KR20170031521A

KR20170031521A - 진세노사이드 Rd의 함량이 증가된 발효 인삼 또는 홍삼 추출물의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 추출물을 포함하는 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물

Info

Publication number: KR20170031521A
Application number: KR1020150129184A
Authority: KR
Inventors: 이훈구; 서동수; 이기무
Original assignee: 주식회사 세화 피앤씨
Priority date: 2015-09-11
Filing date: 2015-09-11
Publication date: 2017-03-21
Also published as: KR101764264B1

Abstract

본 발명은 인삼 또는 홍삼추출물에 혼합효소를 처리함으로써 인삼 또는 홍삼 유래 진세노사이드 Rd의 함량이 선택적으로 증가된 것을 특징으로 하는 발효 인삼 또는 홍삼 추출물의 제조 방법 및 상기 방법에 의해 제조된, 고함량의 진세노사이드 Rd를 유효성분으로 함유하여 육모 및 발모촉진 효능이 우수하면서도 인체에 독성이 없는 외용제 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 발효 인삼 또는 홍삼 추출물의 제조방법은 혼합 효소처리방법을 이용하여, 탁월한 수준으로 증가된 진세노사이드 Rd를 포함하는 추출물을 생산할 수 있고, 이와 같이 고함량의 진세노사이드 Rd를 함유하는 추출물을 유효성분으로 포함하는 외용제 조성물은 모발의 발모 성장지수, 발모비율, 생장기모발 성장치, 모낭수와 크기의 증가가 기존 발모제보다 효능이 우수하여 발모촉진용 외용조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

진세노사이드 Rd의 함량이 증가된 발효 인삼 또는 홍삼 추출물의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 추출물을 포함하는 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물{Method for preparing fermented ginseng or red ginseng extract with increased amount of Ginsenoside Rd, and composition for preventing hair fall or stimulating hair growth comprising the extract prepared thereby}

본 발명은 인삼 또는 홍삼추출물에 혼합효소를 처리함으로써 단일효소처리에 비해 인삼 또는 홍삼 유래 진세노사이드 Rd의 함량이 증가된 것을 특징으로 하는 발효 인삼 또는 홍삼 추출물의 제조 방법, 및 상기 방법에 의해 제조된, 고함량의 진세노사이드 Rd를 유효성분으로 함유하여 육모 및 발모촉진 효능이 우수하면서도 인체에 독성이 없는 외용제 조성물에 관한 것이다.

인간은 나이가 들어가면서 자연노화현상이나, 외부환경요인, 호르몬 불균형 등에 의하여 탈모와 관련된 질환이 나타나게 된다. 탈모와 관련된 질환으로는 남성형 탈모증(Androgenetic alopecia)이 가장 흔한 유형으로 알려져 있으며, 이외에도 여성형 탈모증 등과 같은 다양한 탈모질환이 알려져 있다. 탈모는 정상적으로 모발이 존재해야 할 부위에 모발이 없는 상태를 말하며, 탈모의 주원인은 유전 또는 노화에서 발생하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 최근에는 다양한 후천적 원인들이 관련되어 있다고 알려졌으며, 특히 과도한 스트레스, 두피의 혈액순환불량, 안드로겐 분비과잉, 지루성 피부염, 유전적요인, 영양결핍, 철분 결핍, 약제, 갑상선 기능의 저하 등을 원인으로 생각하고 있다. 그리고 이러한 원인들에 기인한 탈모를 치료할 수 있는 많은 약과 치료법의 연구가 활발히 진행되고 있다.

현재 국내 탈모인구는 대한모발학회에 따르면 1000만명에 달할 것으로 추정하고 있으며, 2011년 건강보험심사평가원 집계 결과 이런 탈모환자의 절반 가까이(45.8%)는 20 내지 30대 젊은 층이었다고 보고하고 있다.

현재 모발성장을 촉진하는 약물로 미국 Food and Drug Administration(FDA)에서 공인 받은 약물은 미녹시딜(Minoxidil), 피나스테리드(Finasteride, 상품명: Propecia) 등이 있다. 파마시아앤업죤 사(Pharmacia & Upjohn Co.)의 미녹시딜은 초기에는 고혈압 치료를 위한 혈관확장제로 개발되었으나 부작용으로 다모증이 보고되면서 육모제로 개발되었다(Br J Dermatol. 1979 Nov;101(5)593-5). 이러한 미녹시딜의 육모효과에 대한 작용기전은 현재까지 명확히 밝혀지지 않았지만, 혈관확장을 통한 영양공급 촉진 및 칼륨 채널 열림(potassium channel opening) 효과 등에 의해 모발성장을 유도하는 것으로 알려져 있다(Meisheri et al.1988; Buhletal.,1990a,1990b). 미녹시딜은 주로 남성 호르몬성 탈모증에 적용되어 두정부 탈모증에는 그 효과가 인증되나, 측두부 탈모증에는 효과가 미미하고, 또한 항고혈압 작용에 의한 허탈감, 저혈압, 빈맥, 심혈관계 합병증과 같은 부작용을 유발할 가능성이 있어 장기 사용에는 부적합하다. 남성호르몬인 안드로젠의 생성, 결합 및 대사를 억제하는 피나스테리드는 남성의 여성화를 초래할 수 있으며, 가임기 여성에게는 기형아 출산의 우려가 높다는 문제가 있다. 이와 같이 화학물질을 사용하는 약물요법은 체내 항상성의 불균형을 초래하여 예기치 않은 각종 부작용이 발생하기 때문에 그 대안으로 부작용이 없는 천연소재를 이용한 발모제에 대한 연구가 활발하게 진행되어 왔다.

