KR102189376B1

KR102189376B1 - 칠엽담 추출물의 지표성분을 포함하는 항염증 또는 탈모방지용 조성물

Info

Publication number: KR102189376B1
Application number: KR1020200023931A
Authority: KR
Inventors: 박영준; 송현남; 현재경; 이세인
Original assignee: (주)셀트리온
Priority date: 2020-02-26
Filing date: 2020-02-26
Publication date: 2020-12-11

Abstract

본 발명은 칠엽담 추출물에서 분리한 지표성분을 포함하는 항염 또는 탈모방지용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 칠엽담 추출물에서 분리한 특정 구조의 지페노사이드 성분의 염증인자 억제 효과 및 테스토스테론 5-알파-환원효소 억제 효과를 이용한 염증성 탈모 및 남성형 탈모 예방 효과가 우수한 조성물, 이를 이용한 피부 외용제 및 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

칠엽담 추출물의 지표성분을 포함하는 항염증 또는 탈모방지용 조성물{Composition For Anti-inflammation and Prevention of Hair loss Comprising the Indicator Ingredient isolated from the Extract of Gynostemma Pentaphyllum}

본 발명은 칠엽담 추출물의 지표성분을 포함하는 항염증 또는 탈모방지용 화장료 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 칠엽담 추출물에서 분리한 특정 구조의 지페노사이드 성분의 염증인자 억제 효과 및 테스토스테론 5-알파-환원효소 억제 효과를 이용하여 염증성 탈모 및 남성형 탈모 예방 효과가 우수한 조성물, 이를 이용한 피부 외용제 및 화장료 조성물에 관한 것이다.

모발의 주기 또는 헤어 사이클(hair cycle)은 모발이 성장하는 성장기 단계, 성장을 멈추고 모구가 축소하는 시기인 퇴행기 단계, 모유두가 활동을 시작하거나 또는 새로운 모발을 발생시켜 오래된 모발을 탈모시키는 시기인 휴지기와 발생기 단계로 나눌 수 있다. 성장기 단계는 모유두에 있는 모모세포는 신속하게 유사분열을 진행시킨다. 모발의 성장기 단계는 딱딱한 케라틴이 모낭 안에서 만들어지고 성장기의 수명은 3 ~ 6년이며 전체 모발의 약 88%를 차지하고 한 달에 1.2 ~ 1.5센치미터 정도 자란다. 퇴행기 단계는 성장기가 끝나고 모발의 형태를 유지하면서 대사과정이 느려지는 시기로써 천천히 성장하며, 세포분열은 정지한다. 이 단계에서는 케라틴을 만들어 내지는 않으며, 퇴행기의 수명은 2~3주이고 전체 모발의 약 1%가 이 시기에 해당이 된다. 휴지기 단계는 모유두가 위축되며 모낭은 차츰 수축되고 모근은 위쪽으로 밀려올라가 빠지며 모낭의 깊이는 1/3로 되어 있다. 휴지기 단계에서 모모세포가 활동을 시작하면 새로운 모발로 대체된다.

남성형 탈모증은 테스토스테론(Testosterone)이라는 남성호르몬에 의해 나타나는 현상으로 이 테스토스테론이 5-알파-환원효소(5α-reductase)라는 효소에 의해 더 강력한 호르몬인 디히드로테스토스테론(Dihydrotestosterone, DHT)으로 바뀌게 되면, 이 호르몬이 모낭에 작용하여 모낭을 성장기 단계에서 퇴화기 단계로 유도하여 탈모가 일어나게 한다. 따라서, 남성형 탈모증을 치료하기 위하여 5알파-리덕타아제에 의한 DHT의 생성을 억제하는 방법이 주로 사용된다.

한편, 다른 탈모의 원인으로 두피 염증이 있을 수 있다. 두피 염증을 유발하는 여러가지 요인들이 있는데, 두피 생리기능 저하로서 비듬이 많이 생기면 모발의 표피 출구인 모구가 막히고 세균번식에 의해 두피 가려움증,　염증을 수반하며, 염증이 심해지면 최종적으로 탈모로 이어진다.　이에 따라, 염증 억제를 통하여 탈모 예방이 필요한 경우가 있다.

