KR102178912B1 - 치료적 단일클론항체 정주에 따른 아나필락시스의 시험관내 예측을 위한 정보제공방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 치료적 단일클론항체 정주에 따른 아나필락시스의 시험관내 예측을 위한 정보제공방법에 관한 것으로, 혈액암을 비롯한 기타 악성종양, 류마티스질환, 및 장기이식 등에서 치료적 단일클론항체 정맥투여시 발생할 수 있는 아나필락시스 부작용 발생 위험을 시험관 내 예측하기 위하여, 피험체로부터 채취한 혈액내에 시험관내에서 해당 단일클론항체를 첨가한 후 피험체 자신의 호중구의 산화물형성능을 측정함으로써, 아나필락시스 부작용의 발생 위험을 간단하고 신속하게 예측할 수 있다.

Description

치료적 단일클론항체 정주에 따른 아나필락시스의 시험관내 예측을 위한 정보제공방법{Method of Providing Information for In Vitro Prediction of Anaphylaxis Post Therapeutic Monoclonal Antibody Infusion}

본 발명은 치료적 단일클론항체 정주(靜注)에 따른 아나필락시스의 시험관내 예측을 위한 정보제공방법에 관한 것이다.

최근 혈액암을 비롯한 기타 악성종양, 류마티스질환이나 장기이식 등에서 단일클론항체(monoclonal antibody, mAb)를 사용한 면역치료의 효과가 입증되었고, 표적치료제로서 개발된 각종 단일클론항체 제제들이 표준치료법으로 확립되고 있다. 단일클론항체는 하이브리도마(hybridoma) 기법으로 시험관내(in vitro)에서 생산된 생물학적 제제인데, 그 본체가 단백질이므로 투여 받은 환자에게 이에 대한 항체(anti-mAb antibody) 생성을 유발한다. 따라서, 정맥으로 주입(정주(靜注), intravenous infusion)시 일부 환자에서 생명을 위협하는 중증 급성 이상반응(acute infusion reaction), 즉, 아나필락시스(anaphylaxis)가 발생할 수 있다. 단일클론항체 정주 후 발생할 수 있는 이와 같은 아나필락시스는 IgE-매개 또는 IgG-매개성 아나필락시스, 사이토카인 방출 증후군(cytokine release syndrome, Lee et al., 2014), 1차 주입물 반응(first infusion reaction) 또는 2차 주입물 반응(second infusion reaction)(Weber et al., 2018) 등으로 분류 및 명명되고 있다.

그 중에서, IgG-매개 아나필락시스는 IgE와는 독립적인 메커니즘으로 작동하며, IgG 항체 또는 보체 단백질에 의해 매개되는데, IgE-매개 아나필락시스와 임상적으로 구별이 불가능하여 문제된다. IgG 의존성 경로는 비만세포(mast cell) 및 IgE가 아닌 대식세포(macrophage)와 IgG가 주요 면역성분으로 작용하며, 히스타민보다는 혈소판 활성 인자(platelet-activating factor: PAF)가 주요 매개체(mediator)로 작용한다. 구체적으로, 인간 IgG 수용체는 대식세포와 호중구에 의한 PAF 분비를 활성화시킬 수 있고, PAF는 비만세포를 활성화시킬 수 있으므로, PAF는 아나필락시스를 유도할 수 있다. 또한, 다량의 알레르겐(allergen)은 Fcγ 수용체(FcγR)를 통해 대식세포 및 호염구(basophil)를 활성화시키는 복합체를 형성하여 IgG-매개 아나필락시스를 유도할 수 있다. 즉, 이와 같은 IgG-매개 아나필락시스는 정주한 단일클론항체 자체 혹은 단일클론항체에 대한 환자 항체와의 면역복합체가 혈중의 백혈구를 자극하여 발생하는 면역학적 이상반응(hypersensitivity)이다.

현재 아나필락시스 예측을 위한 검사중 하나는 피험체의 혈중 sIgE (specific IgE)를 정량하는 것이다. 이미 아나필락시스가 일어난 환자에서 진단을 위하여 비만세포(mast cell)에서 방출된 트립타아제(tryptase)나 히스타민(histamine)과 같은 매개체의 혈중 농도를 측정하는 방법이 사용되고 있다. 다만, 체내 혈중에서 사이토카인은 반감기가 매우 짧으므로, 체내 혈중 사이토카인 농도를 측정하여 진단하는 방법은 정확도가 낮다는 단점이 있다. 한편, 채취한 피험자 혈액에 시험관내에서(in vitro) 알레르겐(allgergen)을 첨가한 후 면역세포의 활성화를 측정하는 검사로 basophil activation testing(BAT)가 있다.

