KR102193452B1 - 가노마이신 i를 유효성분으로 포함하는 골 손실 억제용 조성물 - Google Patents

가노마이신 i를 유효성분으로 포함하는 골 손실 억제용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 가노마이신 I(ganomycin I)를 유효성분으로 포함하는 골 손실 억제용 조성물에 관한 것으로, 가노마이신 I가 파골세포형성 및 파골세포에 의한 과도한 골 흡수를 현저히 억제시키는 것을 확인함으로써, 본 발명의 가노마이신 I를 골 감소 관련 질환 예방 또는 치료용 의약품 또는 골 감소 관련 질환 개선용 건강기능식품 개발에 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

가노마이신 I를 유효성분으로 포함하는 골 손실 억제용 조성물{Composition comprising ganomycin I for inhibiting of bone loss}
본 발명은 가노마이신 I(ganomycin I)를 유효성분으로 포함하는 골 손실 억제용 조성물에 관한 것이다.
최근 평균수명의 증가로 퇴행성 질환들이 급증하고 있다. 특히나 골(뼈)의 건강은 고령자의 신체적 활동과 밀접하게 연관되어 있어 신체적 건강을 유지하여 삶의 질을 유지하는데 기여함은 물론, 신체적 활동이 억제되었을 때 이차적으로 발생할 수 있는 성인병의 억제와도 밀접한 관련이 있다.
골(bone)은 파골세포(osteoclast)에 의한 파괴 및 흡수, 그리고 조골세포(osteoblast)에 의해 생성이 지속적으로 발생하는 역동적인 조직이다. 따라서 골의 항상성 및 건강을 유지하기 위해서는 파골세포와 조골세포 간의 균형이 중요하며 이 균형의 붕괴는 골 질환을 야기하게 된다. 따라서 골 질환의 예방 및 치료를 위한 방법은 조골세포의 뼈 생성 속도를 촉진 시키거나 파골세포에 의한 뼈 흡수를 억제하는 것이다.
특히나, 노령화에 의한 파골세포와 조골세포 간의 균형 붕괴는 조골세포의 뼈 형성 능력보다 파골세포의 뼈 파괴 능력이 과도하여 항상성이 깨어짐으로써 발생하며, 이는 노령화에 의한 골 질환의 예방 및 치료 방법은 파골세포에 의한 골 흡수를 억제하는 것이 중요하다는 것을 의미한다(Tanaka, Y., et al., 2005).
파골세포는 조혈모세포에서 유래된 대식세포(macrophage)가 M-CSF(macrophage colony-stimulating factor)와 RANKL(receptor activator of nuclear factor-κB ligand)에 의해 여러 분화 단계를 거쳐 생성된다. 파골세포의 전구세포 표면에 존재하는 RNAK(receptor activator of nuclear factor-κB)에 RANKL이 결합하게 되면 TRAF6(TNF receptor associated factor 6), c-Fos 및 NFATc1(nuclear factor of activated T cell c1) 등이 활성화되어 파골세포 분화(differentiation)를 유도하게 된다(Sakae T., et al., 2003). 특히, TRAF6의 유도는 p38, ERK(extracellular-signal regulated kinases), JNK(c-Jun N-terminal kinases) 등과 같은 MAPKs(mitogen-activated protein kinases)와 NF-κB(nuclear factor-κB), c-Fos 및 NFATc1과 같은 파골세포의 분화에 중요한 인자들을 활성화시킨다. 이 중, NFATc1은 파골세포의 분화에 필수적인 중요한 전사인자로 파골세포 지표인 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase), OSCAR(osteoclast-associated receptor), CtsK(cathepsin K), MMP-9(matrix methalloproteinase 9) 및 DC-STAMP(dendritic cell-specific transmembrane protein)등의 발현을 촉진하여 파골세포의 분화 및 기능을 활성화시킨다(Qing Hong, Z., et al., 2013).
영지버섯(Ganoderma lucidum)은 구멍쟁이버섯과에 속하는 버섯으로, 암, 알레르기, 관절염, 고혈압, 간염, 염증 등의 치료에 생약으로 오랫동안 사용되어왔다. 가노마이신 I(ganomycin I)은 영지버섯으로부터 분리한 메로테르페노이드 화합물로, α-글루코시다아제(α-glucosidase), HMG-CoA(hydroxy-methylglutaryl-coenzyme A) 환원효소, HIV 프로테아제(HIV protease) 억제 효과가 있다고 알려져 있다. 또한, 가노마이신 I이 항-당뇨 효과가 있음이 보고되었다.
이에, 본 발명인은 천연물로부터 유래된 활성 화합물을 이용해 골 질환 치료를 연구하는 과정에서, 영지버섯으로부터 분리한 가노마이신 I가 파골세포형성을 억제하고, 파골세포에 의한 과도한 골 흡수를 방지하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성할 수 있었다.
종래 선행기술로서 한국등록특허 제0554387호에는 영지버섯 추출물의 파골세포형성 조절 및 골다공증 치료 효과가 기재되어 있으나, 본 발명의 가노마이신 I의 파골세포형성 조절 효과는 전혀 기재되어 있지 않다.
비특허 문헌인 Wang, K., et al.,(2018)에는 영지버섯으로부터 분리한 가노마이신 I이 기재되어 있으나, 가노마이신 I의 파골세포형성 조절 및 골 질환 치료 효과는 전혀 기재 및 암시되어 있지 않다.
