CN107848957A - 递送治疗药物的ph‑敏感性的连接物 - Google Patents

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Abstract

一种具有下式(I)的pH敏感性连接物。其中X为(II)；P为‑C(O)NH‑或‑C(O)O‑；Q为‑R(CH2CH2O)m‑、R(‑C(O)NH‑)z或‑R[‑C(O)CH2CH2‑C(O)NH‑(CH2CH2O)m]Y；R为键、‑C1‑12烷基或C1‑10烷氧基；m为1至12；z为1至4；且Y为1至12。所述连接物可同时结合金属纳米粒子及一或多种具有各种分子尺寸的药物。

Description

递送治疗药物的PH-敏感性的连接物
技术领域
本发明涉及一种可连接药物及纳米粒子的连接物。特别地，本发明连接物为pH-敏感性的，且可同时结合至纳米粒子及相同或不同类型的药物。
背景技术
向细胞(尤其向细胞溶质)特定、有效地递送治疗及诊断化合物为许多医药公司的主要目标。已使用多种不同方法从而提升特定性及吸收量。举例而言，纳米技术已广泛地用于药物递送及癌症疗法的新策略的研发中。已研发出pH-敏感性纳米系统，其中具体通过酸性肿瘤环境来触发药物释放，且此等系统可改良癌症治疗的功效。Feng Wnang等人经由酸不稳定键将多柔比星(doxorubicin)系链至具有聚(乙二醇)位置的AuNP的表面上研发出药物递送系统(American Chemical Society,2011,第5卷,第5期,第3679页-第3692页)。Tian-Meng Sun等人揭示一种癌症干细胞疗法，其使用经由腙键结合至金纳米粒子的多柔比星(Biomaterials 35,2014,第836页-第845页)。US 2013/0331764涉及一种将抗癌药物递送至癌细胞中的方法，其通过使所述抗癌药物结合至pH-敏感性金属纳米粒子，从而使这些pH-敏感性金属纳米粒子与癌细胞分开。WO 2013/139942提供一种包含金属纳米粒子及至少一种连接物的纳米粒子。
然而，仍需要研发具有更佳功效的pH-敏感性递送系统。
发明内容
本发明提供一种具有下式(I)的pH-敏感性连接物，
其中
X为、-SH、-NH2(Boc-NH-；Fmoc-NH-)、-COOH；
n为1至6；
P为-C(O)NH-或-C(O)O-；
Q为-R(CH2CH2O)m-、R(-C(O)NH-)z或-R[-C(O)CH2CH2-C(O)NH-(CH2CH2O)m]Y；
R为键、-C1-12烷基或C1-10烷氧基；
m为1至12；
z为1至4；且
Y为1至12。
在一些实施例中，所述连接物具有下式：
(连接物I-酰胺)；
(连接物I-C(O)O；连接物III)；
(HS-C2-连接物-I)；
(SH-C5-连接物-I-酰胺)；
(SH-C5-连接物-I-C(O)O-；HS-C5-连接物-III；
(ppNH-C1-连接物-I-酰胺)
(ppNH-C1-连接物-I-C(O)O-；NH2-C1-连接物-III-C(O)O-)；
(连接物II-酰胺)；
(连接物II-C(O)O-)；
(SH-C5-连接物-II-酰胺)；
(SH-C5-连接物-II-C(O)O-)；
(ppNH-C1-连接物-II-酰胺)；
(ppNH-C1-连接物-II-C(O)O-)；
(连接物IV-酰胺)；
(连接物IV-C(O)O-)；
(SH-C5-连接物-IV-酰胺)；
(SH-C5-连接物-IV-C(O)O-)；
(ppNH-C1-连接物-IV-酰胺)；或
(ppNH-C1-连接物-IV-C(O)O-)。
本发明亦提供一种金属纳米粒子错合物，其包含与一或多种本发明的连接子错合、视情况与一或多种PEG错合的金属纳米粒子。在一个实施例中，这些金属纳米粒子为Au、Pd、Pt或Ag纳米粒子。在一个实施例中，所述连接物为相同或不同的。更优选地，所述金属纳米粒子错合物包含多数个具有不同分子长度的连接物。
本发明亦提供一种组合物，其包含连接一或多种相同或不同治疗或诊断药物的一或多种金属纳米粒子错合物及医药学上可接受的载剂。
本发明亦提供一种药物递送系统，其包含连接一或多种相同或不同治疗或诊断药物的一或多种金属纳米粒子错合物。
图式简单说明
图1(A)至(C)展示结合至金纳米粒子(Au/LKI-1/mAb-p24)上的抗HIV-1 p24抗体(mAb3)仍展示出结合亲和力。(A)Au/LKI-1/mAb-p24错合物及Au的吸收光谱。Au/LKI-1/mAb-p24错合物展示电浆子峰的2nm红移。(B)Au/LKI-1/mAb-p24错合物展示用Alexa Fluor568二级抗体侦测到的萤光。(C)ELISA分析用于展现Au/LKI-1/mAb-p24错合物的形成及p24抗原的结合活性，以与mAb-p24进行比较。
图2(A)至(B)展示结合至金纳米粒子(Au/LKI-1/Ab-EGFR及Au/LKI-5/Ab-EGFR)及Au上的EGFR(表皮生长因子受体)抗体的吸收光谱。(A)Au/LKI-1/Ab-EGFR错合物展示电浆子峰的1nm红移。(B)Au/LKI-5/Ab-EGFR错合物展示电浆子峰的1nm红移。
图3展示结合至金纳米粒子(Au/LKI-1/Tras)及Au上的曲妥珠单抗(Trastuzumab；Tras)抗体的吸收光谱。Au/LKI-1/Tras错合物展示电浆子峰的8nm红移。
图4(A)至(C)展示结合至金纳米粒子(Au/LKI-1/ETA)上的依那西普(Etanercept；ETA)仍展示结合亲和力。(A)Au/LKI-1/ETA错合物及Au的吸收光谱。Au/LKI-1/ETA错合物展示电浆子峰的2nm红移。(B)Au/LKI-1/ETA错合物展示用Alexa Fluor 568二级抗体侦测到的萤光。(C)观测到Au/LKI-1/ETA错合物、1-5nm金标记的二级抗人类IgG抗体结合至定位于Au表面上的ETA的TEM影像。
图5展示Au/LKI-1/Dox错合物及Au的吸收光谱。UV/vis资料、波长展示Au/LKI-1/Dox错合物的3nm红移。
图6(A)至(D)展示MDA-MB-231乳房肿瘤的治疗。(A)在治疗期间的动物净重量改变(g)。自资料看出，多柔比星及Au/LKI-1/Dox分别导致裸鼠(N＝3)重量减轻超过20％及3％。彼意谓与多柔比星相比，Au/LKI-1/Dox错合物对裸鼠的毒性少得多。(B)MDA-MD-231乳房肿瘤生长(N＝3)的抑制：Dox>Au/LKI-1/Dox>Au/PEG＝PBS。(C)用Au/LKI-1/Dox错合物处理的MDA-MB-231乳房肿瘤细胞的TEM影像易于测定异种移植模型中肿瘤中的Au/LKI-1/Dox错合物。(D)肿瘤样本的免疫组织化学。乳房肿瘤样本获自小鼠，嵌入于石蜡中，且用苏木精曙红染色。与用Au/LKI-1/Dox错合物处理的来自小鼠的肿瘤相比，在用多柔比星处理的来自小鼠的肿瘤中观测到更多的坏死。
具体实施方式
本发明是基于至少一种以下发现：pH敏感性连接物可同时结合金属纳米粒子及一或多种具有各种分子大小的药物。本发明连接物可将这些药物递送至涉及疾病过程的细胞中或接近这些细胞，使得这些药物可选择性地靶向且作用于这些细胞。由本发明连接物提供的靶向递送可用于例如疾病感测、成像、药物递送及疗法。
除非另外定义，否则本文中所用的所有技术及科学术语的含义是与一般熟习此项技术者所通常理解的含义相同。除非另有说明，否则本文中所提及的所有专利、申请案、公开的申请案及其他公开案均以全文引用的方式并入。除非另外说明，否则在本文术语存在多数个定义的情况下，以此部分中的定义为准。
术语“抗体”是以最广泛意义使用，且包括单株抗体(例如全长或完整单株抗体)、多株抗体、单价抗体、多价抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体，只要其展现所需生物活性)，且亦可包括某些抗体片段(如本文中所较较细描述)。抗体可为嵌合、人类、人类化及/或亲和力成熟的。
如本文所用，术语“肿瘤”是指所有赘生性细胞生长及增殖(无论恶性或良性)，及所有癌前及癌细胞以及组织。术语“癌症”、“癌性”、“细胞增殖性病症”、“增殖性病症”及“肿瘤”在本文中提及时不相互排斥。
如本文所使用，术语“癌症”是指哺乳动物中的生理状况，其特征通常为不受调控的细胞生长/增殖。癌症的实例包括(但不限于)癌瘤、淋巴瘤(例如霍奇金氏(Hodgkin's)及非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma))、母细胞瘤、肉瘤及白血病、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状癌、腹膜癌、肝细胞癌、肠胃癌、胰脏癌、神经胶母细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝肿瘤、乳癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾脏癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌瘤、白血病及其他淋巴增殖性病症及各种类型的头颈癌。
如本文所使用，术语“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”、“治疗(therapeutic)”或“疗法(therapy)”未必意谓疾病或病况完全治愈或消除。疾病或病况的任何不合需要的病征或症状在任何程度上的任何减轻均可视为治疗(treatment及/或therapy)。此外，治疗可包括会使患者总体健康或外观感觉恶化的行动。
“有效量”是指在所需剂量及时段下，可有效达成所需治疗或预防结果的量。
本发明的物质/分子的“治疗有效量”可根据诸如以下因素变化：疾病病况、年龄、性别、及个体重量、及在个体中引起所需反应的物质/分子的能力。治疗有效量亦为治疗有益效应超过物质/分子的任何毒性或有害效应的量。“预防有效量”是指在所需剂量及时间段下，可有效实现所需预防结果的量。通常但未必，因为在疾病之前或在疾病早期在个体中使用预防剂量，所以预防有效量将低于治疗有效量。
术语“医药学上可接受的盐”是指对其所投与的生物体不产生显著刺激且不消除化合物的生物活性及特性的化合物的盐。
在一个态样中，本发明提供一种具有下式(I)的pH-敏感性连接物，
其中
X为、-SH、-NH2(Boc-NH-；Fmoc-NH-)、-COOH；
n为1至6；
P为-C(O)NH-或-C(O)O-；
Q为-R(CH2CH2O)m-、R(-C(O)NH-)z或-R[-C(O)CH2CH2-C(O)NH-(CH2CH2O)m]Y；
R为键、-C1-12烷基或C1-10烷氧基；
m为1至12；
z为1至4；且
Y为1至12。
在一些实施例中，本发明连接物具有下式：
(连接物I-酰胺)，
其中m为1至12。
连接物I-酰胺具有式(I)，其中X为n为4，P为C(O)NH，R为键且Q为-R(CH2CH2O)m-。优选地，m为整数1至6。更优选地，m为整数2。
鉴于本发明，，可3使用熟习此项2技2术者已知的方法制备本发明的连接物I-酰胺连接物。举例而言，可如以下流程中所展示制备本发明的优选连接物。
在一些实施例中，本发明连接物具有下式：
(连接物I-C(O)O；连接物III)，
其中m为1至12。
连接物I-C(O)O(连接物III)具有式(I)，其中X为n为4，P为-C(O)O-，R为键，Q为-R(CH2CH2O)m-，且m为1至12。更优选地，m为整数2。
鉴于本发明，可使用熟习此项技术者已知的方法制备本发明的连接物I-C(O)O(连接物III)连接物。举例而言，可如以下流程中所展示制备本发明的优选连接物。
在一些实施例中，本发明连接物具有下式：
(SH-C2-连接物-I)，
其中m为1至12。
连接物SH-C2-连接物-I具有式(I)，其中X为-SH，n为2，P为-C(O)NH-，R为键，Q为-R(CH2CH2O)m-，且m为1至12。更优选地，m为整数2。
鉴于本发明，可使用熟习此项技术者已知的方法制备本发明的SH-C2-连接物-I连接物。举例而言，可如以下流程中所展示制备本发明的优选连接物。
在一些实施例中，本发明连接物具有下式：
(SH-C5-连接物-I-酰胺)，
其中m为1至12。
连接物SH-C5-连接物-I-酰胺具有式(I)，其中X为-SH，n为5，P为-C(O)NH-，R为键，Q为-R(CH2CH2O)m-，且m为1至12。更优选地，m为整数2。
鉴于本发明，可使用熟习此项技术者已知的方法制备本发明的SH-C5-连接物-I-酰胺连接物。举例而言，可如以下流程中所展示制备本发明的优选连接物。
在一些实施例中，本发明连接物具有下式：
(SH-C5-连接物-I-C(O)O-；SH-C5-连接物-III)，
其中m为1至12。
SH-C5-连接物-I-C(O)O-(SH-C5-连接物-III)具有式(I)，其中X为-SH，n为5，P为-C(O)O-，R为键，Q为-R(CH2CH2O)m-，且m为1至12。优选地，m为整数1至6。更优选地，m为整数2。
鉴于本发明，可使用熟习此项技术者已知的方法制备本发明的SH-C5-连接物-I-C(O)O-(SH-C5-连接物-III)连接物。举例而言，可如以下流程中所展示制备本发明的优选连接物。
在一些实施例中，本发明连接物具有下式：
(ppNH-C1-连接物-I-酰胺)，
其中pp为保护基(诸如Boc或Fmoc)；且m为1至12。
NH2-C1-连接物-I-酰胺具有式(I)，其中X为pp-NH-；pp为保护基(诸如Boc或Fmoc)，n为1，P为-C(O)NH-，R为键，Q为-R(CH2CH2O)m-，且m为1至12。优选地，m为整数1至6。更优选地，m为整数2。
鉴于本发明，可使用熟习此项技术者已知的方法制备本发明的NH2-C1-连接物-I-酰胺连接物。举例而言，可如以下流程中所展示制备本发明的优选连接物。
在一些实施例中，本发明连接物具有下式：
(ppNH-C1-连接物-I-C(O)O-；NH2-C1-连接物-III-C(O)O-)，