다만, 이와 같은 검사들은 sIgE 또는 호염구를 대상으로 하며, IgG-매개 아나필락시스나 사이토카인 방출 증후군을 예측 혹은 진단하기 위하여 임상에서 실제로 수행되고 있는 검사는 없다. 현재까지 보고된 사이토카인 방출 증후군을 예측하기 위한 유일한 검사법은, 채취한 환자의 혈액으로부터 림프구를 분리하여 단일클론항체와 하루 동안 반응시킨 후 상층으로 분비된 사이토카인을 측정하는 방법이나(Findlay et al., 2010), 검사방법상 기술적 어려움으로 실제 사용되고 있지는 않은 실정이다.

이에, 본 발명자는 호중구의 산화물형성능(oxidative burst capacity)을 단일 대리표지자로 활용하여, 아나필락시스를 예측할 수 있는 방법에 대한 연구를 수행하여 본 발명을 완성하였다.

대한민국 특허등록 제10-1804291호

단일클론항체 정주에 따른 아나필락시스 부작용을 예측 및 진단하기 위하여 현재 알려진 검사법들은 검사시간이 길며 방법이 복잡하고 고가의 비용이 들어 실제 임상에서 사용되고 있지 않다.

본 발명의 하나의 목적은 피험체로 부터 채취한 혈액을 시험관내에서 후보물질, 예를 들어, 단일클론항체과 접촉시킨 후, 혈액내 다양한 면역세포들의 활성화와 그 면역세포가 분비한 다양한 매개체들의 증가에 대한 통합적 대리표지자로써 호중구 산화물형성능을 측정하여 아나필락시스 위험을 간편하고 신속하게 예측할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양상은 피험체로부터 채취된 혈액에 후보물질을 시험관 내에서 접촉시키는 단계; 혈액 내 호중구의 세포내에 형성된 산화물을 1차 정량하는 단계; 상기 1차 정량에 의해 측정된 제1 정량값을 정상대조군의 정량값과 제1 비교하는 단계; 후보물질과 접촉된 혈액에 호중구의 자극제(stimulator)를 접촉시키는 단계; 상기 자극제가 접촉된 혈액 내 호중구의 세포내에 형성된 산화물을 2차 정량하는 단계; 상기 2차 정량에 의해 측정된 제2 정량값을 정상대조군의 정량값과 제2 비교하는 단계; 및 상기 제1 비교 및 상기 제2 비교 중 하나 이상의 비교 결과, 혈액 내 호중구의 세포내에 형성된 산화물이 정상대조군에 비하여 증가한 경우, 상기 후보물질의 정주에 의해 상기 피험체에 아나필락시스(anaphylaxis)가 발생할 위험이 높은 것으로 판단하는 단계;를 포함하는 아나필락시스 위험 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "아나필락시스"는 단일클론항체의 정맥 주입(정주)시, 항원-항체 반응을 비롯한 면역 반응이 원인이 되어 발생하는 급격한 전신 반응을 말한다.

본 발명은 단일클론항체 정주에 따른 아나필락시스 발행 위험 예측을 위한 정보제공방법에 관한 것이다. 구체적으로, 호염구 등의 면역세포의 활성화 상태나 림프구, 단구 및/또는 호염구(basophil) 등이 분비한 매개체(histamine, 사이토카인 등)를 직접 측정하는 대신, 그 사이토카인에 의하여 프라이밍된 피험체 자신의 호중구의 반응을 측정한다. 즉, 단일클론항체 제제가 시험관내에서 일으킬 수 있는 다양한 이상 면역반응을 반영하는 통합적인 단일 대리표지자(a single comprehensive surrogate biomarker)로서 호중구의 산화물형성능(oxidative burst capacity)을 측정한다(도 1). 호중구의 산화물형성능 증가는 피험체의 혈중 단일클론항체에 대한 specific IgG (sIgG)가 FcγR를 거쳐 직접적으로 피험체 호중구를 활성화(activation) 시키거나, 다른 면역세포가 분비한 사이토카인들이 피험체 호중구를 프라이밍 하는 경우 일어난다. 이와 같은 두 기전으로 호중구 세포내에서 증가한 산화물의 측정값에 기반하여, 후보물질에 의한 아나필락시스 부작용 발생 여부를 예측 또는 진단할 수 있는 정보를 제공할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "프라이밍"은 호중구가 사이토카인의 유도에 의해 호중구 자극제에 대하여 크게 반응하도록 준비하는 과정을 말한다.

