을 의미하며, p<0.05이다.
도 3은 본 발명의 아임계 수 처리된 감탄닌의 MMP1(A) 및 MMP9(B)의 발현 억제효과를 인간 피부 섬유아세포인 Hs68 세포에서 확인한 결과이다. CON은 아무것도 처리하지 않은 음성 대조군이고, RA(retinoic acid)는 레티노산을 0.3ppm 처리한 군이다. 각각의 조건으로 제조된 감탄닌은 400㎍/mL 처리하였다. 도면 내 서로 다른 문자 a~i는 서로 유의미한 차이가 있다는 것을 의미하며, p<0.05이다.
도 4는 본 발명의 아임계 수 처리된 감탄닌의 사이즈 배재 크로마토그래피 결과이다.

본 발명은 아임계 수 처리된 감탄닌을 유효성분으로 함유하는 항염증, 주름개선 및 피부 재생용 화장료 조성물에 관한 것이다.

상기 아임계 수 처리는 150~170℃의 온도 조건에서 1500~2000psi의 압력으로 처리할 수 있고, 바람직하게는 160℃의 온도 조건에서 1700psi의 압력으로 처리하는 것이지만, 이에 한정하는 것은 아니다.

상기 아임계 수 처리는 5~15분 동안 처리할 수 있고, 바람직하게는 10분 동안 처리하는 것이지만, 이에 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현 예에서, 상기 조성물은 항산화 기능을 나타내는 특징이 있다.

본 발명의 일 구현 예에서, 상기 아임계 수 처리시 용매는 pH 3 내지 pH 11의 물일 수 있고, 바람직하게는 pH 3, pH 7 또는 pH 11의 물인 것이지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현 예에서, 상기 아임계 수 처리된 감탄닌은

(a) 감탄닌 분말에 동량의 규조토를 혼합한 후 유리섬유(glass fiber) 필터에 넣고, 아임계 추출기에 장착된 셀(cell)에 투입한 후, 물을 주입한 다음 150~170℃가 될 때까지 가열하는 단계; 및

(b) 상기 단계 (a)에서 가열된 아임계 추출기에 1500~2000psi의 압력을 가해 5~15분 동안 추출하는 단계;를 포함하여 제조될 수 있고,

바람직하게는

(a) 감탄닌 분말에 동량의 규조토를 혼합한 후 유리섬유(glass fiber) 필터에 넣고, 아임계 추출기에 장착된 셀(cell)에 투입한 후, 물을 주입한 다음 160℃가 될 때까지 가열하는 단계; 및

(b) 상기 단계 (a)에서 가열된 아임계 추출기에 1700psi의 압력을 가해 10분 동안 추출하는 단계;를 포함하여 제조될 수 있으며,

더 바람직하게는

(a) 감탄닌 분말 2g에 동량의 규조토를 혼합한 후 유리섬유(glass fiber) 필터에 넣고, 아임계 추출기에 장착된 셀(cell)에 투입한 후, 100mL의 물을 주입한 다음 160℃가 될 때까지 가열하는 단계; 및

(b) 상기 단계 (a)에서 가열된 아임계 추출기에 1700psi의 압력을 가해 10분 동안 추출하는 단계;를 포함하여 제조될 수 있지만, 이에 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 이루어지는 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들 각 제형으로 이루어진 화장료 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 당업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판-부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 아세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 형광물질, 살진균제, 굴수성 유발물질, 보습제, 방향제, 방향제 담체, 단백질, 용해화제, 당 유도체, 일광차단제, 비타민, 식물 추출물 등을 포함하는 부형제를 추가로 함유할 수 있다.

또한, 본 발명은

6) 상기 단계 5)에서 가열된 아임계 추출기에 1500~2000psi의 압력을 가해 5~15분 동안 추출하는 단계;를 포함하는 항염, 주름개선 및 피부 재생 효과가 증진된 감탄닌의 제조 방법에 관한 것이다.