其中
PP为保护基(诸如Boc或Fmoc)；且
m为1至12。
ppNH-C1-连接物-I-C(O)O-(ppNH-C1-连接物-III-C(O)O-)具有式(I)，其中X为pp-NH-(pp为保护基，诸如Boc或Fmoc)，n为1，P为-C(O)O-，R为键，Q为-R(CH2CH2O)m-，且m为1至12。优选地，m为整数1至6。更优选地，m为整数2。
鉴于本发明，可使用熟习此项技术者已知的方法制备本发明的ppNH-C1-连接物-I-C(O)O-(ppNH-C1-连接物-III-C(O)O-)连接物。举例而言，可如以下流程中所展示制备本发明的优选连接物。
在一些实施例中，本发明连接物具有下式：
(连接物II-酰胺)，
其中z为1至4。
连接物II-酰胺具有式(I)，其中X为n为4，P为-C(O)NH-，R为键，Q为R(-CH2C(O)NH-)z，且z为1至4。更优选地，z为整数3。
鉴于本发明，可使用熟习此项技术者已知的方法制备本发明的连接物II-酰胺连接物。举例而言，可如以下流程中所展示制备本发明的优选连接物。
在一些实施例中，本发明连接物具有下式：
(连接物II-C(O)O-)，
其中z为1至4。
连接物II-C(O)O-具有式(I)，其中X为n为4，P为-C(O)O-，R为键，Q为R(-CH2C(O)NH-)z，且z为1至4。更优选地，z为整数3。
鉴于本发明，可使用熟习此项技术者已知的方法制备本发明的连接物II-C(O)O-连接物。举例而言，可如以下流程中所展示制备本发明的优选连接物。
在一些实施例中，本发明连接物具有下式：
(SH-C5-连接物-II-酰胺)，
其中z为1至4。
SH-C5-连接物-II-酰胺具有式(I)，其中X为-SH，n为5，P为-C(O)NH-，R为键，Q为R(-CH2C(O)NH-)z，且z为1至4。更优选地，z为整数3。
在其他实施例中，n为2。鉴于本发明，可使用熟习此项技术者已知的方法制备本发明的SH-C2-5-连接物-II-酰胺连接物。举例而言，可如以下流程中所展示制备本发明的优选连接物。
在一些实施例中，本发明连接物具有下式：
(SH-C5-连接物-II-C(O)O-)
其中z为1至4。
SH-C5-连接物-II-C(O)O-具有式(I)，其中X为CH3C(O)S-，n为5，P为-C(O)O-，R为键，Q为R(-CH2C(O)NH-)z，且z为1至4。更优选地，z为整数3。
在其他实施例中，n为2。鉴于本发明，可使用熟习此项技术者已知的方法制备本发明的SH-C2-5-连接物-II-C(O)O-连接物。举例而言，可如以下流程中所展示制备本发明的优选连接物。
在一些实施例中，本发明连接物具有下式：
(ppNH-C1-连接物-II-酰胺)，
其中pp为保护基(诸如Boc或Fmoc)；且
z为1至4。
ppNH-C1-连接物-II-酰胺具有式(I)，其中X为pp-NH-；pp为保护基(诸如Boc或Fmoc)，n为1，P为-C(O)NH-，R为键，Q为R(-C(O)NH-)z，且z为1至4。更优选地，z为整数3。
鉴于本发明，可使用熟习此项技术者已知的方法制备本发明的ppNH-C1-连接物-II-酰胺连接物。举例而言，可如以下流程中所展示制备本发明的优选连接物。
在一些实施例中，本发明连接物具有下式：
(ppNH-C1-连接物-II-C(O)O-)，
其中pp为保护基(诸如Boc或Fmoc)；且
z为1至4。
ppNH-C1-连接物-II-C(O)O-具有式(I)，其中X为pp-NH-；pp为保护基(诸如Boc或Fmoc)，n为1，P为-C(O)O-，R为键，Q为R(-C(O)NH-)z，且z为1至4。更优选地，z为整数3。
鉴于本发明，可使用熟习此项技术者已知的方法制备本发明的ppNH-C1-连接物-II-C(O)O-连接物。举例而言，可如以下流程中所展示制备本发明的优选连接物。
在一些实施例中，本发明连接物具有下式：
(连接物IV-酰胺)，
其中Y为1至12。
连接物IV-酰胺具有式(I)，其中X为，n为4，P为-C(O)NH-，R为-CH2CH2O-，Q为-R[-C(O)CH2CH2-C(O)NH-(CH2CH2O)m]Y，m为3且Y为1至12。优选地，m为2且Y为2。
在其他实施例中，m为1-12。鉴于本发明，可使用熟习此项技术者已知的方法制备本发明的连接物IV-酰胺连接物。举例而言，可如以下流程中所展示制备本发明的优选连接物。
在一些实施例中，本发明连接物具有下式：
(连接物IV-C(O)O-)，
其中Y为1至12。
连接物IV-C(O)O-具有式(I)，其中X为n为4，P为-C(O)O-，R为-CH2CH2O-，Q为-R[-C(O)CH2CH2-C(O)NH-(CH2CH2O)m]Y，m为3且Y为1至12。更优选地，Y为整数2。
在其他实施例中，m为1-12。鉴于本发明，可使用熟习此项技术者已知的方法制备本发明的连接物IV-C(O)O-连接物。举例而言，可如以下流程中所展示制备本发明的优选连接物。
在一些实施例中，本发明连接物具有下式：
(SH-C5-连接物-IV-酰胺)，
其中Y为1至12。
SH-C5-连接物-IV-酰胺具有式(I)，其中X为CH3C(O)S-，n为5，P为-C(O)NH-，R为-CH2CH2O-，Q为-R[-C(O)CH2CH2-C(O)NH-(CH2CH2O)m]Y，m为3且Y为1至12。更优选地，Y为整数2。
在其他实施例中，n为2或5且m为1-12。鉴于本发明，可使用熟习此项技术者已知的方法制备本发明的连接物SH-C2-5-连接物-IV-酰胺连接物。举例而言，可如以下流程中所展示制备本发明的优选连接物。
在一些实施例中，本发明连接物具有下式：
(SH-C5-连接物-IV-C(O)O-)，
其中Y为1至12。
SH-C5-连接物-IV-C(O)O-具有式(I)，其中X为CH3C(O)S-，n为5，P为-C(O)O-，R为-CH2CH2O-，Q为-R[-C(O)CH2CH2-C(O)NH-(CH2CH2O)m]Y，m为3且Y为1至12。优选地，Y为整数1至6。更优选地，Y为整数2。
在其他实施例中，n为2或5且m为1-12。鉴于本发明，可使用熟习此项技术者已知的方法制备本发明的HS-C2-5-连接物-IV-C(O)O-连接物。举例而言，可如以下流程中所展示制备本发明的优选连接物。
在一些实施例中，本发明连接物具有下式：
(ppNH-C1-连接物-IV-酰胺)，
其中pp为保护基(诸如Boc或Fmoc)；且Y为1至12。
ppNH-C1-连接物-IV-酰胺具有式(I)，其中X为pp-NH-；pp为保护基(诸如Boc或Fmoc)，n为1，P为-C(O)NH-，R为-CH2CH2O-，Q为-R[-C(O)CH2CH2-C(O)NH-(CH2CH2O)m]Y，m为3且Y为1至12。更优选地，Y为整数2。
在其他实施例中，m为1-12。鉴于本发明，可使用熟习此项技术者已知的方法制备本发明的ppNH-C1-连接物-IV-酰胺连接物。举例而言，可如以下流程中所展示制备本发明的优选连接物。
在一些实施例中，本发明连接物具有下式：
(ppNH-C1-连接物-IV-C(O)O-)，
其中pp为保护基(诸如Boc或Fmoc)；且Y为1至12。
ppNH-C1-连接物-IV-C(O)O-具有式(I)，其中X为pp-NH-；pp为保护基(诸如Boc或Fmoc)，n为1，P为-C(O)O-，R为-CH2CH2O-，Q为-R[-C(O)CH2CH2-C(O)NH-(CH2CH2O)m]Y，m为3且Y为1至12。更优选地，Y为整数2。
在其他实施例中，m为1-12。鉴于本发明，可使用熟习此项技术者已知的方法制备本发明的ppNH-C1-连接物-IV-C(O)O-连接物。举例而言，可如以下流程中所展示制备本发明的优选连接物。
在另一态样中，本发明提供一种金属纳米粒子错合物，其包含与一或多种本发明的连接物错合、视情况与一或多种PEG错合的金属纳米粒子。
在一个实施例中，这些金属纳米粒子为Au、Pd、Pt或Ag纳米粒子。
在一个实施例中，所述连接物为相同或不同的。更优选地，所述金属纳米粒子错合物包含多数个具有不同分子长度的连接物。具有不同分子长度的连接物可结合不同治疗或诊断药物，其取决于待治疗或诊断的靶细胞或疾病的需要。连接物经由所述连接物中的1,2-二硫杂环戊烷基团或-SH基团的硫原子连接至金属纳米粒子。
在一个实施例中，用于本发明的PEG的分子量范围介于约2000至20,000Da；优选地，2000至5000。在一些情况下，亦可使用聚乙二醇化以减小连接物或纳米粒子与生物部分之间的电荷相互作用，例如通过在连接物或纳米粒子的表面上产生可避免聚合物与生物部分相互作用的亲水层。在一些情况下，添加聚(乙二醇)重复单元可延长聚合结合物的血浆半衰期，例如通过减少由吞噬细胞系统导致的对聚合结合物的捕捉，同时减少由细胞导致的转染/捕捉效率。一般熟习此项技术者将知晓用于聚乙二醇化聚合物的方法及技术，例如，如下文实例中所论述，通过开环聚合技术(ROMP)或其类似技术，通过使用EDC(1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳化二亚胺盐酸盐)及NHS(N-羟基丁二酰亚胺)以使聚合物与以胺封端的PEG基团反应。
在另一实施例中，金属纳米粒子的尺寸小于约100nm，优选小于80nm。
在一些实施例中，金属纳米粒子错合物进一步连接一或多种相同或不同治疗或诊断药物。优选地，治疗药物为抗肿瘤药物或抗体。优选地，抗体为在诸如肿瘤细胞的细胞表面中靶向抗原特异性表达的抗体；更优选地，抗体拥有靶向、识别及抗肿瘤细胞抗体。
在一些实施例中，抗肿瘤药物为适用于治疗癌症的抗癌药物或抗癌抗体。抗癌药物的实例包括烷基化剂，诸如噻替派及环磷酰胺；磺酸烷酯，诸如硫酸布他卡因(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，诸如苯唑多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米特多巴(meturedopa)及尤利多巴(uredopa)；伸乙亚胺及甲基三聚氰胺，包括六甲蜜胺、三伸乙基三聚氰胺、三伸乙基磷酰胺、三伸乙基硫代磷酰胺及三甲密胺；多聚乙酰(尤其布拉他辛(bullatacin)及布拉他辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氢大麻酚(屈大麻酚(dronabinol))；β-拉帕酮(beta-lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙碱(colchicine)；桦木酸(betulinic acid)；喜树碱(包括合成类似物拓朴替康(topotecan)、CPT-11(伊立替康(irinotecan))、乙酰基喜树碱、东莨菪素(scopolectin)及9-胺基喜树碱)；苔藓抑素(bryostatin)；卡利斯他汀(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)及比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊甙(teniposide)；念珠藻环肽(cryptophycin)(特别是念珠藻环肽1及念珠藻环肽8)；海兔毒素(dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成类似物KW-2189及CB1-TM1)；艾榴素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；沙考地汀(sarcodictyin)；海绵抑素(spongistatin)；氮芥(nitrogen mustard)，诸如氯芥苯丁酸、萘氮芥、氯磷酰胺、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺、氮芥(mechlorethamine)、氮芥氧化物盐酸盐、美法仑(melphalan)、新恩比兴(novembichin)、芬司特瑞(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，诸如卡莫司汀(nitrosureas)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)及雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，诸如烯二炔抗生素(例如卡奇霉素(calicheamicin)，尤其卡奇霉素γII及卡奇霉素ωII(参看，例如Agnew,Chem.Intl.Ed.Engl.,33:183-186(1994))；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素A；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新抑癌素发色团(neocarzinostatin