본 발명의 첫 번째 단계는 피험체로부터 채취된 혈액에 후보물질을 시험관 내에서 접촉시키는 단계이다.

본 발명에서 사용되는 용어, "접촉"은 이의 일반적인 의미이며, 하나 이상의 물질 및/또는 세포가 다른 물질 및/또는 세포에 영향을 줄 수 있을 정도로 가까운 거리에 위치하는 것을 의미한다. 구체적으로, 접촉은 세포간 접촉일 수 있으며, 시험관 내(in vitro)에서 유도될 수 있다.

본 발명에서는 단일클론항체에 대한 sIgG에 의하여 호중구의 새포내 산화물 형성이 유도될 수 있고, 이는 IgE 및 호염구와 상관없이 독립적으로 이루어진다는 것이 확인되었다. 또한, 호중구의 새포내 형성된 산화물은 알레르겐이 첨가된 백혈구 현탁액에서 쉽게 측정될 수 있는 것으로 확인되었으므로, 본 발명의 정보제공방법은 특히, 후보물질의 IgG-매개 아나필락시스 부작용 발생 여부의 신속하고 정확한 진단에 효과적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 정보제공방법에 사용될 수 있는 후보물질은 질병 예방 또는 치료용 정주용 제제 중, 아나필락시스 부작용을 나타내거나 나타낼 것으로 예상되는 물질은 제한 없이 포함될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 후보물질은 단일클론항체일 수 있다.

구체적으로, 단일클론항체의 후보물질은 예를 들어, anti-CD3(OKT3), anti-CD52(alemtuzumab) anti-CD20(rituximab), anti-CD28(TGN1412), natalizumab, anti-TNF-α(adalimumab), infliximab, omalizumab, anti-CD2(LO-CD2a/BTI-322), anti-CD3(Muromonab-CD3), anti-CD20(Tositumomab), anti-CD20(Ibritumomab), anti-CD40(CP-870,893), anti-CD52(Alemtuzumab), anti-IL-2 R(Basiliximab) 및 anti-IL-2 R(Daclizumab)(Bugelski, P.J., 2009)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 정보제공방법에 사용될 수 있는 그 밖의 후보물질은 예를 들어, 폰빌레브란트 인자(von Willebrand factor), 백혈병 치료제제인 bi-specific antibodies 및 chimeric antigen receptors(CARs) 표현 T 세포 등의 기타 생물학적 제제 군으로부터 선택되는 어느 하나의 물질일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

후보물질은 서서히 혈청에 방출되기 때문에 초기 활성화 기간 동안 유리 단일클론항체에 대한 specific IgG(sIgG)의 차단 효과가 지배적이므로, 상기 후보물질은 유리 sIgG의 초기 차단 효과를 극복할 수 있도록 충분한 양으로 사용되는 것이 바람직하다.

본 발명의 두 번째 단계는 혈액 내 호중구의 세포내에 형성된 산화물을 1차 정량하는 단계이다.

본 단계에서는 단일클론항체에 대한 sIgG가 FcγR를 거쳐 직접적으로 피험체 호중구를 활성화(activation)한 상태가 세포내 형성된 산화물의 정량에 의해 확인될 수 있다.

호중구의 세포내 형성된 산화물을 정량하는 단계는, 당업계에서 생물학적 시료에 포함된 산화물을 정량하는데 일반적으로 사용되는 방법이면 제한 없이 사용될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 정량을 위한 측정 신호(signal)는 화학발광(chemiluminescence) 또는 광발광(photoluminescence)일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 광발광은 형광(fluorescence) 또는 인광(phosphorescence)일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 화학발광은 루미놀(luminol)에 의한 것일 수 있다.

호중구의 세포내 형성된 산화물의 실시간 정량은, 혈액에 첨가된 루미놀(luminol) 시약과 호중구의 세포내 골수세포형과산화효소(myeloperoxidase: MPO)의 반응에 따른 화학발광을 PMT(photomultiplier tube)로 측정하여(425nm) 수행될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 형광은 다이하이드로로다민123(dihydrorhodamine 123)에 의한 것일 수 있다.

호중구의 세포내 형성된 산화물의 정량은 예를 들어, 호중구의 유세포분석법(flow cytometry)을 이용한 DHR(dihydrorhodamine) 123 분석에 의해 수행될 수 있다.

형광을 이용한 호중구의 세포내 형성된 산화물의 실시간 정량은 예를 들어, 이미지 세포분석법(image cytometry)을 활용한 DHR 분석에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, CCD 카메라를 장착한 현미경으로 호중구와 기타 세포들의 형광 이미지를 실시간 모니터링하는 cell tracking 및 cell by cell 분석법에 의해 수행될 수 있다.