한국등록특허 제0554387호, 골다공증 예방 및 치료용 영지버섯 추출물, 2006. 02. 15. 등록.
Pham, T.B., et al, Isolation of two farnesyl hydroquinones form Ganoderma lucidum (Leyss Ex. Fr.) Karst, Journal of Medicinal Materials-Hanoi, 20(6), 333-336, 2015. Qing Hong, Z., et al., The effect of rotative stress on CAII, FAS, FASL, OSCAR, and TRAP gene expression in osteoclasts, J. Cell Biochem., 114, 388-397, 2013. Sakae, T., et al., Signal transduction pathway regulating osteoclast differentiation and function, J. Bone Miner. Metab., 21, 123-133, 2003. Tanaka, Y., et al., Osteoblasts and osteoclasts in bone remodeling and inflammation, Curr. Drug Targets Inflamm. Allergy, 4, 325-328, 2005. Wang, K., et al., Structural Modification of Natural Product Ganomycin I Leading to Discovery of a α-Glucosidase and HMG-CoA Reductase Dual inhibitor Improving Obesity and Metabolic Dysfunction in Vivo, J. Med. Chem., 61, 3609-3625, 2018.
본 발명의 목적은 가노마이신 I를 유효성분으로 포함하는 골 손실 억제용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명은 하기 화학식 1의 가노마이신 I(ganomycin I)를 유효성분으로 포함하는 골 감소 억제용 조성물에 관한 것이다.
[화학식 1]
Figure 112019043510681-pat00001
상기 가노마이신 I는 파골세포형성(osteoclastogenesis)을 억제시킬 수 있다.
상기 가노마이신 I는 파골세포의 골 흡수(bone resorption)를 억제시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 가노마이신 I 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 골 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 상기 가노마이신 I 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 골 질환 개선용 건강기능식품에 관한 것이다.
상기 골 질환은 골다공증(osteoporosis), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 골감소증(osteopenia), 치주염(periodontitis), 골 융해성 전이(osteolytic metastasis), 골관절염(osteoarthritis), 노인성척추후만증(senile kyphosis) 및 파제트병(paget disease)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 하기 화학식 1의 가노마이신 I를 유효성분으로 포함하는 골 감소 억제용 조성물에 관한 것이다.
[화학식 1]
Figure 112019043510681-pat00002
상기 가노마이신 I는 통상적인 방법에 따라 합성할 수 있으며, 약학적으로 허용 가능한 염으로 제조될 수도 있다. 또한, 영지버섯(Ganoderma lucidum) 추출물로부터 분리, 정제될 수 있다.
상기 영지버섯 추출물은 영지버섯에 물, C1 내지 C4의 저급 알코올, 아세톤, n-헥산, 디클로로메탄 및 에틸아세테이트로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 용매를 가하여 추출할 수 있다. 상기 C1 내지 C4 저급 알코올은 메탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 및 이소부탄올로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 그러나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 영지버섯 추출물로부터 분리된 가노마이신 I는 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정제할 수 있다. 상기 크로마토그래피는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(Silica gel column chromatography), HP-20 컬럼 크로마토그래피(HP-20 column chromatography), RP-18 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(RP-18 silica gel column chromatography), LH-20 컬럼 크로마토그래피(LH-20 column chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피(High-performance liquid chromatography), 역상 컬럼 크로마토그래피(Reverse-phase column chromatography) 중에서 선택하여 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, "골 감소"는 골의 파괴 및 흡수를 담당하는 파골세포와 골의 생성을 담당하는 조골세포 간의 균형이 깨지면서 나타날 수 있는 것으로, 주로 파골세포의 활성화와 파골세포형성 증가에 의한 골 파괴 및 흡수가 과도하여 나타날 수 있다.
상기 가노마이신 I는 파골세포형성 또는 골 흡수를 억제하여 골 감소를 억제할 수 있다.
본 발명에서 있어서, "파골세포형성(osteoclastogenesis)"은 단핵세포 또는 대식세포 전구체가 증식과 분화 과정을 거쳐 골 흡수 기능을 갖는 파골세포가 되는 과정으로, 파골세포의 형성에는 RANKL과 M-CSF가 필수적이다. 또한, 형성된 파골세포는 뼈에 부착함과 동시에 세포외 공간과 골(뼈)을 흡수하는 공간을 구분하기 위해 파골세포의 액틴이 하나의 큰 링(액틴 링, actin ring)으로 조직화된다. 파골세포에 있어서 액틴 링의 형성은 세포가 골을 흡수할 수 있는 능력(bone resorption)에 대한 중요한 지표가 된다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 가노마이신 I 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 골 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
상기 가노마이신 I은 전체 약학 조성물 총 중량에 대하여 바람직하게는 0.001 내지 50중량%, 더 바람직하게는 0.001 내지 40중량%, 가장 바람직하게는 0.001 내지 30중량%로 하여 첨가될 수 있다.
상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균주사용액의 형태로 제형화 하여 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 가노마이신 I에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토즈, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween)-61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 치료 받을 대상의 연령, 성별, 체중, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여 경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 수 있다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 0.1㎎/㎏/일 내지 500㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수 회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 쥐, 가축, 반려동물, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 복강, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 또한 본 발명의 약학 조성물은 천연물 유래의 조성물이기 때문에, 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 가노마이신 I 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 골 질환 개선용 건강기능식품에 관한 것이다.