chromophore)及相关色素蛋白烯二炔抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、偶氮丝胺酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素(caminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放线菌素d(dactinomycin)、道诺比星(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-侧氧基-L-正白胺酸、多柔比星(包括(N-吗啉基)-多柔比星、氰基-(N-吗啉基)-多柔比星、2-吡咯啉基-多柔比星及去氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)(诸如丝裂霉素C)、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泼非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、奎那霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链脲霉素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、左柔比星(zorubicin)；抗代谢物，诸如甲胺喋呤及5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如迪诺特宁(denopterin)、甲胺喋呤(methotrexate)、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、噻咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮杂尿苷(azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双去氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素，诸如卡普睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸酯(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺，诸如胺格鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺醣苷；胺基乙酰丙酸；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；贝斯布西(bestrabucil)；比山群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；艾福米辛(elformithine)；依利醋铵；埃博霉素(epothilone)；乙环氧啶(etoglucid)；硝酸镓；羟基尿素(hydroxyurea)；蘑菇多醣(lentinan)；罗尼达宁(lonidainine)；类美登素(maytansinoid)，诸如美登素(maytansine)及安丝菌素(ansamitocin)；丙脒腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫比达摩(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他汀(pentostatin)；凡那明(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；多醣错合物(JHS Natural Products,Eugene,Oreg.)；雷佐生(razoxane)；根瘤菌素(rhizoxin)；西佐喃(sizofuran)；锗螺胺；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2”-三氯三乙胺；新月毒素(trichothecene)(尤其是T-2毒素、弗纳库林A(verracurin A)、杆孢菌素A(roridin A)及蛇形菌毒素(anguidine))；尿烷(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托星(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside)(“Ara-C”)；噻替派；类紫杉醇，例如太平洋紫杉醇(Bristol-Myers SquibbOncology,Princeton,N.J.)、不含十六醇聚氧乙烯醚的经白蛋白工程改造的太平洋紫杉醇的纳米粒子调配物(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Ill.)及多西他赛(doxetaxel)(Rhone-Poulenc Rorer,Antony,France)；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫代鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲胺喋呤；铂类似物，诸如顺铂(cisplatin)及卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；奥沙利铂(oxaliplatin)；亮克沃林(leucovovin)；长春瑞滨(vinorelbine)；米托蒽醌(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；柔红霉素(daunomycin)；胺基喋呤(aminopterin)；伊班膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟胺酸(DMFO)；类视黄素(retinoid)，诸如视黄酸；卡培他滨(capecitabine)；以上中的任一者的医药学上可接受的盐、酸或衍生物；以及以上中的两者或更多者的组合，诸如环磷酰胺、多柔比星、长春新碱及泼尼松龙(prednisolone)的组合疗法的缩写CHOP以及奥沙利铂与5-FU及亮克沃林组合的治疗方案的缩写FOLFOX。
纳米粒子中所存在抗癌药物的量可在宽范围上改变。在一些实施例中，纳米粒子可包括以抗癌药物与纳米粒子的质量比计在约1％至约50％(重量/重量)范围内的抗癌药物量。在其他实施例中，纳米粒子可包括以抗癌药物与纳米粒子的质量比计在约5％至约40％(重量/重量)范围内的抗癌药物量。在另其他实施例中，纳米粒子可包括在约10％至约30％(重量/重量)范围内的抗癌药物量。在又其他实施例中，纳米粒子可包括以抗癌药物与纳米粒子的质量比计在约1％至约10％(重量/重量)、约1％至约5％(重量/重量)、约5％至约10％(重量/重量)、约10％至约20％(重量/重量)、约15％至约35％(重量/重量)、约30％至约40％(重量/重量)及其类似者范围内的抗癌药物量。在一些实施例中，纳米粒子可包括以抗癌药物与纳米粒子的质量比计约20％(重量/重量)的抗癌药物量。在其他实施例中，纳米粒子可包括以抗癌药物与纳米粒子的质量比计5％(重量/重量)、约10％(重量/重量)、15％(重量/重量)、约25％(重量/重量)、约30％(重量/重量)及其类似者的抗癌药物量。
本文中所描述的一些实施例涉及一种组合物，其可包含连接一或多种相同或不同治疗或诊断药物的金属纳米粒子错合物及医药学上可接受的载剂。医药组合物便于向生物体投与连接一或多种相同或不同治疗或诊断药物的金属纳米粒子错合物。在此项技术中存在投与化合物的多种技术，其包括(但不限于)经口、注射、喷雾、非经肠及局部投与。
本文中所描述的一些实施例涉及一种药物递送系统，其包含连接一或多种相同或不同治疗或诊断药物的一或多种金属纳米粒子错合物。
在此项技术中存在多种技术投与连接一或多种相同或不同治疗或诊断药物的金属纳米粒子错合物，包括(但不限于)经口、直肠、局部、喷雾注射及非经肠递送，其包括肌内、皮下、静脉内、髓内注射；鞘内、直接室内、腹膜内、鼻内及眼内注射。
实例
实例1 制备连接物I-酰胺
步骤1.将乙醇胺(1.28g，1.05当量)及类脂酸(4.13g，1.0当量)溶解于80mL DCM中，且缓慢添加EDC·HCl(4.98g，1.3当量)、羟基丁二酰亚胺(NHS)(2.30g，1.0当量)及三乙胺(6.4mL，2.3当量)。在室温下进行反应至少5小时且反应后接着TLC。随后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用DCM:MeOH＝9.8:0.2用管柱来纯化萃取物。产物为浅黄色液体。产量：4.04g；81.0％。
步骤2.将氯甲酸4-硝基苯酯(3.35g，1.15当量)置于双颈瓶中。在真空下持续1小时，将三通阀转向至氮气装置且用注射器添加60mL DCM。用10-15mL DCM溶解经称重的步骤1产物1，用注射器将其注入至反应烧瓶中，且随后缓慢添加三乙胺(4.5mL，2.3当量)。在冰浴中进行反应约1小时且随后回到室温下隔夜。反应完成后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用EtOAc:Hex:MeOH＝1:1:0.2用管柱来纯化萃取物。产物为浅黄色液体。纯化后产率：51.6％。
步骤3.将经称重的步骤2产物2(3.5g，1.0当量)溶解于120mL DCM中，且随后缓慢添加水合肼(6.5mL，10.0当量)。在室温下进行反应约24小时。溶液颜色自浅黄色变为橙色。反应完成后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用DCM:MeOH＝9.5:0.5用管柱来纯化萃取物。在此步骤中，产物黏在管柱中，且可增加MeOH至5％以溶离最终产物。产物为浅黄色黏性固体。纯化后产率：19.5％。
连接物I-1(连接物I-酰胺，m＝2)。1H(400MHz)δ1.23-1.31(2H,m),1.40-1.51(3H,m),1.57-1.64(1H,m),1.78-1.86(1H,m),2.05(2H,t),2.32-2.39(1H,m),3.01-3.18(4H,m),3.39(2H,t),3.52-3.57(3H,m),4.03-4.19(4H,m),7.94(1H,s),8.14(1H,s).13C(100MHz)δ25.9,29.0,34.8,36.1,38.9,39.5,40.9,57.2,64.7,69.3,69.6,159.5,174.9ppm。H-Mass(m/z):(M+Na)＝374.1171
连接物I-2(连接物I-酰胺，m＝1)。1H(300MHz)δ1.30-1.38(2H,m),1.45-1.57(3H,m),1.60-1.72(1H,m),1.80-1.92(1H,m),2.06(2H,s),2.36-2.46(1H,m),3.07-3.24(4H,m),3.56-3.65(1H,m),3.95(2H,t),4.02(2H,s),7.88(1H,t),8.11(1H,s).13C(100MHz)δ25.6,28.8,34.6,35.9,38.8,39.4,40.7,56.9,63.7,163.8,174.3ppm。H-Mass(m/z):(M+Na)＝330.0894。
连接物I-3(连接物I-酰胺，m＝3)。1H(300MHz)δ1.30-1.37(2H,m),1.45-1.57(3H,m),1.60-1.72(1H,m),1.80-1.91(1H,m),2.06(2H,t),2.35-2.46(1H,m),3.07-3.23(4H,m),3.39(2H,t),3.47-3.65(7H,m),4.02(2H,s),4.05-4.08(2H,m),7.84(1H,t),8.18(1H,s).13C(100MHz)δ25.7,28.9,34.7,35.9,38.8,39.4,40.7,60.0,64.4,69.4,69.6,70.1,70.3,159.2,174.2ppm。H-Mass(m/z):(M+Na)＝418.1466。
连接物I-4(连接物I-酰胺，m＝4)。1H(300MHz)δ1.30-1.38(2H,m),1.45-1.57(3H,m),1.60-1.72(1H,m),1.80-1.91(1H,m),2.06(2H,t),2.36-2.46(1H,m),3.07-3.23(4H,m),3.39(2H,t),3.49-3.65(11H,m),4.02(2H,s),4.05-4.08(2H,m),7.83(1H,t),8.18(1H,s).13C(100MHz)δ25.7,28.9,34.7,35.9,38.8,39.4,40.7,56.9,64.4,69.4,69.6,70.2,70.3,70.4,159.2,174.1ppm。H-Mass(m/z):(M+Na)＝440.1875。
连接物I-5(连接物I-酰胺，m＝5)。1H(300MHz)δ1.30-1.38(2H,m),1.45-1.57(3H,m),1.60-1.69(1H,m),1.80-1.91(1H,m),2.06(2H,t),2.36-2.46(1H,m),3.07-3.23(4H,m),3.39(2H,t),3.51-3.62(19H,m),4.02(2H,s),4.05-4.08(2H,m),4.83(1H,t),8.18(1H,s).13C(100MHz)δ25.9,29.0,34.8,36.1,39.0,39.4,40.9,57.2,64.8,69.5,69.7,70.3,70.4,70.5,159.5,174.8ppm。H-Mass(m/z):(M+Na)＝550.2234
实例2 制备连接物I-C(O)O
步骤1.将乙二醇(1.30g，1.05当量)及类脂酸(4.13g，1.0当量)溶解于80mL DCM中，且缓慢添加N,N'-二环己基碳化二亚胺(DCC)(5.36g，1.3当量)、4-(二甲胺基)吡啶(DMAP)(0.24g，0.1当量)及三乙胺(6.4mL，2.3当量)。在室温下进行反应至少5小时且反应后接着TLC。随后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用DCM:MOH＝9.8:0.2用管柱来纯化萃取物。产物为浅黄色液体。产量：4.00g；80.5％。
步骤2.将氯甲酸4-硝基苯酯(3.35g，1.15当量)置于双颈瓶中。在真空下持续1小时，将三通阀转向至氮气装置且用注射器添加60mL DCM。用10-15mL DCM溶解经称重的步骤1产物1，用注射器将其注入至反应烧瓶中，且随后缓慢添加三乙胺(4.5mL，2.3当量)。在冰浴中进行反应约1小时且随后回到室温下隔夜。反应完成后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用EtOAc:Hex:MeOH＝1:1:0.2用管柱来纯化萃取物。产物为浅黄色液体。纯化后产率：50.6％。
