KR102187410B1 - 치료제를 전달하기 위한 pH-민감성 링커 - Google Patents

치료제를 전달하기 위한 pH-민감성 링커 Download PDF

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환-위 린
칭-이 린
멍-주 차이
완-이 수
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예-수 차오
이-홍 우
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Abstract

하기 화학식 (I)을 갖는 pH-민감성 링커. 이러한 링커는 금속성 나노입자 및 다양한 분자 크기를 갖는 하나 이상의 제제를 동시에 결합시킬 수 있다:
Figure 112018016857695-pct00107

상기 식에서,
X는
Figure 112018016857695-pct00108
(II)이며; P는 -C(O)NH- 또는 -C(O)O-이며; Q는 -R(CH2CH2O)m-, R(-C(O)NH-)z 또는 -R[-C(O)CH2CH2-C(O)NH-(CH2CH2O)m]Y이며; R은 결합, -C1- 12알킬 또는 C1- 10알콕시이며; m은 1 내지 12이며; z는 1 내지 4이며; Y는 1 내지 12이다.

Description

치료제를 전달하기 위한 pH-민감성 링커
본 발명은 제제 및 나노입자와 연결할 수 있는 링커에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 링커는 pH-민감성이고, 나노입자, 및 동일거나 상이한 종의 제제들에 동시에 결합할 수 있다.
세포, 특히 사이토졸(cytosol)로의 치료 화합물 및 진단 화합물의 특이적이고 효율적인 전달은 많은 제약 회사의 주요 목표이다. 특이성 및 섭취를 증가시키기 위해 여러 상이한 접근법들이 사용되었다. 예를 들어, 나노기술은 약물 전달 및 암 치료를 위한 새로운 전략의 개발에서 널리 사용되고 있다. pH-민감성 나노-시스템이 개발되었는데, 여기에서, 약물 방출은 산성 종양 환경에 의해 특이적으로 유발되며, 이러한 시스템은 암 치료의 효능을 개선시킬 수 있다. 펭 왕 등(Feng Wnang et al.)은 산-불안정한 연결을 통해 폴리(에틸렌 글리콜) 공간을 갖는 AuNP의 표면 상에 독소루비신을 테더링(tethering)시킴으로써 약물 전달 시스템을 개발하였다[American Chemical Society, 2011, Vol. 5, No. 5, pp. 3679-3692]. 티안-멩 선 등(Tian-Meng Sun et al.)은 히드라존 결합을 통해 금 나노입자에 컨쥬게이션된 독소루비신을 사용한 암 줄기 세포 치료법을 개시하였다[Biomaterials 35, 2014, pp. 836-845]. US 2013/0331764호는 암 세포로부터 분리되게 하기 위해 pH-민감성 금속 나노입자에 항암 약물을 결합시킴으로써 암 세포에 항암 약물을 전달하는 방법에 관한 것이다. WO 2013/139942호는 금속 나노입자 및 적어도 하나의 링커를 포함하는 나노입자를 제공한다.
그러나, 보다 양호한 효능을 갖는 pH-민감성 전달 시스템을 개발하는 것이 여전히 요구되고 있다.
본 발명은 하기 화학식 (I)을 갖는 pH-민감성 링커를 제공한다:
Figure 112018016857695-pct00001
상기 식에서,
X는
Figure 112018016857695-pct00002
, -SH, -NH2(Boc-NH-; Fmoc-NH-), -COOH이며;
n은 1 내지 6이며;
P는 -C(O)NH- 또는 -C(O)O-이며;
Q는 -R(CH2CH2O)m-, R(-C(O)NH-)z 또는 -R[-C(O)CH2CH2-C(O)NH-(CH2CH2O)m]Y이며;
R은 결합, -C1-12알킬 또는 C1-10알콕시이며;
m은 1 내지 12이며;
z는 1 내지 4이며;
Y는 1 내지 12이다.
일부 구현예에서, 링커는 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112018016857695-pct00003
(링커 I-아미드);
Figure 112018016857695-pct00004
(링커 I-C(O)O; 링커 III);
Figure 112018016857695-pct00005
(SH-C2-링커-I);
Figure 112018016857695-pct00006
(SH-C5-링커-I-아미드);
Figure 112018016857695-pct00007
(SH-C5-링커-I-C(O)O-;HS-C5-링커-III);
Figure 112018016857695-pct00008
(ppNH-C1-링커-I-아미드);
Figure 112018016857695-pct00009
(ppNH-C1-링커-I-C(O)O-; NH2-C1-링커-III-C(O)O-);
Figure 112018016857695-pct00010
(링커 II-아미드);
Figure 112018016857695-pct00011
(링커 II-C(O)O-);
Figure 112018016857695-pct00012
(SH-C5-링커-II-아미드);
Figure 112018016857695-pct00013
(SH-C5-링커-II-C(O)O-);
Figure 112018016857695-pct00014
(ppNH-C1-링커-II-아미드);
Figure 112018016857695-pct00015
(ppNH-C1-링커-II-C(O)O-);
Figure 112018016857695-pct00016
(링커 IV-아미드);
Figure 112018016857695-pct00017
(링커 IV-C(O)O-);
Figure 112018016857695-pct00018
(SH-C5-링커-IV-아미드);
Figure 112018016857695-pct00019
(SH-C5-링커-IV-C(O)O-);
Figure 112018016857695-pct00020
(ppNH-C1-링커-IV-아미드); 또는
Figure 112018016857695-pct00021
(ppNH-C1-링커-IV-C(O)O-).
본 발명은 또한, 하나 이상의 PEG로 선택적으로 착물화된, 본 발명의 하나 이상의 링커로 착물화된 금속성 나노입자를 포함하는, 금속성 나노입자 착물을 제공한다. 일 구현예에서, 금속성 나노입자는 Au, Pd, Pt 또는 Ag 나노입자이다. 일 구현예에서, 링커는 동일하거나 상이하다. 더욱 바람직하게, 금속성 나노입자 착물은 상이한 분자 길이를 갖는 복수의 링커를 포함한다.
본 발명은 또한, 상이한 치료제 또는 진단제 중 하나 이상의 제제를 연결시키는 하나 이상의 금속성 나노입자 착물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상이한 치료제 또는 진단제 중 하나 이상의 제제를 연결시키는 하나 이상의 금속성 나노입자 착물을 포함하는, 약물 전달 시스템을 제공한다.
도 1a 내지 도 1c는 금 나노입자 상에 컨쥬게이션된 항-HIV-1 p24 항체(mAb3)(Au/LKI-1/mAb-p24)가 여전히 결합 친화력을 나타냄을 도시한 것이다. 도 1a: Au/LKI-1/mAb-p24 착물 및 Au의 흡수 스펙트럼. Au/LKI-1/mAb-p24 착물은 플라즈몬 피크에서 2 nm 적색 이동을 나타낸다. 도 1b: Au/LKI-1/mAb-p24 착물은 Alexa Fluor 568 2차 항체로 검출한 형광을 도시한 것이다. 도 1c: Au/LKI-1/mAb-p24 착물의 형성, 및 mAb-p24의 결합 활성과 비교하기 위한 p24 항원의 결합 활성을 나타내기 위해 ELISA 검정이 사용되었다.
도 2a 및 도 2b는 금 나노입자 상에 컨쥬게이션된 EGFR(표피 성장 인자 수용체) 항체(Au/LKI-1/Ab-EGFR 및 Au/LKI-5/Ab-EGFR) 및 Au의 흡수 스펙트럼을 도시한 것이다. 도 2a: Au/LKI-1/Ab-EGFR 착물은 플라즈몬 피크에서 1 nm 적색 이동을 나타낸다. 도 2b: Au/LKI-5/Ab-EGFR 착물은 플라즈몬 피크에서 1 nm 적색 이동을 나타낸다.
도 3은 금 나노입자 상에 컨쥬게이션된 트라스투즈맙(Tras) 항체(Au/LKI-1/Tras) 및 Au의 흡수 스펙트럼을 도시한 것이다. Au/LKI-1/Tras 착물은 플라즈몬 피크에서 8 nm 적색 이동을 나타낸다.
도 4a 내지 도 4c는 금 나노입자 상에 컨쥬게이션된 에타네셉트(ETA)(Au/LKI-1/ETA)가 여전히 결합 친화력을 나타냄을 도시한 것이다. 도 4a: Au/LKI-1/ETA 착물 및 Au의 흡수 스펙트럼. Au/LKI-1/ETA 착물은 플라즈몬 피크에서 2 nm 적색 이동을 나타낸다. 도 4b: Au/LKI-1/ETA 착물은 Alexa Fluor 568 2차 항체로 검출된 형광을 나타낸다. 도 4c: Au 표면 상에 위치된 ETA에 1 내지 5 nm 금-표지된 2차 항-인간 IgG 항체가 결합한, Au/LKI-1/ETA 착물의 TEM 이미지가 관찰되었다.
도 5는 Au/LKI-1/Dox 착물 및 Au의 흡수 스펙트럼을 도시한 것이다. UV/vis 데이타(파장)는 Au/LKI-1/Dox 착물에서 3 nm 적색 이동을 나타낸다.
도 6a 내지 도 6d는 MDA-MB-231 유방 종양의 치료를 도시한 것이다. 도 6a: 치료 동안 순 동물 체중 변화(g). 이러한 데이타로부터, 독소루비신 및 Au/LKI-1/Dox는 누드 마우스(N=3)에서 각각 20% 및 3%의 체중 손실을 야기시켰다. 이는, 독소루비신과 비교하여 Au/LKI-1/Dox 착물이 누드 마우스에서 훨씬 적은 독성을 나타냄을 의미한다. 도 6b: MDA-MD-231 유방 종양 성장의 억제(N=3): Dox> Au/LKI-1/Dox >Au/PEG=PBS. 도 6c: Au/LKI-1/Dox 착물로 치료된 MDA-MB-231 유방 종양 세포의 TEM 이미지는 이종이식 모델의 종양에서 Au/LKI-1/Dox 착물을 용이하게 결정되었다. 도 6d: 종양 시편의 면역조직화학. 유방 종양 시편을 마우스로부터 취하고, 파라핀에 임베딩하고, 헤마톡실린에오신으로 염색하였다. Au/LKI-1/Dox 착물로 치료된 마우스로부터의 종양에서 보다 독소루비신으로 치료된 마우스로부터의 종양에서 괴사가 더 많이 관찰되었다.
본 발명은 최소한, 금속성 나노입자 및 다양한 분자 크기를 갖는 하나 이상의 제제를 동시에 결합시킬 수 있는 pH-민감성 링커의 발견을 기초로 한다. 본 발명의 링커는 제제가 세포 상에서 선택적으로 표적화하고 효과를 나타낼 수 있도록, 질병 과정에 관련된 세포 안에, 또는 세포 가까이 제제를 전달할 수 있다. 본 발명의 링커에 의해 제공된 표적 전달은 예를 들어, 질병 감지, 영상화, 약물 전달, 및 치료를 위해 사용될 수 있다.
달리 정의하지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 참조된 모든 특허, 출원, 공개된 출원 및 다른 간행물은 달리 기술하지 않는 한 전문이 참고로 포함된다. 본원의 용어에 대해 복수의 정의가 존재하는 경우에, 달리 기술하지 않는 한, 본 섹션에서의 정의가 우선한다.
용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 모노클로날 항체(예를 들어, 전장 또는 손상되지 않은 모노클로날 항체), 폴리클로날 항체, 일가, 다가 항체, 다중특이적 항체(예를 들어, 요망되는 생물학적 활성을 나타내는 한, 이중특이적 항체)를 포함하고, 또한, (본원에서 보다 상세히 기술되는 바와 같이) 특정 항체 단편을 포함할 수 있다. 항체는 키메라, 인간, 인간화된, 및/또는 친화력 성숙된 항체일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "종양"은 악성 또는 양성이든지 간에 모든 신생 세포 성장 및 증식, 및 모든 전암성 및 암성 세포 및 조직을 지칭한다. 용어 "암," "암성," "세포 증식성 질환," "증식성 질환" 및 "종양"은 본원에서 지칭되는 바와 같이 서로 배타적인 것은 아니다.
본원에서 사용되는 용어 "암"은 통상적으로, 조절되지 않는 세포 성장/증식에 의해 특징되는 포유동물에서의 생리학적 상태를 지칭한다. 암의 예는 암종, 림프종(예를 들어, 호지킨 림프종 및 비-호지킨 림프종), 모세포종, 육종, 및 백혈병, 편평세포암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암, 폐의 편평세포 암종, 복막의 암, 간세포 암, 위장암, 췌장암, 아교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부 암, 갑상선 암, 간내 암종, 백혈병 및 다른 림프증식성 질병, 및 다양한 타입의 두경부암을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "치료하는," "치료," "치료학적," 또는 "치료법"은 질병 또는 상태의 완전한 치료 또는 제거(abolition)를 반드시 의미하는 것은 아니다. 질병 또는 상태의 임의의 원치 않는 징후 또는 증상의 임의의 완화는 어느 정도까지, 치료 및/또는 치료법으로 여겨질 수 있다. 또한, 치료는 환자의 웰-빙(well-being) 또는 외모의 전반적인 느낌을 악화시킬 수 있는 행위를 포함할 수 있다.
"유효량"은 요망되는 치료학적 또는 예방학적 결과를 달성하는데, 필요한 투여량에 그리고 필요한 기간 동안, 효과적인 양을 지칭한다.
본 발명의 물질/분자의 "치료학적 유효량"은 개체의 질병 상태, 연령, 성별, 및 체중, 및 개체에서 요망되는 반응을 이끌어내는 물질/분자의 능력과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 치료학적 유효량은 또한, 치료학적으로 유익한 효과가 물질/분자의 임의의 독성 또는 유해한 효과 보다 더 큰 양이다. "예방학적 유효량"은 요망되는 예방학적 결과를 달성하는데 필요한 투여량에서 그리고 기간 동안, 효과적인 양을 지칭한다. 통상적으로, 그러나 필수적인 것은 아니지만, 예방학적 용량이 질병의 초기 단계 이전 또는 초기 단계에서 피검체에 사용될 수 있기 때문에, 예방학적 유효량은 치료학적 유효량 보다 적을 것이다.
용어 "약제학적으로 허용되는 염"은 이러한 것이 투여되는 유기체에 상당한 자극을 야기시키지 않고 화합물의 생물학적 활성 및 성질을 저해하지 않는 화합물의 염을 지칭한다.
일 양태에서, 본 발명은 하기 화학식 (I)을 갖는 pH-민감성 링커를 제공한다:
Figure 112018016857695-pct00022
상기 식에서,
X는
Figure 112018016857695-pct00023
, -SH, -NH2(Boc-NH-; Fmoc-NH-), -COOH이며;
n은 1 내지 6이며;
P는 -C(O)NH- 또는 -C(O)O-이며;
Q는 -R(CH2CH2O)m-, R(-C(O)NH-)z 또는 -R[-C(O)CH2CH2-C(O)NH-(CH2CH2O)m]Y이며;
R은 결합, -C1-12알킬 또는 C1-10알콕시이며;
m은 1 내지 12이며;
z는 1 내지 4이며;
Y는 1 내지 12이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 링커는 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112018016857695-pct00024
(링커 I-아미드)
상기 식에서, m은 1 내지 12이다.
링커 I-아미드는 X가
Figure 112018016857695-pct00025
이고, n이 4이고, P가 C(O)NH이고, R이 결합이고, Q가 -R(CH2CH2O)m-인, 화학식 (I)을 갖는다. 바람직하게, m은 1 내지 6의 정수이다. 더욱 바람직하게, m은 2의 정수이다.
본 발명의 링커 I-아미드의 링커는 본 개시 내용을 고려하여 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 바람직한 링커는 하기 반응식으로 나타낸 바와 같이 제조될 수 있다:
Figure 112018016857695-pct00026
일부 구현예에서, 본 발명의 링커는 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112018016857695-pct00027
(링커 I-C(O)O; 링커 III)
상기 식에서, m은 1 내지 12이다.
링커 I-C(O)O(링커 III)는 X가
Figure 112018016857695-pct00028
이고, n이 4이고, P가 -C(O)O-이고, R이 결합이고, Q가 -R(CH2CH2O)m-이고, m이 1 내지 12인, 화학식 (I)을 갖는다. 더욱 바람직하게, m은 2의 정수이다.
본 발명의 링커 I-C(O)O(링커 III)의 링커는 본 개시 내용을 고려하여 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 바람직한 링커는 하기 반응식에 나타낸 바와 같이 제조될 수 있다:
Figure 112018016857695-pct00029
일부 구현예에서, 본 발명의 링커는 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112018016857695-pct00030
(SH-C2-링커-I)
상기 식에서, m은 1 내지 12이다.