상기 단계 3)의 효모는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)일 수 있고, 바람직하게는 상용 효모인 라 파리지엔느 레드(La parisienne red)인 것이지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시 예에서, 상기 아임계 수 처리된 감탄닌의 제조방법은

1) 떫은 감을 파쇄한 후 물과 혼합하고 실온(15~25℃)에서 5시간 동안 교반한 후 착즙하는 단계;

2) 상기 단계 1) 이후에, 착즙액을 규조토로 여과하여 여과액을 획득하는 단계;

3) 상기 단계 2)의 여과액을 효모를 이용하여 50℃에서 4시간 동안 분해하는 단계;

4) 상기 단계 3)의 효모 분해물을 감압 농축한 후 90℃에서 15분 동안 살균한 다음 동결건조하는 단계;

5) 상기 단계 4)의 동결건조된 감탄닌 분말을 아임계 추출기에 투입한 후, 물을 주입한 다음 160℃가 될 때까지 가열하는 단계; 및

6) 상기 단계 5)에서 가열된 아임계 추출기에 1700psi의 압력을 가해 10분 동안 추출하는 단계;를 포함하여 제조될 수 있고,

바람직하게는

1) 떫은 감을 파쇄한 후 물과 혼합하고 실온에서 5시간 동안 교반한 후 착즙하는 단계;

5) 상기 단계 4)의 동결건조된 감탄닌 분말 2g에 동량의 규조토를 혼합한 후 유리섬유(glass fiber) 필터에 넣고, 아임계 추출기에 장착된 셀(cell)에 투입한 후, 100mL의 물을 주입한 다음 160℃가 될 때까지 가열하는 단계; 및

6) 상기 단계 5)에서 가열된 아임계 추출기에 1700psi의 압력을 가해 10분 동안 추출하는 단계;를 포함하여 제조하는 것이지만, 이에 제한하는 것은 아니다.

이하, 제조예 및 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 제조예 및 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.

제조예 1. 아임계 수 처리된 감탄닌의 제조

1) 감탄닌의 제조

떫은 감을 파쇄한 후 물과 혼합하고 실온에서 5시간 동안 교반한 후 벨트프레스로 착즙하였다. 그 후 착즙액을 규조토로 여과하여 여과액을 획득하였고, 상기 여과액을 효모(La parisienne red, S.I Lesaffre, France)를 이용하여 50℃에서 4시간 동안 분해하였다. 이후, 효모 분해물을 감압 농축한 다음 90℃에서 15분 동안 살균한 후 동결건조하여 제조한 건조분말 형태의 감탄닌을 (주)MSC에서 제공 받아 사용하였다.

2) 아임계 수 처리된 감탄닌의 제조

아임계 수 처리를 위한 용매로는 pH 7의 증류수, 0.1N HCl을 이용하여 pH를 적정한 pH 3의 증류수 또는 0.1N NaOH를 이용하여 pH를 적정한 pH 11의 증류수를 사용하였고, ASE350 아임계 추출 장치를 이용하였다.

상기 (주) MSC에서 제공받은 동결건조한 감탄닌 2g에 동량의 규조토를 혼합한 후 30mm 유리섬유(glass fiber) 필터에 넣고, 아임계 추출기에 장착된 Zirconium 셀(cell)에 투입하였다.

그 후, 상기 감탄닌이 포함된 셀을 오븐에 투입한 후 100mL의 증류수(pH 3, 7 또는 11)를 주입한 다음 160℃ 또는 180℃가 될 때까지 가열하였다. 그 후 가열된 아임계 추출기의 압력이 1700psi까지 도달하면 10분 동안 추출하여 아임계 수 처리된 감탄닌을 획득하였다.

대조군으로는 상기 동결건조한 감탄닌 2g에 pH 7의 증류수 100mL를 혼합한 후 상온(20±5℃)에서 10분 동안 교반한 다음 원심분리하고, 상등액을 회수하여 아임계 수 처리되지 않은 감탄닌 용해물로 사용하였다.