상기 가노마이신 I는 전체 건강기능식품 총 중량에 대하여 바람직하게는 0.001 내지 50중량%, 더 바람직하게는 0.001 내지 30중량%, 가장 바람직하게는 0.001 내지 10중량%로 하여 첨가될 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 가노마이신 I를 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성식품류 등이 있다.
상기 골 질환은 골 감소 관련 질환일 수 있으며, 상기 골 감소 관련 질환은 골다공증(osteoporosis), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 골감소증(osteopenia), 치주염(periodontitis), 골 융해성 전이(osteolytic metastasis), 골관절염(osteoarthritis), 노인성척추후만증(senile kyphosis) 및 파제트병(paget disease)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 가노마이신 I(ganomycin I)를 유효성분으로 포함하는 골 손실 억제용 조성물에 관한 것으로, 가노마이신 I가 파골세포형성(osteoclastogenesis) 및 파골세포에 의한 과도한 골 흡수를 현저히 억제시키는 것을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명의 가노마이신 I를 골 감소 관련 질환 예방 또는 치료용 의약품 또는 골 감소 관련 질환 개선용 건강기능식품 개발에 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 가노마이신 I의 세포 독성 여부를 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 2는 골수 유래 대식세포(BMM)에서의 RANKL에 의해 유도된 파골세포형성에 서 가노마이신 I(GMI)(A, B) 및 SP600125(JNK 억제제)(C, D)의 파골세포형성 억제 효과를 확인한 결과를 보여주는 것으로, (A, C)는 파골세포의 지표인자인 TRAP이 염색된 파골세포 이미지를, (B, D)는 TRAP이 염색된 파골세포의 수를 그래프로 나타낸 것을 보여주고 있다.
도 3은 Raw264.7 세포에서의 RANKL에 의해 유도된 파골세포형성에서 가노마이신 I(GMI)(A, B) 또는 영지버섯 추출물(C, D)의 파골세포형성 억제 효과를 확인한 결과를 보여주는 것으로, (A, C)는 파골세포의 지표인자인 TRAP이 염색된 파골세포 이미지를, (B, D)는 TRAP이 염색된 파골세포의 수를 그래프로 나타낸 것을 보여주고 있다.
도 4는 Raw264.7 세포에서의 RANKL에 의해 유도된 파골세포형성에서 가노마이신 I(GMI)의 파골세포형성 억제 효과를 파골세포 마커인 CtsK 및 c-Src의 단백질 발현 억제 분석을 통해 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 5는 가노마이신 I(GMI)의 RANKL에 의한 액틴 고리 형성(actin-ring formation) 억제 효과를 확인한 결과를 보여주는 것으로, (A)는 액틴 고리 형성 이미지를, (B)는 형성된 액틴 고리 수를 그래프로 나타낸 것을 보여주고 있다.
도 6은 가노마이신 I(GMI)의 골 흡수 억제 효과를 보여주는 것으로, (A)는 흡수 구덩이(resorption pit)의 표면을 확인한 결과를, (B)는 골 흡수 정도를 정량화하여 그래프로 나타낸 결과를 보여주고 있다.
도 7은 파골세포형성 과정에 있어서 가노마이신 I(GMI) 처리시기에 따른 파골세포형성 억제 효과를 확인한 결과를 보여주는 것으로, (A)는 파골세포의 지표인자인 TRAP이 염색된 파골세포 이미지를, (B)는 TRAP이 염색된 파골세포의 수를 그래프로 나타낸 것을 보여주고 있다.
도 8은 가노마이신 I(GMI)의 파골세포 분화 관련 신호전이 물질 중, MAPKs(ERK, JNK, p38)의 활성화(인산화) 억제(A), 이들의 하위 물질인 c-Fos(B)와 NFATc1의 발현 억제(C) 및 NF-κB 활성화에 관련된 IκBα의 분해(D) 확인을 통해 RANKL에 의해 유도된 파골세포형성 억제 기전을 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 9는 가노마이신 I(GMI)의 파골세포 마커인 MMP-9(A), OSCAR(B), TRAP(C) 및 DC-STAMP(D)의 mRNA 발현 억제 확인을 통해 RANKL에 의해 유도된 파골세포형성 억제 효과를 확인한 결과를 보여주고 있다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
<실시예 1. 가노마이신 I(GMI) 분리>
본 발명에서 사용된 가노마이신 I(ganomycin I, GMI)은 Pharm, T.B., et al, (2015)에 기재된 GMI 분리방법을 참고로 하여 영지버섯(Ganoderma lucidum) 자실체로부터 분리하였다.
구체적으로, 건조된 영지버섯을 분쇄하고, 분쇄된 영지버섯 850g에 1.5ℓ 메탄올을 넣고 상온에서 추출하는 과정을 3회 반복하여 조추출물을 확보하였다. 확보한 조추출물을 진공에서 건조하여 영지버섯 메탄올 추출물을 제조하였다. 제조한 영지버섯 메탄올 추출물 40g을 증류수 600㎖에 현탁하고, n-헥산 및 에틸아세테이트를 이용하여 n-헥산 분획물(3.3g) 및 에틸아세테이트 분획물(17.5g)을 확보하였다.