링커 SH-C2-링커-I은 X가 -SH이고, n이 2이고, P가 -C(O)NH-이고, R이 결합이고, Q가 -R(CH2CH2O)m-이고, m이 1 내지 12인 화학식 (I)을 갖는다. 더욱 바람직하게, m은 2의 정수이다.
본 발명의 SH-C2-링커-I의 링커는 본 개시 내용을 고려하여 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 바람직한 링커는 하기 반응식에 나타낸 바와 같이 제조될 수 있다:
Figure 112018016857695-pct00031
일부 구현예에서, 본 발명의 링커는 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112018016857695-pct00032
(SH-C5-링커-I-아미드)
상기 식에서, m은 1 내지 12이다.
링커 SH-C5-링커-I-아미드는 X가 -SH이고, n이 5이고, P가 -C(O)NH-이고, R이 결합이고, Q가 -R(CH2CH2O)m-이고, m이 1 내지 12인 화학식 (I)을 갖는다. 더욱 바람직하게, m은 2의 정수이다.
본 발명의 SH-C5-링커-I-아미드의 링커는 본 개시 내용을 고려하여 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 바람직한 링커는 하기 반응식에 나타낸 바와 같이 제조될 수 있다:
Figure 112018016857695-pct00033
일부 구현예에서, 본 발명의 링커는 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112018016857695-pct00034
(SH-C5-링커-I-C(O)O-;HS-C5-링커-III)
상기 식에서, m은 1 내지 12이다.
SH-C5-링커-I-C(O)O-(SH-C5-링커-III)는 X가 -SH이고, n이 5이고, P가 -C(O)O-이고, R이 결합이고, Q가 -R(CH2CH2O)m-이고, m이 1 내지 12인 화학식 (I)을 갖는다. 바람직하게, m은 1 내지 6의 정수이다. 더욱 바람직하게, m은 2의 정수이다.
본 발명의 SH-C5-링커-I-C(O)O-(SH-C5-링커-III)의 링커는 본 개시 내용을 고려하여 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 바람직한 링커는 하기 반응식에 나타낸 바와 같이 제조될 수 있다:
Figure 112018016857695-pct00035
일부 구현예에서, 본 발명의 링커는 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112018016857695-pct00036
(ppNH-C1-링커-I-아미드)
상기 식에서, pp는 보호기(예를 들어, Boc 또는 Fmoc)이며; m은 1 내지 12이다.
NH2-C1-링커-I-아미드는 X가 pp-NH-이고; pp가 보호기(예를 들어, Boc 또는 Fmoc)이고, n이 1이고, P가 -C(O)NH-이고, R이 결합이고, Q가 -R(CH2CH2O)m-이고, m이 1 내지 12인 화학식 (I)을 갖는다. 바람직하게, m은 1 내지 6의 정수이다. 더욱 바람직하게, m은 2의 정수이다.
본 발명의 NH2-C1-링커-I-아미드의 링커는 본 개시 내용을 고려하여 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 바람직한 링커는 하기 반응식에 나타낸 바와 같이 제조될 수 있다:
Figure 112018016857695-pct00037
일부 구현예에서, 본 발명의 링커는 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112018016857695-pct00038
(ppNH-C1-링커-I-C(O)O-; NH2-C1-링커-III-C(O)O-)
상기 식에서, pp는 보호기(예를 들어, Boc 또는 Fmoc)이며; m은 1 내지 12이다.
ppNH-C1-링커-I-C(O)O-(ppNH-C1-링커-III-C(O)O-)는 X가 pp-NH-(pp는 보호기, 예를 들어, Boc 또는 Fmoc임)이고, n이 1이고, P가 -C(O)O-이고, R이 결합이고, Q가 -R(CH2CH2O)m-이고, m이 1 내지 12인 화학식 (I)을 갖는다. 바람직하게, m은 1 내지 6의 정수이다. 더욱 바람직하게, m은 2의 정수이다.
본 발명의 ppNH-C1-링커-I-C(O)O-(ppNH-C1-링커-III-C(O)O-)의 링커는 본 개시 내용을 고려하여 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 바람직한 링커는 하기 반응식에 나타낸 바와 같이 제조될 수 있다:
Figure 112018016857695-pct00039
일부 구현예에서, 본 발명의 링커는 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112018016857695-pct00040
(링커 II-아미드)
상기 식에서, z는 1 내지 4이다.
링커 II-아미드는 X가
Figure 112018016857695-pct00041
이고, n이 4이고, P가 -C(O)NH-이고, R이 결합이고, Q가 R(-CH2C(O)NH-)z이고, z가 1 내지 4인 화학식 (I)을 갖는다. 더욱 바람직하게, z는 3의 정수이다.
본 발명의 링커 II-아미드의 링커는 본 개시 내용을 고려하여 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 바람직한 링커는 하기 반응식에 나타낸 바와 같이 제조될 수 있다:
Figure 112018016857695-pct00042
일부 구현예에서, 본 발명의 링커는 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112018016857695-pct00043
(링커 II-C(O)O-)
상기 식에서, z는 1 내지 4이다.
링커 II-C(O)O-는 X가
Figure 112018016857695-pct00044
이고, n이 4이고, P가 -C(O)O-이고, R이 결합이고, Q가 R(-CH2C(O)NH-)z이고, z가 1 내지 4인 화학식 (I)을 갖는다. 더욱 바람직하게, z는 3의 정수이다.
본 발명의 링커 II-C(O)O-의 링커는 본 개시 내용을 고려하여 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 바람직한 링커는 하기 반응식에 나타낸 바와 같이 제조될 수 있다:
Figure 112018016857695-pct00045
일부 구현예에서, 본 발명의 링커는 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112018016857695-pct00046
(SH-C5-링커-II-아미드)
상기 식에서, z는 1 내지 4이다.
SH-C5-링커-II-아미드는 X가 -SH이고, n이 5이고, P가 -C(O)NH-이고, R이 결합이고, Q가 R(-CH2C(O)NH-)z이고, z가 1 내지 4인 화학식 (I)을 갖는다. 더욱 바람직하게, z는 3의 정수이다.
다른 구현예에서, n은 2이다. 본 발명의 SH-C2-5-링커-II-아미드의 링커는 본 개시 내용을 고려하여 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 바람직한 링커는 하기 반응식에 나타낸 바와 같이 제조될 수 있다:
Figure 112018016857695-pct00047
일부 구현예에서, 본 발명의 링커는 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112018016857695-pct00048
(SH-C5-링커-II-C(O)O-)
상기 식에서, z는 1 내지 4이다.
SH-C5-링커-II-C(O)O-는 X가 CH3C(O)S-이고, n이 5이고, P가 -C(O)O-이고, R이 결합이고, Q가 R(-CH2C(O)NH-)z이고, z가 1 내지 4인 화학식 (I)을 갖는다. 더욱 바람직하게, z는 3의 정수이다.
다른 구현예에서, n은 2이다. 본 발명의 SH-C2-5-링커-II-C(O)O-의 링커는 본 개시 내용을 고려하여 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 바람직한 링커는 하기 반응식에 나타낸 바와 같이 제조될 수 있다:
Figure 112018016857695-pct00049
일부 구현예에서, 본 발명의 링커는 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112018016857695-pct00050
(ppNH-C1-링커-II-아미드)
상기 식에서, pp는 보호기(예를 들어, Boc 또는 Fmoc)이며; z는 1 내지 4이다.
ppNH-C1-링커-II-아미드는 X가 pp-NH-이고, pp가 보호기(예를 들어, Boc 또는 Fmoc)이고, n이 1이고, P가 -C(O)NH-이고, R이 결합이고, Q가 R(-C(O)NH-)z이고, z가 1 내지 4인 화학식 (I)을 갖는다. 더욱 바람직하게, z는 3의 정수이다.
본 발명의 ppNH-C1-링커-II-아미드의 링커는 본 개시 내용을 고려하여 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 바람직한 링커는 하기 반응식에 나타낸 바와 같이 제조될 수 있다:
Figure 112018016857695-pct00051
일부 구현예에서, 본 발명의 링커는 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112018016857695-pct00052
(ppNH-C1-링커-II-C(O)O-)
상기 식에서, pp는 보호기(예를 들어, Boc 또는 Fmoc)이며; z는 1 내지 4이다.
ppNH-C1-링커-II-C(O)O-는 X가 pp-NH-이고, pp가 보호기(예를 들어, Boc 또는 Fmoc)이고, n이 1이고, P가 -C(O)O-이고, R이 결합이고, Q가 R(-C(O)NH-)z이고, z가 1 내지 4인 화학식 (I)을 갖는다. 더욱 바람직하게, z는 3의 정수이다
본 발명의 ppNH-C1-링커-II-C(O)O-의 링커는 본 개시 내용을 고려하여 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 바람직한 링커는 하기 반응식에 나타낸 바와 같이 제조될 수 있다:
Figure 112018016857695-pct00053
일부 구현예에서, 본 발명의 링커는 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112018016857695-pct00054
(링커 IV-아미드)
상기 식에서, Y는 1 내지 12이다.
링커 IV-아미드는 X가
Figure 112018016857695-pct00055
이고, n이 4이고, P가 -C(O)NH-이고, R이 -CH2CH2O-이고, Q가 -R[-C(O)CH2CH2-C(O)NH-(CH2CH2O)m]Y이고, m이 3이고, Y가 1 내지 12인 화학식 (I)을 갖는다. 바람직하게, m은 2이며, Y는 2이다.
다른 구현예에서, m은 1 내지 12이다. 본 발명의 링커 IV-아미드의 링커는 본 개시 내용을 고려하여 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 바람직한 링커는 하기 반응식에 나타낸 바와 같이 제조될 수 있다:
Figure 112018016857695-pct00056
일부 구현예에서, 본 발명의 링커는 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112018016857695-pct00057
(링커 IV-C(O)O-)
상기 식에서, Y는 1 내지 12이다.
링커 IV-C(O)O-는 X가
Figure 112018016857695-pct00058
이고, n이 4이고, P가 -C(O)O-이고, R이 -CH2CH2O-이고, Q가 -R[-C(O)CH2CH2-C(O)NH-(CH2CH2O)m]Y이고, m이 3이고, Y가 1 내지 12인 화학식 (I)을 갖는다. 더욱 바람직하게, Y는 2의 정수이다.
다른 구현예에서, m은 1 내지 12이다. 본 발명의 링커 IV-C(O)O-의 링커는 본 개시 내용을 고려하여 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 바람직한 링커는 하기 반응식에 나타낸 바와 같이 제조될 수 있다:
Figure 112018016857695-pct00059
일부 구현예에서, 본 발명의 링커는 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112018016857695-pct00060
(SH-C5-링커-IV-아미드)
상기 식에서, Y는 1 내지 12이다.
SH-C5-링커-IV-아미드는 X가 CH3C(O)S-이고, n이 5이고, P가 -C(O)NH-이고, R이 -CH2CH2O-이고, Q가 -R[-C(O)CH2CH2-C(O)NH-(CH2CH2O)m]Y이고, m이 3이고, Y가 1 내지 12인 화학식 (I)을 갖는다. 더욱 바람직하게, Y은 2의 정수이다.
다른 구현예에서, n은 2 또는 5이며, m은 1 내지 12이다. 본 발명의 링커 SH-C2-5-링커-IV-아미드의 링커는 본 개시 내용을 고려하여 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 바람직한 링커는 하기 반응식에 나타낸 바와 같이 제조될 수 있다:
Figure 112018016857695-pct00061
일부 구현예에서, 본 발명의 링커는 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112018016857695-pct00062
(SH-C5-링커-IV-C(O)O-)
상기 식에서, Y는 1 내지 12이다.
SH-C5-링커-IV-C(O)O-는 X가 CH3C(O)S-이고, n이 5이고, P가 -C(O)O-이고, R이 -CH2CH2O-이고, Q가 -R[-C(O)CH2CH2-C(O)NH-(CH2CH2O)m]Y이고, m이 3이고, Y가 1 내지 12인 화학식 (I)을 갖는다. 바람직하게, Y는 1 내지 6의 정수이다. 더욱 바람직하게, Y는 2의 정수이다.
다른 구현예에서, n은 2 또는 5이며, m은 1 내지 12이다. 본 발명의 HS-C2-5-링커-IV-C(O)O-의 링커는 본 개시 내용을 고려하여 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 바람직한 링커는 하기 반응식에 나타낸 바와 같이 제조될 수 있다:
Figure 112018016857695-pct00063
일부 구현예에서, 본 발명의 링커는 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112018016857695-pct00064
(ppNH-C1-링커-IV-아미드)
상기 식에서, pp는 보호기(예를 들어, Boc 또는 Fmoc)이며; Y는 1 내지 12이다.
ppNH-C1-링커-IV-아미드는 X가 pp-NH-이고, pp가 보호기(예를 들어, Boc 또는 Fmoc)이고, n이 1이고, P가,-C(O)NH-이고, R이 -CH2CH2O-이고, Q가 -R[-C(O)CH2CH2-C(O)NH-(CH2CH2O)m]Y이고, m이 3이고, Y가 1 내지 12인 화학식 (I)을 갖는다. 더욱 바람직하게, Y는 2의 정수이다.
다른 구현예에서, m은 1 내지 12이다. 본 발명의 ppNH-C1-링커-IV-아미드의 링커는 본 개시 내용을 고려하여 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 바람직한 링커는 하기 반응식에 나타낸 바와 같이 제조될 수 있다:
Figure 112018016857695-pct00065
일부 구현예에서, 본 발명의 링커는 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112018016857695-pct00066
(ppNH-C1-링커-IV-C(O)O-)
상기 식에서, pp는 보호기(예를 들어, Boc 또는 Fmoc)이며; Y는 1 내지 12이다.
ppNH-C1-링커-IV-C(O)O-는 X가 pp-NH-이고, pp가 보호기(예를 들어, Boc 또는 Fmoc)이고, n이 1이고, P가 -C(O)O-이고, R이 -CH2CH2O-이고, Q가 -R[-C(O)CH2CH2-C(O)NH-(CH2CH2O)m]Y이고, m이 3이고, Y가 1 내지 12인 화학식 (I)을 갖는다. 더욱 바람직하게, Y는 2의 정수이다.
다른 구현예에서, m은 1 내지 12이다. 본 발명의 ppNH-C1-링커-IV-C(O)O-의 링커는 본 개시 내용을 고려하여 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 바람직한 링커는 하기 반응식에 나타낸 바와 같이 제조될 수 있다:
Figure 112018016857695-pct00067
다른 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 PEG로 선택적으로 착물화된, 본 발명의 하나 이상의 링커로 착물화된 금속성 나노입자를 포함하는, 금속성 나노입자 착물을 제공한다.
일 구현예에서, 금속성 나노입자는 Au, Pd, Pt 또는 Ag 나노입자이다.
일 구현예에서, 링커는 동일하거나 상이하다. 더욱 바람직하게, 금속성 나노입자 착물은 상이한 분자 길이를 갖는 복수의 링커를 포함한다. 상이한 분자 길이을 갖는 링커는 치료되거나 진단될 표적 세포 또는 질병의 요건에 따라 상이한 치료제 또는 진단제를 결합시킬 수 있다. 링커는 링커에서 1,2-디티올란 기 또는 -SH 기의 황 원자를 통해 금속성 나노입자에 연결한다.
일 구현예에서, 본 발명에서 사용되는 PEG의 분자량은 약 2000 내지 20,000 Da; 바람직하게, 2000 내지 5000의 범위이다. 페그화(PEGylation)는 또한, 일부 경우에, 링커 또는 나노입자와 생물학적 모이어티 간의 전하 상호작용을 감소시키기 위해, 예를 들어, 생물학적 모이어티와 상호작용하는 것으로부터 폴리머를 차단할 수 있는, 링커 또는 나노입자의 표면 상에 친수성 층을 생성시킴으로써, 사용될 수 있다. 일부 경우에, 폴리(에틸렌 글리콜) 반복 단위의 첨가는 예를 들어, 세포에 의한 트랜스펙션/섭취 효율을 감소시키면서 식세포계(phagocytic system)에 의한 폴리머 컨쥬게이트의 섭취를 감소시킴으로써, 폴리머 컨쥬게이트의 혈장 반감기를 증가시킬 수 있다. 당업자는 개환 중합 기술(ROMP), 등에 의해, 하기 실시예에서 논의되는 바와 같이, 아민에서 종결하는 PEG 기에 폴리머를 반응시키기 위해, 예를 들어, EDC(1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드) 및 NHS(N-히드록시숙신이미드)를 사용함으로써, 폴리머를 페그화하기 위한 방법 및 기술을 인지할 것이다.