예전에 탈모는 노화현상으로 인식되어 왔으나 최근에는 유전적 요인과 함께 스트레스, 영양 불균형, 사회활동의 변화, 질병, 출산, 식생활의 변화, 불규칙한 생활, 과도한 화학 정발제 사용 등 다양한 요인으로 인해 나타나고 있다. 따라서 환경오염, 업무의 스트레스, 식생활변화에 따른 호르몬 분비에 이상 등 후천적 요인의 증가와 더불어 20대, 30대 젊은 남성들에게서도 탈모가 증가함은 물론 과도한 다이어트로 인한 영양부족 상태, 퍼머, 염색, 드라이 등으로 여성의 탈모도 증가하는 추세이다.

이러한 요인들로 인한 탈모 인구의 증가로 탈모 시장은 최근 들어 폭발적인 성장세를 보이고 있다. 탈모시장에서는 모발관리 제품, 탈모치료제, 가발, 모발이식 등 생활용품과 의약품 등이 개발되고 있으나 아직까지 탈모증상을 뚜렷하게 치료할 수 있는 방법이나 약품은 없다.

최근 탈모방지 의약품으로 미국 FDA에서 공인 받은 모발 성장을 촉진하는 약물로 미녹시딜과 피나스테라이드가 있다. 바르는 발모제인 미녹시딜은 혈관 확장작용에 의해, 경구용인 피나스테라이드는 남성 호르몬 활성화 억제작용에 의해 탈모방지 효과가 우수하여 많이 이용되고 있다. 그러나 이러한 발모제들은 치료를 중단할 시 다시 탈모증상이 일어나게 되고 유방암, 가려움증, 홍반, 표피 벗겨짐과 건성화를 동반한 피부염을 일으키고, 장기 사용시에는 부작용의 우려가 크다.

따라서, 최근에는 화학적 치료제가 아닌, 장기간 사용시에도 피부나 두피에 안정한 천연 소재의 탈모 방지 또는 발모제 개발에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.

본 발명에서 사용되는 지페노사이드는 칠엽담 추출물에서 처음 발견된 담마란계 트리터페노이드 사포닌 화합물로서, 제2형 당뇨병, 비만 또는 고지혈증 치료 또는 예방 효과(한국 특허공개공보 10-2014-0108621)와 주름개선 효과(한국 특허등록공보 10-1642660)가 이미 밝혀졌으나, 항염증 및 탈모방지 효과와 관련하여서는 아직까지 알려진 바가 없다.

1. 한국 공개특허 10-2014-0108621 2. 한국 등록특허 10-1642660

이에 본 발명자들은 칠엽담 추출물 내에 함유된 특정 구조의 지페노사이드들에 대한 항염 및 탈모방지 효과를 확인하였으며, 이를 유효성분으로 포함하는 항염증 또는 탈모방지용 화장료 조성물을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 지페노사이드를 포함하는 항염증 또는 탈모방지용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 또 다른 과제는 UL4 또는 UL5를 포함하는 칠엽담 추출물의 분획물을 포함하는 항염증 또는 탈모방지용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하고자, 본 발명은 하기 화학식 1 로 표시되는 지페노사이드 UL4 또는 하기 화학식 2로 표시되는 지페노사이드 UL5를 유효성분으로 포함하는 항염증 또는 탈모방지용 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

[화학식 2]

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

상기의 “지페노사이드(gypenoside)”는 담마란계(dammarane type) 사포닌, 트리터펜(triterpene) 사포닌, 지노사포닌(gynosaponin)등으로 다르게 지칭될 수 있으며, 당 업계에 통상적으로 사용되는 지페노사이드의 다른 명칭도 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명의 일 구체예에서, 지페노사이드 화합물 UL4 및 UL5는 각각 상기의 화학식 1 및 2로 특정된다.

