KR102173730B1

KR102173730B1 - 고미신 m2를 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR102173730B1
Application number: KR1020190044434A
Authority: KR
Inventors: 정길생; 김은남; 김상현; 김민종
Original assignee: 계명대학교 산학협력단
Priority date: 2019-04-16
Filing date: 2019-04-16
Publication date: 2020-11-03
Also published as: KR20200121635A

Abstract

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 고미신 M2(Gomisin M2)를 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 고미신 M2는 알레르기 반응과 관련 있는 비만세포로부터의 히스타민 유리를 억제하고, 염증유발 사이토카인인 TNF-α 또는 IL-6 유전자의 발현을 억제하고, 전사인자인 NF-ĸB 활성을 억제하는 효과가 우수하여, 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 조성물 및 건강기능식품으로 유용하게 사용될 수 있다.
[화학식 1]

Description

고미신 M2를 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical Composition Comprising Gomisin M2 for Preventing or Treating Allergic Disease}

본 발명은 알레르기 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있는 화학식 1에 해당하는 고미신 M2(Gomisin M2)의 알레르기 질환의 예방 및 치료 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따른 고미신 M2는 비만세포로부터 히스타민의 방출을 억제하며, 알레르기를 유발하는 사이토카인의 발현을 억제하여 알레르기 질환의 예방 또는 치료에 널리 사용될 수 있다.

알레르기란, 광범위하고 복잡한 병리적 현상의 총화로 면역반응에 근거한 생체의 전신적 또는 국소적인 장애이다. 인체에 나타나는 알레르기는 면역 기전에 따라 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ 및 Ⅳ형으로 분류되며, 이 중에서 즉시형 과민반응에 속하는 Ⅰ형 알레르기가 임상에 있어서 중요한 부분을 차지하고 있으며, 아토피성 피부염, 알레르기성 비염, 기관지 천식, 고초열 및 화분증 등이 여기에 속한다.

1953년경 Ⅰ형 알레르기는 비만세포의 활성화에 의해 일어나며, 이러한 비만세포의 과립에는 염증반응의 매개체인 히스타민(histamine)이 다량 함유되어 있음이 알려졌다. 알레르기 반응이 일어날 때 비만세포에서 히스타민이 방출되는 현상이 발견된 후에 이 기전을 규명하던 중, 이시자까(Ishizaka)의 immunoglobulin E(IgE)의 발견은 비만세포가 즉시형 알레르기 반응에 관여함을 밝히는 중요한 계기가 되었다. 즉, 비만세포 표면에는 IgE 고친화성 수용체가 있으며, 이 수용체에 IgE가 결합한 후 다시 항원이 결합하여 가교가 형성되면 탈과립반응이 유발되어 과립 내용물인 히스타민, 세로토닌(serotonin), 브라드키닌(bradykinin) 등과 같은 합성되어 저장되어 있던 매개물질(preformed mediator)과, 프로테아제(protease), 프로테오글리칸(proteoglycan) 등이 동시에 방출되는 것이다(Ishizaka, Hosp Pract.; 12(1):57-67, 1977).

1970년대 이후 새로운 지질성의 염증 매개체에 대한 연구 결과가 보고되기 시작하였으며, 이들은 세포의 활성화에 동반하여 세포막 인지질로부터 생산된 프로스타그란딘류(prostaglandins), 류코트리엔류(leukotriens), 트롬복산(thromboxane), 글리세로포스포리피드(glycerophospholipids) 유도체인 PAF(platelet activating factor) 등으로 다양한 생리활성을 나타내는 신생 매개체들로서 Ⅰ형 알레르기 반응을 포함한 각종의 염증 반응에 관여함이 밝혀졌다. 이러한 지질성 매개체는 IgE 수용체가 가교를 형성할 때 비만세포에서 탈과립반응과 병행해서 생산, 방출된다.

Ⅰ형 알레르기는 비만세포의 활성화에 의해 방출되는 과립내용물인 활성아민류와 프로테아제(protease)류, 세포막 인지질에서 생성되는 지질성 매개체, 면역반응의 조절인자로 잘 알려진 IL-3(비만세포 증식인자), IL-4, IL-5과 같은 사이토카인(cytokine)인 등이 관련되어 일어나는 생체의 자연스러운 현상이라고 종합할 수 있다(Galli SJ et al., Curr Opin Immunol.; 3(6):865-872, 1991; Bradding P et al., J Immunol.;151(7):3853-3865, 1993).