3) 수율 확인

상기 아임계 수 처리된 감탄닌 및 감탄닌 용해물의 수율을 측정하였다.

상기 아임계 수 처리된 감탄닌의 아임계 수 처리 후 용액 내 가용화 성분 및 감탄닌 용해물의 용액 내 가용화 성분에 따른 수율은 아임계 수 처리된 감탄닌 용액을 동결건조한 후 건조 중량을 구한 다음 추출에 사용한 원료 건물량에 대한 백분율로 계산하였다.

아임계 수 처리 조건에 따른 수율을 확인한 결과, 표 1에 개시된 바와 같이 아임계 수 처리되지 않은 감탄닌 용해물에 비해 아임계 수 처리된 감탄닌의 수율이 증가하는 것을 확인할 수 있었고, 특히 160℃의 온도 조건에서 아임계 수 처리된 감탄닌의 수율이 180℃의 온도 조건에서 아임계 수 처리된 감탄닌에 비해 높았다.

아임계 수 처리에 사용된 용매의 pH에 따른 수율은 큰 차이가 나타나지는 않았으나, 160℃의 온도 조건에서 pH 7의 물을 이용하여 아임계 수 처리된 감탄닌의 수율이 가장 높았다.

수율 측정 결과

처리 조건		용매 pH	수율(%)
물	상온	pH 7	44.13
아임계 수	160℃	pH 3	88.11
		pH 7	89.95
		pH 11	85.52
	180℃	pH 3	79.65
		pH 7	75.49
		pH 11	79.53

실시예 1. 폴리페놀 함량 및 항산화능 확인

제조예 1의 아임계 수 처리된 감탄닌의 폴리페놀 함량 및 항산화능을 확인하였다.

총 폴레페놀 함량은 Gutfiger(1981)의 방법을 변형하여 측정하였다. 제조예 1의 시료 100㎕에 폴린-시오칼투(Folin-Ciocalteau) 용액 100㎕를 가하고 3분간 정치한 다음 1mL의 0.7M Na₂CO₃ 용액을 첨가하였다. 그 후 상기 혼합액을 1시간 동안 반응시킨 후 분광광도계를 사용하여 750nm에서 흡광도를 측정하였다.

항산화능은 ABTS 라디칼 소거능 및 DPPH 라디칼 소거능으로 측정하였다. ABTS 라디칼 소거능은 Blois(1958)의 방법을 변형하여 측정하였으며, 7mM ABTS와 2.45mM 과황산칼륨(potassium persulfate) 용액을 혼합시켜 하루 동안 암소에 방치하여 ABTS^＋를 형성시켰다. 제조예 1의 시료 50㎕에 희석된 ABTS^＋용액 100㎕를 가해 흡광도의 변화를 734nm에서 측정하였다. ABTS 라디칼을 50% 저해시키는 시료의 농도인 RC₅₀값을 구하였다.

DPPH 라디칼 소거능은 Blois(1958)의 방법을 변형하여 측정하였다. 제조예 1의 시료 100㎕에 0.2mM DPPH 용액 50㎕를 가하고 10분 동안 반응시킨 후, 흡광도의 변화를 517nm에서 측정하였다. DPPH 라디칼 소거능은 시료 용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 계산하였으며, DPPH 라디칼을 50% 저해시키는 시료의 농도인 RC₅₀ 값을 구하였다.

총 폴리페놀 함량 및 항산화능은 표 2에 개시한 바와 같다. 아임계 수 처리에 의해 총 폴리페놀 함량 및 라디칼 소거능이 증가하였고, 특히 160℃에서 아임계 수 처리하였을 경우, 180℃에서 아임계 수 처리한 경우에 비해 폴리페놀 함량 및 라디칼 소거능이 증가되었다. 총 폴리페놀 함량은 160℃의 온도 조건에서 pH 7의 물을 이용하여 아임계 수 처리한 경우 가장 우수했고, 라디칼 소거능은 160℃의 온도 조건에서 pH 7 또는 pH 11의 물을 이용하여 아임계 수 처리한 경우 가장 우수하였다.