다른 일 구현예에서, 금속성 나노입자는 약 100 nm 미만, 바람직하게, 80 nm 미만의 크기를 갖는다.
일부 구현예에서, 금속성 나노입자 착물은 상이한 치료제 또는 진단제 중 하나 이상의 제제를 추가로 연결한다. 바람직하게, 치료제는 항종양 약물 또는 항체이다. 바람직하게, 항체는 종양 세포와 같은 세포 표면에 항원 특이적 발현에 대해 표적화된 항체이며, 더욱 바람직하게, 항체는 표적화, 인지, 및 항-종양 세포 항체를 지닌다.
일부 구현예에서, 항종양 약물은 암의 치료에서 유용한 항암 약물 또는 항암 항체이다. 항암 약물의 예는 알킬화제, 예를 들어, 티오테파 및 시클로포스파미드; 알킬 설포네이트, 예를 들어, 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예를 들어, 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸아멜아민, 예를 들어, 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스파미드, 트리에틸렌티오포스포라미드, 및 트리메틸올로멜라민; 아세토게닌(특히, 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라히드로칸나비놀(드로나비놀); 베타-라파콘; 라파콜; 콜키신; 베툴린산; 캄프토테신(합성 유사 토포테칸, CPT-11(이리노테칸), 아세틸캄프토테신, 스코포렉틴, 및 9-아미노캄프토테신을 포함함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065(이의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체를 포함함); 포도필로톡신 포도필린산; 테니포시드; 그립토피신(특히, 트립토피신 1 및 트립토피신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신(합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1을 포함함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰기스타틴; 질소 머스타드, 예를 들어, 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로르에타민, 메클로르에타민 옥사이드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 펜에스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로우레아, 예를 들어, 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라님누스틴; 항생제, 예를 들어, 에네디인 항생제(예를 들어, 칼리케아마이신, 특히, 칼리케아마이신 감마II 및 칼리케아마이신 오메가II[예를 들어, 문헌[Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)] 참조]; 디네마이신 A를 포함한 디네마이신; 에스페라마이신; 뿐만 아니라, 네오카르지노스타틴 크로모포어 및 관련된 크로모단백질 에네디인 항생제 크로모포어), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노모아신, 카라비신, 카미노마이신, 카르지노필린, 클로로마이신, 닥티노마이신, 다우로루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신(모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신을 포함함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예를 들어, 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사물, 예를 들어, 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU); 폴산 유사체, 예를 들어, 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 푸린 유사체, 예를 들어, 플루다라빈, 6-메르캅토푸린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들어, 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘; 안드레겐, 예를 들어, 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스탄올, 메피티오스탄, 테스톨락톤; 항-안드레날, 예를 들어, 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 폴산 보충제, 예를 들어, 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코사이드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 마이탄시노이드, 예를 들어, 마이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; 다당류 착물(JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); 라족산; 리족신; 시조푸란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2''-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센(특히, T-2 톡신, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노사이드("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예를 들어, 파클리탁셀(Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), 파클리탁셀의 크로모포어-부재, 알부민-조작된 나노입자 제형(American Pharmaceutical Partners, Schaumber g, Ill.), 및 독세탁셀의 크로모포어-부재, 알부민-조작된 나노입자 제형(Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로르안부실; 겔시타빈; 6-티오구아닌; 메르캅토푸린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예를 들어, 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드(VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴; 옥살리플라틴; 류코보빈; 비노렐빈; 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포이소머라아제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레티노이드, 예를 들어, 레틴산; 카페시타빈; 상술된 것 중 임의의 약제학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체; 뿐만 아니라, 상기한 것들 중 둘 이상의 조합, 예를 들어, CHOP, 시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴, 및 프레드니솔론 및 FOLFOX의 병용 치료법에 대한 약어, 5-FU 및 류코보빈과 조합된 옥살리플라틴으로의 치료 요법에 대한 약어를 포함한다.
나노입자에 존재하는 항암 약물의 양은 넓은 범위에 걸쳐 달라질 수 있다. 일부 구현예에서, 나노입자는 나노입자에 대한 항암 약물의 질량 비율을 기초로 하여 약 1% 내지 약 50%(중량/중량) 범위의 항암 약물의 양을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 나노입자는 나노입자에 대한 항암 약물의 질량 비율을 기초로 하여 약 5% 내지 약 40%(중량/중량) 범위의 항암 약물의 양을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 나노입자는 약 10% 내지 약 30%(중량/중량)의 범위의 항암 약물의 양을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 나노입자는 나노입자에 대한 항암 약물의 질량 비율을 기초로 하여 약 1% 내지 약 10%(중량/중량), 약 1% 내지 약 5%(중량/중량), 약 5% 내지 약 10%(중량/중량), 약 10% 내지 약 20%(중량/중량), 약 15% 내지 약 35%(중량/중량), 약 30% 내지 약 40%(중량/중량), 등 범위의 항암 약물의 양을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 나노입자는 나노입자에 대한 항암 약물의 질량 비율을 기초로 하여 약 20%(중량/중량)의 항암 약물의 양을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 나노입자는 나노입자에 대한 항암 약물의 질량 비율을 기초로 하여 5%(중량/중량), 약 10%(중량/중량) 15%(중량/중량), 약 25%(중량/중량), 약 30%(중량/중량) 등의 항암 약물의 양을 포함할 수 있다.
본원에 기술된 일부 구현예는 상이한 치료제 또는 진단제 중 하나 이상의 제제를 연결하는 하나 이상의 금속성 나노입자 착물, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있는 조성물에 관한 것이다. 약제 조성물은 유기체에 상이한 치료제 또는 진단제 중 하나 이상의 제제를 연결하는 하나 이상의 금속성 나노입자 착물의 투여를 촉진시킨다. 경구, 주사, 에어로졸, 비경구 및 국소 투여를 포함하지만, 이로 제한되지 않는, 화합물을 투여하는 다수의 기술들이 당해 분야에 존재한다.
본원에 기술된 일부 구현예는 상이한 치료제 또는 진단제 중 하나 이상의 제제를 연결하는 하나 이상의 금속성 나노입자 착물을 포함하는, 약물 전달 시스템에 관한 것이다.
경구, 직장, 국소, 에어로졸, 주사, 및 근육내, 피하, 정맥내, 골수 내강 주사, 척수강내, 직접 심실내, 복강내, 비강내 및 안구내 주사를 포함하는 비경구 전달을 포함하지만, 이로 제한되지 않는, 상이한 치료제 또는 진단제 중 하나 이상의 제제를 연결시키는 금속성 나노입자 착물을 투여하는 여러 기술이 당해 분야에 존재한다.
실시예
실시예 1: 링커 I-아미드의 제조
단계 1. 에탄올아민(1.28 g, 1.05 eq) 및 리포산(4.13 g, 1.0 eq)을 80 mL DCM에 용해하고, EDC·HCl(4.98 g, 1.3 eq), 히드록시숙신이미드(NHS)(2.30 g, 1.0 eq) 및 트리에틸아민(6.4 mL, 2.3 eq)을 서서히 첨가하였다. 반응을 실온에서 적어도 5시간 동안 수행하고, 반응 이후에 TLC를 수행하였다. 후속하여, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 DCM:MeOH = 9.8:0.2를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 생성물은 옅은 황색 액체이다. 수율: 4.04 g; 81.0%.
단계 2. 4-니트로페닐 클로로포르메이트(3.35 g, 1.15 eq)를 2-구 병에 배치시켰다. 1시간 동안 진공 하에서, 3-방향 밸브를 질소 디바이스로 전환시키고, 60 mL DCM을 시린지로 첨가하였다. 계량된 단계 1 생성물 1을 10 내지 15 mL DCM으로 용해하고, 시린지로 반응 플라스크에 주입하고, 이후에, 트리에틸아민(4.5 mL, 2.3 eq)으로 서서히 첨가하였다. 반응을 얼음 배쓰에서 약 1시간 동안 수행하고, 이후에, 밤새 동안 실온으로 돌아오게 하였다. 반응의 완료 후에, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 EtOAc:Hex:MeOH = 1:1:0.2를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 생성물은 옅은 황색 액체이다. 정제 후, 수율: 51.6%.
단계 3. 계량된 단계 2 생성물 2(3.5 g, 1.0 eq)를 120 mL DCM에 용해하고, 이후에 히드라진 수화물(6.5 mL, 10.0 eq)을 서서히 첨가하였다. 반응을 실온에서 약 24시간 동안 수행하였다. 용액 칼라는 얕은 황색에서 오렌지색으로 변하였다. 반응의 완료 후에, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 DCM:MeOH = 9.5:0.5를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 이러한 단계에서, 생성물은 컬럼에 붙어 있고, MeOH는 최종 생성물을 용리시키기 위해 5%까지 증가될 수 있다. 생성물은 옅은 황색의 점착성의 고형물이다. 정제 후, 수율: 19.5%.
Figure 112018016857695-pct00068
링커 I-1(링커 I-아미드, m=2). 1 H(400 MHz) δ 1.23-1.31(2H, m), 1.40-1.51(3H, m), 1.57-1.64(1H, m), 1.78-1.86(1H, m), 2.05(2H, t), 2.32-2.39(1H, m), 3.01-3.18(4H, m), 3.39(2H, t), 3.52-3.57(3H, m), 4.03-4.19(4H, m), 7.94(1H, s), 8.14(1H, s). 13 C( 100 MHz ) δ 25.9, 29.0, 34.8, 36.1, 38.9, 39.5, 40.9, 57.2, 64.7, 69.3, 69.6, 159.5, 174.9 ppm. H-Mass (m/z): (M+Na) =374.1171
Figure 112018016857695-pct00069
링커 I-2(링커 I-아미드, m=1). 1 H( 300 MHz ) δ 1.30-1.38(2H, m), 1.45-1.57(3H, m), 1.60-1.72(1H, m), 1.80-1.92(1H, m), 2.06(2H, s), 2.36-2.46(1H, m), 3.07-3.24(4H, m), 3.56-3.65(1H, m), 3.95(2H, t), 4.02(2H, s), 7.88(1H, t), 8.11(1H, s). 13 C(100 MHz) δ 25.6, 28.8, 34.6, 35.9, 38.8, 39.4, 40.7, 56.9, 63.7, 163.8, 174.3ppm. H-Mass (m/z): (M+Na) = 330.0894.
Figure 112018016857695-pct00070
링커 I-3(링커 I-아미드, m=3). 1 H(300 MHz) δ 1.30-1.37(2H, m), 1.45-1.57(3H, m), 1.60-1.72(1H, m), 1.80-1.91(1H, m), 2.06(2H, t), 2.35-2.46(1H, m), 3.07-3.23(4H, m), 3.39(2H, t), 3.47-3.65(7H, m), 4.02(2H, s), 4.05-4.08(2H, m), 7.84(1H, t), 8.18(1H, s). 13 C(100 MHz) δ 25.7, 28.9, 34.7, 35.9, 38.8, 39.4, 40.7, 60.0, 64.4, 69.4, 69.6, 70.1, 70.3, 159.2, 174.2ppm. H-Mass (m/z): (M+Na) =418.1466.
Figure 112018016857695-pct00071
링커 I-4(링커 I-아미드, m=4). 1 H(300 MHz) δ 1.30-1.38(2H, m), 1.45-1.57(3H, m), 1.60-1.72(1H, m), 1.80-1.91(1H, m), 2.06(2H, t), 2.36-2.46(1H, m), 3.07-3.23(4H, m), 3.39(2H, t), 3.49-3.65(11H, m), 4.02(2H, s), 4.05-4.08(2H, m), 7.83(1H, t), 8.18(1H, s). 13 C(100 MHz) δ 25.7, 28.9, 34.7, 35.9, 38.8, 39.4, 40.7, 56.9, 64.4, 69.4, 69.6, 70.2, 70.3, 70.4, 159.2, 174.1ppm. H-Mass (m/z): (M+Na) =440.1875.
Figure 112018016857695-pct00072
링커 I-5(링커 I-아미드, m=5). 1 H(300 MHz) δ 1.30-1.38(2H, m), 1.45-1.57(3H, m), 1.60-1.69(1H, m), 1.80-1.91(1H, m), 2.06(2H, t), 2.36-2.46(1H, m), 3.07-3.23(4H, m), 3.39(2H, t), 3.51-3.62(19H, m), 4.02(2H, s), 4.05-4.08(2H, m), 4.83(1H, t), 8.18(1H, s). 13 C(100 MHz) δ 25.9, 29.0, 34.8, 36.1, 39.0, 39.4, 40.9, 57.2, 64.8, 69.5, 69.7, 70.3, 70.4, 70.5, 159.5, 174.8ppm. H-Mass (m/z): (M+Na) =550.2234
실시예 2: 링커 I-C(O)O의 제조
단계 1. 에틸렌 글리콜(1.30 g, 1.05 eq) 및 리포산(4.13 g, 1.0 eq)을 80 mL DCM에 용해하고, N,N'-디시클로헥실카르보디이미드(DCC)(5.36 g, 1.3 eq), 4-(디메틸아미노)피리딘(DMAP)(0.24 g, 0.1 eq) 및 트리에틸아민(6.4 mL, 2.3 eq)을 서서히 첨가하였다. 반응을 실온에서 적어도 5시간 동안 수행하고, 반응 이후에 TLC를 수행하였다. 후속하여, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 DCM:MOH = 9.8:0.2를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 생성물은 옅은 황색 액체이다. 수율: 4.00 g; 80.5%.
단계 2. 4-니트로페닐 클로로포르메이트(3.35 g, 1.15 eq)를 2-구 병에 배치시켰다. 1시간 동안 진공 하에서, 3-방향 밸브를 질소 디바이스로 전환시키고, 60 mL DCM을 시린지로 첨가하였다. 계량된 단계 1 생성물 1을 10 내지 15 mL DCM으로 용해하고, 시린지로 반응 플라스크에 주입하고, 이후에, 트리에틸아민(4.5 mL, 2.3 eq)으로 서서히 첨가하였다. 반응을 얼음 배쓰에서 약 1시간 동안 수행하고, 이후에, 밤새 동안 실온으로 돌아오게 하였다. 반응의 완료 후에, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 EtOAc:Hex:MeOH = 1:1:0.2를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 생성물은 옅은 황색 액체이다. 정제 후, 수율: 50.6%.
단계 3. 계량된 단계 2 생성물 2(3.5 g, 1.0 eq)를 120 mL DCM에 용해하고, 이후에 히드라진 수화물(6.5 mL, 10.0 eq)을 서서히 첨가하였다. 반응을 실온에서 약 24시간 동안 수행하였다. 용액 칼라는 얕은 황색에서 오렌지색으로 변하였다. 반응의 완료 후에, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 DCM:MeOH = 9.5:0.5를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 이러한 단계에서, 생성물은 컬럼에 붙어 있고, MeOH는 최종 생성물을 용리시키기 위해 5%까지 증가될 수 있다. 생성물은 옅은 황색의 점착성의 고형물이다. 정제 후, 수율: 18.5%.
실시예 3: HS-C 2 -링커-I-아미드의 제조
단계 1. 에탄올아민(1.28 g, 1.05 eq) 및 3-(아세틸티오)프로피온산(2.96 g,1.0 eq )을 80 mL DCM에 용해하고, EDC·HCl(4.98 g, 1.3 eq), 히드록시숙신이미드(NHS)(2.30 g, 1.0 eq) 및 트리에틸아민(6.4 mL, 2.3 eq)을 서서히 첨가하였다. 반응을 실온에서 적어도 5시간 동안 수행하고, 반응 이후에 TLC를 수행하였다. 후속하여, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 DCM:MeOH = 9.8:0.2를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 생성물은 옅은 황색 액체이다. 수율: 4.10 g; 70.0%.
단계 2. 4-니트로페닐 클로로포르메이트(3.35 g, 1.15 eq)를 2-구 병에 배치시켰다. 1시간 동안 진공 하에서, 3-방향 밸브를 질소 디바이스로 전환시키고, 60 mL DCM을 시린지로 첨가하였다. 계량된 단계 1 생성물 1을 10 내지 15 mL DCM으로 용해하고, 시린지로 반응 플라스크에 주입하고, 이후에, 트리에틸아민(4.5 mL, 2.3 eq)으로 서서히 첨가하였다. 반응을 얼음 배쓰에서 약 1시간 동안 수행하고, 이후에, 밤새 동안 실온으로 돌아오게 하였다. 반응의 완료 후에, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 EtOAc:Hex:MeOH = 1:1:0.2를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 생성물은 옅은 황색 액체이다. 정제 후, 수율: 48.6%.