본 발명의 세 번째 단계는 상기 1차 정량에 의해 측정된 제1 정량값을 정상대조군의 정량값과 제1 비교하는 단계이다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 1차 정량값과 상기 정상대조군의 정량값 비교에 의하여 IgG-매개 아나필락시스 또는 2차 주입물 반응(second infusion reaction)에 의한 아나필락시스의 위험을 평가할 수 있다.

본 단계에서는 후보물질과 접촉된 혈액 내 호중구의 세포내에 형성된 산화물을 정량한 값(제1 정량값)과 후보물질과 접촉하지 않은 정상대조군의 호중구 세포내 산화물의 정량값을 비교한다. 즉, 본 단계의 비교를 통하여, 단일클론항체에 대한 특이 IgG(sIgG)에 의하여 직접적으로 활성화된 호중구가 측정되며, IgG-매개 아나필락시스 또는 2차 주입물 반응에 의한 아나필락시스 위험에 대한 평가가 가능하다.

본 발명의 네 번째 단계는 후보물질과 접촉된 혈액에 호중구의 자극제(stimulator)를 접촉시키는 단계이다

사전에 후보물질의 처리에 의해 호중구 프라이밍이 이미 유도되어 있다면, 자극제 처리후 호중구의 산화물형성능이 크게 증폭된다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 자극제는 N-포르밀메티오닌-류실-페닐알라닌(N-formylmethionine-leucyl-phenylalanine: fMLP), PMA(phorbol myristate acetate) 또는 PHA(phytohemagglutinin)일 수 있다.

본 발명의 다섯 번째 단계는 상기 자극제가 접촉된 혈액 내 호중구의 세포내에 형성된 산화물을 2차 정량하는 단계이다.

본 발명의 여섯 번째 단계는 상기 2차 정량에 의해 측정된 제2 정량값을 정상대조군의 정량값과 제2 비교하는 단계이다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 2차 정량값과 상기 정상대조군의 정량값 비교에 의하여 IgE-매개 아나필락시스, 사이토카인 방출 증후군 또는 1차 주입물 반응(first infusion reaction)에 의한 아나필락시스의 위험을 평가할 수 있다.

본 단계에서는 후보물질과 접촉 후 자극제가 접촉된 혈액 내 호중구의 세포내에 형성된 산화물을 정량한 값(제2 정량값)과 후보물질 및 자극제와 접촉하지 않은 정상대조군의 호중구 세포내 산화물의 정량값을 비교한다. 즉, 본 단계의 비교를 통하여, 다른 면역세포(림프구, 단구 및/또는 호염구)가 분비한 사이토카인들에 의해 피험체 호중구가 프라이밍(priming)된 상태인지 여부가 판단되며, IgE-매개 아나필락시스, 사이토카인 방출 증후군 또는 1차 주입물 반응에 대한 위험의 평가가 가능하다.

본 발명의 마지막 단계는 상기 1차 정량값 및 상기 2차 정량값 중 하나 이상의 정량값이 상기 정상대조군의 각 정량값보다 큰 경우, 상기 후보물질의 정주에 의해 상기 피험체에 아나필락시스(anaphylaxis)가 발생할 위험이 높은 것으로 판단하는 단계이다.

후보물질의 처리에 따른 혈액내 호중구 세포내에 형성된 산화물에 의한 화학발광을 실시간 연속 측정하여, 반응시간에 따른 반응곡선을 얻을 수 있다. 반응시간은 호중구 자극제 첨가 시점을 기준으로 두 시기로 구분된다. 1차 정량하는 단계(자극제 첨가전)에 의하여 호중구 세포내에 형성된 산화물이 정량(제1 정량값)되며, 후보물질에 의하여 직접적으로 호중구가 활성화되었는지 여부가 평가된다. 2차 정량하는 단계(자극제 첨가후)에 의하여 호중구 세포내에 형성된 산화물이 정량(제2 정량값)되며, 림프구나 단구, 호염구가 분비한 면역매개체(사이토카인 등)에 의한 호중구의 프라이밍 여부가 평가된다. 따라서, 상기 제1 정량값을 단일클론항체를 처리하지 않은 정상대조군의 정량값으로 나눈 제1 지수(index, sample/control ratio) 및/또는 상기 제2 정량값을 단일클론항체 및 자극제를 처리하지 않은 정상대조군의 정량값으로 나눈 제2 지수가 각 지수에 대하여 결정된 임계치(cutoff value)를 초과할 경우, 아나필락시스 양성으로 판정하고, 상기 지수가 임계치보다 낮을 경우, 아나필락시스 음성으로 판정한다.