총 폴리페놀 및 항산화능 측정 결과

처리 조건		용매 pH	폴리페놀 함량 (mg/extract 1g)	라디칼 소거능 RC₅₀(㎍/mL)
처리 조건		용매 pH	폴리페놀 함량 (mg/extract 1g)	ABTs	DPPH
물	상온	pH 7	30.71±0.20	619.88	ND¹⁾
아임계 수	160℃	pH 3	88.76±1.75	213.02	691.13
		pH 7	180.35±0.71	125.08	653.26
		pH 11	180.13±8.66	136.02	550.63
	180℃	pH 3	70.65±0.33	267.17	1230.60
		pH 7	66.65±1.20	225.76	753.9
		pH 11	68.31±0.50	245.37	691.26

¹⁾ ND: not detected

실시예 2. 마우스 대식세포인 RAW 264.7 세포에서 항염증 효과 확인

제조예 1의 아임계 수 처리된 감탄닌의 항염증 효과는 마우스 대식세포인 RAW 264.7 세포에서 확인하였다.

세포 독성을 나타내지 않는 감탄닌의 실험 농도 설정을 위해 Mosmann(1983)의 방법을 이용하여 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazilium bromide) 분석을 진행하였다. 10%(v/v) FBS 및 1%(v/v) 페니실린이 함유된 DMEM 배지를 사용하여 1×10⁶cell/mL로 희석한 RAW 264.7 세포 희석액을 96 웰 플레이트의 각 웰에 200㎕씩 분주하여 24시간 동안 배양한 다음 FBS 및 페니실린이 함유되어 있지 않은 DMEM 배지로 교환한 후, 동일 DMEM 배지로 희석한 제조예 1의 각각의 시료를 400㎍/mL의 농도로 처리하였다. 하루 뒤, MTT 시약을 각 웰 당 20㎕씩 분주하고, 1시간 30분 동안 반응시킨 뒤, 배지를 제거한 다음, 형성된 포르마잔을 DMSO로 녹여 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 400㎍/mL 농도의 시료를 처리하여도 세포 독성이 나타나지 않는 것을 확인하였고(도 1A), 이후, 400㎍/mL 농도의 시료를 RAW 264.7 세포에 처리하여 NO 생성량을 확인하였다.

NO 생성량의 측정을 위해, RAW 264.7 세포를 96 웰 플레이트에 1×10⁶cell/mL로 분주한 후 24시간 배양한 뒤 제조예 1의 시료를 처리하고, 1시간 뒤에 LPS를 처리한 다음 24시간 배양하였다. 배양이 끝나면 배양액 100㎕를 새로운 96 웰 플레이트에 옮겨 담고 100㎕의 그리스(griess)시약을 처리하여 10분 동안 반응시킨 후, 540nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, LPS에 의해 증가된 NO의 생성은 감탄닌을 처리한 경우 감소하였고, 특히 아임계 수 처리되지 않은 감탄닌 용해물에 비해 아임계 수 처리된 감탄닌이 처리된 경우 더욱 현저한 NO 생성 감소효과를 나타냈다. 아임계 수 처리 온도는 160℃에서 180℃로 추출한 경우보다 현저한 NO 생성 저해효과를 나타냈고, 용매의 pH에 따른 NO 생성 저해효과는 크지 않으나, pH 3으로 적정한 물을 이용하여 160℃ 온도에서 아임계 수 처리한 경우 가장 우수한 NO 생성 저해효과를 나타냈다(도 1B).

실시예 3. 인간 피부 섬유아세포 인 Hs68 세포에서 피부 세포 재생능 확인

제조예 1의 아임계 수 처리된 감탄닌의 피부 세포 재생능은 인간 피부 섬유아세포인 Hs68 세포에서 확인하였다.