이러한 천연물을 이용한 발모제 연구 중에서 특히 홍삼이나 인삼추출물이 육모, 발모와 관련되어 효과가 있다는 보고는 여러 논문에서 보고되어있다. 논문 Ginsenosides Rb1 and Rd Regulate Proliferation of Mature Keratinocytes Through Induction of p63 Expression in Hair Follicles(PHYTOTHERAPY RESEARCH Phytother. Res. 27: 1095--1101 (2013))에서는 진세노사이드 Rb1과 Rd가 모공 내 p63이라는 전달물질을 통하여 배양한 각질세포의 증식을 유도하여 발모성분으로 활용될 수 있다는 가능성을 연구결과로 발표한 바 있다. 또한 Promotion of Hair Growth by Ginseng Radix on Cultured Mouse Vibrissal Hair Follicles(PHYTOTHERAPY RESEARCH Phytother . Res. 17, 797-.800 (2003)) 논문에서는 홍삼에서 추출한 진세노사이드중 Rb1과 Rg3가 쥐의 모낭세포를 배양한 세포에서 증식효과를 보여 발모제로서 이용가능성을 제시한 바 있다. 그러나, 이들 두 연구는 in vitro적인 방법으로 배양한 세포를 이용하여 발모성분으로 이용가능성을 제시하였을뿐, 이후 in vivo 적인 동물실험이나 인체실험을 통하여, 그리고 제형 내 안정성 등 그 효과를 임상적으로 확인하지 않아 실제 상업화를 위한 연구로는 미완성의 연구로 여겨진다. 일반적으로 발모효능 평가방법으로는 in vitro 평가법으로 모모세포(毛母細胞)를 이용 세포의 증식효과를 측정하는 방법과, 5-알파-리덕타아제(5-alpha-reductase) 활성억제도를 측정하는 방법이 있고, in vivo 평가모델로는 B57BL/6 마우스를 이용하는 방법이 널리 이용되고 있다.

한편, 진세노사이드와 관련된 특허로 한국등록특허 제10-1063147호에서는 탈모환자10명을 대상으로 실험한 결과, 진세노사이드 Ro가 미녹시딜과 유사한 발모효과를 가진 것으로 보고한 바 있으며, 한국등록특허 제10-134857호에서는 발효 홍삼유래의 진세노사이드 F2가 발모촉진효과가 있음을 보고한 바 있다. 또한 한국등록특허 제10-1132246호에서는 진세노사이드 Rg3와 Rh2를 주성분으로 하는 발모촉진용 화장료 조성물로서 Rg3와 Rh2 조성비가 2:1 내지 8:1에서 모유두세포 증식효과와 마우스실험에서 육모효과가 우수함을 보고한 바 있다.

그러나, 진세노사이드는 인삼이나 홍삼 중의 함량이 적기 때문에 이들의 전체 생산량을 늘리기 위하여 또는 타겟 진세노사이드 성분의 함량을 늘리기 위하여 미생믈 발효나 효소를 통한 생물전환관련 연구가 많이 진행되어 왔다. 이와 관련된 특허로 한국등록특허 제10-1341755호에서는 펙티나제를 이용하여 사포닌 대사체의 총함량을 증가시키는 연구를 통하여 총사포닌의 함량을 늘리는 것에 관하여 개시한 바 있다. 또한 한국등록특허 제10-1017378호에서는 청국장 유래 바실러스 서브틸리스 균주를 이용한 생산실험에서 진세노사이드 Rd 생산량의 증가를 확인하여 이를 제조방법으로 발명하였다. 일반적으로 생물전환 방법인 미생물 균주를 이용하는 발효방법은 효소를 이용하는 방법에 비해 시간이 길고 조건이 까다로운 단점이 있어 진세노사이드를 증가시키는 상용화 방법으로는 일반적으로 효소를 이용한 방법이 더 유용하다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 종래의 합성 화학물질에 비해 부작용이 적으면서도 양모, 발모 촉진 효능이 뛰어난 물질을 인삼 또는 홍삼을 대상으로 찾고자 하였으며, 또한 찾아낸 표적물질의 생산량을 증대시키기 위한 방법을 개발하고자 하였다. 이를 위하여 먼저 홍삼으로부터 분리한 사포닌 대사체 중 하나인 진세노사이드류를 대상으로 연구를 수행하던 중 진세노사이드 Rd가 동물실험에서 발모 성장지수 및 발모비율을 증가시키고, 생장기 모발의 성장을 촉진하며, 모낭조직에서 생장기 모낭의 모낭수와 크기를 증가시키는 활성을 가지고 있음을 발견하였다. 또한 진세노사이드 Rd 생산량을 높이기 위한 방법을 예의 연구한 결과, 인삼 또는 홍삼추출물에 혼합 효소처리를 한 경우 탁월한 진세노사이드 Rd의 함량증가가 확인되어 본 발명을 완성하였다.