또한, 알레르기 항원에 피부가 노출되면 랑게르한스 세포의 표면에 있는 IgE 수용체에 항원 특이 IgE가 결합하고, 이 항원의 표면에 있는 T세포에 전달되어 T세포가 활성화 된다. 이 경우 정상과 달리 알레르기성 피부질환, 특히, 아토피 피부염에서는 Th2가 활성화되어 IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10 및 IL-13 등의 사이토카인이 분비되고, 그 결과 B 세포에서 IgE의 생성이 촉진되고, 활성화되어있는 비만세포의 탈과립을 촉진시켜 사이토카인과 히스타민이 유리된다(Baruah C. C. et al.,Pharmacol Res.;38(6):487-92, 1998; Karadag C. H. et al.,Braz J Med Biol Res.;33(3):327-330, 2000; Paolini R. et al., Nature.;353(6347):855-858, 1991).

현재 임상적으로 사용되고 있는 알레르기 치료 약물은 작용기전에 따라 탈과립저해제, 화학전달물질 작용억제제, 화학전달물질 합성저해제 등으로 대별할 수 있다. 이들 약물들 중 화학전달물질 작용억제제와 화학전달물질 합성저해제의 경우 약물작용점이 비교적 확실하지만, 탈과립저해제의 경우 그 작용기전이 불분명한 상태이며, 또한 이들 약물들은 장기간 투여에 의해 여러 가지 부작용을 초래할 수 있다. 이에 따라Ⅰ형 알레르기의 치료를 위해 비만세포에서 이들 생리활성 물질의 생산 및 유리에 대한 작용기전을 밝히고, 장기복용에 따른 부작용을 최소화할 수 있는 물질의 개발이 대단히 중요하다고 할 수 있다.

한국공개특허 제2017-0101414호(2017.09.06. 공개)

Ishizaka, Hosp Pract.; 12(1):57-67, 1977. Baruah C. C. et al., Pharmacol Res.;38(6):487-92, 1998. Karadag C. H. et al.,Braz J Med Biol Res.;33(3):327-330, 2000. Paolini R. et al., Nature.;353(6347):855-858, 1991.

이에 본 발명자들은 알레르기 질환에 대한 효과를 연구한 결과, 고미신 M2(Gomisin M2)는 비만세포로부터의 히스타민 유리를 억제하고, 염증유발 사이토카인인 종양괴사인자 TNF-α 또는 IL-6 유전자의 발현 억제와 전사인자인 NF-ĸB 활성을 억제하는 효과가 우수하여 알레르기 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 고미신 M2(Gomisin M2)를 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 고미신 M2(Gomisin M2)를 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 고미신 M2(Gomisin M2)를 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 고미신 M2(Gomisin M2)를 유효성분으로 함유하며, 생체 외(in vitro)에서 비만세포의 TNF-α 또는 IL-6 발현 억제, 및 NF-ĸB 활성 억제를 하는 것을 특징으로 하는, TNF-α 또는 IL-6 발현 억제, 및 NF-ĸB 활성 억제용 시약 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 인간을 제외한 개체로부터 분리된 비만세포에 고미신 M2(Gomisin M2)를 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, TNF-α 또는 IL-6 발현, 및 NF-ĸB 활성 억제방법을 제공한다.

본 발명의 고미신 M2를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 비만세포로부터의 히스타민 유리를 억제하고, 염증유발 사이토카인인 종양괴사인자 TNF-α 또는 IL-6 유전자의 발현 억제와 전사인자인 NF-ĸB 활성을 억제함으로서, 비만세포를 매개로 하는 알레르기 질환의 예방 또는 치료에 특히 유용하게 사용될 수 있다.

도 1A는 RBL-2H3 세포에서 히스타민 유리 억제에 대한 고미신 M2의 효과를 보여주는 그래프이다(Dexa : dexamethasone).
도 1B는 랫트 복강 비만세포(rat peritoneal mast cells, RPMCs)에서 히스타민 유리 억제에 대한 고미신 M2의 효과를 보여주는 그래프이다(Dexa : dexamethasone).
도 2는 RBL-2H3 세포에서 세포 내 칼슘 감소에 대한 고미신 M2의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 3은 RBL-2H3 세포에서 고미신 M2의 농도별 TNF-α 및 IL-6 사이토카인의 분비량 감소를 확인한 그래프이다.
도 4는 고미신 M2의 IκBα 분해 및 NF-ĸB 활성 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 5A는 수동형 국소 피부 알레르기 반응(passive cutaneous anaphylaxis, PCA)을 통해 고미신 M2의 피부 알레르기에 대한 효과를 확인한 결과이다(Dexa : dexamethasone).
도 5B는 수동형 국소 피부 알레르기 반응(passive cutaneous anaphylaxis, PCA)을 통해 고미신 M2의 농도별 피부 알레르기에 대한 귀의 색 변화를 나타낸 그래프이다(Dexa : dexamethasone).
도 5C는 수동형 국소 피부 알레르기 반응(passive cutaneous anaphylaxis, PCA)을 통해 고미신 M2의 농도별 피부 알레르기에 대한 귀 두께 변화를 나타낸 그래프이다(Dexa : dexamethasone).
도 6은 BMMC와 RBL-2H3 세포에서 고미신 M2의 세포독성을 확인한 그래프이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 고미신 M2를 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