步骤3.将经称重的步骤2产物2(3.5g，1.0当量)溶解于120mL DCM中，且随后缓慢添加水合肼(6.5mL，10.0当量)。在室温下进行反应约24小时。溶液颜色自浅黄色变为橙色。反应完成后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用DCM:MeOH＝9.5:0.5用管柱来纯化萃取物。在此步骤中，产物黏在管柱中，且可增加MeOH至5％以溶离最终产物。产物为浅黄色黏性固体。纯化后产率：18.5％。
实例3 制备HS-C2-连接物-I-酰胺
步骤1.将乙醇胺(1.28g，1.05当量)及3-(乙酰基硫)丙酸(2.96g，1.0当量)溶解于80mL DCM中，且缓慢添加EDC·HCl(4.98g，1.3当量)、羟基丁二酰亚胺(NHS)(2.30g，1.0当量)及三乙胺(6.4mL，2.3当量)。在室温下进行反应至少5小时且反应后接着TLC。随后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用DCM:MeOH＝9.8:0.2用管柱来纯化萃取物。产物为浅黄色液体。产量：4.10g；70.0％。
步骤2.将氯甲酸4-硝基苯酯(3.35g，1.15当量)置于双颈瓶中。在真空下持续1小时，将三通阀转向至氮气装置且用注射器添加60mL DCM。用10-15mL DCM溶解经称重的步骤1产物1，用注射器将其注入至反应烧瓶中，且随后缓慢添加三乙胺(4.5mL，2.3当量)。在冰浴中进行反应约1小时且随后回到室温下隔夜。反应完成后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用EtOAc:Hex:MeOH＝1:1:0.2用管柱来纯化萃取物。产物为浅黄色液体。纯化后产率：48.6％。
步骤3.将经称重的步骤2产物2(3.5g，1.0当量)溶解于120mL DCM中，且随后缓慢添加水合肼(6.5mL，10.0当量)。在室温下进行反应约24小时。溶液颜色自浅黄色变为橙色。反应完成后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用DCM:MeOH＝9.5:0.5用管柱来纯化萃取物。在此步骤中，产物黏在管柱中，且可增加MeOH至5％以溶离最终产物。产物为浅黄色黏性固体。纯化后产率：19.0％。
实例4 制备HS-C5-连接物-I-酰胺
步骤1.将乙醇胺(1.28g，1.05当量)及6-乙酰基硫己酸(3.81g，1.0当量)溶解于80mL DCM中，且缓慢添加EDC·HCl(4.98g，1.3当量)、羟基丁二酰亚胺(NHS)(2.30g，1.0当量)及三乙胺(6.4mL，2.3当量)。在室温下进行反应至少5小时且反应后接着TLC。随后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用DCM:MOH＝9.8:0.2用管柱来纯化萃取物。产物为浅黄色液体。产量：3.85g；78.0％。
步骤2.将氯甲酸4-硝基苯酯(3.35g，1.15当量)置于双颈瓶中。在真空下持续1小时，将三通阀转向至氮气装置且用注射器添加60mL DCM。用10-15mL DCM溶解经称重的步骤1产物1，用注射器将其注入至反应烧瓶中，且随后缓慢添加三乙胺(4.5mL，2.3当量)。在冰浴中进行反应约1小时且随后回到室温下隔夜。反应完成后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用EtOAc:Hex:MeOH＝1:1:0.2用管柱来纯化萃取物。产物为浅黄色液体。纯化后产率：48.6％。
步骤3.将经称重的步骤2产物2(3.5g，1.0当量)溶解于120mL DCM中，且随后缓慢添加水合肼(6.5mL，10.0当量)。在室温下进行反应约24小时。溶液颜色自浅黄色变为橙色。反应完成后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用DCM:MeOH＝9.5:0.5用管柱来纯化萃取物。在此步骤中，产物黏在管柱中，且可增加MeOH至5％以溶离最终产物。产物为浅黄色黏性固体。纯化后产率：17.0％。
SH-C5-连接物I-1(SH-C5-连接物-1-酰胺，m为2)：1H(400MHz)δ1.26-1.33(2H,m),1.43-1.55(4H,m),2.05(2H,t),2.22(1H,s),2.45(2H,t),3.15-3.19(2H,m),3.37(2H,t),3.54(2H,t),4.03-4.08(4H,m),7.85(1H,t),8.19(1H,s)；13C(100MHz)δ23.7,24.7,27.4,33.1,35.2,38.4,63.3,68.6,69.1,158.3,172.2。H-Mass(m/z):(M+Na)＝316.1336
SH-C5-连接物I-4(SH-C5-连接物-1-酰胺，m为4)：1H(400MHz)δ1.26-1.34(2H,m),1.43-1.56(4H,m),2.05(2H,t),2.22(1H,t),2.43-2.48(2H,m),3.16-3.20(3H,m),3.39(2H,t),3.48-3.50(7H,m),3.56(2H,m),4.03-4.08(4H,m),7.84(1H,m),8.20(1H,s)；13C(100MHz)δ23.7,24.8,27.4,33.1,35.2,38.5,63.4,68.9,69.2,69.6,69.8,158.3,172.2.H-Mass(m/z):(M+Na)＝404.1843
实例5 制备SH-C5-连接物-I-C(O)O-
步骤1.将乙二醇(1.30g，1.05当量)及6-乙酰基硫己酸(3.81g，1.0当量)溶解于80mL DCM中，且缓慢添加N,N'-二环己基碳化二亚胺(DCC)(5.36g，1.3当量)、4-(二甲胺基)吡啶(DMAP)(0.24g，0.1当量)及三乙胺(6.4mL，2.3当量)。在室温下进行反应至少5小时且反应后接着TLC。随后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用DCM:MeOH＝9.8:0.2用管柱来纯化萃取物。产物为浅黄色液体。产量：3.88g；79.8％。
步骤2.将氯甲酸4-硝基苯酯(3.35g，1.15当量)置于双颈瓶中。在真空下持续1小时，将三通阀转向至氮气装置且用注射器添加60mL DCM。用10-15mL DCM溶解经称重的步骤1产物1，用注射器将其注入至反应烧瓶中，且随后缓慢添加三乙胺(4.5mL，2.3当量)。在冰浴中进行反应约1小时且随后回到室温下隔夜。反应完成后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用EA:Hex:MeOH＝1:1:0.2用管柱来纯化萃取物。产物为浅黄色液体。纯化后产率：51.6％。
步骤3.将经称重的步骤2产物2(3.5g，1.0当量)溶解于120mL DCM中，且随后缓慢添加水合肼(6.5mL，10.0当量)。在室温下进行反应约24小时。溶液颜色自浅黄色变为橙色。反应完成后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用DCM:MeOH＝9.5:0.5用管柱来纯化萃取物。在此步骤中，产物黏在管柱中，且可增加MeOH至5％以溶离最终产物。产物为浅黄色黏性固体。纯化后产率：19.4％。
实例6 制备NH2-C1-连接物-I-酰胺
步骤1.将乙醇胺(1.28g，1.05当量)及Boc-甘胺酸(3.50g，1.0当量)溶解于80mLDCM中，且缓慢添加EDC·HCl(4.98g，1.3当量)、羟基丁二酰亚胺(NHS)(2.30g，1.0当量)及三乙胺(6.4mL，2.3当量)。在室温下进行反应至少5小时且反应后接着TLC。随后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用DCM:MeOH＝9.8:0.2用管柱来纯化萃取物。产物为浅黄色液体。产量：4.10g；81.5％。
步骤2.将氯甲酸4-硝基苯酯(3.35g，1.15当量)置于双颈瓶中。在真空下持续1小时，将三通阀转向至氮气装置且用注射器添加60mL DCM。用10-15mL DCM溶解经称重的步骤1产物1，用注射器将其注入至反应烧瓶中，且随后缓慢添加三乙胺(4.5mL，2.3当量)。在冰浴中进行反应约1小时且随后回到室温下隔夜。反应完成后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用EtOAc:Hex:MeOH＝1:1:0.2用管柱来纯化萃取物。产物为浅黄色液体。纯化后产率：51.6％。
步骤3.将经称重的步骤2产物2(3.5g，1.0当量)溶解于120mL DCM中，且随后缓慢添加水合肼(6.5mL，10.0当量)。在室温下进行反应约24小时。溶液颜色自浅黄色变为橙色。反应完成后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用DCM:MeOH＝9.5:0.5用管柱来纯化萃取物。在此步骤中，产物黏在管柱中，且可增加MeOH至5％以溶离最终产物。产物为浅黄色黏性固体。纯化后产率：17.9％。
实例7 制备NH2-C1-连接物-I-C(O)O-
步骤1.将乙二醇(1.30g，1.05当量)及Boc-甘胺酸(3.50g，1.0当量)溶解于80mLDCM中，且缓慢添加N,N'-二环己基碳化二亚胺(DCC)(5.36g，1.3当量)、4-(二甲胺基)吡啶(DMAP)(0.24g，0.1当量)及三乙胺(6.4mL，2.3当量)。在室温下进行反应至少5小时且反应后接着TLC。随后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用DCM:MeOH＝9.8:0.2用管柱来纯化萃取物。产物为浅黄色液体。产量：3.60g；78.0％。
步骤2.将氯甲酸4-硝基苯酯(3.35g，1.15当量)置于双颈瓶中。在真空下持续1小时，将三通阀转向至氮气装置且用注射器添加60mL DCM。用10-15mL DCM溶解经称重的步骤1产物1，用注射器将其注入至反应烧瓶中，且随后缓慢添加三乙胺(4.5mL，2.3当量)。在冰浴中进行反应约1小时且随后回到室温下隔夜。反应完成后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用EA:Hex:MeOH＝1:1:0.2用管柱来纯化萃取物。产物为浅黄色液体。纯化后产率：49.7％。
步骤3.将经称重的步骤2产物2(3.5g，1.0当量)溶解于120mL DCM中，且随后缓慢添加水合肼(6.5mL，10.0当量)。在室温下进行反应约24小时。溶液颜色自浅黄色变为橙色。反应完成后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用DCM:MeOH＝9.5:0.5用管柱来纯化萃取物。在此步骤中，产物黏在管柱中，且可增加MeOH至5％以溶离最终产物。产物为浅黄色黏性固体。纯化后产率：20.0％。
实例8 制备连接物II-酰胺
步骤1.将甘胺酸(2.36g，1.05当量)及类脂酸(6.19g，1.0当量)溶解于80mL DCM中，且缓慢添加EDC·HCl(7.47g，1.3当量)、羟基丁二酰亚胺(NHS)(3.45g，1.0当量)及三乙胺(9.6mL，2.3当量)。在室温下进行反应至少5小时且反应后接着TLC。随后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用DCM:MeOH＝9.5:0.5用管柱来纯化萃取物。产物为浅黄色液体。产率：70.0％。
步骤2.将步骤1产物(5.26g，1.0当量)及乙醇胺(1.28g，1.05当量)溶解于80mLDCM中，且缓慢添加EDC·HCl(4.98g，1.3当量)、羟基丁二酰亚胺(NHS)(2.30g，1.0当量)及三乙胺(6.4mL，2.3当量)。在室温下进行反应至少5小时且反应后接着TLC。随后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用DCM:MeOH＝9.8:0.2用管柱来纯化萃取物。产物为浅黄色液体。产率：81.0％。
步骤3.将氯甲酸4-硝基苯酯(3.35g，1.15当量)置于双颈瓶中。在真空下持续1小时，将三通阀转向至氮气装置且用注射器添加60mL DCM。用10-15mL DCM溶解经称重的步骤1产物1，用注射器将其注入至反应烧瓶中，且随后缓慢添加三乙胺(4.5mL，2.3当量)。在冰浴中进行反应约1小时且随后回到室温下隔夜。反应完成后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用EtOAc:Hex:MeOH＝1:2:0.2用管柱来纯化萃取物。产物为浅黄色液体。纯化后产率：51.6％。
步骤4.将经称重的步骤2产物2(3.5g，1.0当量)溶解于120mL DCM中，且随后缓慢添加水合肼(6.5mL，10.0当量)。在室温下进行反应约24小时。溶液颜色自浅黄色变为橙色。反应完成后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用DCM:MeOH＝9.5:0.5用管柱来纯化萃取物。在此步骤中，产物黏在管柱中，且可增加MeOH至5％以溶离最终产物。产物为浅黄色黏性固体。纯化后产率：30.0％。