상기 에틸아세테이트 분획물을 메탄올:디클로로메탄(0:1→1:0[v/v])의 농도구배 용출 조건에 따라 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분획하여 9개의 분획물을 얻었다(GEB2.1~GEB2.9). 상기 분획물 중, GEB2.7을 아세톤:증류수(1:1[v/v]) 등용매 용출 조건에 따라 RP-18 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 GEB5.8(56㎎) 소분획물을 확보하였다. GEB5.8 소분획물을 디클로로메탄:메탄올:증류수(20:1:0.01[v/v/v]) 등용매 용출 조건에 따른 실리카겔 컬럼 크로마토그래프를 수행하여 6.1㎎의 가노마이신 I를 분리하였다.
< 실시예 2. 가노마이신 I의 물리화학적 구조 확인>
Ganomycin I;
노란색 기름;
[α]24 D : +35° (c0.1, MeOH);
ESI-MS(negative) : m/z 341[M-H]-;
1H NMR (MHz, CDCl3) 및 13C NMR (125MHz, CDCl3) 데이터는 하기 표 1 참조.
Position δH mult. (J=Hz) δC
1 - 146.9
2 - 122.3
3 6.58 d (3.0) 112.8
4 - 149.7
5 6.65 dd (3.0, 9.0) 116.6
6 6.70 d (9.0) 116.9
1' 6.19 d (s) 78.7
2' 7.32 d (s) 149.0
3' - 132.4
4' 2.31 m 25.7
5' 2.24 m 25.6
6' 5.07 m 122.5
7' - 136.7
8' 1.95 m 39.5
9' 2.02 m 26.5
10' 5.07 m 124.1
11' - 131.4
12' 1.62 s 25.2
13' 1.57 s 17.6
14' - 175.6
15' 1.55 s 16
<실시예 3. 동물 세포 배양>
파골세포의 분화를 유도하기 위해 골수 유래 대식세포(bone marrow mcrophage, BMM)를 분리하였다. 구체적으로, 6중령의 수컷 ICR 마우스의 대퇴골 및 정강이 뼈로부터 골수세포(bone marrow cell)를 분리하여 기본 배양 배지(10% FBS(fetal bovine serum), 100U/㎖ 페니실린 및 100㎍/㎖ 스트렙토마이신이 포함된 α-MEM(Minimum Essential Media)(Hyclone사, USA))에 10ng/㎖ M-CSF(macrophage colony-stimulating factor)가 포함된 배지에 넣고 37℃, 5% CO2 조건의 세포 배양기에서 하룻밤 동안 배양하였다. 배양 후 배양액에 떠 있는 세포를 모아 기본 배양 배지에 30ng/㎖ M-CSF가 포함된 배지에 넣어 3일 동안 배양하였다. 3일 경과 후에 배양액을 제거하고, 플레이트에 붙어 있는 세포를 PBS(phosphate buffered saline)로 세척한 후, 스크랩퍼(scrapper)를 이용하여 세포를 모아 골수 유래 대식세포를 분리하였다.
Raw264.7 세포는 10% 열-비활성화 FBS(heat-inactivated FBS) 및 100U/㎖ 페니실린 및 100㎍/㎖ 스트렙토마이신이 포함된 DMEM 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 조건의 세포 배양기에서 배양하였다.
<실시예 4. 가노마이신 I의 세포 독성 확인>
가노마이신 I(이하, GMI라 함)의 파골세포 분화에의 영향을 확인하기에 앞서, GMI의 세포 독성 여부를 확인하기 위해 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 어세이를 수행하였다.
상기 실시예 3에서 분리한 골수 유래 대식세포를 96웰 플레이트에 웰 당 5×104개의 세포를 분주하고, 30ng/㎖ M-CSF 및 0, 3, 10 또는 30μM의 GMI가 포함되어 있는 기본 배양 배지를 넣고 72시간 동안 배양하였다. 이후에 세포에 0.5㎎/㎖의 농도로 MTT 용액을 넣고 3시간 동안 반응시킨 후 배양액을 제거하고 형성된 포마잔(formazan) 침전물을 DMSO(dimethyl sulfoxide)로 녹이고 540㎚에서 흡광도를 측정한 후, GMI를 처리하지 않은 경우의 흡광도를 세포 생존율 100%로 하여 GMI 처리 농도별 세포 생존율을 계산하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에서 보듯이, 골수 유래 대식세포에 GMI를 처리하더라도 세포 생존율이 감소되지 않고, 오히려 증가하는 것을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명의 가노마이신 I가 세포 독성이 없다는 것을 알 수 있었다.
<실시예 5. GMI의 파골세포형성(osteoclastogenesis) 억제 효과 확인>
실시예 5-1. 골수 유래 대식세포를 이용한 파골세포형성 억제 효과 확인
상기 실시예 3에서 분리한 골수 유래 대식세포를 96웰 플레이트에 웰 당 5×104개의 세포를 분주하고, 30ng/㎖ M-CSF, 100ng/㎖ RANKL(receptor activator of nuclear factor-κB ligand) 및 GMI(0, 3, 10, 30μM)가 포함되어 있는 기본 배양 배지를 넣고 6일간 배양하였고, 배양하는 동안 2일에 한 번씩 30ng/㎖ M-CSF, 100ng/㎖ RANKL(receptor activator of nuclear factor-κB ligand) 및 GMI이 포함되어 있는 새 배지로 교체해 주었다.