상기에서, 화학식 1의 지페노사이드 UL4는 (23ξ)-3β,20β,21α-트리히드록시-19-옥소-21,23-에폭시-담마르-24-엔-3-O-[α-L-람노피라노실 (1→2)][β-D-크실로피라노실 (1→3)]-α-L-아라비노피라노사이드 ((23ξ)-3β,20β,21α-trihydroxy-19-oxo-21,23-epoxy- dammar-24-ene-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl (1→2)][β-D-xylopyranosyl (1→3)]-α-L-arabinopyranoside);를 의미한다.

화학식 2의 지페노사이드 UL5는 (23ξ)-3β,20β,21α-트리히드록시-19-옥소-21,23-에폭시-담마르-24-엔-3-O-[α-L-람노피라노실 (1→2)][β-D-글루코피라노실 (1→3)]-α-L-아라비노피라노사이드 ((23ξ)-3β,20β,21α-trihydroxy-19-oxo-21,23-epoxy- dammar-24-ene-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl (1→2)][β-D-glucopyranosyl (1→3)]-α-L-arabinopyranoside)를 의미한다.

상기 지페노사이드는 칠엽담(gynostemma pentaphyllum)으로부터 분리된 것을 특징으로 하나, 이에 한정하는 것은 아니다.

상기 화학식 1 및 2의 지페노사이드는 칠엽담 추출물에서 처음 발견되었으며, 제2형 당뇨병, 비만 또는 고지혈증 치료 또는 예방 효과(한국 특허공개공보 10-2014-0108621)와 주름개선 효과(한국 특허등록공보 10-1642660)가 있는 것으로 밝혀졌다.

상기 “칠엽담(gynostemma pentaphyllum)”은 칠엽담 또는 교고람이라고도 불리며, 우리나라 남부지역과 제주도, 울릉도 등의 섬과 중국·일본 등에서 자생하는 박과(cucurbitaceae)에 속하는 여러해살이 덩굴식물로 산이나 들의 숲 속에서 자라며 뿌리줄기는 옆으로 뻗고 마디에 흰털이 있고 엉키면서 자라지만 덩굴손으로 기어 올라가기도 한다. 칠엽담 잎을 말려 만든 차는 주로 덩굴차라고도 하며 장기들의 기능을 회복시키고 항스트레스, 항산화효과를 나타내며 천식, 기관지염, 궤양 등에도 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

상기 칠엽담 분획물은 칠엽담 추출물에 크로마토그래피 등의 추가 가공단계를 통해 정제된 조성물로서, 지페노사이드 UL4 및 UL5를 포함하고 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 칠엽담 분획물은 지페노사이드 UL4 및 UL5의 함량이 조추출물 대비 높은 조성물로서, 상기 분획물은 건조중량 기준으로 지페노사이드 UL4를 5 내지 10 중량%, 지페노사이드 UL5를 1 내지 5 중량% 포함할 수 있다.

상기 칠엽담 추출물은 경상북도 울릉군에서 재배된 칠엽담으로부터 얻을 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 항염증 또는 탈모방지용 조성물은 상기 지페노사이드 UL4 또는 UL5를 총 조성물의 중량 대비 0.001 내지 20 중량%로 포함할 수 있다. 보다 구체적으로 상기 항염증 또는 탈모방지용 조성물은 상기 UL4 또는 UL5를 총 조성물의 중량 대비 0.01 중량% 내지 10 중량%로 포함할 수 있다. 상기 UL4 또는 UL5 함량이 0.001 중량% 미만인 경우에는 항염 또는 탈모방지 효과가 나타나지 않으며, 20 중량%를 초과하는 경우에는 함유량 증가에 대한 항염 또는 탈모방지 개선 효과 증대 정도가 미미하고, 경제적이지 않다.