즉, 상기 제1 비교에 의하여 단일클론항체에 대한 sIgG에 의하여 직접적으로 활성화된 호중구를 평가할 수 있으므로, IgG-매개 아나필락시스 또는 2차 주입물 반응에 의한 아나필락시스 위험의 평가가 가능하다. 한편, 상기 제2 비교에 의하여 호중구가 다른 면역세포가 분비한 사이토카인에 의하여 프라이밍된 상태인지를 평가할 수 있으므로, IgE-매개 아나필락시스, 사이토카인 방출 증후군 또는 1차 주입물 반응에 의한 아나필락시스 위험의 평가가 가능하다.

치료적 단일클론항체 정주에 따른 아나필락시스의 시험관내 예측을 위한 정보제공방법에 따르면, 피험체로부터 채취한 혈액을 시험관내에서 후보물질과 접촉시킨 후, 혈액 내 호중구의 세포내에 형성된 산화물의 정량값에 근거하여 아나필락시스 위험을 간단하고 신속하게 예측할 수 있으므로, 치료적 단일클론항체가 투여되는 환자에 대한 아나필락시스 부작용을 사전에 확인할 수 있다.

도 1은 치료적 단일클론항체 정주에 따른 아나필락시스 예측을 위한 시험관내 진단법에 대한 검사술식의 개요를 나타낸 모식도이다. 구체적으로, 호중구 산화물형성능을 측정하기 위한 예시로써, luminol-H₂O₂ 시스템을 이용한 화학발광(chemiluminescence)을 측정하는 방법에 관한 것이다.
도 2는 로다민 123의 평균 형광 강도(MFI) 및 호중구(neutrophil)의 평균 FSC 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3는 FSC 및 MFI 값의 로우 데이터(Raw data)를 나타낸 그래프(A), 및 ΔFSC와 NOI의 계산된 지수(index)를 나타낸 그래프(B)이다.
도 4은 31명의 피험체에서, 15분의 활성화 시점에서 측정된 Der f-sNOI와 ΔFSC 간의 상관관계를 나타낸 그래프이다.
도 5는 31 명의 피험체의 Der f-sIgG(total)의 혈중 농도와 나이(A), Der f-sIgE 수준(B) 및 Der f-sIgG4(C)의 상관관계를 나타낸 그래프이다.
도 6는 Der f-sIgG 수준에 따른 Der f-sNOI(A 및 B) 및 Der f-sΔFSC(C)를 나타낸 그래프이다.
도 7은 Der f-sNOI와 Der f-sIgG4(A), Der f-sBAT(B), Der f-sIgE(C) 및 나이(D)의 상관관계를 나타낸 그래프이다.

이하 본 발명을 하나 이상의 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. IgG-매개 아나필락시스의 통합적인 대리표지자로서 호중구 산화물형성능(oxidative burst capacity) 확인 방법

1-1. 피험체 선정

총 31 명의 피험체를 다음 기준에 따라 선정하였다: 경북대학교 병원(대구, 한국) 알레르기 클리닉 방문 및 진단검사의학과에서 다중 알레르겐(multiallergen) 테스트를 실시한 사람. 선택된 31명의 피험체는 남자 16명 및 여자 15명으로, 피험체의 중앙 연령(median age)은 44세였다(3-76세). 다중 알레르겐 테스트를 위하여, 리튬 헤파린(lithium heparin) 튜브를 사용하여 전체 정맥혈 샘플을 수집하였다. 다중 알레르겐 테스트 후, 남은 샘플을 이후의 실험에 사용하였다. 본 실험은 임상연구심의위원회의 승인을 받았고, 모든 참가자에게 서면 동의를 받았으며, 혈액 샘플을 수집하고 4시간 이내에 실험을 수행하였다.

1-2. 유세포 분석

청색 레이저(488㎚)가 장착된 FACSCalibur 유세포분석기를 CaliBRITE 비드 및 FACSComp 소프트웨어(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 사용하여 매일 캘리브레이트(calibrate)하였다. CellQuest Pro 소프트웨어(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 사용한 데이터 수집(acquisition)시, 전방(forward) 및 측면(side) 광산란(light scatter)(각각 FSC 및 SSC)은 선형(linearly)으로 증폭되었고, 반면, 모든 형광은 대수적으로(logarithmically) 증폭되었다.