连接物II-1(连接物II-酰胺，z＝1)。1H(400MHz)δ1.32-1.39(2H,m),1.46-1.57(2H,m),1.63-1.69(1H,m),1.83-1.91(1H,m),2.08(1H,s),2.13(2H,t),2.36-2.46(1H,m),3.07-3.19(2H,m),3.22-3.28(2H,m),3.62-3.65(3H,m),3.95(3H,t),7.01(1H,s),7.91(1H,t),8.01(1H,t),8.14(1H,s).13C(100MHz)δ25.2,28.8,34.6,35.4,38.6,38.7,39.5,42.4,56.60,62.85,135.63,169.72,172.83ppm。H-Mass(m/z):(M+Na)＝387.1102
连接物II-2(连接物II-酰胺，z＝2)。1H(300MHz)δ1.32-1.39(2H,m),1.47-1.57(3H,m),1.61-1.73(1H,m),1.81-1.92(1H,m),2.14(2H,t),2.35-2.46(2H,m),3.09-3.21(3H,m),3.23-3.31(3H,m),3.65-3.71(4H,m),3.97(2H,t),7.78(1H,t),7.89(1H,t),8.12(2H,t).13C(100MHz)δ25.3,28.8,34.6,35.4,38.6,38.7,39.5,42.4,42.6,56.6,60.2,62.8,169.4,169.9,173.1ppm。H-Mass(m/z):(M+Na)＝444.1345
连接物II-3(连接物II-酰胺，z＝3)。1H(300MHz)δ1.23(1H,s),1.32-1.40(2H,m),1.46-1.57(4H,m),1.63-1.70(1H,m),1.80-1.92(2H,t),1.96(1H,s),2.04(1H,s),2.14(3H,t),3.07-3.19(3H,m),3.58-3.66(3H,m),3.72(3H,t),3.96(1H,t),4.05(1H,s),7.86(1H,s),8.10(3H,s).13C(100MHz)δ25.3,28.8,34.6,35.4,38.6,39.5,39.7,40.5,42.4,42.6,56.6,60.2,62.8,169.4,169.6,170.1,173.1ppm。H-Mass(m/z):(M+Na)＝501.1606
连接物II-4(连接物II-酰胺，z＝4)。1H(300MHz)δ1.26(3H,s),1.35-1.42(2H,m),1.47-1.70(4H,m),1.82-1.94(2H,m),2.03-2.20(8H,m),2.26-2.33(2H,m),3.66-3.81(7H,m),3.95-4.01(1H,m),7.86-7.94(1H,m),8.80-8.22(3H,m).13C(100MHz)δ25.3,28.8,29.4,31.2,34.6,35.4,38.5,38.6,42.4,42.6,56.6,66.0,125.8,128.7,129.4,169.4,169.8,170.0,173.1ppm。H-Mass(m/z):(M+Na)＝558.1768
实例9 制备连接物II-C(O)O-
步骤1.将乙醇酸(2.40g，1.05当量)及类脂酸(6.19g，1.0当量)溶解于80mL DCM中，且缓慢添加N,N'-二环己基碳化二亚胺(DCC)(8.05g，1.3当量)、4-(二甲胺基)吡啶(DMAP)(0.37g，0.1当量)及三乙胺(9.6mL，2.3当量)。在室温下进行反应至少5小时且反应后接着TLC。随后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用DCM:MeOH＝9.5:0.5用管柱来纯化萃取物。产物为浅黄色液体。产率：85％。
步骤2.将步骤1产物(5.26g，1.0当量)及乙醇胺(1.28g，1.05当量)溶解于80mLDCM中，且缓慢添加EDC·HCl(4.98g，1.3当量)、羟基丁二酰亚胺(NHS)(2.30g，1.0当量)及三乙胺(6.4mL，2.3当量)。在室温下进行反应至少5小时且反应后接着TLC。随后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用DCM:MeOH＝9.8:0.2用管柱来纯化萃取物。产物为浅黄色液体。产率：80.5％。
步骤3.将氯甲酸4-硝基苯酯(3.35g，1.15当量)置于双颈瓶中。在真空下持续1小时，将三通阀转向至氮气装置且用注射器添加60mL DCM。用10-15mL DCM溶解经称重的步骤1产物1，用注射器将其注入至反应烧瓶中，且随后缓慢添加三乙胺(4.5mL，2.3当量)。在冰浴中进行反应约1小时且随后回到室温下隔夜。反应完成后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用EtOAc:Hex:MeOH＝1:2:0.2用管柱来纯化萃取物。产物为浅黄色液体。纯化后产率：47.8％。
步骤4.将经称重的步骤2产物2(3.5g，1.0当量)溶解于120mL DCM中，且随后缓慢添加水合肼(6.5mL，10.0当量)。在室温下进行反应约24小时。溶液颜色自浅黄色变为橙色。反应完成后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用DCM:MeOH＝9.5:0.5用管柱来纯化萃取物。在此步骤中，产物黏在管柱中，且可增加MeOH至5％以溶离最终产物。产物为浅黄色黏性固体。纯化后产率：19.3％。
实例10 制备连接物SH-C5-连接物-II-酰胺
步骤1.将6-乙酰基硫己酸(5.71g，1.0当量)及甘胺酸(2.36g，1.05当量)溶解于80mL DCM中，且缓慢添加EDC·HCl(7.47g，1.3当量)、羟基丁二酰亚胺(NHS)(3.45g，1.0当量)及三乙胺(9.6mL，2.3当量)。在室温下进行反应至少5小时且反应后接着TLC。随后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用DCM:MeOH＝9.5:0.5用管柱来纯化萃取物。产物为浅黄色液体。产率：68.8％。
步骤2.将步骤1产物(5.26g，1.0当量)及乙醇胺(1.28g，1.05当量)溶解于80mLDCM中，且缓慢添加EDC·HCl(4.98g，1.3当量)、羟基丁二酰亚胺(NHS)(2.30g，1.0当量)及三乙胺(6.4mL，2.3当量)。在室温下进行反应至少5小时且反应后接着TLC。随后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用DCM:MeOH＝9.8:0.2用管柱来纯化萃取物。产物为浅黄色液体。产率：80.5％。
步骤3.将氯甲酸4-硝基苯酯(3.35g，1.15当量)置于双颈瓶中。在真空下持续1小时，将三通阀转向至氮气装置且用注射器添加60mL DCM。用10-15mL DCM溶解经称重的步骤1产物1，用注射器将其注入至反应烧瓶中，且随后缓慢添加三乙胺(4.5mL，2.3当量)。在冰浴中进行反应约1小时且随后回到室温下隔夜。反应完成后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用EtOAc:Hex:MeOH＝1:2:0.2用管柱来纯化萃取物。产物为浅黄色液体。纯化后产率：50.6％。
步骤4.将经称重的步骤2产物2(3.5g，1.0当量)溶解于120mL DCM中，且随后缓慢添加水合肼(6.5mL，10.0当量)。在室温下进行反应约24小时。溶液颜色自浅黄色变为橙色。反应完成后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用DCM:MeOH＝9.5:0.5用管柱来纯化萃取物。在此步骤中，产物黏在管柱中，且可增加MeOH至5％以溶离最终产物。产物为浅黄色黏性固体。纯化后产率：18.3％。
实例11 制备连接物SH-C5-连接物-II-C(O)O-
步骤1.将6-乙酰基硫己酸(5.71g，1.0当量)及乙醇酸(2.40g，1.05当量)溶解于80mL DCM中，且缓慢添加N,N'-二环己基碳化二亚胺(DCC)(8.05g，1.3当量)、4-(二甲胺基)吡啶(DMAP)(0.37g，0.1当量)及三乙胺(9.6mL，2.3当量)。在室温下进行反应至少5小时且反应后接着TLC。随后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用DCM:MeOH＝9.5:0.5用管柱来纯化萃取物。产物为浅黄色液体。产率：78％。
步骤2.将步骤1产物(5.26g，1.0当量)及乙醇胺(1.28g，1.05当量)溶解于80mLDCM中，且缓慢添加EDC·HCl(4.98g，1.3当量)、羟基丁二酰亚胺(NHS)(2.30g，1.0当量)及三乙胺(6.4mL，2.3当量)。在室温下进行反应至少5小时且反应后接着TLC。随后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用DCM:MeOH＝9.8:0.2用管柱来纯化萃取物。产物为浅黄色液体。产率：80.5％。
步骤3.将氯甲酸4-硝基苯酯(3.35g，1.15当量)置于双颈瓶中。在真空下持续1小时，将三通阀转向至氮气装置且用注射器添加60mL DCM。用10-15mL DCM溶解经称重的步骤1产物1，用注射器将其注入至反应烧瓶中，且随后缓慢添加三乙胺(4.5mL，2.3当量)。在冰浴中进行反应约1小时且随后回到室温下隔夜。反应完成后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用EtOAc:Hex:MeOH＝1:2:0.2用管柱来纯化萃取物。产物为浅黄色液体。纯化后产率：51.6％。
步骤4.将经称重的步骤2产物2(3.5g，1.0当量)溶解于120mL DCM中，且随后缓慢添加水合肼(6.5mL，10.0当量)。在室温下进行反应约24小时。溶液颜色自浅黄色变为橙色。反应完成后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用DCM:MeOH＝9.5:0.5用管柱来纯化萃取物。在此步骤中，产物黏在管柱中，且可增加MeOH至5％以溶离最终产物。产物为浅黄色黏性固体。纯化后产率：19.0％。
实例12 制备连接物NH2-C1-连接物-II-酰胺
步骤1.将Boc-甘胺酸(5.26g，1.0当量)及甘胺酸(2.36g，1.05当量)溶解于80mLDCM中，且缓慢添加EDC·HCl(7.47g，1.3当量)、羟基丁二酰亚胺(NHS)(3.45g，1.0当量)及三乙胺(9.6mL，2.3当量)。在室温下进行反应至少5小时且反应后接着TLC。随后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用DCM:MeOH＝9.5:0.5用管柱来纯化萃取物。产物为浅黄色液体。产率：70％。
步骤2.将步骤1产物(5.26g，1.0当量)及乙醇胺(1.28g，1.05当量)溶解于80mLDCM中，且缓慢添加EDC·HCl(4.98g，1.3当量)、羟基丁二酰亚胺(NHS)(2.30g，1.0当量)及三乙胺(6.4mL，2.3当量)。在室温下进行反应至少5小时且反应后接着TLC。随后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用DCM:MeOH＝9.8:0.2用管柱来纯化萃取物。产物为浅黄色液体。产率：77.8％。
步骤3.将氯甲酸4-硝基苯酯(3.35g，1.15当量)置于双颈瓶中。在真空下持续1小时，将三通阀转向至氮气装置且用注射器添加60mL DCM。用10-15mL DCM溶解经称重的步骤1产物1，用注射器将其注入至反应烧瓶中，且随后缓慢添加三乙胺(4.5mL，2.3当量)。在冰浴中进行反应约1小时且随后回到室温下隔夜。反应完成后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用EtOAc:Hex:MeOH＝1:2:0.2用管柱来纯化萃取物。产物为浅黄色液体。纯化后产率：51.6％。
步骤4.将经称重的步骤2产物2(3.5g，1.0当量)溶解于120mL DCM中，且随后缓慢添加水合肼(6.5mL，10.0当量)。在室温下进行反应约24小时。溶液颜色自浅黄色变为橙色。反应完成后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用DCM:MeOH＝9.5:0.5用管柱来纯化萃取物。在此步骤中，产物黏在管柱中，且可增加MeOH至5％以溶离最终产物。产物为浅黄色黏性固体。纯化后产率：18.8％。
实例13 制备NH2-C1-连接物-II-C(O)O-
步骤1.将Boc-甘胺酸(5.26g，1.0当量)及乙醇酸(2.40g，1.05当量)溶解于80mLDCM中，且缓慢添加N,N'-二环己基碳化二亚胺(DCC)(8.05g，1.3当量)、4-(二甲胺基)吡啶(DMAP)(0.37g，0.1当量)及三乙胺(9.6mL，2.3当量)。在室温下进行反应至少5小时且反应后接着TLC。随后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用DCM:MOH＝9.5:0.5用管柱来纯化萃取物。产物为浅黄色液体。产率：82.0％。
步骤2.将步骤1产物(5.26g，1.0当量)及乙醇胺(1.28g，1.05当量)溶解于80mLDCM中，且缓慢添加EDC·HCl(4.98g，1.3当量)、羟基丁二酰亚胺(NHS)(2.30g，1.0当量)及三乙胺(6.4mL，2.3当量)。在室温下进行反应至少5小时且反应后接着TLC。随后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用DCM:MeOH＝9.8:0.2用管柱来纯化萃取物。产物为浅黄色液体。产率：78.5％。