세포 독성을 나타내지 않는 감탄닌의 실험 농도 설정을 위해 Mosmann(1983)의 방법을 이용하여 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazilium bromide) 분석을 진행하였다. Hs68 세포를 24 웰 플레이트에 1×10⁵cell/mL로 분주하여 37℃, 5% CO₂배양기에서 24시간 배양한 후, 400㎍/mL 농도의 제조예 1의 시료를 처리한 후 이틀간 배양하였다. MTT 분석 방법은 실시예 2와 동일하였으며, 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 확인한 결과, 본 발명의 제조예 1의 시료는 400㎍/mL 농도에서 Hs68 세포에 대한 세포 독성을 나타내지 않는 것을 확인하였다(도 2A). 이후, 피부 세포 재생능을 확인하기 위해, UV가 처리된 Hs68 세포에 400㎍/mL 농도의 시료를 처리하였다.

Hs68 세포를 24 웰 플레이트에 1×10⁵cell/mL로 분주하여 37℃, 5% CO₂배양기에서 24시간 배양한 뒤, 배지를 PBS로 갈아 준 다음 UV를 40초간 쬐었다. 이후 DMEM으로 배지를 교환해 준 뒤 제조예 1의 시료를 400㎍/mL의 농도로 처리하여 이틀간 배양하였다. 그 후 MTT 용액을 3시간 동안 처리한 다음 배지를 제거하고, 생성된 포르마잔을 DMSO로 녹인 뒤 540nm에서 흡광도를 측정하여 피부 세포 재생능을 확인하였다.

그 결과, UV에 의해 감소된 세포 재생능은 아임계 수 처리된 감탄닌에 의해 증가하는 것을 확인하였다. 아임계 수 처리되지 않은 감탄닌 용해물을 처리한 경우, UV 단독 처리군에 비해 오히려 세포 재생능이 더욱 감소하였다.

아임계 수 처리 온도는 160℃에서 180℃로 처리한 경우보다 현저한 피부 세포 재생능을 나타냈고, 용매의 pH에 따른 효과는 거의 없었다(도 2B).

실시예 4. 인간 피부 섬유아세포인 Hs68 세포에서 주름개선 효과 확인

제조예 1의 아임계 수 처리된 감탄닌의 주름개선 효과는 실시예 3의 인간 피부 섬유아세포인 Hs68 세포에서 확인하였다.

기질 단백질 분해 효소인 MMP(matrix metalloproteinase)의 발현 증가는 진피층의 콜라겐 붕괴를 유발하고, MMP 발현 감소를 통해 콜라겐 붕괴를 방지할 수 있으므로, MMP1 및 MMP9의 단백질 발현 양상을 측정하였다.

세포 독성을 나타내지 않았던 400㎍/mL의 농도로 제조예 1의 시료를 처리하였으며, Hs68 세포에서 발현되는 기질 단백질 분해 효소인 MMP1 및 MMP9의 단백질 발현 양상을 측정하기 위해 6 웰 플레이트에 1×10⁵cell/mL이 되게 분주한 다음, 24시간 뒤에 제조예 1의 시료를 처리하고, 48시간 동안 배양한 후, 세포를 회수하여 단백질을 RIPA 버퍼를 이용하여 추출하였다. 추출된 단백질은 10% SDS-폴리아크릴아마이드 젤(polyacrylamide gel)을 이용하여 전기영동을 통해 분자량으로 분리한 뒤, PVDF(polyvinylidene fluoride) 멤브레인으로 젤 상의 단백질을 이동시켰다. 그 후 멤브레인을 5%(w/v) 탈지 우유(skim milk)로 1시간 동안 반응시켜 블로킹(blocking) 하였으며, 1:1000 비율로 희석시킨 MMP1 또는 MMP9 항체와 반응시킨 다음 TBST로 3번 세척한 후 2차 항체와 반응시킨 후 TBST로 3번 세척하고, ECL 용액을 이용해 멤브레인을 감광시켜 현상하였다.