배양이 끝난 세포를 3.7% 포르말린으로 15분간 처리하여 고정화 시키고, 0.1% 트리톤 X-100(triton X-100)을 처리하여 세포 투과성을 높인 후 Acid phosphatase leukocyte kit(Sigma-Aldrich 사, USA)를 이용하여 파골세포의 지표인자인 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase)을 염색하였다. 현미경을 이용해 적자색으로 TRAP이 염색된 파골세포를 관찰하였고, 5개 이상의 핵을 가진 TRAP-양성 다핵성 세포를 파골세포로 판단하고, 형성된 파골세포의 수를 측정하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에서 보듯이, TRAP이 염색된 파골세포 이미지(A, C) 및 TRAP이 염색된 파골세포 수를 세어 그래프로 나타낸 결과(B, D)에서, GMI를 처리하지 않은 경우에는 적자색으로 염색된 파골세포가 많은 반면에, GMI를 처리한 경우에는 처리 농도에 따라 적자색으로 염색된 파골세포의 수가 감소하는 것을 확인하였다(A, B). 이러한, 파골세포의 수 감소 효과는 JNK 특이적 억제제인 SP600125를 처리한 경우에도 동일하게 나타나는 것을 확인하였다(C, D).
이를 통해, 본 발명의 가노마이신 I가 파골세포형성을 억제한다는 것을 알 수 있었다.
실시예 5-2. Raw264.7 세포를 이용한 파골세포형성 억제 효과 확인
상기 실시예 3의 Raw264.7 세포를 96웰 플레이트에 웰 당 5×103개의 세포를 분주하고, 100ng/㎖ RANKL(receptor activator of nuclear factor-κB ligand) 및 GMI(0, 3, 10, 30μM) 또는 상기 실시예 1의 영지버섯 추출물(0, 3, 10, 30, 100㎍/㎖)이 포함되어 있는 기본 배양 배지를 넣고 4일간 배양하였고, 배양하는 동안 2일에 한 번씩 RANKL 및 GMI 또는 영지버섯 추출물이 포함되어 있는 새 배지로 교체해 주었다. 배양이 끝난 세포를 상기 실시예 5-1의 TRAP 염색과 동일한 방법으로 염색하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에서 보듯이, TRAP이 염색된 파골세포 이미지(A, C) 및 TRAP이 염색된 파골세포 수를 세어 그래프로 나타낸 결과(B, D)에서, GMI를 처리하지 않은 경우에는 적자색으로 염색된 파골세포가 많으나, GMI를 처리한 경우에는 처리 농도에 따라 적자색으로 염색된 파골세포의 수가 감소하는 것을 확인하였다(A, B). 반면에, 영지버섯 추출물을 처리한 경우에는 영지버섯 추출물을 100㎍/㎖까지 처리하더라도 유의한 파골세포 수의 감소가 나타나지 않는 것을 확인하였다(C, D).
이를 통해, 본 발명의 가노마이신 I가 대식세포로부터 파골세포로의 형성을 억제하고, 이러한 억제 효과는 가노마이신 I를 포함하고 있는 영지버섯 추출물에 비해 현저히 우수하다는 것을 알 수 있었다.
또한, GMI가 파골세포형성을 억제하는지 재확인하기 위해 Raw264.7 세포로부터 파골세포형성을 유도한 세포에서의 파골세포 마커인 CtsK(cathepsin K) 및 c-Src의 발현 정도를 확인하였다.
상기와 동일한 방법으로 Raw264.7 세포를 이용하여 파골세포형성을 유도하였고, 유도된 파골세포를 모았다. 모은 세포를 용해(lysis)시켜 확보한 단백질을 이용해 웨스턴 블롯을 수행하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 이때, CtsK 및 c-Src를 검출할 수 있는 항체를 처리하였고, RANKL 및 GMI를 처리하지 않은 Raw264.7 세포를 대조군으로 이용하였다.
도 4에서 보듯이, RANKL 및 GMI를 처리하지 않은 세포에서는 파골세포의 마커인 CtsK 및 c-Src가 모두 발현이 되지 않는 반면에, RANKL만 처리한 세포에서는 CtsK 및 c-Src의 발현이 증가하는 것을 확인함으로써 RANKL에 의해 파골세포가 형성되는 것을 확인하였다. 한편, RANKL 및 GMI를 함께 처리한 세포의 경우에는 GMI 처리 농도에 따라 CtsK 및 c-Src의 발현이 감소되는 것을 확인하였다.
이를 통해, 가노마이신 I가 RANKL에 의해 유도되는 파골세포형성을 억제한다는 것을 알 수 있었다.
상기 실시예 5-1 및 5-2의 결과를 통해, 본 발명의 가노마이신 I의 파골세포형성 억제 효과가 매우 우수하다는 것을 알 수 있었다.
<실시예 6. GMI의 골 흡수 억제 효과 확인>
실시예 6-1. 액틴 고리 형성(actin-ring formation) 억제 효과 확인
액틴 고리 형성(actin-ring formation)은 파골세포의 골 흡수 활성의 중요 지표이며, 파골세포형성(osteoclastogenesis) 과정에서 성숙된 파골세포의 가장 명백한 특징이다. 이에, 본 발명의 GMI의 골 흡수 억제 여부를 확인하기 위해 액틴 고리 형성 정도를 확인하였다.