[특허문헌 1] 한국등록특허 제10-1063147호 [특허문헌 2] 한국등록특허 제10-1132246호 [특허문헌 3] 한국등록특허 제10-1341775호

상기와 같은 문제점을 해소하기 위하여, 본 발명은 인삼 또는 홍삼 추출물로부터 혼합효소처리를 통하여 진세노사이드 Rd를 다량 획득하는 것을 특징으로 하는 발효 인삼 또는 홍삼 추출물의 제조 방법과 상기 방법에 의해 제조된 유효성분으로 고함량의 진세노사이드 Rd를 함유하는 탈모방지 또는 발모촉진용 외용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

이상과 같은 발명의 목적을 해결하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 인삼 또는 홍삼 추출물로부터 혼합 효소처리를 이용하여 원료 인삼 또는 홍삼 추출물 대비 진세노사이드 Rd의 함량을 선택적으로 증가시키는 것을 특징으로 하는 발효 인삼 또는 홍삼 추출물의 제조 방법에 관한 것이다.

구체적인 양태로서, 본 발명에 따른 원료 인삼 또는 홍삼 추출물 대비 진세노사이드 Rd의 함량이 선택적으로 증가되는 것을 특징으로 하는 인삼 또는 홍삼 추출물의 제조 방법은 다음의 단계를 포함할 수 있다:

a) 원료 인삼 또는 홍삼 추출물을 제조하는 단계; 및

b) 단계 a)에서 제조된 원료 인삼 또는 홍삼 추출물에 효소의 혼합물을 접종하고, 30 내지 60℃ 의 온도에서 1 내지 24시간 동안 10 내지 20rpm으로 교반하여 발효 인삼 또는 홍삼추출액을 제조하는 단계.

본 발명에서, 진세노사이드 Rd는 (3β,12β)-20-(β-D-글루코피라노실옥시)-12-하이드록시다마르-24-엔-3-일-2-O-β-D-글루코피라노실-β-D-글루코피라노사이드((3β,12β)-20-(β-D-Glucopyranosyloxy)-12-hydroxydammar-24-en-3-yl-2-O-β-D-glucopyranosyl-β-D-glucopyranoside)라고 하며, 하기 화학식 1의 구조를 갖는 물질로, 인삼 또는 홍삼에 존재하는 물질이다.

[화학식 1]

이하, 각 단계를 구체적으로 설명한다.

상기 방법에서, 단계 a)에서 진세노사이드 Rd의 원생약으로 인삼 또는 홍삼을 사용할 수 있다. 인삼의 학명은 Panax ginseng C. A.Meyer로 두릅나무과(Araliaceae)의 식물이다. 홍삼은 이러한 인삼의 뿌리를 찐 것으로, 일반적으로 4년근 이상의 인삼을 사용하여, 홍삼의 연근은 4년근, 5년근 및 6년근으로 나누고 있다. 본 발명에서 사용되는 인삼 또는 홍삼의 종류는 특별한 제한은 없으며, 필요에 따라 적절한 것을 원생약으로서 직접 재배, 가공하거나 시판되는 것을 선택할 수 있다.

구체적인 양태로서, 상기 단계 a)는 효소 처리를 위한 재료가 되는 인삼 또는 홍삼의 추출액을 제조하는 단계로서, 원생약인 인삼 또는 홍삼을 세척, 건조, 파쇄한 후, 추출 용매를 가하고 가열하는 것에 의해 수행될 수 있다.

인삼 또는 홍삼의 추출액을 제조하기 위한 추출 용매로는, 본 발명에 따른 유효성분인 진세노사이드 Rd를 추출하기 위한 것이라면 통상 사용되는 추출용매를 제한없이 사용할 수 있다. 바람직하게, 상기 추출용매는 물, 또는 물과 다른 수혼화성 용매(예를 들어, 에탄올, 메탄올, 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 글리세린등), 또는 이들의 혼합용매를 사용할 수 있고, 추출용매는 원생약의 중량을 기준으로 5 내지 20배 중량을 사용할 수 있다. 상기 추출용매를 이용하여 50 내지 80℃의 온도, 4 내지 12시간 동안 추출하여 인삼 또는 홍삼 추출액을 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 구체적인 일 실시예에서는 홍삼의 건조 중량에 대한 10배의 중량의 물을 사용하여 6시간 동안 끓여 식히는 방법에 의하여 홍삼 추출물을 준비하였다.

나아가, 단계 b)는 상기 단계 a)에서 제조된 원료 인삼 또는 홍삼 추출물을 효소처리하는 단계로서, 특히, 특정 효소의 혼합물을 사용하는 것, 즉 단일효소처리가 아닌 복합효소처리하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게, 상기 단계 b)에서 사용될 수 있는 효소의 혼합물은 셀룰레이즈(Cellulase (A1)), 글루코아밀레이즈(Glucoamylase (A2)), 풀룰라네이즈(Pullulanase (A3)), 및 알파-아밀레이즈(Alpha-amylase (A4))로 이루어진 군으로부터 선택되는 둘 이상의 효소의 혼합물이고, 더욱 바람직하게는 셀룰레이즈:글루코아밀레이즈가 1:1로 혼합된 효소의 혼합물 또는 글루코아밀레이즈:풀룰라네이즈가 1:1로 혼합된 효소의 혼합물이다. 상기 단계 b)에서 사용되는 효소의 혼합물의 농도는 원료 인삼 또는 홍삼 추출액 대비 1.0 내지 20.0 중량%이 바람직하다. 나아가, 복합 효소 처리를 위해 30 내지 60℃ 의 온도에서 1 내지 24 시간 동안 교반하여 반응시키는 것이 바람직하다.

