KR101744567B1

KR101744567B1 - 페닐-β-D-글루코피라노사이드를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101744567B1
Application number: KR1020140172879A
Authority: KR
Inventors: 이효종; 황수정
Original assignee: 인제대학교 산학협력단
Priority date: 2014-12-04
Filing date: 2014-12-04
Publication date: 2017-06-09
Also published as: KR20160068055A

Abstract

본 발명은 페닐-β-D-글루코피라노사이드(Phenyl-β-D-glucopyranoside)를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 페닐-β-D-글루코피라노사이드의 용량의존적으로 LPS에 의해 유도되는 NO 생성, iNOS 유전자 및 iNOS 단백질 발현이 억제되었으며, 염증성 사이토카인(cytokines) 및 케모카인(chemokines)의 발현이 페닐-β-D-글루코피라노사이드의 용량의존적으로 감소되었다. 또한, 페닐-β-D-글루코피라노사이드는 Ninj1 발현 및 MMP 활성을 감소시켜 세포와 기질간 접착 활성이 억제하고 NF-κB 신호과정을 억제시키는 것이 확인됨에 따라, 본 발명의 페닐-β-D-글루코피라노사이드를 유효성분으로 함유하는 조성물은 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학조성물 및 개선용 건강식품조성물로 사용될 수 있다.

Description

페닐-β-D-글루코피라노사이드를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating imflammation disease comprising phenyl-β-D-glucopyranoside}

본 발명은 페닐-β-D-글루코피라노사이드를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

염증반응의 조절이 염증 관련 질환의 병인과 밀접하게 관련되며, 이러한 염증 반응은 다양한 신호전달 예를들어, 사이클로옥시게나아제-2(cyclooxygenase-2; COX-2), 유도 산화질소 합성효소(inducible nitric oxide synthase; iNOS), 사이토카인 등의 순차적인 활성화와 관련된다.

NO(nitric oxide), 인터루킨-6(interleukin-6; IL-6) 및 인터루킨-β(interleukin-1β; IL-1β)와 같은 인터루킨, 종양괴사인자-α(tumor necorsis factor-alpha; TNF-α)를 포함한 염증 매개물의 과도한 생성은 류마티스 관절염, 염증성 장질환, 골다공증, 건선, 내독소혈증, 독성쇼크증후군과 같은 염증질환을 매개한다.

인체에서 발생하는 염증 반응은 크게 급성 염증 반응(Acute inflammation)과 만성 염증 반응(Chronic inflammation)으로 구분할 수 있다. 급성 염증 반응은 외부로부터 유입된 항원으로부터 신체를 보호하기 위해 급속하게 발생하는 반응이다.

급성 염증 과정의 시작은 IL-1β, IL-6, TNF-α와 같은 염증성 사이토카인의

분비와, iNOS 및 COX-2 등과 같은 염증 매개 물질 합성 유전자들의 증가를 동반하게 된다. 이처럼 분비된 염증 조절 물질에 의해 활성화된 대식 세포들이 유입된 항원을 효과적으로 제거하게 되며 항원이 모두 제거되면 더 이상의 진행은 멈추게 된다.

급성과 달리 만성 염증 반응은 외부 항원보다는 인체 내부적 요인에 의해 장기간 동안 진행되는 염증 반응으로 대식 세포에 의한 단순 염증 반응이 아닌 대식세포, 호중구와 T 림프구가 포함된 염증 반응으로 IL-17 및 IL-23의 발현이 증가되고 이로 인한 TNF-α 등 염증성 사이토카인들이 지속적으로 발현되어 일어난다.

이와 같은 만성염증질환의 치료는 고전적으로 프레드니솔론과 같은 스테로이

드에 의한 염증 억제제, 나프록센과 같은 비스테로이드성 항염치료제(nonsteroidal anti-inflammatory drugs; NSAID) 및 사이클로스포린이나 FK506과 같이 칼슘 및 칼모듈린 의존성 단백인산화 효소인 칼시뉴린(calcineurin)에 결합하여 그 작용을 억제하는 면역억제제가 가장 많이 사용되고 왔다.

그러나 이러한 스테로이드를 비롯한 면역억제제들은 신독성, 감염, 임파종,당뇨병, 진전(tremor), 두통, 설사, 고혈압, 오심, 신기능 장애 등의 부작용이 따르게 된다.

한국등록특허 제10-1431957호

본 발명은 페닐-β-D-글루코피라노사이드가 지질다당류(LPS)로 자극된 Raw 264.7 세포에서 NO, IL-1β 및 TNF-α와 같은 염증매개성 인자의 발현을 억제하는 것을 확인함에 따라, 염증성 질환 치료제로 이용될 수 있는 페닐-β-D-글루코피라노사이드를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 치료제 또는 염증성 질환 개선용 건강식품을 제공하고자 한다.

본 발명은 페닐-β-D-글루코피라노사이드(Phenyl-β-D-glucopyranoside)를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 페닐-β-D-글루코피라노사이드(Phenyl-β-D-glucopyranoside)를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강식품조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 페닐-β-D-글루코피라노사이드의 용량의존적으로 LPS에 의해 유도되는 NO 생성, iNOS 유전자 및 iNOS 단백질 발현이 억제되었으며, 염증성 사이토카인(cytokines) 및 케모카인(chemokines)의 발현 역시 페닐-β-D-글루코피라노사이드의 용량의존적으로 감소되었다. 또한, 페닐-β-D-글루코피라노사이드는 Ninj1 발현 및 MMP 활성을 감소시켜 세포와 기질간 접착 활성이 억제하고 NF-κB 신호과정을 억제하는 것이 확인됨에 따라, 본 발명의 페닐-β-D-글루코피라노사이드를 유효성분으로 함유하는 조성물은 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학조성물 및 개선용 건강식품조성물로 사용될 수 있다.