상기 실시예 3에서 분리한 골수 유래 대식세포를 커버 글라스(cover glass)를 깐 플레이트에 분주하고, 30ng/㎖ M-CSF 및 100ng/㎖ RANKL가 포함되어 있는 기본 배양 배지를 넣고 7일간 배양하여 파골세포로의 분화를 유도하였다. 이때, GMI를 농도별(0, 3, 10, 30 μM)로 함께 처리하였고, 2일에 한 번씩 새 배지로 교체해주었다. 7일 후, PBS로 세척하고, 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 15분간 처리하여 세포를 고정화 시키고, 0.1% 트리톤 X-100을 처리하여 세포 투과성을 높인 후 형광물질인 FITC가 결합되어 있는 팔로이딘(FITC-phalloidin)을 암소에서 10분간 처리하였다. 10분 후에 세포를 PBS로 세척하고, 봉입(mounting)시킨 후, Zeiss LSM510 META NLO inverted confocal laser scanning microscope(Zeiss, Germany)를 이용해 액틴 고리 형성을 관찰하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5(A)의 현미경 이미지 및 도 5(B)의 형성된 액틴 고리 수를 분석한 결과에서 보듯이, GMI를 처리하지 않은 경우에는 액틴 고리가 다수 형성되어 있는 반면에, GMI를 처리한 경우에는 처리 농도에 따라 액틴 고리 수가 감소되는 것을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명의 가노마이신 I가 파골세포의 성숙 및 액틴 고리 형성을 억제함으로써 골 흡수를 방지함을 알 수 있었다.
실시예 6-2. 골 흡수 억제 효과 확인
본 발명의 GMI의 골 흡수 억제 효과를 확인하기 위해 골 흡수 어세이(bone resorption assay)를 수행하였다.
상기 실시예 3에서 분리한 골수 유래 대식세포를 Corning사(USA)의 OsteoAssay Surface 96웰 플레이트에 웰 당 5×104개의 세포를 분주하고, 30ng/㎖ M-CSF 및 100ng/㎖ RANKL가 포함되어 있는 기본 배양 배지를 넣고 7일간 배양하여 파골세포로의 분화를 유도하였다. 이때, GMI를 농도별(0, 3, 10, 30 μM)로 함께 처리하였고, 2일에 한 번씩 새 배지로 교체해주었다. 7일 후, 하이포아염소산나트륨(sodium hypochlorite)을 처리하여 세포를 완전히 제거하고, 플레이트를 증류수로 세척하였다. 이후, H550 Nikon Microscope를 이용하여 흡수 구덩이(resorption pit)를 관찰하고, 이미지 J 프로그램을 이용해 골 흡수율을 정량하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6(A)의 흡수 구덩이 이미지와 도 6(B)의 골 흡수율을 분석한 그래프에서 보듯이, GMI를 처리하지 않은 경우의 파골세포에 의한 골 흡수 구덩이 및 골 흡수율에 비해, GMI를 처리한 경우에는 처리 농도에 따라 골 흡수 구덩이 및 골 흡수율이 감소하는 것을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명의 가노마이신 I가 파골세포의 골 흡수 활성을 억제한다는 것을 알 수 있었다.
상기 결과들을 통해, 본 발명의 가노마이신 I가 파골세포형성과 파골세포의 성숙을 억제하고, 파골세포의 골 흡수 기능을 억제함으로써 골 손실을 방지한다는 것을 알 수 있었다.
< 실시예 7. 파골세포형성에 있어서 GMI의 작용 시기 확인>
파골세포형성 과정에 있어서, 본 발명의 GMI가 파골세포형성 억제를 위해 작용하는 시기를 확인하였다.
상기 실시예 3에서 분리한 골수 유래 대식세포를 96웰 플레이트에 웰 당 5×104개의 세포를 분주하고, 10ng/㎖ M-CSF 및 100ng/㎖ RANKL이 포함되어 있는 기본 배양 배지를 넣고 7일간 배양하였고, 배양하는 동안 2일에 한 번씩 10ng/㎖ M-CSF 및 100ng/㎖ RANKL이 포함되어 있는 새 배지로 교체해 주었다. 이때, 7일간의 배양 과정에서 30μM의 GMI를 배양 시작일을 기준으로 1일 또는 3일 후부터 처리하고, 7일간의 배양이 끝난 세포는 형성된 파골세포를 확인하기 위해 상기 실시예 5-1과 동일한 방법으로 TRAP 염색을 수행하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에서 보듯이, TRAP이 염색된 파골세포 이미지(A) 및 TRAP이 염색된 파골세포 수를 세어 그래프로 나타낸 결과(B)에서, GMI를 처리하지 않은 경우에는 염색된 파골세포가 많은 반면에, 배양 시작일로부터 1일 후에 GMI를 처리한 경우에는 염색된 파골세포가 현저히 감소하였고, 배양 시작일로부터 3일 후에 GMI를 처리한 경우에는 1일 후에 처리한 경우보다 염색된 파골세포의 수가 많은 것을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명의 가노마이신 I가 파골세포형성 과정 중에서 초기 단계에 작용하여 파골세포의 형성을 억제한다는 것을 알 수 있었다.