상기와 같은 방법에 따라 원료 인삼 또는 홍삼 추출물로부터 발효 인삼 또는 홍삼 추출물을 제조하는 경우, 추출물 내에 포함된 진세노사이드 Rd의 양이 현저하게 증가하여, 고함량의 진세노사이드 Rd를 포함한 발효 추출물을 수득할 수 있다.

구체적인 일 실시예에서, 복합 효소처리후 생산된 진세노사이드 Rd 생산량은 미처리군보다 2-7배 이상의 진세노사이드 Rd를 생산하였다(표3 내지 5 참조). 특히, 사용된 4가지 효소 중에는 셀룰레이즈(Cellulase)와 글루코아밀레이즈(Glucoamylase) 효소를 1:1 혼합 사용한 효소군이 효소처리 3시간후 미처리군에 비하여 7배 이상의 가장 높은 진세노사이드 Rd를 생산함을 확인하였다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기와 같은 제조방법에 의해 제조된, 고함량의 진세노사이드 Rd를 유효성분으로서 포함하는 탈모방지 또는 발모촉진용 외용제 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 조성물은, 상기 제조방법에 의해 상기 화학식 1의 진세노사이드 Rd를 고함량으로 포함한다. 바람직한 양태에서, 상기 외용제 조성물에는 진세노사이드 Rd가 전체 조성물중 0.001 내지 10.0중량%로 포함될 수 있다.

이러한 진세노사이드 Rd는 동물 및 인체를 대상으로 하여 시험한 결과, 탈모 방지 및 발모 촉진 효과를 나타냄을 확인하였는바, 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물로 사용될 수 있다. 바람직한 양태에서, 상기 외용제 조성물은 화장료 조성물 또는 약학적 조성물의 형태로 공지의 방법에 의하여 향장학적으로 또는 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 희석제 등의 첨가제를 포함시켜 제조될 수 있다. 본 발명의 외용제 조성물은 예를 들어, 헤어토닉, 헤어컨디셔너, 헤어에센스, 헤어로션, 헤어 영양로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 헤어크림, 헤어영양크림, 헤어모이스처크림, 헤어맛사지크림, 헤어왁스, 헤어 에어로졸, 헤어팩, 헤어영양팩, 헤어비누, 헤어클렌징폼, 머릿기름, 모발건조제, 모발보존처리제, 모발염색제, 모발용 웨이브제, 모발탈색제, 헤어겔, 헤어글레이즈, 헤어래커, 헤어모이스처라이저, 헤어무스 또는 헤어스프레이 등의 형태로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 발효 인삼 또는 홍삼 추출물의 제조방법은 혼합 효소처리방법을 이용하여, 탁월한 수준으로 증가된 진세노사이드 Rd를 포함하는 추출물을 생산할 수 있고, 이와 같이 고함량의 진세노사이드 Rd를 함유하는 추출물을 포함하는 외용제 조성물은 탁월한 발모 촉진, 탈모 방지 및 양모효과를 나타내는바, 탈모를 완화시키고, 모발의 양모, 육모를 촉진하는 조성물, 즉 탈모방지 또는 발모촉진용 외용조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 실험예 2의 결과로 B57/BL6 마우스에서 진세노사이드 Rd를 4주 처리후 육모효과를 음성대조군, 양성대조군과 비교실험한 결과이며,
도 2는 본 발명의 실험예 2의 결과로 B57/BL6 마우스에서 진세노사이드 Rd를 4주 처리후 모낭부위에 대해 음성대조군, 양성대조군과 조직염색결과를 비교한 사진이며,
도 3은 실험예 1의 결과로 홍삼 추출물을 효소 처리하여 진세노사이드 Rd를 확인한 크로마토그램이다.
도 4는 본 발명의 실험예 4의 결과로 진세노사이드 Rd 0.1%를 함유한 액상제형을 탈모환자에 6개월 사용하게 한 후, 사용전후의 탈모부위를 비교 촬영한 사진이며,
도 5는 본 발명의 실험예 4의 결과로 진세노사이드 Rd 0.1%를 함유한 액상제형을 탈모환자에 6개월 사용하게 한 후, 사용전후의 탈모부위를 제모 후 촬영한 사진이다.

본 발명은 하기 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다. 이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.

실험예 1: 진세노사이드 Rd의 생산

홍삼을 정제수로 세척한 후 건조하고 작은 조각으로 파쇄하였다. 홍삼 건조중량의 약 10배 물을 사용하여 열을 가하여 통상적인 방법에 따라 홍삼 추출물을 준비하였다. 20L의 용기에 준비한 추출물을 담고 Celluclast(Cellulase), Glucoamylase, Pullulanase, alpha-amylase(Novozyme 제품)등 4종의 단독효소와 혼합효소 2종을 홍삼 추출물 전체 중량을 기준으로 10 중량%의 농도로 접종하였다. 접종 후 25℃ 조건에서 1, 3, 6, 12, 24시간 반응시킨 후 시간별로 시료를 채취하여, 진세노사이드 Rd함량을 Prep.HPLC(Waters Co., Ltd. 미국)를 이용하여 정량하였다. 분석을 위한 용매조건 및 분석조건은 하기 표 1 및 2에 기재된 바와 같이 설정하여 진행하였다. 분리된 진세노사이드는 Sigma 표준품과 비교한 결과, 도 1의 HPLC 크로마토그램에서 나타난 바와 같이 진세노사이드 Rd임을 확인할 수 있었다.