상기 화학식 1의 고미신 M2는 천연물로부터 분리할 수도 있다. 본 발명자는 오미자(Schisandra chinensis (Turcz.))에서 본 발명의 고미신 M2를 동정하였다. 일 구현예로서, Schisandra chinensis (Turcz.) (오미자)를 대구 약령시장에서 구입하고, Schisandra chinensis (Turcz.) (보골지) 20 kg을 95% 에탄올 10L에 5일 실온추출 후 감압농축하여 95% 에탄올 추출물 5.7kg을 얻은 후, 95% 에탄올 추출물을 물에 현탁시켜 CH₂Cl₂과 EtOAc 그리고 n-BuOH로 액액 분배하여 분획을 얻었다. 그 중 CH₂Cl₂ 분획 525g을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 ether/acetone (20: 1 to 1: 2)를 하여 5개의 분획을 수득하고, 분획물 중 Fr. 1을 메탄올로 Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피 MeOH/H₂O (1:1)로 용리하여 2개의 분획물을 얻었다 (Fr.1-1 및 Fr.1-2). 그 중 Fr.1-2을 Medium-pressure liquid chromatography (MPLC) MeOH / H₂O (10:1 to 1:1)로 용리하여 64mg 수득하였다. 그 후 ¹H 및 ¹³C-NMR 분석을 통해 분획물이 고미신 M2임을 확인하였다.

아울러, 본 발명에서 상기 알레르기 질환은 바람직하게는 비만세포를 매개로 발생되는 알레르기성 질환일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

구체적으로, 상기 알레르기성 질환은 접촉피부염, 아토피피부염, 천식, 알레르기성 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 아나필락틱 쇼크(anaphylactic shock), 다발성 경화증, 급성 염증, 만성 염증질환, 두드러기, 고초열, 소화관 알레르기, 약제 알레르기, 식품 알레르기 및 화분증으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.

상기 화학식 I의 고미신 M2는 비만세포에서 종양괴사인자 TNF-α 및 인터류IL-6의 발현을 억제하며, 전사인자인 NF-ĸB 활성을 억제하는 효과가 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 화학식 I으로 표시되는 고미신 M2가 활성화된 비만세포에서 히스타민의 유리를 억제하고(도 1), 세포 내 칼슘의 양을 감소시켜 비만세포의 탈과립을 억제하며(도 2), 염증유발 사이토카인 유전자들인 TNF-α 및 IL-6의 발현 및 전사인자인 NF-ĸB 활성을 억제하는 것을 확인하였다(도 3 및 도 4).

아울러, 본 발명의 다른 실시예에 따르면, 항알레르기 효과를 갖는 약물을 개발할 때 많이 사용되는 수동형 국소 피부 알레르기 반응(passive cutaneous anaphylaxis, PCA)을 이용하여 고미신 M2의 피부 알레르기에 대한 효과를 실험한 결과, 고미신 M2가 농도 의존적으로 국소 피부 알레르기 반응을 억제함을 알 수 있었다(도 5).

따라서, 본 발명의 고미신 M2를 유효성분으로 포함하는 조성물은 알레르기 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였으며, 바람직하게는 염증성 알레르기 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

본 발명에서 사용되는 용어“알레르기”는 어떤 외래성 물질과 접한 생체가 그 물질에 대하여 정상과는 다른 반응을 나타내는 현상을 의미한다. 알레르기란 광범위하고 복잡한 병리적 현상의 총화로 면역반응에 근거한 생체의 전신적 또는 국소적인 장애이다. 인체에 나타나는 알레르기는 면역 기전에 따라 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ 및 Ⅳ형으로 분류되며, 이 중에서 즉시형 과민반응에 속하는 Ⅰ형 알레르기가 임상에 있어서 중요한 부분을 차지하고 있으며, 아토피성 피부염, 알레르기성 비염, 기관지 천식, 고초열 및 화분증 등이 여기에 속한다. 상기 알레르기 질환은 바람직하게는 염증성 알레르기 질환일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어“예방”은 본 발명의 조성물의 투여로 알레르기 질환을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어“치료”는 본 발명의 조성물의 투여로 알레르기 질환의 증상이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 조성물은 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 ~ 90 중량부로 포함되는 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 고미신 M2에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올 레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용 될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

한편, 주사제에는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제, 방부제 등과 같은 종래의 첨가제가 포함될 수 있다.