단계 3. 계량된 단계 2 생성물 2(3.5 g, 1.0 eq)를 120 mL DCM에 용해하고, 이후에 히드라진 수화물(6.5 mL, 10.0 eq)을 서서히 첨가하였다. 반응을 실온에서 약 24시간 동안 수행하였다. 용액 칼라는 얕은 황색에서 오렌지색으로 변하였다. 반응의 완료 후에, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 DCM:MeOH = 9.5:0.5를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 이러한 단계에서, 생성물은 컬럼에 붙어 있고, MeOH는 최종 생성물을 용리시키기 위해 5%까지 증가될 수 있다. 생성물은 옅은 황색의 점착성의 고형물이다. 정제 후, 수율: 19.0%.
실시예 4: HS-C 5 -링커-I-아미드의 제조
단계 1. 에탄올아민(1.28 g, 1.05 eq) 및 6-아세틸티오헥산산(3.81 g,1.0 eq)을 80 mL DCM에 용해하고, EDC·HCl(4.98 g, 1.3 eq), 히드록시숙신이미드(NHS)(2.30 g, 1.0 eq) 및 트리에틸아민(6.4 mL, 2.3 eq)을 서서히 첨가하였다. 반응을 실온에서 적어도 5시간 동안 수행하고, 반응 이후에 TLC를 수행하였다. 후속하여, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 DCM:MOH = 9.8:0.2를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 생성물은 옅은 황색 액체이다. 수율: 3.85 g; 78.0%.
단계 2. 4-니트로페닐 클로로포르메이트(3.35 g, 1.15 eq)를 2-구 병에 배치시켰다. 1시간 동안 진공 하에서, 3-방향 밸브를 질소 디바이스로 전환시키고, 60 mL DCM을 시린지로 첨가하였다. 계량된 단계 1 생성물 1을 10 내지 15 mL DCM으로 용해하고, 시린지로 반응 플라스크에 주입하고, 이후에, 트리에틸아민(4.5 mL, 2.3 eq)으로 서서히 첨가하였다. 반응을 얼음 배쓰에서 약 1시간 동안 수행하고, 이후에, 밤새 동안 실온으로 돌아오게 하였다. 반응의 완료 후에, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 EtOAc:Hex:MeOH = 1:1:0.2를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 생성물은 옅은 황색 액체이다. 정제 후, 수율: 48.6%.
단계 3. 계량된 단계 2 생성물 2(3.5 g, 1.0 eq)를 120 mL DCM에 용해하고, 이후에 히드라진 수화물(6.5 mL, 10.0 eq)을 서서히 첨가하였다. 반응을 실온에서 약 24시간 동안 수행하였다. 용액 칼라는 얕은 황색에서 오렌지색으로 변하였다. 반응의 완료 후에, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 DCM:MeOH = 9.5:0.5를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 이러한 단계에서, 생성물은 컬럼에 붙어 있고, MeOH는 최종 생성물을 용리시키기 위해 5%까지 증가될 수 있다. 생성물은 옅은 황색의 점착성의 고형물이다. 정제 후, 수율: 17.0%.
Figure 112018016857695-pct00073
SH-C5-링커 I-1(SH-C5-링커-1-아미드, m은 2임): 1 H( 400 MHz ) δ 1.26-1.33(2H, m), 1.43-1.55(4H, m), 2.05(2H, t), 2.22(1H, s), 2.45(2H, t), 3.15-3.19(2H, m), 3.37(2H, t), 3.54(2H, t), 4.03-4.08(4H, m), 7.85(1H, t), 8.19(1H, s); 13 C(100 MHz) δ 23.7, 24.7, 27.4, 33.1, 35.2, 38.4, 63.3, 68.6, 69.1, 158.3, 172.2. H-Mass (m/z): (M+Na) =316.1336
Figure 112018016857695-pct00074
SH-C5-링커 I-4(SH-C5-링커-1-아미드, m은 4임): 1 H( 400 MHz ) δ 1.26-1.34(2H, m), 1.43-1.56(4H, m), 2.05(2H, t), 2.22(1H, t), 2.43-2.48(2H, m), 3.16-3.20(3H, m), 3.39(2H, t), 3.48-3.50(7H, m), 3.56(2H, m), 4.03-4.08(4H, m), 7.84(1H, m), 8.20(1H, s); 13 C(100 MHz) δ 23.7, 24.8, 27.4, 33.1, 35.2, 38.5, 63.4, 68.9, 69.2, 69.6, 69.8, 158.3, 172.2. H-Mass (m/z): (M+Na) =404.1843
실시예 5: SH-C 5 -링커-I-C(O)O-의 제조
단계 1. 에틸렌 글리콜(1.30 g, 1.05 eq) 및 6-아세틸티오헥산산(3.81 g,1.0 eq)을 80 mL DCM에 용해하고, N,N'-디시클로헥실카르보디이미드(DCC)(5.36 g, 1.3 eq), 4-(디메틸아미노)피리딘(DMAP)(0.24 g, 0.1 eq) 및 트리에틸아민(6.4 mL, 2.3 eq)을 서서히 첨가하였다. 반응을 실온에서 적어도 5시간 동안 수행하고, 반응 이후에 TLC를 수행하였다. 후속하여, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 DCM:MeOH = 9.8:0.2를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 생성물은 옅은 황색 액체이다. 수율: 3.88 g; 79.8%.
단계 2. 4-니트로페닐 클로로포르메이트(3.35 g, 1.15 eq)를 2-구 병에 배치시켰다. 1시간 동안 진공 하에서, 3-방향 밸브를 질소 디바이스로 전환시키고, 60 mL DCM을 시린지로 첨가하였다. 계량된 단계 1 생성물 1을 10 내지 15 mL DCM으로 용해하고, 시린지로 반응 플라스크에 주입하고, 이후에, 트리에틸아민(4.5 mL, 2.3 eq)으로 서서히 첨가하였다. 반응을 얼음 배쓰에서 약 1시간 동안 수행하고, 이후에, 밤새 동안 실온으로 돌아오게 하였다. 반응의 완료 후에, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 EA:Hex:MeOH = 1:1:0.2를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 생성물은 옅은 황색 액체이다. 정제 후, 수율: 51.6%.
단계 3. 계량된 단계 2 생성물 2(3.5 g, 1.0 eq)를 120 mL DCM에 용해하고, 이후에 히드라진 수화물(6.5 mL, 10.0 eq)을 서서히 첨가하였다. 반응을 실온에서 약 24시간 동안 수행하였다. 용액 칼라는 얕은 황색에서 오렌지색으로 변하였다. 반응의 완료 후에, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 DCM:MeOH = 9.5:0.5를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 이러한 단계에서, 생성물은 컬럼에 붙어 있고, MeOH는 최종 생성물을 용리시키기 위해 5%까지 증가될 수 있다. 생성물은 옅은 황색의 점착성의 고형물이다. 정제 후, 수율: 19.4%.
실시예 6: NH 2 -C 1 -링커-I-아미드의 제조
단계 1. 에탄올아민(1.28 g, 1.05 eq) 및 Boc-글리신(3.50 g,1.0 eq)을 80 mL DCM에 용해하고, EDC·HCl(4.98 g, 1.3 eq), 히드록시숙신이미드(NHS)(2.30 g, 1.0 eq) 및 트리에틸아민(6.4 mL, 2.3 eq)을 서서히 첨가하였다. 반응을 실온에서 적어도 5시간 동안 수행하고, 반응 이후에 TLC를 수행하였다. 후속하여, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 DCM:MeOH = 9.8:0.2를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 생성물은 옅은 황색 액체이다. 수율: 4.10 g; 81.5%.
단계 2. 4-니트로페닐 클로로포르메이트(3.35 g, 1.15 eq)를 2-구 병에 배치시켰다. 1시간 동안 진공 하에서, 3-방향 밸브를 질소 디바이스로 전환시키고, 60 mL DCM을 시린지로 첨가하였다. 계량된 단계 1 생성물 1을 10 내지 15 mL DCM으로 용해하고, 시린지로 반응 플라스크에 주입하고, 이후에, 트리에틸아민(4.5 mL, 2.3 eq)으로 서서히 첨가하였다. 반응을 얼음 배쓰에서 약 1시간 동안 수행하고, 이후에, 밤새 동안 실온으로 돌아오게 하였다. 반응의 완료 후에, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 EtOAc:Hex:MeOH = 1:1:0.2를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 생성물은 옅은 황색 액체이다. 정제 후, 수율: 51.6%.
단계 3. 계량된 단계 2 생성물 2(3.5 g, 1.0 eq)를 120 mL DCM에 용해하고, 이후에 히드라진 수화물(6.5 mL, 10.0 eq)을 서서히 첨가하였다. 반응을 실온에서 약 24시간 동안 수행하였다. 용액 칼라는 얕은 황색에서 오렌지색으로 변하였다. 반응의 완료 후에, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 DCM:MeOH = 9.5:0.5를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 이러한 단계에서, 생성물은 컬럼에 붙어 있고, MeOH는 최종 생성물을 용리시키기 위해 5%까지 증가될 수 있다. 생성물은 옅은 황색의 점착성의 고형물이다. 정제 후, 수율: 17.9%.
실시예 7: NH 2 -C 1 -링커-I-C(O)O-의 제조
단계 1. 에틸렌 글리콜(1.30 g, 1.05 eq) 및 Boc-글리신(3.50 g,1.0 eq)을 80 mL DCM에 용해하고, N,N'-디시클로헥실카르보디이미드(DCC)(5.36 g, 1.3 eq), 4-(디메틸아미노)피리딘(DMAP)(0.24 g, 0.1 eq) 및 트리에틸아민(6.4 mL, 2.3 eq)을 서서히 첨가하였다. 반응을 실온에서 적어도 5시간 동안 수행하고, 반응 이후에 TLC를 수행하였다. 후속하여, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 DCM:MeOH = 9.8:0.2를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 생성물은 옅은 황색 액체이다. 수율: 3.60 g; 78.0%.
단계 2. 4-니트로페닐 클로로포르메이트(3.35 g, 1.15 eq)를 2-구 병에 배치시켰다. 1시간 동안 진공 하에서, 3-방향 밸브를 질소 디바이스로 전환시키고, 60 mL DCM을 시린지로 첨가하였다. 계량된 단계 1 생성물 1을 10 내지 15 mL DCM으로 용해하고, 시린지로 반응 플라스크에 주입하고, 이후에, 트리에틸아민(4.5 mL, 2.3 eq)으로 서서히 첨가하였다. 반응을 얼음 배쓰에서 약 1시간 동안 수행하고, 이후에, 밤새 동안 실온으로 돌아오게 하였다. 반응의 완료 후에, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 EA:Hex:MeOH = 1:1:0.2를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 생성물은 옅은 황색 액체이다. 정제 후, 수율: 49.7%.
단계 3. 계량된 단계 2 생성물 2(3.5 g, 1.0 eq)를 120 mL DCM에 용해하고, 이후에 히드라진 수화물(6.5 mL, 10.0 eq)을 서서히 첨가하였다. 반응을 실온에서 약 24시간 동안 수행하였다. 용액 칼라는 얕은 황색에서 오렌지색으로 변하였다. 반응의 완료 후에, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 DCM:MeOH = 9.5:0.5를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 이러한 단계에서, 생성물은 컬럼에 붙어 있고, MeOH는 최종 생성물을 용리시키기 위해 5%까지 증가될 수 있다. 생성물은 옅은 황색의 점착성의 고형물이다. 정제 후, 수율: 20.0%.
실시예 8: 링커 II-아미드의 제조
단계 1. 글리신(2.36 g, 1.05 eq) 및 리포산(6.19 g,1.0 eq)을 80 mL DCM에 용해하고, EDC·HCl(7.47 g, 1.3 eq), 히드록시숙신이미드(NHS)(3.45 g, 1.0 eq) 및 트리에틸아민(9.6 mL, 2.3 eq)을 서서히 첨가하였다. 반응을 실온에서 적어도 5시간 동안 수행하고, 반응 이후에 TLC를 수행하였다. 후속하여, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 DCM:MeOH = 9.5:0.5를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 생성물은 옅은 황색 액체이다. 수율: 70.0%.
단계 2. 단계 1 생성물(5.26 g, 1.0 eq) 및 에탄올아민(1.28 g, 1.05 eq)을 80 mL DCM에 용해하고, EDC·HCl(4.98 g, 1.3 eq), 히드록시숙신이미드(NHS)(2.30 g, 1.0 eq) 및 트리에틸아민(6.4 mL, 2.3 eq)을 서서히 첨가하였다. 반응을 실온에서 적어도 5시간 동안 수행하고, 반응 이후에 TLC를 수행하였다. 후속하여, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 DCM:MeOH = 9.8:0.2를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 생성물은 옅은 황색 액체이다. 수율: 81.0%.
단계 3. 4-니트로페닐 클로로포르메이트(3.35 g, 1.15 eq)를 2-구 병에 배치시켰다. 1시간 동안 진공 하에서, 3-방향 밸브를 질소 디바이스로 전환시키고, 60 mL DCM을 시린지로 첨가하였다. 계량된 단계 1 생성물 1을 10 내지 15 mL DCM으로 용해하고, 시린지로 반응 플라스크에 주입하고, 이후에, 트리에틸아민(4.5 mL, 2.3 eq)으로 서서히 첨가하였다. 반응을 얼음 배쓰에서 약 1시간 동안 수행하고, 이후에, 밤새 동안 실온으로 돌아오게 하였다. 반응의 완료 후에, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 EtOAc:Hex:MeOH = 1:2:0.2를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 생성물은 옅은 황색 액체이다. 정제 후, 수율: 51.6%.
단계 4. 계량된 단계 2 생성물 2(3.5 g, 1.0 eq)를 120 mL DCM에 용해하고, 이후에 히드라진 수화물(6.5 mL, 10.0 eq)을 서서히 첨가하였다. 반응을 실온에서 약 24시간 동안 수행하였다. 용액 칼라는 얕은 황색에서 오렌지색으로 변하였다. 반응의 완료 후에, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 DCM:MeOH = 9.5:0.5를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 이러한 단계에서, 생성물은 컬럼에 붙어 있고, MeOH는 최종 생성물을 용리시키기 위해 5%까지 증가될 수 있다. 생성물은 옅은 황색의 점착성의 고형물이다. 정제 후, 수율: 30.0%.
Figure 112018016857695-pct00075
링커 II-1(링커 II-아미드, z=1). 1 H(400 MHz) δ 1.32-1.39(2H, m), 1.46-1.57(2H, m), 1.63-1.69(1H, m), 1.83-1.91(1H, m), 2.08(1H, s), 2.13(2H, t), 2.36-2.46(1H, m), 3.07-3.19(2H, m), 3.22-3.28(2H, m), 3.62-3.65 (3H, m), 3.95 (3H, t), 7.01(1H, s), 7.91(1H, t), 8.01(1H, t), 8.14(1H, s). 13 C(100 MHz) δ 25.2, 28.8, 34.6, 35.4, 38.6, 38.7, 39.5, 42.4, 56.60, 62.85, 135.63, 169.72, 172.83 ppm. H-Mass (m/z): (M+Na) =387.1102
Figure 112018016857695-pct00076
링커 II-2(링커 II-아미드, z=2). 1 H(300 MHz) δ 1.32-1.39(2H, m), 1.47-1.57(3H, m), 1.61-1.73(1H, m), 1.81-1.92(1H, m), 2.14(2H, t), 2.35-2.46(2H, m), 3.09-3.21(3H, m), 3.23-3.31(3H, m), 3.65-3.71(4H, m), 3.97 (2H, t), 7.78 (1H, t), 7.89(1H, t), 8.12(2H, t). 13 C(100 MHz) δ 25.3, 28.8, 34.6, 35.4, 38.6, 38.7, 39.5, 42.4, 42.6, 56.6, 60.2, 62.8, 169.4, 169.9, 173.1 ppm. H-Mass (m/z): (M+Na) =444.1345
Figure 112018016857695-pct00077
링커 II-3(링커 II-아미드, z=3). 1 H(300 MHz) δ 1.23(1H, s), 1.32-1.40(2H, m), 1.46-1.57(4H, m), 1.63-1.70(1H, m), 1.80-1.92(2H, t), 1.96(1H, s), 2.04(1H, s), 2.14(3H, t), 3.07-3.19(3H, m), 3.58-3.66 (3H, m), 3.72 (3H, t), 3.96(1H, t), 4.05(1H, s), 7.86(1H, s), 8.10(3H, s). 13 C(100 MHz) δ 25.3, 28.8, 34.6, 35.4, 38.6, 39.5, 39.7, 40.5, 42.4, 42.6, 56.6, 60.2, 62.8, 169.4, 169.6, 170.1, 173.1 ppm. H-Mass (m/z): (M+Na) =501.1606
Figure 112018016857695-pct00078
링커 II-4(링커 II-아미드, z=4). 1 H(300 MHz) δ 1.26(3H, s), 1.35-1.42(2H, m), 1.47-1.70(4H, m), 1.82-1.94(2H, m), 2.03-2.20(8H, m), 2.26-2.33(2H, m), 3.66-3.81(7H, m), 3.95-4.01(1H, m), 7.86-7.94(1H, m), 8.80-8.22(3H, m). 13 C(100 MHz) δ 25.3, 28.8, 29.4, 31.2, 34.6, 35.4, 38.5, 38.6, 42.4, 42.6, 56.6, 66.0, 125.8, 128.7, 129.4, 169.4, 169.8, 170.0, 173.1 ppm. H-Mass (m/z): (M+Na) =558.1768
실시예 9: 링커 II-C(O)O-의 제조
단계 1. 글리콜산(2.40 g, 1.05 eq) 및 리포산(6.19 g,1.0 eq)을 80 mL DCM에 용해하고, N,N'-디시클로헥실카르보디이미드(DCC)(8.05 g, 1.3 eq), 4-(디메틸아미노)피리딘(DMAP)(0.37 g, 0.1 eq) 및 트리에틸아민(9.6 mL, 2.3 eq)을 서서히 첨가하였다. 반응을 실온에서 적어도 5시간 동안 수행하고, 반응 이후에 TLC를 수행하였다. 후속하여, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 DCM:MeOH = 9.5:0.5를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 생성물은 옅은 황색 액체이다. 수율: 85%.