본 발명의 다른 일 구체예에서, 상기 항염 또는 탈모방지 조성물은 칠엽담 분획물을 총 조성물의 중량 대비 0.001 내지 30 중량%로 포함할 수 있다. 상기 분획물 함량이 0.001 중량% 미만인 경우에는 항염 또는 탈모방지 개선 효과가 나타나지 않으며, 30 중량%를 초과하는 경우에는 함유량 증가에 대한 항염 또는 탈모방지 개선 효과 증대 정도가 미미하고, 경제적이지 않다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 칠엽담 분획물은 하기와 같은 단계를 통하여 얻을 수 있다.

(i) 칠엽담 건조물을 물과 알코올의 혼합용매로 추출하고, 추출액을 농축하여 칠엽담 추출물을 수득하는 단계;

(ii) 상기 칠엽담 추출물을 물과 알코올의 혼합용매로 용해시키는 단계; 및

(iii) 상기 추출물을 이온교환수지 칼럼에 물과 알코올 혼합용매의 비율을 조정하여 용출시키는 단계.

본 발명의 다른 일 구체예에서, 상기 단계 (iii)의 용출액을 컬럼 크로마토그래피에 넣어 클로로포름과 알코올의 혼합용매로 용출하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 구체예에서, 상기 단계 (i)에서는 칠엽담의 지상부위 건조물을 물과 알코올이 9 : 1 내지 1 : 9, 바람직하게는 2:1 내지 1:1, 더욱 바람직하게는 1.5:1의 부피비로 혼합된 혼합용매로 60 내지 95 ℃에서 환류방법으로 가열추출하고, 감압 여과한 다음, 여과액을 감압 농축하여 칠엽담 지상부위 추출물을 수득할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 구체예에서, 상기 단계 (ii)에서는 칠엽담 지상부위 추출물을 물과 알코올이 9 : 1 내지 1 : 2, 바람직하게는 7:1 내지 5:1, 더욱 바람직하게는 6:1의 부피비로 혼합된 혼합용매에 용해시킬 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 구체예에서, 상기의 단계 (i)에서는 건조/절단된 칠엽담과 물과 알코올 혼합 용매의 질량 대 부피비가 1:5~20 (kg/L)일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 구체예에서, 상기의 단계 (i)에서 사용되는 칠엽담 건조물은 칠엽담 지상부위 건조물일 수 있으며, 더욱 구체적으로 칠엽담 잎과 줄기의 건조물일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 구체예에서, 상기 단계 (iii)에서는 상기에서 얻은 에탄올 조추출물을 다공성 폴리머 합성흡착수지가 충진된 칼럼에 흡착시킨 후, 정제수와 에탄올 혼합용매로 세척하고 용출시켜 얻어진 용출액을 건조시켜 칠엽담 분획물을 수득할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 구체예에서, 상기의 단계 (i)에서의 추출용매와 단계 (ii)에서의 용해용 용매는, C1 내지 C4의 저급 알코올을 사용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 구체예에서, 상기의 단계 (iii)에서 이온교환수지는 다공성 폴리머 합성흡착수지일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 다이아이온(Diaion) HP20, HP21 또는 HP2MG 수지로 이루어진 군으로부터 선택된 단독 또는 2종 이상을 사용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 구체예에서, 상기의 단계 (ii)의 물과 알코올 혼합액은 물과 알코올이 1:3 내지 1:5, 더욱 바람직하게는 1:4의 부피비로 혼합된 용합용매일 수 있다.

상기의 칼럼을 통해 용출된 용출액을 감압농축하여 용매를 증발시킨 후 동결건조하여 분말의 형태로 수득하거나 고형분의 함량이 일정하게 유지된 형태의 수용액으로 분획물을 수득할 수 있다.

또한, 상기 칠엽담 분획물에 대한 추가 크로마토그래피를 통하여 지페노사이드 UL4 및 UL5를 얻을 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 제조공정상의 편의 또는 경제적인 목적에 따라, 지페노사이드를 분리하기 위한 분획물과 항염증 또는 탈모방지 용도로 사용되는 분획물은 서로 상이할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 조성물은 5-알파-환원효소 저해 효과가 있을 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 조성물은 NO(nitric oxide) 생성 억제 효과가 있을 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 조성물이 특정하고 있는 탈모방지용 용도는 남성형 탈모 또는 염증성 탈모 방지 용도일 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.