또한, 본 발명의 치료용 조성물은 임의의 생리학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제(Remington: The Science and Practice of Pharmacy, l9th Edition, Alfonso, R., ed, Mack Publishing Co.(Easton, PA: 1995))를 추가로 포함할 수 있다. 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충용액, 예를 들어 인산, 시트르산 및 다른 유기산; 아스코르브산을 비롯한 항산화제; 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 다른 탄수화물; 킬레이트제, 예를 들어 EDTA; 당 알콜, 예를 들어 만니톨 또는 소르비톨; 염-형성 반대이온, 예를 들어 나트륨; 및(또는) 비이온성 계면활성제, 예를 들어 트윈, 플루로닉스 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이 포함된다.

본 발명의 약학적 조성물의 인체에 대한 투여량은 대상체의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로 0.01 - 100 mg/kg/day이며, 바람직하게는 0.1 - 20 mg/kg/day이며, 더욱 바람직하게는 1 - 5 mg/kg/day일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 '대상체'는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 고미신 M2(Gomisin M2)를 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

상기 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

그밖에 천연 과일 주스, 합성 과일 주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 건강기능식품 조성물은 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 차, 기능수, 드링크제, 알코올 및 비타민 복합제 중 어느 하나의 형태일 수 있다.

또한, 상기 건강기능식품은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, "식품첨가물"로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품안전청에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반 시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 "식품첨가물공전"에 수재된 품목으로 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성품, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고랭색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류 첨가 알칼리제, 보존료제제, 타르색소 제제 등의 혼합 제제류 등을 들 수 있다.

이때, 건강기능식품을 제조하는 과정에서 식품에 첨가되는 프라바스타틴 및 항혈소판제는 필요에 따라 그 함량을 적절히 가감할 수 있으며, 바람직하게는 식품 100 중량부에 1 중량부 내지 90 중량부 포함되도록 첨가될 수 있다.

더불어, 본 발명은 고미신 M2(Gomisin M2)를 유효성분으로 함유하며, 생체 외(in vitro)에서 비만세포의 TNF-α 또는 IL-6 발현 억제, 및 NF-ĸB 활성 억제를 하는 것을 특징으로 하는, TNF-α 또는 IL-6 발현 억제, 및 NF-ĸB 활성 억제용 시약 조성물을 제공한다.

또한, 인간을 제외한 개체로부터 분리된 비만세포에 고미신 M2(Gomisin M2)를 유효성분으로 함유하는 조성물을 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, TNF-α 또는 IL-6 발현, 및 NF-ĸB 활성 억제방법을 제공한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<실시예 1> 비만세포에서 고미신 M2의 히스타민 유리 억제 효과 확인

<1-1> 시약 및 세포 배양

항-dinitrophenyl(DNP)-IgE (Cat No. D8406), DNP-human serum albumin(HSA) (Cat No. A6661)은 Sigma사(미국)에서 구입하였다. 인간 비만세포주인 RBL-2H3 세포(한국세포주은행에서 구입)는 열에 의해 불활성화한 10% FBS가 첨가된 Gibco사(미국)의 Dulbecco’s modified eagle medium (Cat No. 12800-017)에서 배양하였다.

<1-2> 랫트의 복강 비만세포의 분리 및 배양

랫트 복강 비만세포(rat peritoneal mast cells, RPMCs)를 분리하기 위하여 랫트를 이산화탄소로 안락사한 후 20mL의 완충용액(Tyrode’s buffer: 137mM NaCl, 5.6mM glucose, 12mM NaHCO₃, 2.7mM KCl, 0.3mM NaH₂PO₄, 0.1% gelatin)을 복강 내에 주사하고 약 90초 동안 복부의 좌우측을 약하게 마사지하였다. 랫트의 복강 외피를 절개한 후 복강 내의 완충용액을 파스퇴르 피펫을 사용하여 회수한 후 실온에서 원심분리(150g, 10분)하여 침전시켰다. 침전물을 다시 1mL의 완충용액에 섞은 후 2mL의 Histodenz 용액(0.235g/mL) 위에 조심히 띄우고 실온에서 원심분리(400g, 10분)하였다. 상층액을 제거한 후 남은 침전물에 1mL의 완충용액을 가하여 세척하고 톨루이딘 블루(toluidine blue) 염색을 통해 비만세포를 확인하였으며, 트리판 블루(trypan blue) 염색을 통해 세포의 생존 여부를 확인하였다. RPMCs는 열에 의해 불활성화한 10% FBS가 첨가된 Gibco사(미국)의 Alpha minimum essential media (Cat No. 11900-024)에서 배양하였다.