단계 2. 단계 1 생성물(5.26 g, 1.0 eq) 및 에탄올아민(1.28 g, 1.05 eq)을 80 mL DCM에 용해하고, EDC·HCl(4.98 g, 1.3 eq), 히드록시숙신이미드(NHS)(2.30 g, 1.0 eq) 및 트리에틸아민(6.4 mL, 2.3 eq)을 서서히 첨가하였다. 반응을 실온에서 적어도 5시간 동안 수행하고, 반응 이후에 TLC를 수행하였다. 후속하여, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 DCM:MeOH = 9.8:0.2를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 생성물은 옅은 황색 액체이다. 수율: 80.5%.
단계 3. 4-니트로페닐 클로로포르메이트(3.35 g, 1.15 eq)를 2-구 병에 배치시켰다. 1시간 동안 진공 하에서, 3-방향 밸브를 질소 디바이스로 전환시키고, 60 mL DCM을 시린지로 첨가하였다. 계량된 단계 1 생성물 1을 10 내지 15 mL DCM으로 용해하고, 시린지로 반응 플라스크에 주입하고, 이후에, 트리에틸아민(4.5 mL, 2.3 eq)으로 서서히 첨가하였다. 반응을 얼음 배쓰에서 약 1시간 동안 수행하고, 이후에, 밤새 동안 실온으로 돌아오게 하였다. 반응의 완료 후에, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 EtOAc:Hex:MeOH = 1:2:0.2를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 생성물은 옅은 황색 액체이다. 정제 후, 수율: 47.8%.
단계 4. 계량된 단계 2 생성물 2(3.5 g, 1.0 eq)를 120 mL DCM에 용해하고, 이후에 히드라진 수화물(6.5 mL, 10.0 eq)을 서서히 첨가하였다. 반응을 실온에서 약 24시간 동안 수행하였다. 용액 칼라는 얕은 황색에서 오렌지색으로 변하였다. 반응의 완료 후에, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 DCM:MeOH = 9.5:0.5를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 이러한 단계에서, 생성물은 컬럼에 붙어 있고, MeOH는 최종 생성물을 용리시키기 위해 5%까지 증가될 수 있다. 생성물은 옅은 황색의 점착성의 고형물이다. 정제 후, 수율: 19.3%.
실시예 10: 링커 SH-C 5 -링커-II-아미드의 제조
단계 1. 6-아세틸티오헥산산(5.71 g, 1.0 eq) 및 글리신(2.36 g,1.05 eq)을 80 mL DCM에 용해하고, EDC·HCl(7.47 g, 1.3 eq), 히드록시숙신이미드(NHS)(3.45 g, 1.0 eq) 및 트리에틸아민(9.6 mL, 2.3 eq)을 서서히 첨가하였다. 반응을 실온에서 적어도 5시간 동안 수행하고, 반응 이후에 TLC를 수행하였다. 후속하여, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 DCM:MeOH = 9.5:0.5를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 생성물은 옅은 황색 액체이다. 수율: 68.8%.
단계 2. 단계 1 생성물(5.26 g, 1.0 eq) 및 에탄올아민(1.28 g, 1.05 eq)을 80 mL DCM에 용해하고, EDC·HCl(4.98 g, 1.3 eq), 히드록시숙신이미드(NHS)(2.30 g, 1.0 eq) 및 트리에틸아민(6.4 mL, 2.3 eq)을 서서히 첨가하였다. 반응을 실온에서 적어도 5시간 동안 수행하고, 반응 이후에 TLC를 수행하였다. 후속하여, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 DCM:MeOH = 9.8:0.2를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 생성물은 옅은 황색 액체이다. 수율: 80.5%.
단계 3. 4-니트로페닐 클로로포르메이트(3.35 g, 1.15 eq)를 2-구 병에 배치시켰다. 1시간 동안 진공 하에서, 3-방향 밸브를 질소 디바이스로 전환시키고, 60 mL DCM을 시린지로 첨가하였다. 계량된 단계 1 생성물 1을 10 내지 15 mL DCM으로 용해하고, 시린지로 반응 플라스크에 주입하고, 이후에, 트리에틸아민(4.5 mL, 2.3 eq)으로 서서히 첨가하였다. 반응을 얼음 배쓰에서 약 1시간 동안 수행하고, 이후에, 밤새 동안 실온으로 돌아오게 하였다. 반응의 완료 후에, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 EtOAc:Hex:MeOH = 1:2:0.2를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 생성물은 옅은 황색 액체이다. 정제 후, 수율: 50.6%.
단계 4. 계량된 단계 2 생성물 2(3.5 g, 1.0 eq)를 120 mL DCM에 용해하고, 이후에 히드라진 수화물(6.5 mL, 10.0 eq)을 서서히 첨가하였다. 반응을 실온에서 약 24시간 동안 수행하였다. 용액 칼라는 얕은 황색에서 오렌지색으로 변하였다. 반응의 완료 후에, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 DCM:MeOH = 9.5:0.5를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 이러한 단계에서, 생성물은 컬럼에 붙어 있고, MeOH는 최종 생성물을 용리시키기 위해 5%까지 증가될 수 있다. 생성물은 옅은 황색의 점착성의 고형물이다. 정제 후, 수율: 18.3%.
실시예 11: 링커SH -C 5 -링커-II-C(O)O-의 제조
단계 1. 6-아세틸티오헥산산(5.71 g, 1.0 eq) 및 글리콜산(2.40 g,1.05 eq)을 80 mL DCM에 용해하고, N,N'-디시클로헥실카르보디이미드(DCC)(8.05 g, 1.3 eq), 4-(디메틸아미노)피리딘(DMAP)(0.37 g, 0.1 eq) 및 트리에틸아민(9.6 mL, 2.3 eq)을 서서히 첨가하였다. 반응을 실온에서 적어도 5시간 동안 수행하고, 반응 이후에 TLC를 수행하였다. 후속하여, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 DCM:MeOH = 9.5:0.5를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 생성물은 옅은 황색 액체이다. 수율: 78%.
단계 2. 단계 1 생성물(5.26 g, 1.0 eq) 및 에탄올아민(1.28 g, 1.05 eq)을 80 mL DCM에 용해하고, EDC·HCl(4.98 g, 1.3 eq), 히드록시숙신이미드(NHS)(2.30 g, 1.0 eq) 및 트리에틸아민(6.4 mL, 2.3 eq)을 서서히 첨가하였다. 반응을 실온에서 적어도 5시간 동안 수행하고, 반응 이후에 TLC를 수행하였다. 후속하여, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 DCM:MeOH = 9.8:0.2를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 생성물은 옅은 황색 액체이다. 수율: 80.5%.
단계 3. 4-니트로페닐 클로로포르메이트(3.35 g, 1.15 eq)를 2-구 병에 배치시켰다. 1시간 동안 진공 하에서, 3-방향 밸브를 질소 디바이스로 전환시키고, 60 mL DCM을 시린지로 첨가하였다. 계량된 단계 1 생성물 1을 10 내지 15 mL DCM으로 용해하고, 시린지로 반응 플라스크에 주입하고, 이후에, 트리에틸아민(4.5 mL, 2.3 eq)으로 서서히 첨가하였다. 반응을 얼음 배쓰에서 약 1시간 동안 수행하고, 이후에, 밤새 동안 실온으로 돌아오게 하였다. 반응의 완료 후에, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 EtOAc:Hex:MeOH = 1:2:0.2를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 생성물은 옅은 황색 액체이다. 정제 후, 수율: 51.6%.
단계 4. 계량된 단계 2 생성물 2(3.5 g, 1.0 eq)를 120 mL DCM에 용해하고, 이후에 히드라진 수화물(6.5 mL, 10.0 eq)을 서서히 첨가하였다. 반응을 실온에서 약 24시간 동안 수행하였다. 용액 칼라는 얕은 황색에서 오렌지색으로 변하였다. 반응의 완료 후에, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 DCM:MeOH = 9.5:0.5를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 이러한 단계에서, 생성물은 컬럼에 붙어 있고, MeOH는 최종 생성물을 용리시키기 위해 5%까지 증가될 수 있다. 생성물은 옅은 황색의 점착성의 고형물이다. 정제 후, 수율: 19.0%.
실시예 12: 링커NH 2 -C 1 -링커-II-아미드의 제조
단계 1. Boc-글리신(5.26 g, 1.0 eq) 및 글리신(2.36 g,1.05 eq)을 80 mL DCM에 용해하고, EDC·HCl(7.47 g, 1.3 eq), 히드록시숙신이미드(NHS)(3.45 g, 1.0 eq) 및 트리에틸아민(9.6 mL, 2.3 eq)을 서서히 첨가하였다. 반응을 실온에서 적어도 5시간 동안 수행하고, 반응 이후에 TLC를 수행하였다. 후속하여, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 DCM:MeOH = 9.5:0.5를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 생성물은 옅은 황색 액체이다. 수율: 70%.
단계 2. 단계 1 생성물(5.26 g, 1.0 eq) 및 에탄올아민(1.28 g, 1.05 eq)을 80 mL DCM에 용해하고, EDC·HCl(4.98 g, 1.3 eq), 히드록시숙신이미드(NHS)(2.30 g, 1.0 eq) 및 트리에틸아민(6.4 mL, 2.3 eq)을 서서히 첨가하였다. 반응을 실온에서 적어도 5시간 동안 수행하고, 반응 이후에 TLC를 수행하였다. 후속하여, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 DCM:MeOH = 9.8:0.2를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 생성물은 옅은 황색 액체이다. 수율: 77.8%.
단계 3. 4-니트로페닐 클로로포르메이트(3.35 g, 1.15 eq)를 2-구 병에 배치시켰다. 1시간 동안 진공 하에서, 3-방향 밸브를 질소 디바이스로 전환시키고, 60 mL DCM을 시린지로 첨가하였다. 계량된 단계 1 생성물 1을 10 내지 15 mL DCM으로 용해하고, 시린지로 반응 플라스크에 주입하고, 이후에, 트리에틸아민(4.5 mL, 2.3 eq)으로 서서히 첨가하였다. 반응을 얼음 배쓰에서 약 1시간 동안 수행하고, 이후에, 밤새 동안 실온으로 돌아오게 하였다. 반응의 완료 후에, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 EtOAc:Hex:MeOH = 1:2:0.2를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 생성물은 옅은 황색 액체이다. 정제 후, 수율: 51.6%.
단계 4. 계량된 단계 2 생성물 2(3.5 g, 1.0 eq)를 120 mL DCM에 용해하고, 이후에 히드라진 수화물(6.5 mL, 10.0 eq)을 서서히 첨가하였다. 반응을 실온에서 약 24시간 동안 수행하였다. 용액 칼라는 얕은 황색에서 오렌지색으로 변하였다. 반응의 완료 후에, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 DCM:MeOH = 9.5:0.5를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 이러한 단계에서, 생성물은 컬럼에 붙어 있고, MeOH는 최종 생성물을 용리시키기 위해 5%까지 증가될 수 있다. 생성물은 옅은 황색의 점착성의 고형물이다. 정제 후, 수율: 18.8%.
실시예 13: NH 2 -C 1 -링커-II-C(O)O-의 제조
단계 1. Boc-글리신(5.26 g, 1.0 eq) 및 글리콜산(2.40 g,1.05 eq)을 80 mL DCM에 용해하고, N,N'-디시클로헥실카르보디이미드(DCC)(8.05 g, 1.3 eq), 4-(디메틸아미노)피리딘(DMAP)(0.37 g, 0.1 eq) 및 트리에틸아민(9.6 mL, 2.3 eq)을 서서히 첨가하였다. 반응을 실온에서 적어도 5시간 동안 수행하고, 반응 이후에 TLC를 수행하였다. 후속하여, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 DCM:MOH = 9.5:0.5를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 생성물은 옅은 황색 액체이다. 수율: 82.0%.
단계 2. 단계 1 생성물(5.26 g, 1.0 eq) 및 에탄올아민(1.28 g, 1.05 eq)을 80 mL DCM에 용해하고, EDC·HCl(4.98 g, 1.3 eq), 히드록시숙신이미드(NHS)(2.30 g, 1.0 eq) 및 트리에틸아민(6.4 mL, 2.3 eq)을 서서히 첨가하였다. 반응을 실온에서 적어도 5시간 동안 수행하고, 반응 이후에 TLC를 수행하였다. 후속하여, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 DCM:MeOH = 9.8:0.2를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 생성물은 옅은 황색 액체이다. 수율: 78.5%.
단계 3. 4-니트로페닐 클로로포르메이트(3.35 g, 1.15 eq)를 2-구 병에 배치시켰다. 1시간 동안 진공 하에서, 3-방향 밸브를 질소 디바이스로 전환시키고, 60 mL DCM을 시린지로 첨가하였다. 계량된 단계 1 생성물 1을 10 내지 15 mL DCM으로 용해하고, 시린지로 반응 플라스크에 주입하고, 이후에, 트리에틸아민(4.5 mL, 2.3 eq)으로 서서히 첨가하였다. 반응을 얼음 배쓰에서 약 1시간 동안 수행하고, 이후에, 밤새 동안 실온으로 돌아오게 하였다. 반응의 완료 후에, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 EtOAc:Hex:MeOH = 1:2:0.2를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 생성물은 옅은 황색 액체이다. 정제 후, 수율: 51.0%.
단계 4. 계량된 단계 2 생성물(3.5 g, 1.0 eq)을 120 mL DCM에 용해하고, 이후에 히드라진 수화물(6.5 mL, 10.0 eq)을 서서히 첨가하였다. 반응을 실온에서 약 24시간 동안 수행하였다. 용액 칼라는 얕은 황색에서 오렌지색으로 변하였다. 반응의 완료 후에, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 DCM:MeOH = 9.5:0.5를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 이러한 단계에서, 생성물은 컬럼에 붙어 있고, MeOH는 최종 생성물을 용리시키기 위해 5%까지 증가될 수 있다. 생성물은 옅은 황색의 점착성의 고형물이다. 정제 후, 수율: 19.5%.
실시예 14: 링커 IV-아미드의 제조
Figure 112018016857695-pct00079
단계 1. 에탄올아민(1.92 g, 1.05 eq) 및 리포산(6.19 g,1.0 eq)을 80 mL DCM에 용해하고, EDC·HCl(7.47 g, 1.3 eq), 히드록시숙신이미드(NHS)(3.45 g, 1.0 eq) 및 트리에틸아민(9.6 mL, 2.3 eq)을 서서히 첨가하였다. 반응을 실온에서 적어도 5시간 동안 수행하고, 반응 이후에 TLC를 수행하였다. 후속하여, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 DCM:MeOH = 9.8:0.2를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 생성물은 옅은 황색 액체이다. 수율: 66.0%.