단백질 발현량은 세포유지유전자(housekeeping gene)인 β-액틴으로 보정하여 비교하였다. 그 결과, 160℃의 온도로 아임계 수 처리된 감탄닌은 아임계 수 처리되지 않은 감탄닌 용해물, 180℃의 온도로 아임계 수 처리된 감탄닌에 비해 MMP1 및 MMP9의 발현을 감소시키는 효과가 우수하다는 것을 확인할 수 있었고, 용매의 pH에 따른 차이는 거의 없었다(도 3).

실시예 5. 아임계 수 추출에 따른 감탄닌 저분자화 확인

제조예 1의 추출 조건에 따른 감탄닌의 저분자화를 확인하기 위한 사이즈 배제(Size exclusion) 크로마토그래피 기기분석 조건은 하기 표 3 및 표 4와 같다.

기기분석 조건

Detector	UV-Vis + RI
Wavelength	250, 280 nm
Column	Shodex sugar 803+804 (8.0mm × 300mm, 6 ㎛)
Mobile phase	A 100% Water
Flow rate	0.8 mL/min /60 min
Injection volume	10 ㎕
Temperature	40℃

기기분석 방법

Method editor
Method	Sequence Edit #: 시료 측정 순서 작성
Temperature	160℃
Static time	10min
Rinse volume	60%
Solvent A	Water
Solvent B	Methanol (washing solvent)
Solvent C	-
Cell type	Zr(지르코늄-산 염기 사용가능한 cell)
Solvent saver	Press
Save to	-
Heat	온도 설정에 따라 변경(자동)
Cycles	1
Purge	100S

표준(standard) 물질로 플로란 및 저분자에 해당하는 당(베르바스코오스, 스타키오스, 락토오스, 프룩토오스, 아라비노오스)을 이용하여 분자량에 따른 머무름 시간을 확인하였다.

플로란을 사용하여 6600 Da 이상의 분자량별 피크 변화를 확인하였다. 분자량에 따른 머무름 시간은 하기 표 5에 개시된 바와 같았고, 이를 통해 R² 값이 0.9872인 하기 식 1을 도출할 수 있었다.

또한, 저분자에 해당하는 당을 이용하여 6600 Da 미만의 분자량별 피크 변화를 확인하였다. 분자량에 따른 머무름 시간은 하기 표 6에 개시된 바와 같았고, 이를 통해 R² 값이 0.9906인 하기 식 2를 도출할 수 있었다.

표준 물질 플로란의 분자량별 머무름 시간

플로란	P-5	P-10	P-20	P-50	P-100	P-200	P-400
분자량(Da)	6,600	9,900	23,000	48,800	113,000	200,000	348,000
머무름 시간(분)	26.175	25.241	23.427	21.819	20.282	19.531	18.974

[식 1]

y=6E+09e^-0.53x

y: 분자량, x: 머무름 시간

표준 물질 저분자당의 머무름 시간

	베르바스코오스	스타키오스	락토오스	프룩토오스	아라비노오스
분자량(Da)	828.72	666.58	360.31	180.16	150.13
머무름 시간(분)	31.067	31.136	32.611	34.396	34.738

[식 2]

y=6E+08e^-0.435x

y: 분자량, x: 머무름 시간

그 후, 제조예 1의 각각의 조건으로 처리된 감탄닌의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과는 도 4에 개시된 바와 같고, 이를 바탕으로 머무름 시간이 27분 이하이면 상기 식 1에, 머무름 시간이 27분 초과면 상기 식 2에 대입하여 분자량을 확인하였을 때, 하기 표 7에 개시된 바와 같이 160℃의 온도로 아임계 추출한 감탄닌은 저분자화가 거의 발생하지 않은 것을 확인할 수 있었다. 또한, 180℃의 온도로 아임계 추출한 감탄닌은 pH 3, pH 7 및 pH 11의 물을 이용하여 추출한 경우 저분자화가 일어나 감탄닌 용해물에서는 관측되지 않은 34분 대에 새로운 피크가 확인되었고, 180℃의 온도로 pH 11의 물을 이용하여 아임계 추출한 경우 용해도가 더욱 상승하는 것으로 보아 pH 11의 물을 이용하였을 경우 저분자화가 더욱 잘 일어난 것을 알 수 있었다.