<1-2-1> 유세포 분석에 의한 DHR 분석

오버레이 방법(overlay procedure)을 사용하여 전혈(whole blood)로부터 백혈구(leukocyte) 현탁액을 분리하였다. 1.5㎖ 마이크로원심분리 튜브에서, 1.0㎖의 Histopaque-1077(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로 500㎕의 전혈을 조심스럽게 오버레이하고, 적혈구(red blood cell) 침강(sedimentation)을 위하여 실온에서 20분 동안 튜브를 방치하였다. 그 후, 상층액(백혈구를 포함하는 혈장 250㎕)을 조심스럽게 마이크로피펫으로 흡입하였다. 그 다음, 각 피험체의 분리된 백혈구 현탁액을 튜브 당 60㎕의 부피로 2개의 분획(자극 및 비자극)으로 나누고, 해동 및 희석된 DHR(dihydrorhodamine) 123(Sigma-Aldrich; 최종 농도=375ng/㎖) 2.0㎕를 첨가하였다. DHR 123을 세포에 로딩하기 위하여, 두 튜브를 5분 동안 37℃의 진탕항온수조에서 배양하고, 자극하고자하는 분획("자극" 분획)을 Der f(Dermatophagoides farinae) 추출물(연세대학교 의과대학 알레르기 학회) 패치(patch)(직경 1㎜)에 스파이크하였다. 이어서, 두 튜브를 15분 동안 37℃의 진탕항온수조에서 배양하였다. 그 후, 4℃에서 EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid)-PBS(phosphate buffered saline)(PBS 중 0.01M EDTA) 125㎕를 튜브에 첨가하여 반응을 중지시키고, 샘플을 즉시 유세포 분석에 사용하였다.

530/30 통과대역(bandpass) 필터를 갖는 FL1(fluorescence 1) 검출기를 사용하여 로다민(rhodamine) 123의 형광을 측정하였다. 로다민 123의 평균 형광 강도(mean fluorescence intensity: MFI)와 호중구(neutrophil)의 평균 FSC를 측정하였다(도 1). 호중구에 대하여 두 개의 regional gate가 사용되었다: FSC/SSC 플롯 및 로다민 123/SSC 플롯. 로다민 123 히스토그램의 피크의 주요 부분(M1 또는 M2)의 기하 평균과 게이팅된 호중구의 FSC 히스토그램으로 MFI 값과 평균 FSC 값을 각각 표현하였다. 자극 및 비자극 호중구에 대한 MFI의 변화는 호중구 산화 지수(neutrophil oxidative index: NOI)로 나타내었고, 이는 하기 식 (1)에 의하여 계산되었다. 또한, FSC의 변화(ΔFSC)는 하기 식 (2)에 의하여 계산되었다.

(1) NOI = MFI(자극)/MFI(비자극)

(2) ΔFSC = 평균 FSC(자극) - 평균 FSC(비자극)

양성 결과와 음성 결과를 구별하는 임계치(cutoff value)은 NOI는 1.20이고 ΔFSC는 50이었다.

<1-2-2> CD63 분석

BAT(basophil activation testing)는 3색 유세포 분석에 의해 수행되었다. 호염기구(basophil) 프라이밍(priming)을 위하여, 전혈 100㎕에 IL(interleukin)-3(Sigma-Aldrich)를 넣고 37℃에서 10분 동안 배양하였다. 프라이밍된 전혈을 Der f 추출물 패치로 스파이크(spike)하고, 반응 혼합물을 30분 동안 37℃의 진탕항온수조에서 배양하였다. 4℃에서 30분 동안 형광 표지된 항체 CD123 phycoerythrin-cyanine 5, CD203c allophyocyanin 및 CD36 fluorescein isothiocyanate로 샘플을 표지하였다. 3.0㎖의 용해액(lysing solution)에 적혈구를 용해하고, 1회 세척한 후, 남아있는 펠렛을 유세포 분석 데이터 수집을 위해 PBS에 재현탁하였다(모두 BD Biosciences). 호염기구의 CD63+ 비율에 대한 양성 결과와 음성 결과를 구별하는 임계치는 3.0%이었다.

1-3. Der f -sIgE, Der f -sIgG 및 Der f -sIgG4 수준 측정

RIDASCREEN Specific IgG 키트 및 Der f(R-Biopharm AG, Darfmstadt, Germany) 디스크를 사용한 ELISA 방법으로 혈장 샘플에서 Der f-특이적(Der f-s) IgG(Der f-sIgG) 항체(total) 수준을 2.5㎍/㎖의 검출 한계(limit of detection: LOD)로 측정하였다. 또한, ImmunoCAP Specific IgG(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용한 ELISA 방법으로 Der f-sIgE 및 Der f-sIgG4 항체 수준을 0.1㎍/㎖의 LOD로 측정하였다.