<1-3> 마우스의 골수 유래 비만세포의 분리 및 배양

마우스 골수 유래 비만세포(bone marrow-derived mast cells, BMMCs)를 분리하기 위하여 마우스를 이산화탄소로 안락사한 후, 엉덩이에서 발목까지 피부를 제거하고 가위로 뼈를 부수지 않고 쥐의 대퇴골에서 근육을 조심스럽게 제거하였다. 모든 후속 단계는 골수의 오염을 방지하기 위해 멸균 세포 배양 후드 내에서 수행되었다. 다음 단계에서 대퇴골과 경골을 PBS로 씻어 내고, 각 뼈의 끝 부분이 절단하였다. 골수강을 열고, 골수를 인슐린 주사기를 사용하여 페트리 접시 (Sarstedt, N

mbrecht, Germany)에 세포를 수집 하였다. 세포 현탁액을 T 플라스크로 옮겼다.

<1-4> 비만세포로부터 고미신 M2의 히스타민의 유리 억제 효과 확인

비만세포로부터 히스타민 유리에 대한 억제효과를 확인하기 위하여 RBL-2H3 세포와 RPMCs를 항-DNP-IgE로 감작시킨 후, DNP-HSA를 처리하여 활성화시킴으로써 세포 내 과립의 주 함유물질이자 알레르기 유발물질인 히스타민을 유리시켰다. 활성화에 앞서 각각의 비만세포들에는 다양한 농도의 고미신 M2를 전처리하였다. 활성화된 비만세포의 배양액을 회수하여 실험에 사용하였다. 즉, 에펜돌프 튜브에 시료 200μL를 취하여 0.1N 염산 80μL와 60％ 과염소산 용액 20μL를 혼합한 후에 원심분리(13,000g, 20분, 5415R, Eppendorf사)를 하였다. 그 상등액 200μL를 취해 5N NaOH 용액 100μL, n-부탄올(n-butanol) 800μL, 5M NaCl 200μL를 혼합한 시험관에 넣고 이를 진탕한 후 원심분리(13,000g, 20분)를 수행하였다. 상기 시험관에서 부탄올(butanol)층 500μL를 취해 0.1N 염산 200μL, n-헵탄(n-heptane) 500μL를 가하여 진탕하고 다시 원심분리(13,000g, 20분)를 수행하여 얻어진 수층 150μL에 1N NaOH 40μL, 1％ o-프탈디알데하이드(o-phthaldialdehyde)용액(Sigma사, Cat No. P1378) 10μL를 가하여 혼합하고 5분 동안 방치한 다음, 3N 염산 20μL을 추가하여 방출파장(emission wavelength) 440nm, 여기파장(excitation wavelength) 360nm에서 형광강도를 형광분석기(GEMINIEM, Molecular Devices 사)를 이용하여 측정하였다. 측정한 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1의 결과, 활성화된 비만세포에서 많은 양의 히스타민이 유리되는 결과로부터 고미신 M2의 처리에 의해 농도 의존적으로 히스타민의 유리가 억제됨을 알 수 있었다(도 1A: RBL-2H3 세포, 도 1B: RPMCs 세포). 특히, 본 발명의 고미신 M2는 비교예로 사용된 덱사메타손(dexamethasone)에 비해 낮은 농도에서 비슷한 수준의 히스타민의 유리 억제 효과를 가짐을 알 수 있었다. 이를 통해, 본 발명의 고미신 M2는 알레르기 질환에 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

<1-5> 비만세포에서 세포 내 칼슘에 대한 고미신 M2의 효과 확인

칼슘(Ca)은 세포 내 2차 전달물질로서 생리활성의 조절에 중요한 역할을 하고, 비만세포의 탈과립을 조절하는 신호전달 물질로 잘 알려져 있다. 따라서 세포 내 칼슘의 양이 증가하면 비만세포가 탈과립되고, 반대로 칼슘의 양이 감소하면 비만세포의 탈과립이 억제된다. 따라서 세포 내 칼슘에 대한 고미신 M2 효과의 관찰을 통해 고미신 M2의 비만세포에서 히스타민 유리 작용기전을 확인할 수 있다.

RBL-2H3 세포에 항-DNP-IgE와 DNP-HSA를 각각 처리함으로써 활성화된 비만세포에서 세포 내 칼슘 양과 고미신 M2을 처리한 후 세포 내 칼슘의 양은 Fluo-3, AM(Invitrogen사, Cat No. F1242)을 이용하여 형광염색한 후 형광분석기로 측정하였다. 측정한 결과는 도 2에 나타내었다.