진세노사이드 분석을 위한 용매조건
Time (min)	Flow (ml/min)	H₂O (%)(A액)	ACN(B액)
	1.0	82.0	18.0
35	1.0	76.0	24.0
45	1.0	71.0	29.0
80	1.0	60.0	40.0
110	1.0	35.0	65.0
130	1.0	15.0	85.0
150	1.0	15.0	85.0
155	1.0	82.0	18.0

진세노사이드 분석을 위한 HPLC 분석조건
Control factor	Condition
HPLC	Waters-PAD(Waters 1525, detector 2998)
Injection volume	20 μL
Column	Gemnini C18 (250x4.6mm 5 μm, Phenomex)
Mobile phase	Solvent A: Water, Solvent B: ACN
Flow rate	1.00 mL/min
Column Temperature	40℃
Wavelength	203 nm

홍삼추출물에 효소 처리후의 진세노사이드 함량 변화
Ginsenoside (mg/g)	Control	Celluclast(A1)+Glucoamylase(A2)					Celluclast(A1)
Ginsenoside (mg/g)	Control	1 h	3 h	6 h	12 h	24 h	1 h	3 h	6 h	12 h	24 h
Rg1	3.2	3.5	3.8	4.2	5.0	5.2	4.0	4.3	4.2	4.2	4.4
Re	6.2	6.6	7.0	7.2	7.7	6.6	7.0	7.0	7.2	7.4	6.4
Rf	2.1	2.1	2.2	2.3	1.8	1.4	2.2	2.3	2.3	1.5	1.2
F4	0.3	0.4	0.2	0.2	0.0	0.2	0.4	0.3	0.2	0.1	0.5
Rk3	0.1	0.1	0.1	0.2	0.0	0.0	0.1	0.0	0.2	0.2	0.3
F3	0.1	0.0	0.0	0.3	0.8	1.1	0.0	1.0	2.0	2.3	2.5
Rb1	12.1	2.8	1.8	1.6	1.3	1.3	1.7	1.2	1.2	1.2	1.6
Rc	10.1	9.2	7.3	4.2	1.8	0.2	3.4	0.5	0.7	0.0	0.0
Rb2	5.0	4.7	7.1	7.4	5.2	2.5	4.2	1.4	0.0	0.4	0.0
Rb3	1.1	1.2	1.4	1.1	0.8	0.4	0.8	0.0	0.0	0.0	0.0
Rd	2.5	16.1	17.5	16.4	15.5	10.0	10.1	8.6	8.0	6.9	5.0
F2	0.4	0.7	1.1	2.2	4.1	3.3	4.4	6.0	1.5	0.3	0.1
Rg3(s)	0.3	0.2	0.2	0.6	0.5	0.0	0.7	0.5	0.0	0.0	0.0
Rg3(r)	0.4	0.4	0.4	0.3	0.1	0.0	0.4	0.2	0.0	0.0	0.0
Rk1	0.5	0.6	0.6	0.4	0.2	0.0	0.4	0.0	0.2	0.2	0.2
CK	0.0	0.0	0.0	0.0	2.2	2.1	1.6	2.5	4.0	4.4	4.2
Total	44.4	47.6	50.5	48.6	47.0	44.3	41.4	28.8	31.7	29.1	26.4

홍삼 추출물에 효소 처리후의 진세노사이드 함량 변화
Ginsenoside (mg/g)	Control	Glucoamylase(A2)					Glucoamylase(A2)+Pullalanase(A3)
Ginsenoside (mg/g)	Control	1 h	3 h	6 h	12 h	24 h	1 h	3 h	6 h	12 h	24 h
Rg1	4.2	5.3	4.8	5.1	5.2		5.4	4.6	5.3	4.6	4.6	4.9
Re	7.2	8.6	7.7	8.3	8.3		8.5	7.9	8.6	8.1	7.7	8.2
Rf	2.3	2.8	2.5	2.6	2.5		2.3	2.6	2.9	2.6	2.3	2.3
F4	0.4	0.5	0.4	0.2	0.3		0.2	0.4	0.2	0.5	0.4	0.3
Rk3	0.1	0.2	0.1	0.8	0.1		0.0	0.2	0.7	0.2	0.2	3.7
F3	0.2	0.0	0.0	0.0	1.0		0.8	0.0	0.0	0.0	0.0	0.6
Rb1	14.1	2.4	1.4	1.3	1.9		2.0	2.4	1.7	1.6	1.9	2.0
Rc	11.1	9.0	5.3	3.8	1.9		1.2	11.7	12.1	10.0	7.8	5.4
Rb2	6.0	7.5	6.8	6.7	5.0		4.1	6.5	6.8	5.7	4.2	2.9
Rb3	1.1	1.5	1.3	1.3	0.9		0.6	1.2	1.3	1.1	0.8	0.6
Rd	2.9	4.3	4.1	4.8	2.9		2.4	4.7	4.2	5.4	3.3	3.2
F2	0.7	0.3	0.9	0.7	1.6		1.1	0.4	0.9	2.1	4.0	0.6
Rg3(s)	0.7	0.0	0.7	0.7	0.7		0.4	0.7	0.8	0.7	0.7	0.8
Rg3(r)	0.4	0.0	0.4	0.4	0.4		0.2	0.5	0.5	0.5	0.4	0.5
Rk1	0.6	0.3	0.5	0.5	0.3		0.0	0.7	0.7	0.5	0.5	0.4
CK	0.0	0.0	1.5	0.0	3.1		1.7	0.0	0.0	0.0	0.0	1.3
Total	52.1	42.6	38.5	37.3	36.1		31.0	44.5	46.6	43.4	39.0	37.8