<실시예 8. 파골세포형성에 있어서 GMI의 작용 기전 확인>
대식세포 또는 파골세포 전구세포로부터 파골세포로의 분화를 통한 파골세포형성에 있어서, RANKL가 이의 수용체인 RANK(receptor activator of nuclear factor-κB)에 결합하여 NF-κB 및 ERK, JNK와 p38과 같은 MAPKs를 활성화 시키고, 이어서 AP-1 및 NFATc1을 활성화시킨다. 이에, 파골세포형성 과정에서 있어서 본 발명의 GMI에 의한 억제 기전을 확인하였다.
실시예 8-1. MAPK 관련 기전에의 작용 확인
상기 실시예 3의 Raw264.7 세포에 100ng/㎖ RANKL 및 GMI(0, 3, 10, 30μM)가 포함되어 있는 기본 배양 배지를 넣고 10분간 처리한 후, 세포를 모았다. 모은 세포를 용해시켜 확보한 단백질을 이용해 웨스턴 블롯을 수행하였고, 그 결과를 도 8(A)에 나타내었다. 이때, 파골세포 분화와 관련되어 있는 신호전달물질로 p38, ERK, JNK를 이용하였고, 각 신호전달물질 및 이들의 인산화 된 형태(p-p38, p-ERK, p-JNK, p-AKT)를 검출할 수 있는 항체를 처리하였다.
도 8(A)에서 보듯이, RANKL만 단독으로 처리한 경우에는 인산화 된 ERK, JNK 및 p38(p-ERK, p-JNK, p-p38)이 증가하는 반면에, RANKL 및 GMI를 같이 처리한 경우에는 RANKL 단독 처리에 의해 증가된 인산화 된 ERK, JNK 및 p38가 GMI 처리 농도 의존적으로 감소되는 것을 확인하였다.
상기 결과를 바탕으로, GMI가 MAPKs의 하위 물질로 파골세포형성 관련 주요 인자인 AP-1 및 NFATc1의 발현에 관여하는지 확인하기 위해, 상기와 동일한 방법을 통해 세포를 확보하되, GMI을 24시간 또는 48시간 동안 처리하였다.
확보한 세포를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하였고, 그 결과를 도 8(B) 및 8(C)에 나타내었다. 이때, GMI을 24시간 동안 처리한 세포를 이용하여 AP-1을, 48시간 동안 처리한 세포를 이용하여 NFATc1을 검출하였고, 항체로는 NFATc1에 대한 항체와 AP-1을 확인하기 위해서 AP-1을 구성하고 있는 c-Fos에 대한 항체를 처리하였다.
도 8(B)의 c-Fos의 발현을 확인한 결과에서 보듯이, RANKL만 단독으로 처리한 경우에 c-Fos의 발현이 증가하는 반면에, RANKL 및 GMI를 같이 처리한 경우에는 증가된 c-Fos의 발현이 GMI 처리 농도 의존적으로 감소되는 것을 확인하였다.
또한, 도 8(C)의 NFATc1의 발현을 확인한 결과에서 보듯이, RANKL 단독 처리에 의해 증가된 NFATc1의 발현이 GMI 처리에 의해 감소되는 것을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명의 가노마이신 I는 RANKL-유도 파골세포형성에서 MAPK/AP-1 신호전달 과정 및 NFATc1의 발현을 억제함으로써 파골세포형성을 억제한다는 것을 알 수 있었다.
실시예 8-2. NF-κB 관련 기전에의 작용 확인
상기 실시예 8-1과 동일한 방법으로 세포를 확보하되, GMI는 15분간 처리하였다. 확보한 세포를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하였고, 그 결과를 도 8(D)에 나타내었다. 이때, 신호전달물질로 NF-κB의 활성화를 확인하기 위해 NF-κB의 활성에 관여하는 IκBα(IκBα가 분해되면 NF-κB가 활성화 됨)를 검출할 수 있는 항체를 처리하였다.
도 8(D)에서 보듯이, GMI를 처리하더라도 IkBα의 양이 변화가 없는 것을 관찰함으로써 GMI가 NF-κB 활성화에 영향을 주지 않는다는 것을 알 수 있었다.
<실시예 9. NFATc1 타켓 유전자의 발현에 있어서 GMI의 영향 확인>
상기 실시예 8에서 GMI가 NFATc1의 발현을 억제한다는 것을 바탕으로, GMI가 NFATc1 타겟 유전자이며 파골세포의 마커인 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase), OSCAR(osteoclast-associated receptor), MMP-9(matrix methalloproteinase 9) 및 DC-STAMP(dendritic cell-specific transmembrane protein)의 mRNA 발현에 미치는 영향을 확인하였다.
상기 실시예 3에서 분리한 골수 유래 대식세포를 6웰 플레이트에 분주하고, 30ng/㎖ M-CSF, 100ng/㎖ RANKL가 포함된 기본 배양 배지를 처리하였다. 이어서, GMI를 0, 3, 10, 30μM이 되도록 처리하고 4일간 배양하였다. 배양이 끝난 세포를 모아 RNeasy Mini Kit(QIAGEN, USA)를 이용하여 회사에서 제공한 매뉴얼을 이용해 총 RNA(total RNA)를 분리하였다. 분리한 총 RNA 1㎍와 RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction) 키트(Invitrogen사, USA)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA를 주형으로 하여, 하기 표 2의 프라이머와 TOPreal qPCR 2×PreMIX(Enzynomics사, KOR)를 이용하여 qPCR(real-time quantitative PCR)을 수행하여 파골세포 마커의 mRNA 발현량을 확인하였고, 그 결과를 도 9에 나타내었다. 이때, β-액틴(β-actin)을 정량 대조군으로 이용하여 mRNA 발현량 분석에 이용하였다.