아울러, 본 발명의 지페노사이드는 하기 단계를 포함하는 방법으로 분리되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

(i) 칠엽담 건조물을 30 내지 50% 알코올 용매로 열수추출하여 칠엽담 추출물을 수득하는 단계;

(ii) 다공성 폴리머 합성흡착수지에 상기 칠엽담 추출물을 흡착시키는 단계;

(iii) 70 내지 90% 에탄올로 용출하여 칠엽담 분획물을 수득하는 단계; 및

(iv) 상기 칠엽담 분획물을 크로마토그래피를 실시하여 상기 지페노사이드를 분리하는 단계.

본 발명에 따른 지페노사이드를 제조하는 방법은 이에 제한되는 것은 아니며, 상기 지페노사이드는 칠엽담 이외의 다른 식물로부터 추출할 수도 있으며, 또한 일반적인 화학적 합성 방법에 의해서 합성할 수도 있다.

본 발명의 피부 외용제 또는 화장료 조성물은 그 제형이 특별히 한정되는 것은 아니며, 제조하고자 하는 제형에 따라 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 화장료 조성물 배합을 포함할 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물은 헤어토닉, 모발 영양화장수, 스칼프트리트먼트, 헤어트리트먼트, 헤어린스, 헤어샴푸, 헤어로션, 화장수, 유액, 영양크림, 팩, 미용액, 에센스 등의 제형으로 제조할 수 있으며, 제조하고자 하는 제형에 따라, 유제, 유화제, 유화안정화제, 보습제, 증점제, 보존제, 향료 등을 선택하여 배합할 수 있다.

본 발명의 지페노사이드 UL4 또는 UL5는 NO 생성을 억제하여 우수한 항염 효과를 나타내며, 5-알파-환원효소의 활성을 억제하여 우수한 탈모 방지 효과를 나타낸다.

도 1은 칠엽담 조추출물과 칠엽담 분획물의 5-알파-환원효소 억제 효과 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 지페노사이드 UL4의 5-알파-환원효소 억제 효과 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 지페노사이드 UL5의 5-알파-환원효소 억제 효과 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 지페노사이드 UL4의 농도별 NO 생성억제 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 지페노사이드 UL5의 농도별 NO 생성억제 결과를 나타낸 것이다.
도 6는 칠엽담 분획물의 농도별 NO 생성억제 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 칠엽담 조추출물의 농도별 NO 생성억제 결과를 나타낸 것이다.

실시예 1. 칠엽담으로부터 분리된 지페노사이드의 제조

(1) 칠엽담 추출물의 제조

칠엽담 24.0 kg을 칭량하여 추출기에 넣고 40% 에탄올 336.0 L를 가하여 80~90℃에서 4시간 추출한 후 추출액을 유출시켜 1차 추출액을 얻는다. 추출 잔사가 남아 있는 추출기에 40% 에탄올 240.0 L를 가하여 80~90℃에서 2시간 추출한 후 유출시켜 2차 추출액을 얻는다. 1차 및 2차 추출액을 여과한 후 감압농축하여 농축액을 얻는다.

(2) 칠엽담 분획물의 제조 방법

컬럼에 다공성 합성흡착제인 Diaion HP-20(mitsubishi Chemical Co. Ltd., Tokyo, Japan)을 충진시키고 96% 에탄올 20 L를 가하여 10분간 재순환 세척을 한 후 정제수 40 L를 흘려주어 레진(resin)의 알코올 농도를 15%로 낮추어주었다. 상기 실시예 1-(1)에서 수득한 칠엽담 농축액에 에탄올을 가하여 시료의 용해도를 높이고 농축액의 에탄올 농도가 15%가 되도록 한 후 컬럼에 투입하여 흡착시킨다. 컬럼에 15% 에탄올을 흘려주어 무기물을 제거하고, 이어서 80% 에탄올로 용출하여 칠엽담 분획물을 얻는다. 이어 용출액을 감악농축하여 용매를 증발시킨 후 동결건조하여 분말 형태의 분획물을 획득하였으며, 해당 분획물 내 UL4가 5 내지 10 중량%, UL5가 1 내지 5 중량% 포함되어 있음을 확인하였다.