단계 2. 단계 1 생성물(4.98 g, 1.0 eq) 및 숙신산(2.48 g, 1.05 eq)을 80 mL DCM에 용해하고, N,N'-디시클로헥실카르보디이미드(DCC)(5.36 g, 1.3 eq), 4-(디메틸아미노)피리딘(DMAP)(0.24 g, 0.1 eq) 및 트리에틸아민(6.4 mL, 2.3 eq)을 서서히 첨가하였다. 반응을 실온에서 적어도 5시간 동안 수행하고, 반응 이후에 TLC를 수행하였다. 후속하여, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 DCM:MeOH = 9.5:0.5를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 생성물은 옅은 황색 액체이다. 수율: 80.7%.
단계 3. 단계 2 생성물(3.49 g, 1.0 eq) 및 2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에탄올(1.57 g, 1.05 eq)을 80 mL DCM에 용해하고, EDC·HCl(2.49 g, 1.3 eq), 히드록시숙신이미드(NHS)(1.15 g, 1.0 eq) 및 트리에틸아민(3.2 mL, 2.3 eq)을 서서히 첨가하였다. 반응을 실온에서 적어도 5시간 동안 수행하고, 반응 이후에 TLC를 수행하였다. 후속하여, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 DCM:MeOH = 9.8:0.2를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 생성물은 옅은 황색 액체이다. 수율: 81.2%.
단계 4. 4-니트로페닐 클로로포르메이트(3.35 g, 1.15 eq)를 2-구 병에 배치시켰다. 1시간 동안 진공 하에서, 3-방향 밸브를 질소 디바이스로 전환시키고, 60 mL DCM을 시린지로 첨가하였다. 계량된 단계 3 생성물을 10 내지 15 mL DCM으로 용해하고, 시린지로 반응 플라스크에 주입하고, 이후에, 트리에틸아민(4.5 mL, 2.3 eq)으로 서서히 첨가하였다. 반응을 얼음 배쓰에서 약 1시간 동안 수행하고, 이후에, 밤새 동안 실온으로 돌아오게 하였다. 반응의 완료 후에, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 EtOAc:Hex:MeOH = 1:2:0.2를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 생성물은 옅은 황색 액체이다. 정제 후, 수율: 48.6%.
단계 5. 계량된 단계 4 생성물(3.5 g, 1.0 eq)을 120 mL DCM에 용해하고, 이후에 히드라진 수화물(6.5 mL, 10.0 eq)을 서서히 첨가하였다. 반응을 실온에서 약 24시간 동안 수행하였다. 용액 칼라는 얕은 황색에서 오렌지색으로 변하였다. 반응의 완료 후에, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 DCM:MeOH = 9.5:0.5를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 이러한 단계에서, 생성물은 컬럼에 붙어 있고, MeOH는 최종 생성물을 용리시키기 위해 5%까지 증가될 수 있다. 생성물(링커 IV-2)을 옅은 황색의 점성 고형물이다. 정제 후, 수율: 30.0%.
1 H(300 MHz) δ 1.30-1.34(2H, m), 1.47-1.56(3H, m), 1.60-1.67(1H, m), 1.82-1.87(1H, m), 2.23(2H, t), 2.54-2.56(4H, m), 2.63-2.2.66(4H, m), 3.07-3.25(2H, m), 3.33-3.39(3H, m), 3.40-3.43(2H, m), 3.46-3.50(5H, m), 3.54-3.58(5H, m), 4.03-4.05(2H, m), 4.07-4.10(2H, m), 4.13-4.15(2H, m)
13 C(100 MHz) δ 24.5, 24.6, 27.5, 33.7, 34.7, 38.1, 41.0, 55.7, 55.8, 59.6, 59.7, 59.8, 65.7, 65.8, 65.9, 71.5, 71.7, 171.7, 171.9, 172.0, 177.1, 177.2, 177.3
실시예 15: 링커 IV-C(O)O-의 제조
단계 1. 에틸렌 글리콜(1.96 g, 1.05 eq) 및 리포산(6.19 g,1.0 eq)을 80 mL DCM에 용해하고, N,N'-디시클로헥실카르보디이미드(DCC)(8.04 g, 1.3 eq), 4-(디메틸아미노)피리딘(DMAP)(0.37 g, 0.1 eq) 및 트리에틸아민(9.6 mL, 2.3 eq)을 서서히 첨가하였다. 반응을 실온에서 적어도 5시간 동안 수행하고, 반응 이후에 TLC를 수행하였다. 후속하여, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 DCM:MeOH = 9.8:0.2를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 생성물은 옅은 황색 액체이다. 수율: 66.0%.
단계 2. 단계 1 생성물(4.98 g, 1.0 eq) 및 숙신산(2.48 g, 1.05 eq)을 80 mL DCM에 용해하고, N,N'-디시클로헥실카르보디이미드(DCC)(5.36 g, 1.3 eq), 4-(디메틸아미노)피리딘(DMAP)(0.24 g, 0.1 eq) 및 트리에틸아민(6.4 mL, 2.3 eq)을 서서히 첨가하였다. 반응을 실온에서 적어도 5시간 동안 수행하고, 반응 이후에 TLC를 수행하였다. 후속하여, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 DCM:MeOH = 9.5:0.5를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 생성물은 옅은 황색 액체이다. 수율: 81.2%.
단계 3. 단계 2 생성물(3.49 g, 1.0 eq) 및 2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에탄올(1.57 g, 1.05 eq)을 80 mL DCM에 용해하고, EDC·HCl(2.49 g, 1.3 eq), 히드록시숙신이미드(NHS)(1.15 g, 1.0 eq) 및 트리에틸아민(3.2 mL, 2.3 eq)을 서서히 첨가하였다. 반응을 실온에서 적어도 5시간 동안 수행하고, 반응 이후에 TLC를 수행하였다. 후속하여, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 DCM:MeOH = 9.8:0.2를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 생성물은 옅은 황색 액체이다. 수율: 80.5%.
단계 4. 4-니트로페닐 클로로포르메이트(3.35 g, 1.15 eq)를 2-구 병에 배치시켰다. 1시간 동안 진공 하에서, 3-방향 밸브를 질소 디바이스로 전환시키고, 60 mL DCM을 시린지로 첨가하였다. 계량된 단계 3 생성물을 10 내지 15 mL DCM으로 용해하고, 시린지로 반응 플라스크에 주입하고, 이후에, 트리에틸아민(4.5 mL, 2.3 eq)으로 서서히 첨가하였다. 반응을 얼음 배쓰에서 약 1시간 동안 수행하고, 이후에, 밤새 동안 실온으로 돌아오게 하였다. 반응의 완료 후에, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 EtOAc:Hex:MeOH = 1:2:0.2를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 생성물은 옅은 황색 액체이다. 정제 후, 수율: 50.3%.
단계 5. 계량된 단계 4 생성물(3.5 g, 1.0 eq)을 120 mL DCM에 용해하고, 이후에 히드라진 수화물(6.5 mL, 10.0 eq)을 서서히 첨가하였다. 반응을 실온에서 약 24시간 동안 수행하였다. 용액 칼라는 얕은 황색에서 오렌지색으로 변하였다. 반응의 완료 후에, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 DCM:MeOH = 9.5:0.5를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 이러한 단계에서, 생성물은 컬럼에 붙어 있고, MeOH는 최종 생성물을 용리시키기 위해 5%까지 증가될 수 있다. 생성물은 옅은 황색의 점착성의 고형물이다. 정제 후, 수율: 31.0%.
실시예 16: SH-C 5 -링커-IV-아미드의 제조
단계 1. 에탄올아민(1.92 g, 1.05 eq) 및 6-아세틸티오헥산산(5.71 g, 1.0 eq)을 80 mL DCM에 용해하고, EDC·HCl(7.47 g, 1.3 eq), 히드록시숙신이미드(NHS)(3.45 g, 1.0 eq) 및 트리에틸아민(9.6 mL, 2.3 eq)을 서서히 첨가하였다. 반응을 실온에서 적어도 5시간 동안 수행하고, 반응 이후에 TLC를 수행하였다. 후속하여, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 DCM:MeOH = 9.8:0.2를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 생성물은 옅은 황색 액체이다. 수율: 74.0%.
단계 2. 단계 1 생성물(4.98 g, 1.0 eq) 및 숙신산(2.48 g, 1.05 eq)을 80 mL DCM에 용해하고, N,N'-디시클로헥실카르보디이미드(DCC)(5.36 g, 1.3 eq), 4-(디메틸아미노)피리딘(DMAP)(0.24 g, 0.1 eq) 및 트리에틸아민(6.4 mL, 2.3 eq)을 서서히 첨가하였다. 반응을 실온에서 적어도 5시간 동안 수행하고, 반응 이후에 TLC를 수행하였다. 후속하여, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 DCM:MeOH = 9.5:0.5를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 생성물은 옅은 황색 액체이다. 수율: 80.2%.
단계 3. 단계 2 생성물(3.49 g, 1.0 eq) 및 2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에탄올(1.57 g, 1.05 eq)을 80 mL DCM에 용해하고, EDC·HCl(2.49 g, 1.3 eq), 히드록시숙신이미드(NHS)(1.15 g, 1.0 eq) 및 트리에틸아민(3.2 mL, 2.3 eq)을 서서히 첨가하였다. 반응을 실온에서 적어도 5시간 동안 수행하고, 반응 이후에 TLC를 수행하였다. 후속하여, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 DCM:MeOH = 9.8:0.2를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 생성물은 옅은 황색 액체이다. 수율: 80.0%.
단계 4. 4-니트로페닐 클로로포르메이트(3.35 g, 1.15 eq)를 2-구 병에 배치시켰다. 1시간 동안 진공 하에서, 3-방향 밸브를 질소 디바이스로 전환시키고, 60 mL DCM을 시린지로 첨가하였다. 계량된 단계 3 생성물을 10 내지 15 mL DCM으로 용해하고, 시린지로 반응 플라스크에 주입하고, 이후에, 트리에틸아민(4.5 mL, 2.3 eq)으로 서서히 첨가하였다. 반응을 얼음 배쓰에서 약 1시간 동안 수행하고, 이후에, 밤새 동안 실온으로 돌아오게 하였다. 반응의 완료 후에, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 EtOAc:Hex:MeOH = 1:2:0.2를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 생성물은 옅은 황색 액체이다. 정제 후, 수율: 51.1%.
단계 5. 계량된 단계 4 생성물(3.5 g, 1.0 eq)을 120 mL DCM에 용해하고, 이후에 히드라진 수화물(6.5 mL, 10.0 eq)을 서서히 첨가하였다. 반응을 실온에서 약 24시간 동안 수행하였다. 용액 칼라는 얕은 황색에서 오렌지색으로 변하였다. 반응의 완료 후에, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 DCM:MeOH = 9.5:0.5를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 이러한 단계에서, 생성물은 컬럼에 붙어 있고, MeOH는 최종 생성물을 용리시키기 위해 5%까지 증가될 수 있다. 생성물은 옅은 황색의 점착성의 고형물이다. 정제 후, 수율: 28.0%.
실시예 17: SH-C 5 -링커-IV-C(O)O-의 제조
단계 1. 에틸렌 글리콜(1.96 g, 1.05 eq) 및 6-아세틸티오헥산산(5.71 g, 1.0 eq)을 80 mL DCM에 용해하고, N,N'-디시클로헥실카르보디이미드(DCC)(8.04 g, 1.3 eq), 4-(디메틸아미노)피리딘(DMAP)(0.37 g, 0.1 eq) 및 트리에틸아민(9.6 mL, 2.3 eq)을 서서히 첨가하였다. 반응을 실온에서 적어도 5시간 동안 수행하고, 반응 이후에 TLC를 수행하였다. 후속하여, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 DCM:MeOH = 9.8:0.2를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 생성물은 옅은 황색 액체이다. 수율: 71.5%.
단계 2. 단계 1 생성물(4.98 g, 1.0 eq) 및 숙신산(2.48 g, 1.05 eq)을 80 mL DCM에 용해하고, N,N'-디시클로헥실카르보디이미드(DCC)(5.36 g, 1.3 eq), 4-(디메틸아미노)피리딘(DMAP)(0.24 g, 0.1 eq) 및 트리에틸아민(6.4 mL, 2.3 eq)을 서서히 첨가하였다. 반응을 실온에서 적어도 5시간 동안 수행하고, 반응 이후에 TLC를 수행하였다. 후속하여, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 DCM:MeOH = 9.5:0.5를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 생성물은 옅은 황색 액체이다. 수율: 81.4%.
단계 3. 단계 2 생성물(3.49 g, 1.0 eq) 및 2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에탄올(1.57 g, 1.05 eq)을 80 mL DCM에 용해하고, EDC·HCl(2.49 g, 1.3 eq), 히드록시숙신이미드(NHS)(1.15 g, 1.0 eq) 및 트리에틸아민(3.2 mL, 2.3 eq)을 서서히 첨가하였다. 반응을 실온에서 적어도 5시간 동안 수행하고, 반응 이후에 TLC를 수행하였다. 후속하여, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 DCM:MOH = 9.8:0.2를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 생성물은 옅은 황색 액체이다. 수율: 78.8%.
단계 4. 4-니트로페닐 클로로포르메이트(3.35 g, 1.15 eq)를 2-구 병에 배치시켰다. 1시간 동안 진공 하에서, 3-방향 밸브를 질소 디바이스로 전환시키고, 60 mL DCM을 시린지로 첨가하였다. 계량된 단계 3 생성물을 10 내지 15 mL DCM으로 용해하고, 시린지로 반응 플라스크에 주입하고, 이후에, 트리에틸아민(4.5 mL, 2.3 eq)으로 서서히 첨가하였다. 반응을 얼음 배쓰에서 약 1시간 동안 수행하고, 이후에, 밤새 동안 실온으로 돌아오게 하였다. 반응의 완료 후에, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 EtOAc:Hex:MeOH = 1:2:0.2를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 생성물은 옅은 황색 액체이다. 정제 후, 수율: 51.1%.
단계 5. 계량된 단계 4 생성물(3.5 g, 1.0 eq)를 120 mL DCM에 용해하고, 이후에 히드라진 수화물(6.5 mL, 10.0 eq)을 서서히 첨가하였다. 반응을 실온에서 약 24시간 동안 수행하였다. 용액 칼라는 얕은 황색에서 오렌지색으로 변하였다. 반응의 완료 후에, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 DCM:MeOH = 9.5:0.5를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 이러한 단계에서, 생성물은 컬럼에 붙어 있고, MeOH는 최종 생성물을 용리시키기 위해 5%까지 증가될 수 있다. 생성물은 옅은 황색의 점착성의 고형물이다. 정제 후, 수율: 27.8%.
실시예 18: NH 2 -C 1 -링커-IV-아미드의 제조
단계 1. 에탄올아민(1.92 g, 1.05 eq) 및 Boc-글리신(5.26 g, 1.0 eq)을 80 mL DCM에 용해하고, EDC·HCl(7.47 g, 1.3 eq), 히드록시숙신이미드(NHS)(3.45 g, 1.0 eq) 및 트리에틸아민(9.6 mL, 2.3 eq)을 서서히 첨가하였다. 반응을 실온에서 적어도 5시간 동안 수행하고, 반응 이후에 TLC를 수행하였다. 후속하여, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 DCM:MeOH = 9.8:0.2를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 생성물은 옅은 황색 액체이다. 수율: 62.0%.
단계 2. 단계 1 생성물(4.98 g, 1.0 eq) 및 숙신산(2.48 g, 1.05 eq)을 80 mL DCM에 용해하고, N,N'-디시클로헥실카르보디이미드(DCC)(5.36 g, 1.3 eq), 4-(디메틸아미노)피리딘(DMAP)(0.24 g, 0.1 eq) 및 트리에틸아민(6.4 mL, 2.3 eq)을 서서히 첨가하였다. 반응을 실온에서 적어도 5시간 동안 수행하고, 반응 이후에 TLC를 수행하였다. 후속하여, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 DCM:MeOH = 9.5:0.5를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 생성물은 옅은 황색 액체이다. 수율: 80.4%.
단계 3. 단계 2 생성물(3.49 g, 1.0 eq) 및 2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에탄올(1.57 g, 1.05 eq)을 80 mL DCM에 용해하고, EDC·HCl(2.49 g, 1.3 eq), 히드록시숙신이미드(NHS)(1.15 g, 1.0 eq) 및 트리에틸아민(3.2 mL, 2.3 eq)을 서서히 첨가하였다. 반응을 실온에서 적어도 5시간 동안 수행하고, 반응 이후에 TLC를 수행하였다. 후속하여, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 DCM:MeOH = 9.8:0.2를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 생성물은 옅은 황색 액체이다. 수율: 71.0%.