홍삼 추출물에 효소 처리후의 진세노사이드 함량 변화
Ginsenoside (mg/g)	Control	Pullalanase(A3)					Alpha-amylase(A4)
Ginsenoside (mg/g)	Control	1 h	3 h	6 h		12 h	24 h	1 h	3 h	6 h	12 h	24 h
Rg1	4.0	4.8	4.8	4.1	5.4		5.2	4.2	5.1	4.1	4.1	4.2
Re	6.2	8.6	7.5	7.3	8.2		8.1	7.1	8.1	6.8	6.7	6.2
Rf	2.1	2.2	2.5	2.8	2.3		2.1	2.2	2.1	1.6	1.3	1.3
F4	0.3	0.4	0.4	0.2	0.2		0.2	0.3	0.1	0.4	0.3	0.3
Rk3	0.1	0.2	0.1	0.7	0.1		0.0	0.2	0.6	0.2	0.2	3.1
F3	0.2	0.0	0.0	0.0	1.0		0.8	0.0	0.2	0.3	0.0	0.5
Rb1	13.4	2.2	1.4	1.1	1.8		2.0	2.1	1.5	1.8	1.5	2.0
Rc	10.1	9.6	5.8	4.8	2.9		1.2	11.5	12.0	10.7	8.8	5.9
Rb2	6.6	7.1	5.8	6.1	5.0		4.1	6.2	6.5	5.1	3.2	2.6
Rb3	1.3	1.4	1.3	1.3	0.8		0.6	1.1	1.2	1.0	0.8	0.6
Rd	2.4	4.2	4.0	4.4	2.2		2.4	2.1	2.2	2.4	2.3	2.0
F2	0.8	0.3	0.8	0.5	1.4		1.0	0.3	0.8	2.0	3.0	0.8
Rg3(s)	0.8	0.0	0.6	0.6	0.5		0.3	0.5	0.7	0.6	0.5	0.4
Rg3(r)	0.5	0.0	0.3	0.2	0.4		0.1	0.7	0.6	0.8	0.4	0.3
Rk1	0.6	0.3	0.4	0.4	0.3		0.0	0.5	0.6	0.4	0.4	0.3
CK	0.0	0.0	1.3	0.0	3.0		1.5	0.0	0.0	0.0	0.8	1.2
Total	49.4	41.3	37.0	34.5	35.5		29.6	39.0	40.1	38.2	34.3	31.7

상기 표 3 내지 5에 나타난 바와 같이, 대조군 및 각각의 효소를 단독으로 처리하는 경우에 비해 2 이상의 효소를 복합처리하는 경우, 홍삼 추출물 중 진세노사이드 Rd의 함량이 현저하게 증가한 것을 확인할 수 있었다.

특히 셀룰레이즈인 셀루클라스트와 글루코아밀레이즈를 조합한 경우, 대조군 대비 약 7배, 셀루클라스트 단독에 비해 약 1.6배 많은 진세노사이드 Rd를 함유하고 있는 것으로 확인하였다.

실험예 2: 동물모델에서 진세노사이드 Rd의 발모효능평가

(1) 동물 군분리 및 제모

6주령의 C57BL6 마우스로서 검역 및 순화 기간 중 이상이 발견되지 않은 건강한 동물만을 대상으로 순화종료 시점(P42~43 days)에 electric clipper(ER143 / Panasonic / Japan)를 이용하여 1차 제모 후 shaving form(Gillette foamy sensitive / Gillette (35735378)/ Australia)을 바르고 shaving razor(Gillette Venus / Gillette (46239951)/ U.S)를 이용하여 가로로 등쪽 경부에서 꼬리 기시부까지의 길이와 세로로 등쪽 정중선을 기준으로 좌우 각각 1 cm 이상의 폭에 대하여 2차 제모를 실시하여 등쪽 피부색이 균질한 핑크색을 보이는 개체만을 선별하여 실험에 사용하였다. 군 분리는 제모 다음날 실시하도록 하며 제모과정에서 찰과 및 심한 발적이 발생하지 않은 동물만을 이용하여 체중 기준으로 Z 배열법에 따라 군 분리하였다.

(2) 투여방법

제모부위에 붓을 댄 후 0.1 중량% 진세노사이드 Rd 200ul을 micropipette을 이용하여 붓끝에 분주한 후 상하 방향으로 제모부위 전체에 균질하게 1일 1회 4주간 도포하였다.