(3) 칠엽담 추출물로부터 UL4, UL5 분리 방법

실시예 1-(1)에서 수득한 칠엽담 추출물을 취하여, 상기 1-(2)와 같은 과정을 통해 무기물을 제거하고, 무기물을 제거하기 위한 15% 에탄올 이후 45% 에탄올로 용출한 용출액을 제거한 후, 이어서 80% 에탄올로 용출하여 칠엽담 지페노사이드 분획물을 얻는다. 이러한 분획물에 실리카겔 323 g을 사용한 칼럼(직경 4.6 cm x 높이 31 cm)에 넣은 후, 클로로포름 : 메탄올 = 8 : 1 혼합용매 (v/v) 2 L; 5 : 1 혼합용매 (v/v) 3 L; 3 : 1 혼합용매 (v/v) 2 L; 1 : 1 혼합용매 (v/v) 3 L를 순차적으로 사용하면서 크로마토그래피를 실시하여 각각 Fr. A(1.56 g); Fr. B(5.99 g); Fr. C(3.12 g); Fr. D(8.15 g)를 수득하였다. 각 분획을 MCI-gel에서 아세토니트릴의 수용액 농도를 5, 10, 15, 20, 25%로 점차 올려 가면서 크로마토그래피를 실시하여, Fr. B로부터 지페노사이드 UL4를 얻었으며, Fr. C로부터 지페노사이드 UL5 를 수득하였다.

상기 지페노사이드 UL4, 지페노사이드 UL5 의 구조식은 각각 하기 화학식 1 및 화학식 2와 같으며, NMR 데이터는 각각 하기 표 1 및 2로 표시하였다.

[화학식 1]

[화학식 2]

	UL 4 (23S)	UL 4 (23R)
Position	δ_H(Hz)	δ_H(Hz)
1	0.67m 2.54m	0.67m 2.54m
3	3.31dd (11.7, 4.1)	3.31dd (11.7, 4.1)
5	1.16m	1.16m
9	1.64m	1.64m
13	2.19m	2.04m
17	2.08m	2.08m
18	0.83s	0.82s
19	10.27s	10.29s
21	5.56s	5.45s
22	2.03dd (12.8, 3.3) 2.69dd (12.8, 8.8)	2.21dd (12.8, 7.2) 2.43dd (12.8, 7.2)
23	5.39dt (8.8, 3.3)	4.94dt (8.0, 8.0)
24	5.93d (8.8)	5.77d (8.6)
26	1.58s	1.58s
27	1.60s	1.64s
28	1.20s	1.20s
29	1.04s	1.04s
30	1.02s	0.94s
Rha-6	1.61d (6.0)	1.61d (6.0)
3-O-Ara	4.90d (5.6)	4.90d (5.6)
Rha	6.16s	6.16s
Xyl	5.02d (7.3)	5.02d (7.3)

UL 5 (23S)	UL 5 (23S)	UL 5 (23R)
Position	δ_H(Hz)	δ_H(Hz)
1	0.69m 2.59m	0.69m 2.59m
3	3.31dd (11.7, 3.5)	3.31dd (11.7, 3.5)
5	1.17m	1.17m
9	1.64m	1.64m
13	2.20m	2.03m
17	2.02m	2.02m
18	0.88s	0.86s
19	10.26s	10.28s
21	5.85s	5.51s
22	2.03m 2.68m	2.20dd (12.8, 7.5) 2.42dd (12.8, 7.5)
23	5.38dt (8.7, 3.2)	4.93dt (8.0, 8.0)
24	5.92d (8.7)	5.75d (8.0)
26	1.61s	1.62s
27	1.64s	1.66s
28	1.26s	1.26s
29	1.07s	1.07s
30	1.07s	0.98s
Rha-6	1.58d (6.0)	1.58d (6.0)
3-O-Ara	4.81d (5.7)	4.81d (5.7)
Rha	6.16s	6.16s
Glc	5.08d (7.7)	5.08d (7.7)

실험예 1. 테스토스테론 5-알파-환원효소 억제효과 확인

상기 지페노사이드 UL4, UL5 및 칠엽담 분획물의 테스토스테론 5-알파- 환원효소 억제 효과를 확인하기 위하여 다음과 같은 방법으로 실험을 수행하였다.