도 2의 결과, 활성화된 비만세포는 급격한 세포 내 칼슘의 증가를 나타내었다. 그러나 본 발명의 고미신 M2를 처리한 군에서 유의적으로 세포 내 칼슘의 양 증가가 현저하게 감소하는 결과로부터 고미신 M2가 칼슘의 양을 감소시켜 비만세포의 탈과립을 억제함으로써 알레르기 치료에 효과가 있음을 알 수 있었다.

특히, 본 본 발명의 고미신 M2는 비교예로 사용된 세포내 칼슘 저해제인 BAPTA-AM(1,2-*?*Bis(2-*?*aminophenoxy)*?*ethane-*?*N,N,N′,N′-tetraacetic acid tetrakis(acetoxymethyl ester))에 비해 낮은 농도에서 비슷한 수준으로 비만세포의 탈과립을 억제함을 알 수 있었다.

<실시예 2> 비만세포에서 고미신 M2의 염증 유발 저해 효과 확인

<2-1> 비만세포 내 염증유발 사이토카인 TNF-α 및 IL-6 에 대한 고미신 M2의 효과 확인

비만세포에서 유리되거나 새로 합성되어 분비됨으로써 염증성 알레르기를 일으키는 생리활성물질인 TNF-α 및 IL-6와 같은 염증 유발성 사이토카인의 발현에 대한 고미신 M2의 효과를 확인하기 위해, 비만세포를 항-DNP-IgE로 감작시킨 후, DNP-HSA로 활성화하여 염증 유발성 사이토카인의 분비를 촉진시킨 다음 효소결합 면역흡착 분석법을 이용하여 각각의 분비량을 측정하였다.

구체적으로, 효소결합 면역흡착 분석법으로 배양액 내의 사이토카인 농도를 산출하기 위하여 이미 상품화 되어있는 키트(San Diego, BD biosciences 사)를 사용하였다. 간략히 방법을 기술하면, 항원이 부착되어 있는 웰에 배양액과 농도별로 희석한 표준시료를 200μl를 넣고 방치하였다. 120분 후 세척액으로 3회 세척 후 1차 항체를 100μl씩 넣었다. 잘 혼합하여 60분간 방치한 후 세척액으로 3회 세척한 후 2차 항체와 효소 시약을 섞은 혼합시약을 100μl씩 넣었다. 반응이 끝난 후 혼합물을 버리고 세척액으로 4회 세척 후 기질 용액을 100μl씩 넣고 빛을 차단한 실온 상태에서 20분간 방치하였다. 반응 후 정지시약(2N H₂SO₄)을 50μl씩 넣어주어 반응을 정지하고, 450nm에서의 흡광도를 흡광분석기(Sunnyvale, Molecular devices 사)로 측정하였다. 이렇게 측정한 결과는 도 3에 나타내었다.

도 3의 결과, 항-DNP-IgE와 DNP-HSA로 활성화시킨 RBL-2H3 세포에서 IL-6 및 TNF-α 사이토카인의 분비량이 증가하였으며, 고미신 M2를 농도별로 전 처리한 결과 고미신 M2가 농도 의존적으로 이들 사이토카인의 분비량을 감소시킴을 확인하였다. 또한, 대조군인 덱사메타손(dexamethasone)에 비해 더 낮은 농도에서 효과적으로 염증 유발성 사이토카인의 분비량을 감소시킴을 확인함으로써 고미신 M2가 덱사메타손에 비해 더 효과적으로 염증 유발을 저해시킴을 알 수 있었다.

<2-2> NF-ĸB에 대한 고미신 M2의 효과 확인

고미신 M2가 염증 유발성 사이토카인인 TNF-α 및 IL-6의 발현을 억제하는 과정에 관여하는 보다 정확한 신호전달 기전을 밝히기 위해, 염증성 사이토카인의 전사를 조절하는 인자로서 면역반응과 염증반응을 매개하는 중요한 신호 전달 물질인 NF-ĸB의 활성화에 대해 측정하였다. 비활성 상태의 NF-ĸB는 내인성 억제 단백질인 IĸBα에 결합하여 비활성화 상태를 유지하다가 활성화되면 IĸBα가 인산화 되어 분해되면서 이들로부터 유리되어 핵으로 이동하여 전사인자로써 활동하므로 IĸBα에 대한 분해 영향도 아울러 측정하였다. NF-ĸB에 대한 고미신 M2의 효과를 확인하기 위해, 비만세포를 항-DNP-IgE로 감작시킨 후, DNP-HSA로 활성화하여 NF-ĸB를 활성화시킨 다음 웨스턴 블럿(Western blot analysis)을 이용하여 핵과 세포질에서 각각의 단백질량을 측정하였다.