1-4. 통계분석

SPSS Version 19.0(SPSS, Inc., Chicago, IL, USA)을 사용하여 통계분석을 수행하였다. 회귀 분석(regression analysis) 또는 윌콕슨 부호 순위 검정(Wilcoxon signed rank test)을 사용하여 두 그룹을 비교하였다. P<0.05는 통계적으로 유의하다고 간주하였고, 결과는 중앙값(범위)으로 표현하였다.

실시예 2. Der f 추출물 처리 후, 시간에 따른 ΔFSC 및 NOI의 확인

Der f 추출물 처리 후, 시간에 따른 ΔFSC 및 NOI를 확인하기 위하여, 실시예 1-2 및 1-3을 수행하였다. 이때, 최소의 조작을 위하여, 오버레이 방법을 사용하여 백혈구 현탁액을 분리하였다.

그 결과, Der f 추출물을 스파이크하지 않은 비자극 샘플에서, 호중구의 로다민 123 형광의 시간 의존적 증가가 관찰되었고, Der f 추출물을 스파이크한 자극 시료는 비자극 시료 대비 MFI가 더 빨리 증가하였다(도 2A). 또한, Der f-sNOI에서 시간 의존적 증가가 관찰되었고, ΔFSC는 활성화 30분에 피크에 도달하였다(도 2B). 0분(스파이크 전)에서 40분까지 활성화 시간에 따라 이들 지표의 선형성을 평가한 결과, Der f-sNOI 값의 선형성이 유의한 것으로 확인되었다(P<0.01). 반면, ΔFSC 값은 유의하지 않은 것으로 나타났다(P=0.118). 따라서, 이후의 실험에서는 활성화 시간을 15분으로 설정하여 진행하였다.

한편, ΔFSC는 Der f-sNOI와 유의한 상관관계를 나타내는 것으로 확인되었다(P<0.00005)(도 3). 31명의 피험체 중, 단 한명의 피험체(73 세 여자)에서 2.5㎍/㎖ LOD(검출 불가능) 이하의 Der f-sIgG 수준이 확인되었으며, 상기 피험체는 Der f-sIgG를 생산하지 않는 "무반응자(non-responder)"인 것으로 고려하였다. Der f에 대한 상기 무반응자를 제외하면, Der f-sIgG의 수준은 연령에 따라 증가하는 것으로 확인되었다(P<0.05, 도 4A). 반면, Der f-sIgG와 Der f-sIgE(도 4B) 또는 Der f-sIgG4(도 4C) 사이의 유의성은 나타나지 않은 것으로 확인되었다.

실시예 3. Der f -sIgG 수준에 따른 Der f -sNOI 및 Der f -sΔFSC 값 확인

Der f-sIgG 수준에 따른 Der f-sNOI 및 Der f-sΔFSC 값 확인하기 위하여, 실시예 1-2 및 1-3을 수행하였다.

그 결과, Der f-sIgG의 최저(<2.5㎍/㎖) 및 최고(48.8㎍/㎖) 수준에서, 호중구 산화물 형성(oxidative burst: OB)은 나타나지 않았다(NOI=-1). 이로 인해 Der f-sIgG vs. Der f-sNOI 플롯(도 5a)에서 31명 피험체의 점(dot)은 깔때기 모양(funnel-shaped)으로 분포되었다. 가장 낮은 수준의 경우(Der f에 대한 무반응자)가 제외되었을 때, Der f-sIgG 수준이 검출 가능한 나머지 피험체의 경우, 두 파마미터 사이에 유의한 관계가 확인되었다(도 5B).

즉, Der f-sIgG 수치가 증가할수록 Der f-sNOI는 감소하는 것으로 확인되었다(P<0.05). 이는 용해성 Der f 알레르겐은 서서히 혈청에 방출되기 때문에 초기 활성화 기간 동안 유리 Der f-sIgG의 차단 효과가 지배적이나, 점차 알레르겐이 방출되어, 시간에 따라 sIgG가 면역 복합체를 형성하기 때문인 것으로 확인되었다. 또한, 면역 복합체는 궁극적으로 호중구의 Fcγ 수용체에 결합하여, 산화물을 형성(Der f-sNOI)하는 것으로 확인되었다.

한편, Der f-특이적 ΔFSC(Der f-sΔFSC)는 Der f-sIgG 수준과는 유의한 상관 관계가 없는 것으로 확인되었다(도 5C).

실시예 4. Der f -sNOI 및 다른 파라미터 사이의 관계 확인

Der f-sNOI 및 다른 파라미터 사이의 관계 확인하기 위하여 실시예 1-2 및 1-3을 수행하였다.