(3) 체모에 대한 image analysis software 분석(이미지분석)

실험 시작 후 0일, 2주, 4주에 털이 자라는 상태를 육안으로 확인하기 위해 에테르로 마취한 후 사진촬영을 실시하였으며, 털이 자란 상태 정도를 육안으로 판단 비교하였다. 사진기는 Nikon사의 D70모델 (Tokyo, Japan)을 사용하였다. 이 사진을 image analysis software (Each system ships with 1 full version of Quantity One and unlimited copies of Quantity OneBasic Mode. Bio-Rad, USA)로 분석하였다. 전체 삭모 부위 중 생장기 모발이 자란 부위의 비 (전체 삭모 부위 면적 중 검정색 변한 면적의 비)를 구하였다. 이를 시험 1주, 2주, 3주, 4주째 측정하였다.

표 6에서 보는 바와 같이 시료투여 최종 4주째 등 부분의 전체 삭모 부위 중 생장기 모발이 자란 부위의 비(전체 삭모 부위 면적 중 검정색 변한 면적의 비)가 C57/BL6 음성대조군(NC)이 202.40이고, 양성대조군(PC)으로 3% 미녹시딜군이 217.78인데 비하여 0.1% 진세노사이드 Rd 도포군(DR-W)이 220.32로 음성대조군(negative control)에 비하여 통계학적으로 유의성 있게 전체 삭모 부위 중 생장기 모발이 자란 부위의 비가 증가(p<0.01) 하여 생장기 모발의 발모를 촉진하는 것으로 확인되었으며 양성대조군은 3% 미녹시딜 처리군(MXD)과도 유사한 결과를 보였다.

이미지분석에 의한 전체 삭모부위 중 생장기 모발이 자란 부위의 비율

Group	생장기 모발이 자란 부위/전체 삭모 부위
Group	1 주	2 주	3주	4 주
1% TXN-NC	112.8	168.1	172.9	191.3
	114.9	179.2	185.5	202.9
	118.8	167.2	172.6	205.1
	123.2	169.5	195.8	210.9
	138.7	165.4	171.1	201.8
Mean	121.68	169.88	179.58	202.40
S.E	4.62	2.43	4.83	3.20
1% TXN + 3% MXD(PC)	132.0	162.7	219.4	218.6
	136.8	188.2	198.1	217.7
	142.1	160.8	177.4	226.2
	135.6	172.5	205.8	213.3
	143.9	186.1	226.6	214.1
Mean	137.98	173.96	205.46	217.78
S.E	2.20	5.78	8.63	2.12
1%TXN+DR-W(Gin Rd)	129.1	85.3	208.1	227.3
	137.2	161.6	233.2	217.5
	145.0	152.7	218.7	225.0
	129.1	177.0	218.0	213.2
	148.8	188.6	197.4	218.6
Mean	137.84	153.04	215.08	220.32
S.E	4.04	18.08	5.98	2.58

실험예 3: 조직학적 분석

실험예 2에 따른 실험 4주째에 시료도포부위를 적출한 후 10% 포르말린 완충액을 사용하여 고정하였다. 통상적인 방법의 조직처리과정을 거쳐 파라핀에 포맷한 후, 마이크로톰(HM-315 model, Microm Co., Germany)을 이용하여 제작한 4μm의 파라핀 조직절편을 헤마톡시실린&에오신(Hematolxylin & Eosin) 염색하여 광학현미경(Olympus, Tokyo, Japan)으로 모낭조직의 조직학적 변화를 관찰하였다. 즉, 조직검사를 시행하여 생장기 모낭의 형성 여부를 평가하였다. 도 2에서 보는 바와 같이 진세노사이드를 처리한 군이 음성대조군에 비하여 모안의 모낭크기와 수가 많이 증가하여 육모효과가 있음을 확인하였으며, 기타 염증소견이나 병리학적 소견도 발견되지 않았다.

실험예 4: 탈모환자에서 탈모방지 육모효과 측정

(1) 발모제 조성물 제조

진세노사이드 Rd를 함유하는 발모제 조성물을 하기 표 7의 조성과 같이 액상시료로 제조하여 시험하였다. 시험대상자는 40대 내지 60대사이의 남녀 20명을 선정하여, 두 그룹(group)으로 나누어 6개월간 시험하였다. 시료는 매일 아침저녁 2회 약 5ml씩 사용하도록 하였으며 시험 전과 시험 후에 탈모부위의 육모상태를 아래와 같이 5가지 기준으로 평가하여 평균값을 산출하였다. 이와 같이 평가한 결과를 표 8에 나타내었다.

발모제 시료

성분	함량
성분	대조군	시험군
에탄올	15	15
진세노사이드 Rd		0.1
글리세린	1	1
방부제(메틸파라벤)	0.1	0.1
점증제(잔탄검)	0.1	0.1
정제수	To 100	To 100

<육모상태 판정기준>

0: 탈모부위가 처음과 차이가 없음: 신생모 등이 전혀 발견되지 않는다.

1: 탈모부위에 미세한 발모효과가 있음

2: 탈모부위에 발모효과 있음

3: 탈모부위에 중간 정도의 효과가 있음

4: 탈모부위에 우수한 발모효과가 있음.

발모시험결과

	대조군	시험군	비고
육모효과(평균값)	1.2	3.7	-

표 8에서 보는 바와 같이 진세노사이드 Rd를 함유한 시험군에서 대조군 대비 우수한 발모효과를 확인하였으며, 시험대상 중 효과가 우수한 시험자를 도 3에 나타내었다.

제조예1 : 헤어샴푸 제조예

표 9에 기재된 조성으로, 통상의 제조방법에 따라 발모샴푸를 제조하였다.