구체적으로, BMMC 세포를 0.5mM 페닐메탄에설포닐 플루오라이드(Phenylmethanesulfonyl fluoride, Sigma사, Cat No. P7626)와 5μg/mL의 류펩틴(leupeptin, Sigma 사, Cat No. L2884)을 함유한 추출완충액(0.5% triton X-100, 1mM Na₃VO₄등을 함유한 PBS용액)으로 용해시킨 후, 소니케이션(sonication)하여 DNA를 조각내었다. 단백질량은 소혈청알부민(bovine serum albumin)을 표준으로 하여 Bio-Rad 사의 protein assay kit(Cat No. 500-0002)를 이용해서 측정하였다. 세포 총 단백 10~50μg을 0.1％ SDS를 함유한 8~12％(w/v) 폴리아크릴아마이드겔(polyacrylamide gel)에서 전기영동한 후에 겔에 존재하는 단백질을 일렉트로블로팅(electroblotting) 방법으로 니트로셀룰로오스(nitrocellulose, NC) 필터에 옮긴 후, 비특이적인 결합을 차단하기 위하여 니트로셀룰로오스 필터를 5％ 탈지분유를 함유한 tris-buffered saline-tween(TBS-tween, Sigma 사) 용액에 넣고 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 필터를 타겟 단백질에 대한 항체를 함유한 TBS-tween 용액에 넣고 4℃에서 12시간 동안 방치한 후에 HRP(horseradish peroxidase, Sigma 사, Cat No. P0889)로 표지된 2차 항체로 표지하였으며, ECL(Enhanced chemiluminescence, Thermo scientific 사, Cat No. 34080)을 이용하여 밴드들을 측정하였다. 이렇게 측정한 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4의 결과, BMMC 세포를 항-DNP-IgE로 감작시킨 후, DNP-HSA로 활성화하면 IĸBα가 분해되고, 핵 내의 NF-κB가 증가함을 확인할 수 있었다. 여기에 고미신 M2를 처리할 경우 항-DNP-IgE와 DNP-HSA 결합에 의한 IκBα의 분해를 억제하고 핵 내의 NF-ĸB가 감소함을 확인하였다. 이를 통해 고미신 M2는 NF-ĸB의 활성에 대한 억제 효과가 있으며 이는 핵 내에서 염증 유발성 사이토카인의 유전자 발현에 관여함을 알 수 있었다. 즉, 고미신 M2가 염증 질환에 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

덧붙여, 덱사메타손(dexamethasone)은 전사억제의 기작으로써 강력한 항염증작용을 갖는 약품이므로 염증 신호전달 기전의 억제제 역할을 함으로써 비교약물로 사용되었다.

<실시예 3> 국소 피부 알레르기 반응에 대한 고미신 M2의 효과 확인

항알레르기 효과를 갖는 약물을 개발할 때 많이 사용되는 수동형 국소 피부 알레르기 반응(passive cutaneous anaphylaxis, PCA)을 이용하여 고미신 M2의 피부 알레르기에 대한 효과를 실험하였다. PCA는 IgE에 의해 매개되는 알레르기 반응으로 항체를 국소 피부에 피내주사하고 48시간 후 항원을 생쥐의 꼬리 정맥으로 투여하여 인위적으로 알레르기 반응을 일으키는 실험 방법이다. 이 경우 항체 주사부위에서 항원-항체 반응이 일어나 그 주변에 존재하는 비만세포가 활성화되어 히스타민이 분비되고 국소적으로 알레르기 반응이 일어난다. 따라서 이에 대해 고미신 M2의 농도를 달리하여 귀에 발라준 뒤 생쥐의 발적 정도와 귀의 부종 정도를 관찰하였다. 이렇게 관찰한 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5의 결과, 고미신 M2를 처리 시 농도가 높을수록 부종이 감소하고(도 5B), 발적 부위가 작아지는 결과(도 5C)로부터 고미신 M2가 농도 의존적으로 국소 피부 알레르기 반응을 억제함을 알 수 있었다.

<실시예 4> 비만세포 내에서 고미신 M2의 세포독성 확인

고미신 M2의 세포독성을 확인하기 위하여 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 실험을 하기와 같이 실시하였다. MTT 용액은 살아있는 세포에서 미토콘드리아의 디하이드로게나아제(dehydrogenases)에 의해서 포르마잔(formazan)을 형성하여 세포의 생존 여부를 확인할 수 있다. 세포독성 확인을 위해 BMMC와 RBL-2H3 세포를 96 웰 플레이트에 3×10⁴세포/웰로 37℃에서 배양한 후 고미신 M2를 각각 0.01 ~ 100μM로 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 각 웰에 20μL의 MTT 용액을 첨가하고 2시간 동안 추가로 배양한 후 배양액을 제거하고 100μL의 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide)를 첨가한 후 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6의 결과, 고미신 M2는 10μM의 농도까지 세포독성을 나타내지 않아, 인체에 전혀 무해함을 확인할 수 있었다.