실시예 1 내지 4에 따른 아임계 수 처리된 감탄닌의 효능 평가에서는 저분자화가 일어난 180℃의 온도에서 아임계 수 처리된 감탄닌에 비해 160℃의 온도에서 아임계 수 처리된 감탄닌의 항산화, 항염증, 주름개선 및 피부 재생 효과가 증진되었으므로, 180℃의 온도에서 아임계 수 처리에 의해 새롭게 생성된 저분자 물질에 비해 160℃의 온도에서 아임계 수 처리에 의해 증가된 머무름 시간 15분대의 물질이 감탄닌 효능 증진에 효과적이라는 것을 확인하였다.

처리 조건에 따른 감탄닌 머무름 시간 및 분자량 예측 값

처리 조건		용매 pH	머무름 시간(min)	분자량 예측 값(Da)	피크 면적 값	면적(%)
물	상온	pH 7	14.977	2,141,925	301,435	17.070
			15.830	1,362,900	907,179	51.380
			17.481	568,124	557,046	31.545
아임계 수	160℃	pH 3	15.743	1,427,215	5,351,431	86.860
		pH 3	18.323	363,609	809,660	13.140
		pH 7	15.895	1,316,748	5,653,206	87.380
		pH 7	18.279	372,188	816,176	12.620
		pH 11	15.861	1,340,690	5,762,952	87.870
		pH 11	18.269	374,166	795,819	12.130
	180℃	pH 3	15.995	1,248,777	902,410	30.860
			17.019	725,746	1,225,036	41.900
			18.459	338,323	787,067	26.920
			34.245	204	9,477	0.320
		pH 7	17.346	610,263	1,770,984	62.900
			18.504	330,349	1,037,419	36.860
			34.060	221	6,214	0.220
		pH 11	15.984	1,256,079	970,078	30.440
			17.131	683,919	1,319,895	41.410
			18.464	337,427	887,918	27.860
			34.082	218	9,203	0.290

Claims

(a) 감탄닌 분말에 동량의 규조토를 혼합한 후 유리섬유(glass fiber) 필터에 넣고, 아임계 추출기에 장착된 셀(cell)에 투입한 후, 물을 주입한 다음 150~170℃가 될 때까지 가열하는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)에서 가열된 아임계 추출기에 1500~2000psi의 압력을 가해 5~15분 동안 추출하는 단계;를 포함하여 제조되는 것을 특징으로 하는 아임계 수 처리된 감탄닌을 유효성분으로 함유하는 항염증, 주름개선 및 피부 재생용 화장료 조성물.
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1) 떫은 감을 파쇄한 후 물과 혼합하고 실온에서 3~7시간 동안 교반한 후 착즙하는 단계;
2) 상기 단계 1) 이후에, 착즙액을 여과하여 여과액을 획득하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 여과액을 효모를 이용하여 45~55℃에서 3~5시간 동안 분해하는 단계;
4) 상기 단계 3)의 효모 분해물을 감압 농축한 후 85~95℃에서 10~20분 동안 살균한 다음 동결건조하는 단계;
5) 상기 단계 4)의 동결건조된 감탄닌 분말을 아임계 추출기에 투입한 후, 물을 주입한 다음 150~170℃가 될 때까지 가열하는 단계; 및
6) 상기 단계 5)에서 가열된 아임계 추출기에 1500~2000psi의 압력을 가해 5~15분 동안 추출하는 단계;를 포함하는 항염, 주름개선 및 피부 재생 효과가 증진된 감탄닌의 제조 방법.