단계 4. 4-니트로페닐 클로로포르메이트(3.35 g, 1.15 eq)를 2-구 병에 배치시켰다. 1시간 동안 진공 하에서, 3-방향 밸브를 질소 디바이스로 전환시키고, 60 mL DCM을 시린지로 첨가하였다. 계량된 단계 3 생성물을 10 내지 15 mL DCM으로 용해하고, 시린지로 반응 플라스크에 주입하고, 이후에, 트리에틸아민(4.5 mL, 2.3 eq)으로 서서히 첨가하였다. 반응을 얼음 배쓰에서 약 1시간 동안 수행하고, 이후에, 밤새 동안 실온으로 돌아오게 하였다. 반응의 완료 후에, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 EtOAc:Hex:MeOH = 1:2:0.2를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 생성물은 옅은 황색 액체이다. 정제 후, 수율: 51.9%.
단계 5. 계량된 단계 4 생성물(3.5 g, 1.0 eq)을 120 mL DCM에 용해하고, 이후에 히드라진 수화물(6.5 mL, 10.0 eq)을 서서히 첨가하였다. 반응을 실온에서 약 24시간 동안 수행하였다. 용액 칼라는 얕은 황색에서 오렌지색으로 변하였다. 반응의 완료 후에, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 DCM:MeOH = 9.5:0.5를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 이러한 단계에서, 생성물은 컬럼에 붙어 있고, MeOH는 최종 생성물을 용리시키기 위해 5%까지 증가될 수 있다. 생성물은 옅은 황색의 점착성의 고형물이다. 정제 후, 수율: 29.0%.
실시예 19: NH 2 -C 1 -링커-IV-C(O)O-의 제조
단계 1. 에틸렌 글리콜(1.96 g, 1.05 eq) 및 Boc-글리신(5.26 g, 1.0 eq)을 80 mL DCM에 용해하고, N,N'-디시클로헥실카르보디이미드(DCC)(8.04 g, 1.3 eq), 4-(디메틸아미노)피리딘(DMAP)(0.37 g, 0.1 eq) 및 트리에틸아민(9.6 mL, 2.3 eq)을 서서히 첨가하였다. 반응을 실온에서 적어도 5시간 동안 수행하고, 반응 이후에 TLC를 수행하였다. 후속하여, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 DCM:MeOH = 9.8:0.2를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 생성물은 옅은 황색 액체이다. 수율: 75.0%.
단계 2. 단계 1 생성물(4.98 g, 1.0 eq) 및 숙신산(2.48 g, 1.05 eq)을 80 mL DCM에 용해하고, N,N'-디시클로헥실카르보디이미드(DCC)(5.36 g, 1.3 eq), 4-(디메틸아미노)피리딘(DMAP)(0.24 g, 0.1 eq) 및 트리에틸아민(6.4 mL, 2.3 eq)을 서서히 첨가하였다. 반응을 실온에서 적어도 5시간 동안 수행하고, 반응 이후에 TLC를 수행하였다. 후속하여, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 DCM:MeOH = 9.5:0.5를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 생성물은 옅은 황색 액체이다. 수율: 80.5%.
단계 3. 단계 2 생성물(3.49 g, 1.0 eq) 및 2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에탄올(1.57 g, 1.05 eq)을 80 mL DCM에 용해하고, EDC·HCl(2.49 g, 1.3 eq), 히드록시숙신이미드(NHS)(1.15 g, 1.0 eq) 및 트리에틸아민(3.2 mL, 2.3 eq)을 서서히 첨가하였다. 반응을 실온에서 적어도 5시간 동안 수행하고, 반응 이후에 TLC를 수행하였다. 후속하여, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 DCM:MeOH = 9.8:0.2를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 생성물은 옅은 황색 액체이다. 수율: 81.0%.
단계 4. 4-니트로페닐 클로로포르메이트(3.35 g, 1.15 eq)를 2-구 병에 배치시켰다. 1시간 동안 진공 하에서, 3-방향 밸브를 질소 디바이스로 전환시키고, 60 mL DCM을 시린지로 첨가하였다. 계량된 단계 3 생성물을 10 내지 15 mL DCM으로 용해하고, 시린지로 반응 플라스크에 주입하고, 이후에, 트리에틸아민(4.5 mL, 2.3 eq)으로 서서히 첨가하였다. 반응을 얼음 배쓰에서 약 1시간 동안 수행하고, 이후에, 밤새 동안 실온으로 돌아오게 하였다. 반응의 완료 후에, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 EtOAc:Hex:MeOH = 1:2:0.2를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 생성물은 옅은 황색 액체이다. 정제 후, 수율: 50.6%.
단계 5. 계량된 단계 4 생성물(3.5 g, 1.0 eq)을 120 mL DCM에 용해하고, 이후에 히드라진 수화물(6.5 mL, 10.0 eq)을 서서히 첨가하였다. 반응을 실온에서 약 24시간 동안 수행하였다. 용액 칼라는 얕은 황색에서 오렌지색으로 변하였다. 반응의 완료 후에, ddH2O를 첨가함으로써 혼합물을 켄칭시키고, DCM으로 2 내지 3회 추출하였다. 유기층을 수거하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조시키고, MgSO4로 여과하고, 이후에, DCM을 제거하였다. 추출물을 DCM:MeOH = 9.5:0.5를 사용하여 컬럼으로 정제하였다. 이러한 단계에서, 생성물은 컬럼에 붙어 있고, MeOH는 최종 생성물을 용리시키기 위해 5%까지 증가될 수 있다. 생성물은 옅은 황색의 점착성의 고형물이다. 정제 후, 수율: 31.2%.
실시예 20: 본 발명의 링커의 세포독성 검정
본 출원인은 9개의 링커의 세포독성을 시험하였으며, 각 링커에 대한 IC50 값을 계산하였다. 인간 유방 선암 MCF7, MDA-MB-453 및 MDA-MB-231 및 인간 포유류 상피 세포 H184B5F5/M10을 세포독성 시험을 위해 선택하였다. 세포를 6-웰 플레이트에 시딩하고, 링커 I-1(링커 I-아미드, m=2), 링커 I-2(링커 I-아미드, m=1), 링커 I-3(링커 I-아미드, m=3), 링커 I-4(링커 I-아미드, m=4), 링커 I-5(링커 I-아미드, m=5), 링커 II-1(링커 II-아미드, z=1), 링커 II-2(링커 II-아미드, z=2), 링커 II-3(링커 II-아미드, z=3), 및 링커 II-4(링커 II-아미드, z=4)로 처리하고, 37℃에서 72시간 동안 추가로 인큐베이션하였다. 사진을 찍은 후에, 혈구 계산기를 사용하여 세포를 계수하였다. 50%까지 성장을 억제하는 링커 농도(IC50)를 확인하기 위하여 성장 억제를 미처리된 대조군과 비교하였다. IC50의 요약은 표 1에 나타내었다. IC50 값을 링커 I-1 내지 링커 I-5 및 링커 II-1에서 300 내지 700 μM 이었다. 링커 II-2 내지 II-4의 IC50 값은 800 μM 초과이었다. 이러한 데이타는, 세포 독성이 컨주게이트 약물을 위한 링커 및 약물 전달을 위한 금 나노입자의 경우에 낮음을 시사하고 있다.
표 1. 72시간 동안 인간 유방 선암 MCF7, MDA-MB-453 및 MDA-MB-231 및 인간 포유동물 상피 세포 H184B5F5/M10에서 링커 세포독성의 IC50 값의 요약
Figure 112018016857695-pct00080
실시예 21: 금 나노입자, 링커 및 항암 약물 및/또는 항체의 착물의 제조
1. Au/LKI-1/mAb-p24 착물
Au/LKI-1/mAb-p24 착물의 제조
금 나노입자 상에 항체를 컨주게이션하기 위하여, 항-HIV-1 p24(HIV-1 p24)(GeneTex, GTX41595) 항체를 10 kDa MWCO 원심여과기(Millipore, UFC501024)를 이용하여 농축하고, 1 mg/mL로 100 mM Na2HPO4, pH 7.4 완충제에 용해하였다. 이후에, 수 중 5 ㎕의 100 mM NaIO4를 50 ㎕의 항체 용액에 첨가하고, 혼합물을 어두운 곳에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 250 ㎕의 1× PBS를 첨가하여 반응을 켄칭하였다. 이 때에, 항체의 Fc 부분 상의 탄수화물 모이어티는 알데히드 기로 산화되었다. 이후에, 링커 I-1(링커 I-아미드, m=2)을 항체 용액에 첨가하였다. 링커는 분자의 마주하는 사이트 상에 히드라지드 및 디티올 기를 갖는다. 히드라지드 모이어티는 개질된 항체 분자의 Fc 부분의 알데히드 기와 상호작용한다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하고, 이후에 티올화된 항체를 원심여과기를 이용하여 수거하고, 0.1 M 소듐 포스페이트 완충제, pH 7.4에서 재현탁하였다. 100 마이크로리터의 0.1 mg/ml의 농도의 티올화된 항체를 0.5 mL의 금 나노입자와 혼합하고, 현탁액을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 추가 사용을 위하여 항체-금 나노입자 착물을 4℃에서 저장하였다.
Au/LKI-1/mAb-p24 착물의 특징분석
Au/LKI-1/mAb-p24 착물의 제형을 UV/Vis 분광계(Beckman, DU 800)로 분석하였다. 기록된 표면 플라즈몬 공명 스펙트럼은 항체-컨쥬게이션된 금 나노입자의 플라즈몬 피크(λmax)의 2 nm 적색 이동을 나타내었다(도 1a). Alex Fluor 568 2차 항체 표지된 Au/LKI-1/mAb-p24 착물의 적색 형광 이미지를 도립 현미경(Nikon, TE2000-U)을 이용하여 측정하였다. 각 금 나노입자는 적색 형광을 나타내었는데, 이는 각 금 나노입자가 표면 상에서 항-HIV-1 P24 항체와 컨쥬게이션되었음을 시사하는 것이다(도 1b). 또한, 본 출원인은 금 나노입자 상의 항-HIV-1 P24 항체의 결합 친화력을 조사하였다. 본 출원인은 항-HIV-1 P24 단백질에 대한 Au/LKI-1/mAb-p24 착물의 결합 친화력을 확인할 수 있다(도 1c).
2. Au/LKI-1 또는 LKI-5/Ab-EGFR 착물
Au/LKI-1 또는 LKI-5/ Ab-EGFR 착물의 제조
금 나노입자 상에 항체를 컨쥬게이션하기 위하여, 항-인간 EGFR 클론 H11(Thermo, MA1-12693)을 10 kDa MWCO 원심여과기(Millipore, UFC501024)를 이용하여 농축하고, 1 mg/mL로 100 mM Na2HPO4, pH 7.4 완충제에 용해하였다. 이후에, 수 중 5 ㎕의 100 mM NaIO4를 50 ㎕의 항체 용액에 첨가하고, 혼합물을 어두운 곳에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 250 ㎕의 1× PBS를 첨가하여 반응을 켄칭하였다. 이 때에, 항체의 Fc 부분 상의 탄수화물 모이어티는 알데히드 기로 산화되었다. 이후에, 링커 I-1(링커 I-아미드, m=2) 또는 링커 I-5(링커 I-아미드, m=5)를 항체 용액에 첨가하였다. 링커는 분자의 마주하는 사이트 상에 히드라지드 및 디티올 기를 갖는다. 히드라지드 모이어티는 개질된 항체 분자의 Fc 부분의 알데히드 기와 상호작용한다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하고, 이후에 티올화된 항체를 원심여과기를 이용하여 수거하고, 0.1 M 소듐 포스페이트 완충제, pH 7.4에서 재현탁하였다. 100 마이크로리터의 0.1 mg/ml의 농도의 티올화된 항체를 0.5 mL의 금 나노입자와 혼합하고, 현탁액을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 추가 사용을 위하여 항체-금 나노입자 착물을 4℃에서 저장하였다.
Au/LKI-1 또는 LKI-5/Ab-EGFR 착물의 특징분석
Au/LKI-1/Ab-EGFR 착물 또는 Au/LKI-5/Ab-EGFR 착물의 제형을 UV/Vis 분광계(Beckman, DU 800)로 분석하였다. 기록된 표면 플라즈몬 공명 스펙트럼은 항체-컨쥬게이션된 금 나노입자의 플라즈몬 피크(λmax)의 2 nm 적색 이동을 나타내었다(도 2). 본 출원인은 EGFR 항체 및 금 나노입자 컨쥬게이션을 위해, 두 개의 링커, 즉 링커 I-1(링커 I-아미드(m=2)) 및 링커 I-5(링커 I-아미드(m=5))를 시험하였다. Au/LKI-1/Ab-EGFR 착물 및 Au/LKI-5/Ab-EGFR 착물의 유세포 계측 분석은 인간 유방 선암 MCF-7 세포에 대한 친화력을 타겟화한다는 것을 입증하였다. Au/LKI-1/Ab-EGFR 착물 및 Au/LKI-5/Ab-EGFR 착물 둘 모두는 EGFR 항체와 비교하는 유사한 타겟화 능력을 나타내었다(표 2). 이러한 데이타는, 링커가 항체 및 금 나노입자 컨쥬게이션에 대해 적합하고, 항체에 대한 결합 친화력을 유지한다는 것을 시사하였다.
표 2. MCF-7 유방 종양 세포에서의 표면의 EFGR에 대한 Ab-EGFR, Au/LKI-1/Ab-EGFR 착물 및 Au/LKI-5/Ab-EGFR 착물의 타겟화 효과의 유세포 계측 분석
Figure 112018016857695-pct00081
3. Au/ LKI -1/ 트라스투즈맙 ( Tras ) 착물
Au/ LKI -1/ Tras 착물의 제조
금 나노입자 상에 항체를 컨쥬게이션하기 위하여, Tras(JHL biotech, JHL1188) 항체 10 kDa MWCO 원심여과기(Millipore, UFC501024)를 이용하여 농축하고, 1 mg/mL로 100 mM Na2HPO4, pH 7.4 완충제에 용해하였다. 이후에, 수 중 5 ㎕의 100 mM NaIO4를 50 ㎕의 항체 용액에 첨가하고, 혼합물을 어두운 곳에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 250 ㎕의 1× PBS를 첨가하여 반응을 켄칭하였다. 이 때에, 항체의 Fc 부분 상의 탄수화물 모이어티는 알데히드 기로 산화되었다. 이후에, 링커 I-1(링커 I-아미드(m=2))을 항체 용액에 첨가하였다. 링커는 분자의 마주하는 사이트 상에 히드라지드 및 디티올 기를 갖는다. 히드라지드 모이어티는 개질된 항체 분자의 Fc 부분의 알데히드 기와 상호작용한다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하고, 이후에 티올화된 항체를 원심여과기를 이용하여 수거하고, 0.1 M 소듐 포스페이트 완충제, pH 7.4에서 재현탁하였다. 100 마이크로리터의 0.1 mg/ml의 농도의 티올화된 항체를 0.5 mL의 금 나노입자와 혼합하고, 현탁액을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 추가 사용을 위하여 Au/LKI-1/Tras 착물을 4℃에서 저장하였다.
Au/ LKI -1/ Tras 착물의 특징분석
Au/LKI-1/Tras 착물의 제형을 UV/Vis 분광계(Beckman, DU 800)로 분석하였다. 기록된 표면 플라즈몬 공명 스펙트럼은 항체-컨쥬게이션된 금 나노입자의 플라즈몬 피크(λmax)에서 8 nm 적색 이동을 나타내었다(도 3). 본 출원인은 Au/LKI-1/Tras 착물을 시험하였다. Au/LKI-1/Tras 착물의 유세포 계측 분석은 인간 유방 선암 세포에 대한 타겟화 친화력을 나타내었다. Au/LKI-1/Tras 착물은 트라스투즈맙과 비교하여 유사한 타겟화 능력을 나타내었다(표 3).
표 3. MDA-MB-453 유방 종양 세포에서 표면의 Her2/neu에 대한 Tras 및 Au/LKI-1/Tras 착물의 타겟화 효과의 유세포 계측 분석
Figure 112018016857695-pct00082
4. Au/ LKI -1/ 에타너셉트 (ETA) 착물
Au/ LKI -1/ETA 착물의 제조
금 나노입자 상에 항체를 컨쥬게이션하기 위하여, 에타너셉트(ETA)(Mycenax biotech, TuNEX)mf 10 kDa MWCO 원심여과기(Millipore, UFC501024)를 이용하여 농축하고, 1 mg/mL로 100 mM Na2HPO4, pH 7.4 완충제에 용해하였다. 이후에, 수 중 5 ㎕의 100 mM NaIO4를 50 ㎕의 항체 용액에 첨가하고, 혼합물을 어두운 곳에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 250 ㎕의 1× PBS를 첨가하여 반응을 켄칭하였다. 이 때에, 항체의 Fc 부분 상의 탄수화물 모이어티는 알데히드 기로 산화되었다. 이후에, 링커 I-1을 항체 용액에 첨가하였다. 링커는 분자의 마주하는 사이트 상에 히드라지드 및 디티올 기를 갖는다. 히드라지드 모이어티는 개질된 항체 분자의 Fc 부분의 알데히드 기와 상호작용한다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하고, 이후에 티올화된 항체를 원심여과기를 이용하여 수거하고, 0.1 M 소듐 포스페이트 완충제, pH 7.4에서 재현탁하였다. 100 마이크로리터의 0.1 mg/ml의 농도의 티올화된 항체를 0.5 mL의 금 나노입자와 혼합하고, 현탁액을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 추가 사용을 위하여 Au/LKI-1/ETA 착물을 4℃에서 저장하였다.