테스토스테론(testosterone) 500 ppm, 75 μl에 상기 실시예 1-(2)에서 획득한 칠엽담 분획물 및 실시예 1-(3)에서 분리한 UL4 및 UL5의 농도별 시료 50 μl, 5mg/ml으로 희석한 테스토스테론 5-알파-환원효소액(Rat Liver Microsome, Sigma社) 250 μl 및 0.02mM 인산완충액(phosphate buffer, pH 6.5) 250 μl를 혼합하고, 니코틴아마이드 아데닌 디뉴클레오티드 인산 환원형(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced form, NADPH) 0.77 mg/ml 250 μl을 가하여 반응을 개시한다. 인큐베이터에서 37 ℃, 1시간 간 교반하며 반응시켰다.

상기 반응 후, 디클로로메탄(dichloromethane)을 1250 μl 넣어 반응을 정지시키고, 내부 표준물질(p-hydroxybenzoic acid n-hexyl ester) 100 ppm을 125 μl씩 넣었다.

그 후, 인큐베이터에서 50 rpm으로 교반하며, 30분간 잘 섞이게 한 다음, 400g에서 10분간 원심 분리하여, 상층을 제거하였다. 그 후, 디클로로메탄(dichloromethane) 층을 질소로 날리고, 여기에 메탄올(methanol) 100 μl를 가하여 고속액체크로마토그래피(HPLC)로 남아있는 테스토스테론(testosterone)량을 측정하였다.

상기 고속액체크로마토그래피의 측정은 컬럼(colomn)으로 YMC-Pack Pro C18 (250 x 4.6 mm) 사용하였고, 이동상으로는 메탄올과 물을 65:35의 비율로 혼합하여 사용하였으며, 유속은 1.0 ml/min, 컬럼온도는 40 ℃, 주입량은 10 μl, 검출파장은 242 nm에서 측정하는 방법으로 수행하였다.

상기 고속액체크로마토그래피는 내부표준물질법을 이용하였고, 피크-면적비 (테스토스테론/내부표준물질)로 테스토스테론의 함량을 계산하였다. 상기 피크-면적비로 계산된 테스토스테론의 함량을 이용하여 하기 계산식 1로 각 시료의 테스토스테론 5-알파-환원효소 활성 억제율을 계산하였다. 상기 시료의 효과를 비교하기 위한 양성대조군으로는 시판되고 있는 테스토스테론 5-알파- 환원효소 저해제인 피나스테라이드(finasteride)를 사용하였다.

[계산식 1]

억제율(%)=100 X {(A-B)/(C-B)}

상기 계산식 1에서 A는 상기 실시예 1의 식물 추출물을 첨가한 후 1시간 동안 반응 시킨 경우의 피크 면적비를 나타내고, B는 아무런 시료를 첨가하지 않고, 상시 실시예에서 제조된 효소액으로 반응시킨 경우의 피크 면적비를 나타내며, C는 NADPH를 첨가하기 전에 디클로로메탄을 첨가시켜 반응을 진행하지 않은 경우의 피크 면적비를 나타낸다.

상기 계산식에 의해 계산된 결과를 바탕으로, 칠엽담 분획물, UL4 및 UL5 억제율을 도 1 내지 3에 나타내었다.