목적유전자 프라이머 종류 프라이머 염기서열
MMP-9 sense 5′-TGG GCA AGC AGT ACT CTT CC-3′
antisense 5′-AAC AGG CTG TAC CCT TGG TC-3′
TRAP sense 5′-ACT TGC GAC CAT TGT TAG CC-3′
antisense 5′-TTC GTT GAT GTC GCA CAG AG-3′
β-actin sense 5′-GGG AAA TCG TGC GTG ACA TCA AAG-3′
antisense 5′-AAC CGC TCC TTG CCA ATA GT-3′
OSCR, DC-STAMP는 Origene 사(USA)의 프라이머를 구입하여 사용
도 9에서 보듯이, RANKL 및 GMI를 처리하지 않는 경우에 비해, RANKL만 처리한 경우는 파골세포의 마커인 MMP-9(A), OSCAR(B), TRAP(C) 및 DC-STAMP(D)의 mRNA 발현량이 모두 증가하는 반면에, RANKL와 GMI를 함께 처리한 경우에는 RANKL에 의해 증가된 모든 파골세포 마커의 mRNA 발현량이 GMI 처리 농도에 따라 감소되는 것을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명의 가노마이신 I가 RANKL에 의해 유도되는 파골세포형성을 억제한다는 것을 알 수 있었다.
따라서, 상기 결과들을 통해, 본 발명의 가노마이신 I가 세포 독성이 없으며, 파골세포형성 및 골 흡수 억제 효과가 우수하다는 것을 알 수 있었고, 이를 통해, 가노마이신 I를 골 손실 방지를 통한 골 손실 관련 질환 치료에 이용할 수 있음을 알 수 있었다.
<제제예 1. 약학적 제제>
제제예 1-1. 정제의 제조
가노마이신 I 200g을 락토즈 175.9g, 감자전분 180g 및 콜로이드성 규산 32g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄하여 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160g, 활석 50g 및 스테아린산 마그네슘 5g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.
제제예 1-2. 주사액제의 제조
가노마이신 I 1g, 염화나트륨 0.6g 및 아스코르브산 0.1g을 증류수에 용해시켜서 100㎖를 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20℃에서 30분간 가열하여 멸균시켰다.
<제제예 2. 건강기능식품의 제조>
제제예 2-1. 건강기능식품의 제조
가노마이신 I 20g, 비타민 혼합물 적량, 비타민 A 아세테이트 70㎍, 비타민 E 1.0㎎, 비타민 B1 0.13㎎, 비타민 B2 0.15㎎, 비타민 B6 0.5㎎, 비타민 B12 0.2㎍, 비타민 C 10㎎, 비오틴 10㎍, 니코틴산아미드 1.7㎎, 엽산 50㎍, 판토텐산 칼슘 0.5㎎, 무기질 혼합물 적량, 황산제1철 1.75㎎, 산화아연 0.82㎎, 탄산 마그네슘 25.3㎎, 제1인산칼륨 15㎎, 제2인산칼슘 55㎎, 구연산칼륨 90㎎, 탄산칼슘 100㎎, 염화마그네슘 24.8㎎을 섞어 과립으로 제조하였으나, 용도에 따라 다양한 제형으로 변형시켜 제조할 수 있다. 또한, 상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강기능식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하여 제조할 수 있다.
제제예 2-2. 건강기능성 음료의 제조
가노마이신 I 1g, 구연산 0.1g, 프락토올리고당 100g, 정제수 900g을 섞어 통상의 음료 제조방법에 따라 교반, 가열, 여과, 살균, 냉장하여 음료를 제조하였다.

Claims (7)

  1. 하기 화학식 1의 가노마이신 I(ganomycin I)를 유효성분으로 포함하는 파골세포형성(osteoclastogenesis) 억제 및 파골세포의 골 흡수(bone resorption) 억제작용을 특징으로 하는 골 감소 억제용 조성물(단, 여성갱년기 증후군의 골다공증은 제외로 한다).
    [화학식 1]
    Figure 112020132505787-pat00003
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항의 가노마이신 I 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 것을 특징으로 하는 골 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 골 질환은 골다공증(osteoporosis), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 골감소증(osteopenia), 치주염(periodontitis), 골 융해성 전이(osteolytic metastasis), 골관절염(osteoarthritis), 노인성척추후만증(senile kyphosis) 및 파제트병(paget disease)으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 골 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제1항의 가노마이신 I 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 것을 특징으로 하는 골 질환 개선용 건강기능식품.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 골 질환은 골다공증(osteoporosis), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 골감소증(osteopenia), 치주염(periodontitis), 골 융해성 전이(osteolytic metastasis), 골관절염(osteoarthritis), 노인성척추후만증(senile kyphosis) 및 파제트병(paget disease)으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 골 질환 개선용 건강기능식품.
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