하기에 본 발명에 따른 고미신 M2를 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

<처방예 1> 약학조성물의 처방예

<처방예 1-1> 산제의 제조

고미신 M2 20 mg, 유당 100 mg 및 탈크 10 mg을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

<처방예 1-2> 정제의 제조

고미신 M2 20 mg, 옥수수전분 100 mg, 유당 100 mg 및 스테아린산 마그네슘 2 mg을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

<처방예 1-3> 캅셀제의 제조

고미신 M2 10 mg, 옥수수전분 100 mg, 유당 100 mg 및 스테아린산 마그네슘 2mg을 혼합한 후 통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

<처방예 1-4> 주사제의 제조

고미신 M2 10 mg, 주사용 멸균 증류수 적량 및 pH 조절제 적량을 혼합한 후 통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조하였다.

<처방예 1-5> 연고제의 제조

고미신 M2 10mg, PEG-4000 250mg, PEG-400 650mg, 백색바셀린 10mg, 파라옥시안식향산메칠 1.44mg, 파라옥시안식향산프로필 0.18mg 및 잔량의 정제수를 혼합한 후 통상의 연고제의 제조방법에 따라서 연고제를 제조하였다.

<처방예 2> 건강기능식품

<처방예 2-1> 건강식품의 제조

고미신 M2 1 ㎎, 비타민 혼합물 적량(비타민 A 아세테이트 70 ㎍, 비타민 E 1.0 ㎎, 비타민 B 1 0.13 ㎎, 비타민 B 2 0.15 ㎎, 비타민 B 6 0.5 ㎎, 비타민 B 12 0.2 ㎍, 비타민 C 10 ㎎, 비오틴 10 ㎍, 니코틴산아미드 1.7 ㎎, 엽산 50 ㎍, 판토텐산 칼슘 0.5 ㎎) 및 무기질 혼합물 적량(황산제1철 1.75 ㎎, 산화아연 0.82 ㎎, 탄산마그네슘 25.3 ㎎, 제1인산칼륨 15 ㎎, 제2인산칼슘 55 ㎎, 구연산칼륨 90 ㎎, 탄산칼슘 100 ㎎, 염화마그네슘 24.8 ㎎)을 혼합한 다음 과립을 제조하고 통상의 방법에 따라 건강식품을 제조하였다.

<처방예 2-2> 건강음료의 제조

고미신 M2 1 ㎎, 구연산 1000 ㎎, 올리고당 100 g, 매실농축액 2 g, 타우린 1 g 및 정제수를 가하여 전체 900 ㎖가 되도록 하며, 통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다.

본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 고미신 M2는 알레르기 반응과 관련 있는 비만세포로부터의 히스타민 유리를 억제하고, 염증 유발 사이토카인인 TNF-α 및 IL-6 유전자의 발현 및 전사인자인 NF-ĸB 활성을 억제하는 효과가 우수하여, 알레르기 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있어 산업상 이용가능성이 높다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 고미신 M2(Gomisin M2)를 유효성분으로 포함하는 접촉피부염 또는 아토피피부염에서 선택된 알레르기성 피부질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
[화학식 1]
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제 1 항에 있어서,
상기 조성물은 염증유발 사이토카인인 TNF-α 또는 IL-6 발현 억제와 염증유발 사이토카인의 전사인자인 NF-ĸB 활성 억제하는 것을 특징으로 하는 알레르기 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
하기 화학식 1로 표시되는 고미신 M2(Gomisin M2)를 유효성분으로 포함하는 접촉피부염 또는 아토피피부염에서 선택된 알레르기성 피부질환 예방 또는 개선용 건강기능식품.
[화학식 1]
고미신 M2(Gomisin M2)를 유효성분으로 함유하며, 생체 외(in vitro)에서 비만세포의 TNF-α 또는 IL-6 발현 억제, 및 NF-ĸB 활성 억제를 하는 것을 특징으로 하는, TNF-α 또는 IL-6 발현 억제, 및 NF-ĸB 활성 억제용 시약 조성물.
인간을 제외한 개체로부터 분리된 비만세포에 고미신 M2(Gomisin M2)를 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, TNF-α 또는 IL-6 발현, 및 NF-ĸB 활성 억제방법.