번호	원료명	함량(중량%)
1	소듐라우레스셀페이트(27%)	45
2	폴리쿼터니움-10	0.2
3	디메티콘(50%)	2.0
4	코카미도프로필베타인	6.0
5	카보머	적량
6	D-판테놀	0.1
7	에탄올	5.0
8	진세노사이드 Rd	0.1
9	멘톨	0.1
10	향료	적량
11	방부제(MCI)	적량
12	소금	적량
13	트리에탄올아민	적량
14	정제수	잔량
	계	100

제조예2 : 헤어에센스 제조예

표 10에 기재된 조성으로 통상의 방법에 따라 헤어에센스를 제조하였다.

번호	원료명	함량(중량%)
1	프로필렌글리콜	10.0
2	디메치콘(30%)	3.0
3	아모디메치콘	3.0
4	에탄올	5.0
5	진세노사이드 Rd	0.1
6	방부제(MCI)	적량
7	향	적량
8	정제수	잔량
	계	100.0

제조예3 : 헤어토닉 제조예

표 11의 기재된 조성으로 통상의 방법에 따라 제조하였다.

	원료명	함량(중량%)
1	프로필렌글리콜	5.0
2	에탄올	15.0
3	진세노사이드 Rd	0.1
4	피이지-40-하이드로제네티드카스터오일	1.0
5	멘톨	적량
6	방부제(MCI)	적량
8	정제수	잔량
	계	100.0

제조예4 : 헤어컨디셔너 제조예

표 12에 기재된 조성으로 통상의 방법에 따라 제조하였다.

번호	원료명	함량(중량%)
1	세틸알콜	3.0
2	세토스테아릴알콜	2.0
3	미리스틸알콜	2.0
4	디메티콘	5.0
5	카보머	적량
6	D-판테놀	0.1
7	스테아릴아미노프로필디메틸아민	1.0
8	진세노사이드 Rd	0.1
9	멘톨	0.1
10	향료	적량
11	방부제(MCI)	적량
12	비헨트리모늄클로라이드	적량
13	트리에탄올아민	적량
14	정제수	잔량
	계	100

제조예 5: 헤어오일 제조예

표 13의 조성으로 통상의 방법에 따라 제조하였다.

번호	원료명	함량(중량%)
1	사이클로디메티콘	50.0
2	사이클로펜타실록산	10.0
3	디메티코놀	30.0
4	동백유	5.0
5	토코페롤아세테이트	0.1
6	진세노사이드 Rd	0.1
7	멘톨	0.1
8	향료	적량
9	천연오일	잔량
	계	100

제조예 6: 헤어매니큐어 제조예

표 14에 기재된 조성으로 통상의 방법에 따라 제조하였다.

번호	원료명	함량(중량%)
1	글리세린	5.0
2	폴리비닐피롤리돈	1.0
3	비즈왁스	5.0
4	칸데릴라왁스	3.5
5	유화제	1.5
6	점증제	0.2
7	진세노사이드 Rd	0.1
8	색소	2.0
9	향료	적량
10	하이드롤라이즈드 케라틴	적량
11	방부제	적량
12	정제수	잔량
	계	100

Claims

a) 원료 인삼 또는 홍삼 추출물을 제조하는 단계: 및
b) 단계 a)에서 제조된 원료 인삼 또는 홍삼 추출물에 효소의 혼합물을 접종하고, 30 내지 60℃의 온도에서 1 내지 24시간 동안 10 내지 20rpm으로 교반하여 발효시키는 단계를 포함하고,
원료 인삼 또는 홍삼 추출물 대비 진세노사이드 Rd의 함량을 선택적으로 증가시키는 것을 특징으로 하는, 발효 인삼 또는 홍삼 추출물의 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 단계 a)는 인삼 또는 홍삼을 세척, 건조, 파쇄한 후, 추출 용매를 가하고 가열하는 것에 의해 수행되는 것인, 인삼 또는 홍삼 추출물의 진세노사이드 Rd의 함량을 증가시키는 방법.
제1항에 있어서,
상기 단계 b)의 효소의 혼합물은 글루코아밀레이즈, 풀룰라네이즈, 셀룰라클라스트 및 글루코아미네이즈로 이루어진 군으로부터 선택되는 둘 이상의 효소의 혼합물인, 인삼 또는 홍삼 추출물의 진세노사이드 Rd의 함량을 증가시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 b)에서 사용되는 효소의 혼합물의 농도는 1.0 내지 20.0 중량%인 것을 특징으로 하는, 인삼 또는 홍삼 추출물의 진세노사이드 Rd의 함량을 증가시키는 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된, 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물.
제5항에 있어서, 상기 조성물이 헤어토닉, 헤어컨디셔너, 헤어에센스, 헤어로션, 헤어 영양로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 헤어크림, 헤어영양크림, 헤어모이스처크림, 헤어맛사지크림, 헤어왁스, 헤어 에어로졸, 헤어팩, 헤어영양팩, 헤어비누, 헤어클렌징폼, 머릿기름, 모발건조제, 모발보존처리제, 모발염색제, 모발용 웨이브제, 모발탈색제, 헤어겔, 헤어글레이즈, 헤어래커, 헤어모이스처라이저, 헤어무스 또는 헤어스프레이인 것인, 조성물.