실험결과, UL4는 100ppm에서 26.20%, 1000ppm에서 38.40%, 10000 ppm에서 43.15%로, UL5는 1000 ppm에서 5.22%, 10000 ppm에서 17.79%로 농도 의존적으로 5-알파-환원효소의 활성 억제 효과가 있는 것을 확인하였다(도 2 및 3 참조).

또한, 이들 성분을 포함한 분획물의 경우 조추출물 대비 34배 정도 높은 효능이 있는 것을 확인하였다(도 1 참조).

실험예 2. 대식세포 Raw264.7 배양

마우스 유래의 대식세포인 Raw264.7은 한국 세포주 은행에서 분양 받았으며 10% 우태아혈청(FBS)과 겐타마이신(gentamicin)을 첨가한 DMEM /F12(Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12) 배양액에서 계대 배양하였다. 세포 배양은 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 수행하였다.

실험예 3. NO(nitric oxide) 생성 억제 효과 및 세포독성 실험

Raw264.7 세포(5 X 10⁵ cells/ ml)를 24 웰 플레이트에서 하루 동안 배양한 뒤 세럼을 포함하지 않은 배지(serum-free media)로 교체하여 3시간 동안 방치(starvation) 시킨다. 여러 농도(1, 10, 25, 50ppm)의 시료와 양성 대조군, 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS) 0.1 ug/ml을 24시간 동안 처리하였다. 그 후 세포 배양 배지 100 ul를 96 웰 플레이트에 옮겨 동량의 그리스 시약(griess reagent)와 반응시켜 마이크로 플레이트 리더를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 신선한 배지는 모든 실험에서 무처리군으로 사용되었으며 기저(basal) 대조군으로 LPS처리군, 양성 대조군으로 일산화질소합성효소(nitric oxide synthase, NOS) 억제제인 L-NMMA와 유도성 NOS(inducible NOS, iNOS) 선택적 억제제인 1400W를 사용하였다. 시료의 NO 양은 배지에서 준비된 아질산나트륨(sodium nitrite, NaNO₂) 표준 곡선으로부터 계산하였으며, 각각에 대한 NO 생성 억제 결과를 하기 표 3 및 도 4 내지 7에 나타내었다(T test; *, p<0.05).

실험 결과, UL4, UL5 및 칠엽담 분획물 모두 샘플의 농도 의존적으로 NO 생성 억제율이 증가됨을 확인하였다(도 4 내지 7 참조).

시료	처리농도 (ug/ml)	NO 생성 억제율 (%)
UL4	1	0
	10	7.9%
	25	14.6%
	50	23.1%
UL5	1	11.7%
	10	20.1%
	25	28.8%
	50	50.3%
칠엽담 조추출물	1	0%
	10	0%
	25	0%
	50	0%
칠엽담 분획물	1	0%
	10	6.5%
	25	19.8%
	50	65.3%

Claims

하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 지페노사이드를 포함하는 탈모 방지용 조성물.
[화학식 1]

[화학식 2]
제1항에 있어서,
상기 지페노사이드는 칠엽담(gynostemma pentaphyllum)으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 탈모 방지용 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 조성물은 5-알파-환원효소(5α-reductase) 저해 효과가 있는 것을 특징으로 하는 탈모 방지용 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 조성물은 NO(nitric oxide) 생성 억제 효과가 있는 것을 특징으로 하는 탈모 방지용 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 탈모방지용은 남성형 탈모 또는 염증성 탈모 방지 용도인 것을 특징으로 하는 탈모 방지용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 지페노사이드는 하기 단계를 포함하는 방법으로 분리되는 것을 특징으로 하는 탈모 방지용 조성물:
(i) 칠엽담 건조물을 30 내지 50% 알코올 용매로 열수추출하여 칠엽담 추출물을 수득하는 단계;
(ii) 다공성 폴리머 합성흡착수지에 상기 칠엽담 추출물을 흡착시키는 단계;
(iii) 70 내지 90% 에탄올로 용출하여 칠엽담 분획물을 수득하는 단계; 및
(iv) 상기 칠엽담 분획물을 크로마토그래피를 실시하여 상기 지페노사이드를 분리하는 단계.