步骤3.将氯甲酸4-硝基苯酯(3.35g，1.15当量)置于双颈瓶中。在真空下持续1小时，将三通阀转向至氮气装置且用注射器添加60mL DCM。用10-15mL DCM溶解经称重的步骤1产物1，用注射器将其注入至反应烧瓶中，且随后缓慢添加三乙胺(4.5mL，2.3当量)。在冰浴中进行反应约1小时且随后回到室温下隔夜。反应完成后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用EtOAc:Hex:MeOH＝1:2:0.2用管柱来纯化萃取物。产物为浅黄色液体。纯化后产率：51.0％。
步骤4.将经称重的步骤2产物(3.5g，1.0当量)溶解于120mL DCM中，且随后缓慢添加水合肼(6.5mL，10.0当量)。在室温下进行反应约24小时。溶液颜色自浅黄色变为橙色。反应完成后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用DCM:MeOH＝9.5:0.5用管柱来纯化萃取物。在此步骤中，产物黏在管柱中，且可增加MeOH至5％以溶离最终产物。产物为浅黄色黏性固体。纯化后产率：19.5％。
实例14 制备连接物IV-酰胺
步骤1.将乙醇胺(1.92g，1.05当量)及类脂酸(6.19g，1.0当量)溶解于80mL DCM中，且缓慢添加EDC·HCl(7.47g，1.3当量)、羟基丁二酰亚胺(NHS)(3.45g，1.0当量)及三乙胺(9.6mL，2.3当量)。在室温下进行反应至少5小时且反应后接着TLC。随后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用DCM:MeOH＝9.8:0.2用管柱来纯化萃取物。产物为浅黄色液体。产率：66.0％。
步骤2.将步骤1产物(4.98g，1.0当量)及丁二酸(2.48g，1.05当量)溶解于80mLDCM中，且缓慢添加N,N'-二环己基碳化二亚胺(DCC)(5.36g，1.3当量)、4-(二甲胺基)吡啶(DMAP)(0.24g，0.1当量)及三乙胺(6.4mL，2.3当量)。在室温下进行反应至少5小时且反应后接着TLC。随后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用DCM:MeOH＝9.5:0.5用管柱来纯化萃取物。产物为浅黄色液体。产率：80.7％。
步骤3.将步骤2产物(3.49g，1.0当量)及2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙醇(1.57g，1.05当量)溶解于80mL DCM中，且缓慢添加EDC·HCl(2.49g，1.3当量)、羟基丁二酰亚胺(NHS)(1.15g，1.0当量)及三乙胺(3.2mL，2.3当量)。在室温下进行反应至少5小时且反应后接着TLC。随后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用DCM:MeOH＝9.8:0.2用管柱来纯化萃取物。产物为浅黄色液体。产率：81.2％。
步骤4.将氯甲酸4-硝基苯酯(3.35g，1.15当量)置于双颈瓶中。在真空下持续1小时，将三通阀转向至氮气装置且用注射器添加60mL DCM。用10-15mL DCM溶解经称重的步骤3产物，用注射器将其注入至反应烧瓶中，且随后缓慢添加三乙胺(4.5mL，2.3当量)。在冰浴中进行反应约1小时且随后回到室温下隔夜。反应完成后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用EtOAc:Hex:MeOH＝1:2:0.2用管柱来纯化萃取物。产物为浅黄色液体。纯化后产率：48.6％。
步骤5.将经称重的步骤4产物(3.5g，1.0当量)溶解于120mL DCM中，且随后缓慢添加水合肼(6.5mL，10.0当量)。在室温下进行反应约24小时。溶液颜色自浅黄色变为橙色。反应完成后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用DCM:MeOH＝9.5:0.5用管柱来纯化萃取物。在此步骤中，产物黏在管柱中，且可增加MeOH至5％以溶离最终产物。产物(连接物IV-2)为淡黄色黏性固体。纯化后产率：30.0％。
1H(300MHz)δ1.30-1.34(2H,m),1.47-1.56(3H,m),1.60-1.67(1H,m),1.82-1.87(1H,m),2.23(2H,t),2.54-2.56(4H,m),2.63-2.2.66(4H,m),3.07-3.25(2H,m),3.33-3.39(3H,m),3.40-3.43(2H,m),3.46-3.50(5H,m),3.54-3.58(5H,m),4.03-4.05(2H,m),4.07-4.10(2H,m),4.13-4.15(2H,m)
13C(100MHz)δ24.5,24.6,27.5,33.7,34.7,38.1,41.0,55.7,55.8,59.6,59.7,59.8,65.7,65.8,65.9,71.5,71.7,171.7,171.9,172.0,177.1,177.2,177.3
实例15 制备连接物IV-C(O)O-
步骤1.将乙二醇(1.96g，1.05当量)及类脂酸(6.19g，1.0当量)溶解于80mL DCM中，且缓慢添加N,N'-二环己基碳化二亚胺(DCC)(8.04g，1.3当量)、4-(二甲胺基)吡啶(DMAP)(0.37g，0.1当量)及三乙胺(9.6mL，2.3当量)。在室温下进行反应至少5小时且反应后接着TLC。随后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用DCM:MeOH＝9.8:0.2用管柱来纯化萃取物。产物为浅黄色液体。产率：66.0％。
步骤2.将步骤1产物(4.98g，1.0当量)及丁二酸(2.48g，1.05当量)溶解于80mLDCM中，且缓慢添加N,N'-二环己基碳化二亚胺(DCC)(5.36g，1.3当量)、4-(二甲胺基)吡啶(DMAP)(0.24g，0.1当量)及三乙胺(6.4mL，2.3当量)。在室温下进行反应至少5小时且反应后接着TLC。随后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用DCM:MeOH＝9.5:0.5用管柱来纯化萃取物。产物为浅黄色液体。产率：81.2％。
步骤3.将步骤2产物(3.49g，1.0当量)及2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙醇(1.57g，1.05当量)溶解于80mL DCM中，且缓慢添加EDC·HCl(2.49g，1.3当量)、羟基丁二酰亚胺(NHS)(1.15g，1.0当量)及三乙胺(3.2mL，2.3当量)。在室温下进行反应至少5小时且反应后接着TLC。随后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用DCM:MeOH＝9.8:0.2用管柱来纯化萃取物。产物为浅黄色液体。产率：80.5％。
步骤4.将氯甲酸4-硝基苯酯(3.35g，1.15当量)置于双颈瓶中。在真空下持续1小时，将三通阀转向至氮气装置且用注射器添加60mL DCM。用10-15mL DCM溶解经称重的步骤3产物，用注射器将其注入至反应烧瓶中，且随后缓慢添加三乙胺(4.5mL，2.3当量)。在冰浴中进行反应约1小时且随后回到室温下隔夜。反应完成后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用EtOAc:Hex:MeOH＝1:2:0.2用管柱来纯化萃取物。产物为浅黄色液体。纯化后产率：50.3％。
步骤5.将经称重的步骤4产物(3.5g，1.0当量)溶解于120mL DCM中，且随后缓慢添加水合肼(6.5mL，10.0当量)。在室温下进行反应约24小时。溶液颜色自浅黄色变为橙色。反应完成后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用DCM:MeOH＝9.5:0.5用管柱来纯化萃取物。在此步骤中，产物黏在管柱中，且可增加MeOH至5％以溶离最终产物。产物为浅黄色黏性固体。纯化后产率：31.0％。
实例16 制备SH-C5-连接物-IV-酰胺
步骤1.将乙醇胺(1.92g，1.05当量)及6-乙酰基硫己酸(5.71g，1.0当量)溶解于80mL DCM中，且缓慢添加EDC·HCl(7.47g，1.3当量)、羟基丁二酰亚胺(NHS)(3.45g，1.0当量)及三乙胺(9.6mL，2.3当量)。在室温下进行反应至少5小时且反应后接着TLC。随后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用DCM:MeOH＝9.8:0.2用管柱来纯化萃取物。产物为浅黄色液体。产率：74.0％。
步骤2.将步骤1产物(4.98g，1.0当量)及丁二酸(2.48g，1.05当量)溶解于80mLDCM中，且缓慢添加N,N'-二环己基碳化二亚胺(DCC)(5.36g，1.3当量)、4-(二甲胺基)吡啶(DMAP)(0.24g，0.1当量)及三乙胺(6.4mL，2.3当量)。在室温下进行反应至少5小时且反应后接着TLC。随后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用DCM:MeOH＝9.5:0.5用管柱来纯化萃取物。产物为浅黄色液体。产率：80.2％。
步骤3.将步骤2产物(3.49g，1.0当量)及2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙醇(1.57g，1.05当量)溶解于80mL DCM中，且缓慢添加EDC·HCl(2.49g，1.3当量)、羟基丁二酰亚胺(NHS)(1.15g，1.0当量)及三乙胺(3.2mL，2.3当量)。在室温下进行反应至少5小时且反应后接着TLC。随后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用DCM:MeOH＝9.8:0.2用管柱来纯化萃取物。产物为浅黄色液体。产率：80.0％。
步骤4.将氯甲酸4-硝基苯酯(3.35g，1.15当量)置于双颈瓶中。在真空下持续1小时，将三通阀转向至氮气装置且用注射器添加60mL DCM。用10-15mL DCM溶解经称重的步骤3产物，用注射器将其注入至反应烧瓶中，且随后缓慢添加三乙胺(4.5mL，2.3当量)。在冰浴中进行反应约1小时且随后回到室温下隔夜。反应完成后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用EtOAc:Hex:MeOH＝1:2:0.2用管柱来纯化萃取物。产物为浅黄色液体。纯化后产率：51.1％。
步骤5.将经称重的步骤4产物(3.5g，1.0当量)溶解于120mL DCM中，且随后缓慢添加水合肼(6.5mL，10.0当量)。在室温下进行反应约24小时。溶液颜色自浅黄色变为橙色。反应完成后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用DCM:MeOH＝9.5:0.5用管柱来纯化萃取物。在此步骤中，产物黏在管柱中，且可增加MeOH至5％以溶离最终产物。产物为浅黄色黏性固体。纯化后产率：28.0％。
实例17 制备SH-C5-连接物-IV-C(O)O-
步骤1.将乙二醇(1.96g，1.05当量)及6-乙酰基硫己酸(5.71g，1.0当量)溶解于80mL DCM中，且缓慢添加N,N'-二环己基碳化二亚胺(DCC)(8.04g，1.3当量)、4-(二甲胺基)吡啶(DMAP)(0.37g，0.1当量)及三乙胺(9.6mL，2.3当量)。在室温下进行反应至少5小时且反应后接着TLC。随后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用DCM:MeOH＝9.8:0.2用管柱来纯化萃取物。产物为浅黄色液体。产率：71.5％。
步骤2.将步骤1产物(4.98g，1.0当量)及丁二酸(2.48g，1.05当量)溶解于80mLDCM中，且缓慢添加N,N'-二环己基碳化二亚胺(DCC)(5.36g，1.3当量)、4-(二甲胺基)吡啶(DMAP)(0.24g，0.1当量)及三乙胺(6.4mL，2.3当量)。在室温下进行反应至少5小时且反应后接着TLC。随后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用DCM:MeOH＝9.5:0.5用管柱来纯化萃取物。产物为浅黄色液体。产率：81.4％。
步骤3.将步骤2产物(3.49g，1.0当量)及2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙醇(1.57g，1.05当量)溶解于80mL DCM中，且缓慢添加EDC·HCl(2.49g，1.3当量)、羟基丁二酰亚胺(NHS)(1.15g，1.0当量)及三乙胺(3.2mL，2.3当量)。在室温下进行反应至少5小时且反应后接着TLC。随后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用DCM:MOH＝9.8:0.2用管柱来纯化萃取物。产物为浅黄色液体。产率：78.8％。
步骤4.将氯甲酸4-硝基苯酯(3.35g，1.15当量)置于双颈瓶中。在真空下持续1小时，将三通阀转向至氮气装置且用注射器添加60mL DCM。用10-15mL DCM溶解经称重的步骤3产物，用注射器将其注入至反应烧瓶中，且随后缓慢添加三乙胺(4.5mL，2.3当量)。在冰浴中进行反应约1小时且随后回到室温下隔夜。反应完成后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用EtOAc:Hex:MeOH＝1:2:0.2用管柱来纯化萃取物。产物为浅黄色液体。纯化后产率：51.1％。