그 결과, Der f-sNOI와 Der f-sIgG4, Der f-특이적 BAT(Der f-sBAT, CD63+ 호염기구의 비율) 또는 Der f-sIgE 사이에는 유의한 관계가 나타나지 않는 것으로 확인되었다(도 6A 내지 6D). 연령이 증가함에 따라 Der f-sNOI의 감소 경향성이 관찰되었으나, 유의하지는 않은 것으로 확인되었다(P=0.157).

이와 같은 결과를 통하여, IgE 및 호염구 독립적으로 호중구의 산화물 형성의 측정에 의하여, IgG-매개 아나필락시스의 분석이 가능하고, 또한, in vitro에서 호중구의 후속적인 세포내 산화물의 형성 및 호염구의 활성화는 유도되지 않음을 확인하였다.

실시예 5. free preexisting Der f -sIgG에 의한 호중구 산화물 형성 확인

호중구 산화물 형성이 free preexisting Der f-sIgG에 의한 것인지 확인하기 위하여, Der f-sΔFSC 및 Der f-sNOI이 모두 양성인 4명의 피험체를 선정하였다. free preexisting Der f-sIgG를 제거하기 위하여, 상기 피험체의 백혈구 현탁액을 3.0 ㎖의 Roswell Park Memorial Institute 배지로 3회 세척하였다.

그 결과, Der f-sΔFSC 값(임계치=50)은 2.0(-6.0-15.0)으로, Der f-sNOI 값(임계치=1.20)은 1.05(0.98-1.09)으로 나타나, 호중구 반응은 모든 세척된 백혈구 현탁액에서 거의 나타나지 않는 것으로 확인되었다.

이와 같은 결과를 통하여, Der f 추출물을 첨가한 후의 호중구 OB는 현탁액 중의 free preexisting Der f-sIgG에 의한 것임을 확인하였다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (9)

1. 피험체로부터 채취된 혈액에 후보물질을 시험관 내에서 접촉시키는 단계;
   혈액 내 호중구의 세포내에 형성된 산화물을 1차 정량하는 단계;
   상기 1차 정량에 의해 측정된 제1 정량값을 정상대조군의 정량값과 제1 비교하는 단계;
   후보물질과 접촉된 혈액에 호중구의 자극제(stimulator)를 접촉시키는 단계;
   상기 자극제가 접촉된 혈액 내 호중구의 세포내에 형성된 산화물을 2차 정량하는 단계;
   상기 2차 정량에 의해 측정된 제2 정량값을 정상대조군의 정량값과 제2 비교하는 단계; 및
   상기 제1 비교 및 상기 제2 비교 중 하나 이상의 비교 결과, 혈액 내 호중구의 세포내에 형성된 산화물이 정상대조군에 비하여 증가한 경우, 상기 후보물질의 정주에 의해 상기 피험체에 아나필락시스(anaphylaxis)가 발생할 위험이 높은 것으로 판단하는 단계;
   를 포함하는 아나필락시스 위험 예측을 위한 정보제공방법.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 1차 정량값과 상기 정상대조군의 정량값 비교에 의하여 IgG-매개 아나필락시스 또는 2차 주입물 반응(second infusion reaction)에 의한 아나필락시스의 위험을 평가하는 것인 정보제공방법.
   
3. 제 1 항에 있어서, 상기 2차 정량값과 상기 정상대조군의 정량값 비교에 의하여 IgE-매개 아나필락시스, 사이토카인 방출 증후군 또는 1차 주입물 반응(first infusion reaction)에 의한 아나필락시스의 위험을 평가하는 것인 정보제공방법.
   
4. 제 1 항에 있어서, 상기 정량을 위한 측정 신호(signal)는 화학발광(chemiluminescence) 또는 광발광(photoluminescence)인 것인 정보제공방법.
   
5. 제 4 항에 있어서, 상기 광발광은 형광(fluorescence) 또는 인광(phosphorescence)인 것인 정보제공방법.
   
6. 제 4 항에 있어서, 상기 화학발광은 루미놀(luminol)에 의한 것인 정보제공방법.
   
7. 제 5 항에 있어서, 상기 형광은 다이하이드로로다민123(dihydrorhodamine 123)에 의한 것인 정보제공방법.
   
8. 제 1 항에 있어서, 상기 후보물질은 단일클론항체인 것인 정보제공방법.
   
9. 제 1 항에 있어서, 상기 자극제는 N-포르밀메티오닌-류실-페닐알라닌(N-formylmethionine-leucyl-phenylalanine: fMLP), PMA(phorbol myristate acetate) 또는 PHA(phytohemagglutinin)인 것인 정보제공방법.

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