Au/ LKI -1/ETA 착물의 특징분석
Au/LKI-1/ETA 착물의 제형을 UV/Vis 분광계(Beckman, DU 800)로 분석하였다. 기록된 표면 플라즈몬 공명 스펙트럼은 Au/LKI-1/ETA의 플라즈몬 피크(λmax)에서 2 nm 적색 이동을 나타내었다(도 4a). Alex Fluor 568 2차 항체 표지된 Au/LKI-1/ETA 착물의 적색 형광 이미지를 도립 현미경(Nikon, TE2000-U)을 이용하여 측정하였다. 각 금 나노입자는 적색 형광을 나타내었는데, 이는 각 금 나노입자가 표면 상에서 ETA 항체와 컨쥬게이션되었음을 시사한다(도 4b). 본 출원인은 1 내지 5 nm AuNP로 컨쥬게이션된 2차 항체와 결합시킴으로써 Au/LKI-1/ETA 착물을 추가로 시험하였다. Au/LKI-1/ETA 착물의 TEM 이미지에서, AuNP 표면 상에 위치된 ETA에 1 내지 5 nm 금-표지된 2차 항-인간 IgG 항체의 결합이 관찰되었다(도 4c). 본 출원인은 ETA 및 Au/LKI-1/ETA의 TNFα 차단 능력을 추가로 조사하였다. MCF-7 세포(5×105)를 2시간 동안 각각 12.5 ng/mL TNFα 및 62.5, 125, 250, 500 ng/mL ETA 또는 Au/LKI-1/ETA 착물의 혼합물로 처리하였다. 처리된 세포를 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션하고, 이후에, 세포 수를 MTS [(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸륨)] 검정에 의해 카운팅하였다. TNFα 차단 능력이 단지 ETA 및 Au/LKI-1/ETA 착물 둘 모두에서 관찰되었다. ETA 및 Au/LKI-1/ETA 착물을 사용하여 TNFα 유도된 MCF-7 세포 아폽토시스를 차단하는 이의 능력을 시험하였다(표 4). Au/LKI-1/ETA 착물은 ETA와 비교하여 유사한 차단 TNFα 능력을 나타내었다.
표 4. TNFα 유도된 MCF-7 세포 아폽토시스를 차단하기 위한 Au/LKI-1/ETA 착물의 능력
Figure 112018016857695-pct00083
5. Au/ LKI -1/ 독소루비신 ( Dox ) 착물
Au/ LKI -1/ Dox 착물의 제조
1 eq. 독소루비신 및 2 eq. 링커 I-1(링커 I-아미드(m=2)를 무수 MeOH에 첨가하고, 실온에서 혼합하였다. TFA(1.3 eq.)를 밤새 반응을 위해 얻어진 혼합물에 첨가하였다. 얻어진 혼합물을 여과하여 투명한 용액을 수득하였다. 투명한 용액을 드롭퍼(dropper)에 의해 50 mL EtOAc와 함께 플라스크에 첨가하고, 20분 동안 교반하고, 여과하여 Dox-링커-1 고형물을 수득하였다. 얻어진 고형물을 EtOAc로 세척하고, 이후에 건조시켰다. 400 ㎕ Dox/LKI-1(2000 ppm) 및 2 ㎕ NaOH를 1 mL AuNPs(50 ppm)에 첨가하고, 이후에, 21시간 동안 혼합하였다. 혼합물을 1400 rpm에서 20분 동안 원심분리하였다. 얻어진 침전물을 DI 수로 세척하고, 얻어진 침전물을 DI 수에 재현탁하였다. PEG(2K, 2000 Da)를 현탁액에 첨가하고, 밤새 혼합하여 Au/LKI-1/Dox 착물을 수득하였다.
Au/ LKI -1/ Dox 착물의 특징분석
Au/LKI-1/DOX 착물을 UV/Vis 분광계(Beckman, DU 800)로 분석하였다. 기록된 표면 플라즈몬 공명 스펙트럼은 Au/LKI-1/Dox 착물의 플라즈몬 피크(λmax)의 3 nm 적색 이동을 나타내었다(도 5).
다른 링커, I-2, I-3, I-4, I-5, II-1, II-2, II-3, II-4, IV-2, SHI-1 및 SHI-4는 상술된 공정에 따라 다양한 착물을 수득하기 위해 DOX 및 금 나노입자를 컨쥬게이션하도록 사용되었다.
실시예 22: Au/ 링커들 ( LKs )/ Dox 착물의 세포독성 검정
본 출원인은 Au/LKs/Dox 착물의 세포독성을 시험하였으며, IC50 값을 계산하였다. 인간 유방 선암 MCF7, MDA-MB-453 및 MDA-MB-231 및 인간 유방 상피 세포 H184B5F5/M10을 세포독성 시험을 위해 선택하였다. 세포를 96-웰 플레이트에 시딩하고, 하기 표에 나타낸 바와 같이 다양한 링커를 사용하여 독소루비신과 컨쥬게이션되고 SH-PEG(Au/LK/Dox, 2 μM 독소루비신 함유)으로 캡핑된 2 μM 독소루비신(Dox), 20 내지 50 nm 금 나노입자로 처리하고, 37℃에서 72시간 동안 추가로 인큐베이션하였다. CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay(MTS) 시약을 Promega(Madison, WI, USA)로부터 구매하고, 검정을 제조업체 설명서에 따라 수행하였다. 흡광도를 마이크로플레이트 판독기(Bio-tek, Powerwave X340, Winooski, VT, USA)를 이용하여 490 nm에서 측정하였다. 성장 억제를 미처리된 대조군과 비교하여 50%까지 성장을 억제하는 Au/LKs/Dox 착물 농도(IC50)를 확인하였다.
표 5. 72시간 동안 인간 유방 선암 MCF7, MDA-MB-453 및 MDA-MB-231 및 인간 유방 상피 세포 H184B5F5/M10에서의 Au/LKs/Dox 착물 세포독성의 IC50 값의 요약
Figure 112018016857695-pct00084
IC50 값은 Dox와 유사하게 암 세포(MCF-7,MDA-MB-231,MDA-MB-453)에 대해 Au/LK/Dox 착물(LKI-1, LKI-2, LKII-1, LKII-3 및 LKIV-2) 중에서 0.46 내지 1.93 μM이었다. 정상 세포, M10에 대하여, 착물의 세포 독성은 Dox 보다 낮다. 데이타는 Au/LKs/Dox 착물이 Dox 보다 더 안전함을 시사한다.
실시예 23: Au/ LKI -1/ Dox 착물의 pH-민감성 LKI -1 방출 시험
1 mL의 Au/LKI-1/Dox 착물 용액을 20분 동안 14000 rpm으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하고, pH 5.5를 갖는 완충제 또는 pH 7.4를 갖는 완충제를 여기에 첨가하였다. 상이한 시점 후에, 착물 용액을 20분 동안 14000 rpm으로 원심분리하고, 이후에, 상청액을 557.6 nm(F-4500 FL 분광광도계)에서 형광 스캔하여 OD 값을 수득하였다. Dox 표준 곡선으로부터 내삽에 의해 착물로부터 방출된 Dox 양이 얻어질 수 있다(X 시간 Dox 방출량).
1 mL의 Au/LKI-1/Dox 착물 용액을 20분 동안 14000 rpm으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하고 pH 1.0을 갖는 완충제를 여기에 첨가하였다. 1시간 후에, 착물용액을 20분 동안 14000 rpm으로 원심분리하고, 이후에, 상청액을 557.6 nm(F-4500 FL 분광광도계)에서 형광 스캔하여 OD 값을 수득하였다. Dox 표준 곡선으로부터 내삽에 의해 Dox 100% 방출이 얻어질 수 있다(pH=1 인큐베이션 1h Dox 방출량). Dox 누적 방출 백분율은 하기 수학식에 따라 계산된다:
● Dox 누적 방출 % = (X 시간 Dox 방출량/ pH=1 인큐베이션 1h Dox 방출량)*100%
표 6. Au/LKI-1/Dox 착물의 pH-민감성 LKI-1 방출 시험
Figure 112018016857695-pct00085
데이타는, LKI-1이 pH 7.4에서 보다 pH 5.5에서 보다 잘 Dox를 방출시킬 수 있다. Au/LKI-1/Dox에서, Dox는 시간-의존적으로 점점 더 많이 방출되었다.
실시예 24: 효능 연구 설계
BALB/c-nu/nu 마우스를 BioLASCO Taiwan으로부터 구매하였다. 8주령 수컷 마우스의 등에 200 ㎕의 50:50 Matrigel/Leibovitz's(L-15) 중 1.0×107 MDA-MB-231 유방 종양 세포와 함께 하기 물질의 피하 주사에 의해 단독으로 주사하였다. (1) 비히클-PBS(음성 대조군), (2) 독소루비신(양성 대조군), 5 mg/kg, (3) Au/PE g, (4) Au/LKI-1/Dox 착물, 5 mg/kg의 Dox. 임상적 증상이 희생을 필요로 할 때까지 치료를 진행하였다. 마우스를 1주일에 최소 2번씩 계량하고, 임상적 증상이 희생을 필요로 할 때까지 종양 크기를 모니터링하였다(도 6a, 및 도 6b 참조). 이종이식 모델에서 Au/LKI-1/Dox 착물로 치료된 MDA-MB-231 유방 종양 세포의 TEM 이미지. 도면에서 화살표는, Au/LKI-1/Dox 착물이 MDA-MB-231 유방 종양 세포 내측에 존재함을 나타내는 것이다(도 6c). 이종이식 모델에서 Au/LKI-1/Dox 착물로 처리된 MDA-MB-231 종양 세포의 H&E 염색(도 6d 참조).

Claims (35)

  1. 하기 화학식 (I)을 갖는 pH-민감성 링커(pH-sensitive linker):
    Figure 112020104119114-pct00123

    상기 식에서,
    X는
    Figure 112020104119114-pct00124
    , -SH 또는 -NH2이며;
    n은 1 내지 6이며;
    P는 -C(O)NH- 또는 -C(O)O-이며;
    Q는 -R(CH2CH2O)m-, -R(-C(O)NH-)z 또는 -R[-C(O)CH2CH2-C(O)NH-(CH2CH2O)m-]Y이며;
    R은 결합, -(CH2)1-12- 또는 -(CH2)1-10-O-이며;
    m은 1 내지 12이며;
    z는 1 내지 4이며;
    Y는 1 내지 12이다.
  2. 제1항에 있어서, 하기 화학식을 갖는 pH-민감성 링커:
    Figure 112020104119114-pct00125
    (링커 I-아미드)
    상기 식에서, m은 1 내지 12이다.
  3. 제1항에 있어서, 하기 화학식을 갖는 pH-민감성 링커:
    Figure 112020104119114-pct00126
    (링커 I-C(O)O; 링커 III)
    상기 식에서, m은 1 내지 12이다.
  4. 제1항에 있어서, 하기 화학식을 갖는 pH-민감성 링커:
    Figure 112020104119114-pct00127
    (SH-C2-링커-I)
    상기 식에서, m은 1 내지 12이다.
  5. 제1항에 있어서, 하기 화학식을 갖는 pH-민감성 링커:
    Figure 112020104119114-pct00128
    (SH-C5-링커-I-아미드)
    상기 식에서, m은 1 내지 12이다.
  6. 제1항에 있어서, 하기 화학식을 갖는 pH-민감성 링커:
    Figure 112020104119114-pct00129

    (SH-C5-링커-I-C(O)O-;HS-C5-링커-III)
    상기 식에서, m은 1 내지 12이다.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서, 하기 화학식을 갖는 pH-민감성 링커:
    Figure 112020104119114-pct00130
    (링커 II-아미드)
    상기 식에서, z는 1 내지 4이다.
  10. 제1항에 있어서, 하기 화학식을 갖는 pH-민감성 링커:
    Figure 112020104119114-pct00131
    (링커 II-C(O)O-)
    상기 식에서, z는 1 내지 4이다.
  11. 제1항에 있어서, 하기 화학식을 갖는 pH-민감성 링커:
    Figure 112020104119114-pct00132
    (SH-C5-링커-II-아미드)
    상기 식에서, z는 1 내지 4이다.
  12. 제1항에 있어서, 하기 화학식을 갖는 pH-민감성 링커:
    Figure 112020104119114-pct00133
    (SH-C5-링커-II-C(O)O-)
    상기 식에서, z는 1 내지 4이다.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 제1항에 있어서, 하기 화학식을 갖는 pH-민감성 링커:
    Figure 112020104119114-pct00134

    (링커 IV-아미드)
    상기 식에서, Y는 1 내지 12이다.
  16. 제1항에 있어서, 하기 화학식을 갖는 pH-민감성 링커:
    Figure 112020104119114-pct00135

    (링커 IV-C(O)O-)
    상기 식에서, Y는 1 내지 12이다.
  17. 제1항에 있어서, 하기 화학식을 갖는 pH-민감성 링커:
    Figure 112020104119114-pct00136

    (SH-C5-링커-IV-아미드)
    상기 식에서, Y는 1 내지 12이다.
  18. 제1항에 있어서, 하기 화학식을 갖는 pH-민감성 링커:
    Figure 112020104119114-pct00137

    (SH-C5-링커-IV-C(O)O-)
    상기 식에서, Y는 1 내지 12이다.
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 하나 이상의 PEG와 착물화되거나 착물화되지 않은, 제1항 내지 제6항, 제9항 내지 제12항, 및 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항의 하나 이상의 링커와 착물화된 금속성 나노입자를 포함하는, 금속성 나노입자 착물로서, 금속성 나노입자가 Au 나노입자인, 금속성 나노입자 착물.
  22. 삭제
  23. 제21항에 있어서, 하나 이상의 링커가 동일하거나 상이한, 금속성 나노입자 착물.
  24. 제21항에 있어서, 금속성 나노입자 착물이 상이한 분자 길이를 갖는 복수의 링커를 포함하는, 금속성 나노입자 착물.
  25. 제21항에 있어서, 본 발명에서 사용되는 PEG의 분자량이 2000 내지 20,000 Da의 범위인, 금속성 나노입자 착물.
  26. 제21항에 있어서, 금속성 나노입자가 80 nm 미만의 크기를 갖는, 금속성 나노입자 착물.
  27. 제21항에 있어서, 금속성 나노입자 착물이 상이한 치료제 또는 진단제 중 하나 이상의 제제를 추가로 연결시키는, 금속성 나노입자 착물.
  28. 제27항에 있어서, 치료제가 항종양 약물 또는 항체이며; 항체가 특정 세포에 대해 표적화된 항체인, 금속성 나노입자 착물.
  29. 제28항에 있어서, 항종양 약물이 항암 약물인, 금속성 나노입자 착물.
  30. 제29항에 있어서, 항암 약물이 알킬화제, 알킬 설포네이트, 아지리딘, 푸린 유사체, 피리미딘 유사체, 캄프토테신 또는 독소루비신, 시스플라틴인, 금속성 나노입자 착물.
  31. 제29항에 있어서, 항암 약물의 양이 금속성 나노입자 착물의 1% 내지 50%(중량/중량)를 차지하는, 금속성 나노입자 착물.
  32. 항-종양 약물 및 항체로부터 선택된 상이한 치료제 또는 진단제 중 하나 이상의 제제와 연결된 청구항 제21항의 하나 이상의 금속성 나노입자 착물, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약제 조성물.
  33. 제27항의 금속성 나노입자 착물을 포함하는, 암을 치료하기 위한 치료제 또는 진단제를 피검체에 전달하기 위한 약제 조성물.
  34. 상이한 치료제 또는 진단제 중 하나 이상의 제제와 연결된 제21항의 하나 이상의 금속성 나노입자 착물을 포함하는, 약물 전달 시스템.
  35. 제28항에 있어서, 항체가 종양 세포에 대해 표적화된 항체이거나 항종양 항체인, 금속성 나노입자 착물.
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