步骤5.将经称重的步骤4产物(3.5g，1.0当量)溶解于120mL DCM中，且随后缓慢添加水合肼(6.5mL，10.0当量)。在室温下进行反应约24小时。溶液颜色自浅黄色变为橙色。反应完成后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用DCM:MeOH＝9.5:0.5用管柱来纯化萃取物。在此步骤中，产物黏在管柱中，且可增加MeOH至5％以溶离最终产物。产物为浅黄色黏性固体。纯化后产率：27.8％。
实例18 制备NH2-C1-连接物-IV-酰胺
步骤1.将乙醇胺(1.92g，1.05当量)及Boc-甘胺酸(5.26g，1.0当量)溶解于80mLDCM中，且缓慢添加EDC·HCl(7.47g，1.3当量)、羟基丁二酰亚胺(NHS)(3.45g，1.0当量)及三乙胺(9.6mL，2.3当量)。在室温下进行反应至少5小时且反应后接着TLC。随后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用DCM:MeOH＝9.8:0.2用管柱来纯化萃取物。产物为浅黄色液体。产率：62.0％。
步骤2.将步骤1产物(4.98g，1.0当量)及丁二酸(2.48g，1.05当量)溶解于80mLDCM中，且缓慢添加N,N'-二环己基碳化二亚胺(DCC)(5.36g，1.3当量)、4-(二甲胺基)吡啶(DMAP)(0.24g，0.1当量)及三乙胺(6.4mL，2.3当量)。在室温下进行反应至少5小时且反应后接着TLC。随后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用DCM:MeOH＝9.5:0.5用管柱来纯化萃取物。产物为浅黄色液体。产率：80.4％。
步骤3.将步骤2产物(3.49g，1.0当量)及2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙醇(1.57g，1.05当量)溶解于80mL DCM中，且缓慢添加EDC·HCl(2.49g，1.3当量)、羟基丁二酰亚胺(NHS)(1.15g，1.0当量)及三乙胺(3.2mL，2.3当量)。在室温下进行反应至少5小时且反应后接着TLC。随后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用DCM:MeOH＝9.8:0.2用管柱来纯化萃取物。产物为浅黄色液体。产率：71.0％。
步骤4.将氯甲酸4-硝基苯酯(3.35g，1.15当量)置于双颈瓶中。在真空下持续1小时，将三通阀转向至氮气装置且用注射器添加60mL DCM。用10-15mL DCM溶解经称重的步骤3产物，用注射器将其注入至反应烧瓶中，且随后缓慢添加三乙胺(4.5mL，2.3当量)。在冰浴中进行反应约1小时且随后回到室温下隔夜。反应完成后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用EtOAc:Hex:MeOH＝1:2:0.2用管柱来纯化萃取物。产物为浅黄色液体。纯化后产率：51.9％。
步骤5.将经称重的步骤4产物(3.5g，1.0当量)溶解于120mL DCM中，且随后缓慢添加水合肼(6.5mL，10.0当量)。在室温下进行反应约24小时。溶液颜色自浅黄色变为橙色。反应完成后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用DCM:MeOH＝9.5:0.5用管柱来纯化萃取物。在此步骤中，产物黏在管柱中，且可增加MeOH至5％以溶离最终产物。产物为浅黄色黏性固体。纯化后产率：29.0％。
实例19 制备NH2-C1-连接物-IV-C(O)O-
步骤1.将乙二醇(1.96g，1.05当量)及Boc-甘胺酸(5.26g，1.0当量)溶解于80mLDCM中，且缓慢添加N,N'-二环己基碳化二亚胺(DCC)(8.04g，1.3当量)、4-(二甲胺基)吡啶(DMAP)(0.37g，0.1当量)及三乙胺(9.6mL，2.3当量)。在室温下进行反应至少5小时且反应后接着TLC。随后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用DCM:MeOH＝9.8:0.2用管柱来纯化萃取物。产物为浅黄色液体。产率：75.0％。
步骤2.将步骤1产物(4.98g，1.0当量)及丁二酸(2.48g，1.05当量)溶解于80mLDCM中，且缓慢添加N,N'-二环己基碳化二亚胺(DCC)(5.36g，1.3当量)、4-(二甲胺基)吡啶(DMAP)(0.24g，0.1当量)及三乙胺(6.4mL，2.3当量)。在室温下进行反应至少5小时且反应后接着TLC。随后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用DCM:MeOH＝9.5:0.5用管柱来纯化萃取物。产物为浅黄色液体。产率：80.5％。
步骤3.将步骤2产物(3.49g，1.0当量)及2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙醇(1.57g，1.05当量)溶解于80mL DCM中，且缓慢添加EDC·HCl(2.49g，1.3当量)、羟基丁二酰亚胺(NHS)(1.15g，1.0当量)及三乙胺(3.2mL，2.3当量)。在室温下进行反应至少5小时且反应后接着TLC。随后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用DCM:MeOH＝9.8:0.2用管柱来纯化萃取物。产物为浅黄色液体。产率：81.0％。
步骤4.将氯甲酸4-硝基苯酯(3.35g，1.15当量)置于双颈瓶中。在真空下持续1小时，将三通阀转向至氮气装置且用注射器添加60mL DCM。用10-15mL DCM溶解经称重的步骤3产物，用注射器将其注入至反应烧瓶中，且随后缓慢添加三乙胺(4.5mL，2.3当量)。在冰浴中进行反应约1小时且随后回到室温下隔夜。反应完成后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用EtOAc:Hex:MeOH＝1:2:0.2用管柱来纯化萃取物。产物为浅黄色液体。纯化后产率：50.6％。
步骤5.将经称重的步骤4产物(3.5g，1.0当量)溶解于120mL DCM中，且随后缓慢添加水合肼(6.5mL，10.0当量)。在室温下进行反应约24小时。溶液颜色自浅黄色变为橙色。反应完成后，通过添加ddH2O来淬灭混合物，且用DCM萃取2-3次。收集有机层，用无水硫酸镁干燥，用MgSO4过滤且随后移除DCM。通过使用DCM:MeOH＝9.5:0.5用管柱来纯化萃取物。在此步骤中，产物黏在管柱中，且可增加MeOH至5％以溶离最终产物。产物为浅黄色黏性固体。纯化后产率：31.2％。
实例20 本发明连接物的细胞毒性分析
吾等检测9个连接物的细胞毒性，且计算各连接物的IC50值。选择人类乳腺癌MCF7、MDA-MB-453及MDA-MB-231以及人类乳腺上皮细胞H184B5F5/M10用于细胞毒性测试。在6孔培养盘及经处理的连接物I-1(连接物I-酰胺，m＝2)、连接物I-2(连接物I-酰胺，m＝1)、连接物I-3(连接物I-酰胺，m＝3)、连接物I-4(连接物I-酰胺，m＝4)、连接物I-5(连接物I-酰胺，m＝5)、连接物II-1(连接物II-酰胺，z＝1)、连接物II-2(连接物II-酰胺，z＝2)、连接物II-3(连接物II-酰胺，z＝3)及连接物II-4(连接物II-酰胺，z＝4)中接种细胞，且进一步在37℃下培育72小时。在照完相片之后，通过使用血球计计数细胞。生长抑制与未经处理的对照物进行比较以找到抑制50％生长的连接物浓度(IC50)。IC50的概述展示于表1中。IC50值在连接物I-1至连接物I-5及连接物II-1中为300至700μM。连接物II-2至II-4的IC50值大于800μM。此等资料表明细胞毒性低至结合药物的连接物及药物递送的金纳米粒子。
表1 人类乳腺癌MCF7、MDA-MB-453及MDA-MB-231以及人类乳腺上皮细胞H184B5F5/M10中持续72小时时连接物细胞毒性的IC50值概述。
实例21 制备金纳米粒子、连接物及抗癌药物及/或抗体的错合物
1.Au/LKI-1/mAb-p24错合物
制备Au/LKI-1/mAb-p24错合物
为将抗体结合至金纳米粒子上，使用10kDa MWCO离心过滤器(Millipore，UFC501024)浓缩抗HIV-1 p24(HIV-1p24)(GeneTex，GTX41595)抗体，且以1mg/mL溶解于100mM Na2HPO4、pH 7.4缓冲剂中。随后，将5μL含有100mM NaIO4的水溶液添加至50μL抗体溶液中，且在暗处培育混合物30分钟。通过添加250μL 1×PBS来淬灭反应。此时，氧化抗体的Fc部分上的碳水化合物部分以使其具有醛基。随后，添加连接物I-1(连接物I-酰胺，m＝2)至抗体溶液中。连接物在分子相对位置上具有酰肼及二硫醇基。酰肼部分与经改质抗体分子的Fc部分的醛基相互作用。在室温下培育反应混合物2小时，且随后使用离心过滤器收集硫醇化抗体，且在0.1M磷酸钠缓冲剂(pH 7.4)中对其进行再悬浮。将一百微升0.1mg/ml浓度的硫醇化抗体与0.5mL金纳米粒子混合，且在室温下培育悬浮液1小时。将抗体-金纳米粒子错合物保持在4℃来储存以供进一步使用。
Au/LKI-1/mAb-p24错合物的表征
用UV-Vis分光光度计(Beckman，DU 800)分析Au/LKI-1/mAb-p24错合物的调配物。所记录表面电浆子共振谱展示抗体结合的金纳米粒子的电浆子峰(λmax)中的2nm红移(图1A)。使用倒置显微镜(Nikon，TE2000-U)量测Alex Fluor 568二级抗体标记的Au/LKI-1/mAb-p24错合物的红色萤光影像。各金纳米粒子展示红色萤光，其表明各金纳米粒子在表面上与抗HIV-1 P24抗体结合(图1B)。另外，吾等研究抗HIV-1 P24抗体在金纳米粒子上的结合亲和力。自ELISA，吾等可确认Au/LKI-1/mAb-p24错合物对抗HIV-1 P24蛋白质的结合亲和力(图1C)。
2.Au/LKI-1或LK I-5/Ab-EGFR错合物
制备Au/LKI-1或LK I-5/Ab-EGFR错合物
为将抗体结合至金纳米粒子上，使用10kDa MWCO离心过滤器(Millipore，UFC501024)浓缩抗人类EGFR纯系H11(Thermo，MA1-12693)，且以1mg/mL溶解于100mMNa2HPO4、pH 7.4缓冲剂中。随后，将5μL含有100mM NaIO4的水溶液添加至50μL抗体溶液中，且在暗处培育混合物30分钟。通过添加250μL 1×PBS来淬灭反应。此时，氧化抗体的Fc部分上的碳水化合物部分以使其具有醛基。随后，添加连接物I-1(连接物I-酰胺，m＝2)或连接物I-5(连接物I-酰胺，m＝5)至抗体溶液中。连接物在分子相对位置上具有酰肼及二硫醇基。酰肼部分与经改质抗体分子的Fc部分的醛基相互作用。在室温下培育反应混合物2小时，且随后使用离心过滤器收集硫醇化抗体，且在0.1M磷酸钠缓冲剂(pH 7.4)中对其进行再悬浮。将一百微升0.1mg/ml浓度的硫醇化抗体与0.5mL金纳米粒子混合，且在室温下培育悬浮液1小时。将抗体-金纳米粒子错合物保持在4℃来储存以供进一步使用。
Au/LKI-1或LK I-5/Ab-EGFR错合物的表征
用UV-Vis分光光度计(Beckman，DU 800)分析Au/LKI-1/Ab-EGFR错合物或Au/LKI-5/Ab-EGFR错合物的调配物。所记录表面电浆子共振谱展示抗体结合的金纳米粒子的电浆子峰(λmax)中的2nm红移(图2)。吾等检测两个连接物连接物I-1(连接物I-酰胺(m＝2))及连接物I-5(连接物I-酰胺(m＝5))以检测EGFR抗体及金纳米粒子结合。Au/LKI-1/Ab-EGFR错合物及Au/LKI-5/Ab-EGFR错合物的流式细胞测量术分析显示人类乳腺癌MCF-7细胞上的靶向亲和力。与EGFR抗体相比，Au/LKI-1/Ab-EGFR错合物及Au/LKI-5/Ab-EGFR错合物均展示类似靶向能力(表2)。此等资料表明连接物适用于抗体及金纳米粒子结合，且保持对抗体的结合亲和力。
表2 Ab-EGFR、Au/LKI-1/Ab-EGFR错合物及Au/LKI-5/Ab-EGFR错合物在MCF-7乳房肿瘤细胞表面的EFGR上的靶向作用的流动式细胞量测分析。
3.Au/LKI-1/曲妥珠单抗(Tras)错合物
制备Au/LKI-1/Tras错合物
为将抗体结合至金纳米粒子上，使用10kDa MWCO离心过滤器(Millipore，UFC501024)浓缩Tras(JHL biotech，JHL1188)抗体，且以1mg/mL溶解于100mM Na2HPO4、pH7.4缓冲剂中。随后，将5μL含有100mM NaIO4的水溶液添加至50μL抗体溶液中，且在暗处培育混合物30分钟。通过添加250μL1×PBS来淬灭反应。此时，氧化抗体的Fc部分上的碳水化合物部分以使其具有醛基。随后，添加连接物I-1(连接物I-酰胺(m＝2))至抗体溶液中。连接物在分子相对位置上具有酰肼及二硫醇基。酰肼部分与经改质抗体分子的Fc部分的醛基相互作用。在室温下培育反应混合物2小时，且随后使用离心过滤器收集硫醇化抗体，且在0.1M磷酸钠缓冲剂(pH 7.4)中对其进行再悬浮。将一百微升0.1mg/ml浓度的硫醇化抗体与0.5mL金纳米粒子混合，且在室温下培育悬浮液1小时。将Au/LKI-1/Tras错合物保持在4℃来储存以供进一步使用。
Au/LKI-1/Tras错合物的表征
用UV-Vis分光光度计(Beckman，DU 800)分析Au/LKI-1/Tras错合物的调配物。所记录表面电浆子共振谱展示抗体结合的金纳米粒子的电浆子峰(λmax)中的8nm红移(图3)。吾等检测Au/LKI-1/Tras错合物。Au/LKI-1/Tras错合物的流式细胞测量术分析显示在人类乳腺癌细胞上的靶向亲和力。与曲妥珠单抗相比，Au/LKI-1/Tras错合物展示类似的靶向能力(表3)。
表3.Tras及Au/LKI-1/Tras错合物在MDA-MB-453乳房肿瘤细胞表面的Her2/neu上的靶向作用的流动式细胞量测分析。
4.Au/LKI-1/依那西普(ETA)错合物
制备Au/LKI-1/ETA错合物
为将抗体结合至金纳米粒子上，使用10kDa MWCO离心过滤器(Millipore，UFC501024)浓缩依那西普(ETA)(Mycenax biotech，TuNEX)，且以1mg/mL溶解于100mMNa2HPO4、pH 7.4缓冲剂中。随后，将5μL含有100mMNaIO4的水溶液添加至50μL抗体溶液中，且在暗处培育混合物30分钟。通过添加250μL 1×PBS来淬灭反应。此时，氧化抗体的Fc部分上的碳水化合物部分以使其具有醛基。随后，添加连接物I-1至抗体溶液中。连接物在分子相对位置上具有酰肼及二硫醇基。酰肼部分与经改质抗体分子的Fc部分的醛基相互作用。在室温下培育反应混合物2小时，且随后使用离心过滤器收集硫醇化抗体，且在0.1M磷酸钠缓冲剂(pH 7.4)中对其进行再悬浮。将一百微升0.1mg/ml浓度的硫醇化抗体与0.5mL金纳米粒子混合，且在室温下培育悬浮液1小时。将Au/LKI-1/ETA错合物保持在4℃来储存以供进一步使用。
Au/LKI-1/ETA错合物的表征
用UV-Vis分光光度计(Beckman，DU 800)分析Au/LKI-1/ETA错合物的调配物。所记录表面电浆子共振谱展示Au/LKI-1/ETA的电浆子峰(λmax)中的2nm红移(图4A)。使用倒置显微镜(Nikon，TE2000-U)量测Alex Fluor 568二级抗体标记的Au/LKI-1/ETA错合物的红色萤光影像。各金纳米粒子展示红色萤光，其表明各金纳米粒子在表面上与ETA抗体结合(图4B)。吾等通过与结合有1-5nmAuNP的二级抗体结合来进一步检测Au/LKI-1/ETA错合物。观测到Au/LKI-1/ETA错合物的TEM影像、1-5nm金标记的二级抗人类IgG抗体结合至定位于AuNP表面上的ETA(图4C)。吾等进一步研究ETA及Au/LKI-1/ETA的TNFα阻断能力。分别用12.5ng/mL TNFα及62.5、125、250、500ng/mL ETA或Au/LKI-1/ETA错合物的混合物处理MCF-7细胞(5x105)2小时。经处理细胞在37℃下培育72小时，且随后通过MTS[(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羟基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑鎓)]分析来计数细胞数目。TNFα阻断能力在仅ETA及Au/LKI-1/ETA错合物中均观测到。ETA及Au/LKI-1/ETA错合物用于测试其阻断TNFα诱导的MCF-7细胞凋亡的能力，表4。与ETA相比，Au/LKI-1/ETA错合物展示类似的阻断TNFα能力
表4.Au/LKI-1/ETA错合物阻断TNFα诱导的MCF-7细胞凋亡的能力
5.Au/LKI-1/多柔比星(Dox)错合物
制备Au/LKI-1/Dox错合物
添加1当量多柔比星及2当量连接物I-1(连接物I-酰胺(m＝2))至干燥MeOH中，且在室温下混合。添加TFA(1.3当量)至所得混合物中以进行反应隔夜。过滤所得混合物，获得澄清溶液。通过滴管添加澄清溶液至具有50mL EtOAc的烧瓶中，搅拌20分钟，且过滤，获得Dox-连接物-1固体。所得固体用EtOAc洗涤，且随后干燥。添加400μL Dox/LKI-1(2000ppm)及2μL NaOH至1mLAuNPs(50ppm)中，且随后混合21小时。混合物以1400rpm离心20分钟。所得沈淀物通过DI水洗涤，且所得沈淀物再悬浮于DI水中。添加PEG(2K，2000Da)至悬浮液中，且混合隔夜，获得Au/LKI-1/Dox错合物。
Au/LKI-1/Dox错合物的表征
用UV-Vis分光光度计(Beckman,DU 800)分析Au/LKI-1/DOX错合物。所记录表面电浆子共振谱展示Au/LKI-1/Dox错合物的电浆子峰(λmax)中的3nm红移(图5)。
其他连接物I-2、I-3、I-4、I-5、II-1、II-2、II-3、II-4、IV-2、SHI-1及SHI-4用于结合DOX及金纳米粒子以获得根据上文所提及的方法的各种错合物。
实例22 Au/连接物(LK)/Dox错合物的细胞毒性分析
吾等检测Au/LK/Dox错合物的细胞毒性，且计算IC50值。选择人类乳腺癌MCF7、MDA-MB-453及MDA-MB-231以及人类乳腺上皮细胞H184B5F5/M10用于细胞毒性测试。在96孔培养盘及经处理的2μM多柔比星(Dox)、20-50nm与多柔比星结合的金纳米粒子中使用如下表中展示的各种连接物接种细胞，且用SH-PEG(Au/LK/Dox，含有2μM多柔比星)覆盖，且进一步在37℃下培育72小时。CellTiter单溶液细胞增殖分析(AQueous One Solution CellProliferation Assay)(MTS)试剂购自Promega(Madison，WI，USA)，且分析根据制造商的说明书进行。使用微定量盘式读取器(Bio-tek，Powerwave X340，Winooski，VT，USA)在490nm下量测吸光度。生长抑制与未经处理的对照物相比以找到抑制50％生长的Au/LK/Dox错合物浓度(IC50)。
表5 人类乳腺癌MCF7、MDA-MB-453及MDA-MB-231以及人类乳腺上皮细胞H184B5F5/M10中持续72小时Au/LK/Dox错合物细胞毒性的IC50值概述。
IC50值在Au/LK/Dox错合物(LKI-1、LKI-2、LKII-1、LKII-3及LKIV-2)中针对癌细胞(MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-453)为0.46～1.93μM，其类似于Dox。对于正常细胞M10，错合物的细胞毒性低于Dox。资料表明Au/LK/Dox错合物比Dox更加安全。
实例23 Au/LKI-1/Dox错合物的pH-敏感性LKI-1释放测试
以14000rpm离心1mL Au/LKI-1/Dox错合物溶液20分钟。丢掉上澄液，且添加pH5.5缓冲剂或pH 7.4缓冲剂至其中。在不同时间点之后，以14000rpm离心错合物溶液20分钟，且随后将上澄液在557.6nm(F-4500FL分光光度计)下进行萤光扫描，获得OD值。通过自Dox标准曲线内插可获得自错合物释放的Dox量(X小时Dox释放量)。
以14000rpm离心1mL Au/LKI-1/Dox错合物溶液20分钟。丢掉上澄液，且添加pH1.0缓冲剂至其中。在一小时之后，以14000rpm离心错合物溶液20分钟，且随后将上澄液在557.6nm(F-4500FL分光光度计)下进行萤光扫描，获得OD值。通过自Dox标准曲线(pH＝1培育1小时Dox释放量)内插可获得Dox 100％释放。根据下式计算Dox累积释放百分比。
●Dox累积释放％＝(X小时Dox释放量/pH＝1培育1小时Dox释放量)*100％
表6 Au/LKI-1/Dox错合物的pH-敏感性LKI-1释放测试
资料展示LKI-1在pH 5.5下比在pH 7.4下释放更多Dox。在Au/LKI-1/Dox中，Dox随时间变化释放越来越多。
实例24 功效研究设计
BALB/c-nu/nu小鼠购自BioLASCO Taiwan。八周龄雄性小鼠通过皮下注射单侧注射含有1.0×107个MDA-MB-231乳房肿瘤细胞的200μL 50:50 Matrigel/Leibovitz's(L-15)至背部。(1)媒剂-PBS(阴性对照)，(2)多柔比星(阳性对照)，5mg/kg，(3)Au/PEG，(4)Au/LKI-1/Dox错合物，5mg/kg Dox。处理持续进行直至临床症状需要处死为止。小鼠每周最少称量两次，且监测肿瘤尺寸直至临床症状需要处死为止(参看图6A、图6B)。在异种移植模型中用Au/LKI-1/Dox错合物处理的MDA-MB-231乳房肿瘤细胞的TEM影像。图中的箭头展示Au/LKI-1/Dox错合物存在于MDA-MB-231乳房肿瘤细胞内部。(参看图6C)在异种移植模型中用Au/LKI-1/Dox错合物处理的MDA-MB-231肿瘤细胞的H&E染色。(参看图6D)。

Claims (34)

1.一种pH-敏感性连接物，其具有下式(I)，
其中
X为-SH、-NH2(Boc-NH-；Fmoc-NH-)、-COOH；
n为1至6；
P为-C(O)NH-或-C(O)O-；
Q为-R(CH2CH2O)m-、R(-C(O)NH-)z或-R[-C(O)CH2CH2-C(O)NH-(CH2CH2O)m]Y；
R为键、-C1-12烷基或C1-10烷氧基；
m为1至12；
z为1至4；且
Y为1至12。
2.如权利要求1的pH-敏感性连接物，其具有下式：
(连接物I-酰胺)，
其中m为1至12。
3.如权利要求1的pH-敏感性连接物，其具有下式：
(连接物I-C(O)O；连接物III)，
其中m为1至12。
4.如权利要求1的pH-敏感性连接物，其具有下式：
(SH-C2-连接物-I)，
其中m为1至12。
5.如权利要求1的pH-敏感性连接物，其具有下式：
(SH-C5-连接物-I-酰胺)，
其中m为1至12。
6.如权利要求1的pH-敏感性连接物，其具有下式：
(SH-C5-连接物-I-C(O)O-；HS-C5-连接物-III)，
其中m为1至12。
7.如权利要求1的pH-敏感性连接物，其具有下式：
(ppNH-C1-连接物-I-酰胺)，
其中pp为保护基(诸如Boc或Fmoc)；且m为1至12。
8.如权利要求1的pH-敏感性连接物，其具有下式：
(ppNH-C1-连接物-I-C(O)O-；NH2-C1-连接物-III-C(O)O-)，
其中pp为保护基(诸如Boc或Fmoc)；且m为1至12。
9.如权利要求1的pH-敏感性连接物，其具有下式：
(连接物II-酰胺)，
其中z为1至4。
10.如权利要求1的pH-敏感性连接物，其具有下式：
(连接物II-C(O)O-)，
其中z为1至4。
11.如权利要求1的pH-敏感性连接物，其具有下式：
(SH-C5-连接物-II-酰胺)，
其中z为1至4。
12.如权利要求1的pH-敏感性连接物，其具有下式：
(SH-C5-连接物-II-C(O)O-)，
其中z为1至4。
13.如权利要求1的pH-敏感性连接物，其具有下式：
(ppNH-C1-连接物-II-酰胺)，
其中pp为保护基(诸如Boc或Fmoc)；且
z为1至4。
14.如权利要求1的pH-敏感性连接物，其具有下式：
(ppNH-C1-连接物-II-C(O)O-)，
其中pp为保护基(诸如Boc或Fmoc)；且
z为1至4。
15.如权利要求1的pH-敏感性连接物，其具有下式：
(连接物IV-酰胺)，
其中Y为1至12。
16.如权利要求1的pH-敏感性连接物，其具有下式：
(连接物IV-C(O)O-)，
其中Y为1至12。
17.如权利要求1的pH-敏感性连接物，其具有下式：
(SH-C5-连接物-IV-酰胺)，
其中Y为1至12。
18.如权利要求1的pH-敏感性连接物，其具有下式：
(SH-C5-连接物-IV-C(O)O-)，
其中Y为1至12。
19.如权利要求1的pH-敏感性连接物，其具有下式：
(ppNH-C1-连接物-IV-酰胺)，
其中pp为保护基(诸如Boc或Fmoc)；且Y为1至12。
20.如权利要求1的pH-敏感性连接物，其具有下式：
(ppNH-C1-连接物-IV-C(O)O-)，
其中pp为保护基(诸如Boc或Fmoc)；且Y为1至12。
21.一种金属纳米粒子错合物，其包含与一或多种如权利要求1至20中任一项的连接物错合、视情况与一或多种PEG错合的金属纳米粒子。
22.如权利要求21的金属纳米粒子错合物，其中所述金属纳米粒子为Au纳米粒子、Pd纳米粒子、Pt纳米粒子或Ag纳米粒子。
23.如权利要求21的金属纳米粒子错合物，其中所述多种连接物为相同或不同的。
24.如权利要求21的金属纳米粒子错合物，其中所述金属纳米粒子错合物包含多数个具有不同分子长度的连接物。
25.如权利要求21的金属纳米粒子错合物，其中用于本发明的PEG的分子量范围介于约2000至20,000Da。
26.如权利要求21的金属纳米粒子错合物，其中所述金属纳米粒子的尺寸小于约80nm。
27.如权利要求21的金属纳米粒子错合物，其中所述金属纳米粒子错合物进一步连接一或多种相同或不同治疗或诊断药物。
28.如权利要求27的金属纳米粒子错合物，其中所述治疗药物为抗肿瘤药物或抗体；优选地，所述抗体为靶向诸如肿瘤细胞的特异性细胞的抗体或抗肿瘤抗体。
29.如权利要求28的金属纳米粒子错合物，其中所述抗肿瘤药物为抗癌药物。
30.如权利要求29的金属纳米粒子错合物，其中所述抗癌药物为烷化剂、磺酸烷酯、氮丙啶、嘌呤类似物、嘧啶类似物、喜树碱(camptothecin)或多柔比星(doxorubicin)、顺铂(cisplatin)。
31.如权利要求29的金属纳米粒子错合物，其中所述抗癌药物的量占所述金属纳米粒子错合物的约1％至约50％(重量/重量)。
32.一种医药组合物，其包含连接一或多种相同或不同治疗或诊断药物的一或多种金属纳米粒子错合物及医药学上可接受的载剂。
33.一种向个体递送治疗或诊断药物的方法，其包含向所述个体投与如权利要求27的金属纳米粒子错合物。
34.一种药物递送系统，其包含连接一或多种相同或不同治疗或诊断药物的一或多种如权利要求1至20中任一项的金属纳米粒子错合物。
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