도 1은 지질다당류(Lipopolysaccharide; LPS)로 자극된 Raw 264.7 세포에서 산화질소(N0) 생성에 미치는 페닐-β-D-글루코피라노사이드(phenyl-β-D-glucopyranoside)의 영향을 확인한 결과로, 도 1a는 페닐-β-D-글루코피라노사이드 화합물 구조이며, 도 1b는 각각 0, 200 및 500 μM 페닐-β-D-글루코피라노사이드가 처리된 Raw 264.7 세포에 1μg/ml LPS를 24시간 동안 처리한 후, 그리스 시약을 이용하여 N0 생성량을 확인한 결과이며(**P<0.01은 대조군 vs. LPS-처리군; ⁺ P<0.05은 LPS vs. LPS + 페닐-β-D-글루코피라노사이드 처리군), 도 1c는 0, 62.5, 125, 250, 500 및 1000 μM 페닐-β-D-글루코피라노사이드 처리하고 24시간 후 세포 생존율을 확인한 MTT 분석 결과로, 각각의 값을 100%로 표준화하고 평균±표준편차(S.D.)를 대조군 세포의 상대값으로 나타내었다.
도 2는 지질다당류(Lipopolysaccharide; LPS)로 자극된 Raw 264.7 세포에서 산화질소(N0) 생성을 유도하는 iNOS 발현에 미치는 페닐-β-D-글루코피라노사이드(phenyl-β-D-glucopyranoside)의 영향을 확인한 결과로, 도 2a는 iNOS mRNA 수준을 확인한 RT-PCR 분석결과이며, 도 2b는 LPS 자극 24시간 후 iNOS 단백질 수준을 확인한 웨스턴 블롯 결과이며, 도 2c는 면역염색결과로, 녹색은 iNOS 항체를 이용하여 면역염색한 세포이며, 푸른색은 DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)로 염색하여 시각화한 세포이다. 도 2d는 iNOS 면역염색한 세포를 ImageJ (NIH Image)을 이용하여 정량화한 결과로, 값은 대조군의 면역활성 값으로 100% 표준화하였으며, 오차값은 각 실험군(n=1)의 평균±표준편차(S.D.)이며, ***P<0.001은 대조군 vs. LPS-처리군; ⁺⁺⁺P<0.001은 LPS 단독 처리군 vs. LPS + 페닐-β-D-글루코피라노사이드 처리군이며, 이미지는 40배 확대하여 확인하였다.
도 3은 지질다당류(Lipopolysaccharide; LPS)로 자극된 Raw 264.7 세포에서 염증성 사이토카인 및 다른 염증 관련 유전자의 mRNA 발현에 미치는 페닐-β-D-글루코피라노사이드(phenyl-β-D-glucopyranoside)의 영향을 확인한 결과로, 도 3a는 염증성 사이토카인 유전자인 인터루킨-1β(IL-1β) 및 종양 괴사 인자(TNF-α)의 mRNA 발현 수준을 확인한 RT-PCR 분석 결과이며, 도 3b는 다른 염증 관련 유전자인 사이클로올시게나아제(cyclooxygenase-2), 케모카인(C-X-C motif) 리간드 1(CXCL1), 인터루킨-6(interleukin-6)의 mRNA 발현 수준을 확인한 RT-PCR 분석 결과로, 각 유전자의 mRNA 발현 수준은 대조군을 1로 표준화하고 그의 상대값으로 나타내었다.
도 4는 1 μM 지질다당류(Lipopolysaccharide; LPS)로 자극된 Raw 264.7 세포에서 Ninj1 발현에 미치는 페닐-β-D-글루코피라노사이드(phenyl-β-D-glucopyranoside)의 영향을 확인한 결과로, 도 4a는 0, 200 및 500 μM 페닐-β-D-글루코피라노사이드를 처리하고 24시간 후 RT-PCR를 수행한 결과이며, 도 4b는 0, 200 및 500 μM 페닐-β-D-글루코피라노사이드를 처리하고 24시간 후 웨스턴 블롯을 수행한 결과이며, 도 4c는 500 μM 페닐-β-D-글루코피라노사이드를 처리한 후 Ninj1(녹색)로 면역염색하고 핵을 DAPI(파랑)로 대비 염색한 결과이다. 도 4d는 Ninj1 면역염색 후 ImageJ (NIH Image)를 이용하여 정량한 결과로, 각각의 값은 처리되지 않은 대조군의 면역활성으로 100% 표준화하였으며, 오차 값은 각 실험 군(n=1)의 평균±표준편차(S.D.)로 **P<0.01은 대조군 vs. LPS 처리군; ⁺⁺P<0.01 은 LPS 단독 처리군 vs. LPS + 페닐-β-D-글루코피라노사이드 처리군이며, 이미지는 40배 확대하여 확인하였다.
도 5는 1 μM/ml 지질다당류(Lipopolysaccharide; LPS)로 자극된 Raw 264.7 세포에서 세포-기질간의 접착 활성에 미치는 페닐-β-D-글루코피라노사이드(phenyl-β-D-glucopyranoside)의 영향을 확인한 결과로, 도 5a 내지 도 5d는 0, 200 및 500 μM 페닐-β-D-글루코피라노사이드를 Raw 264.7 세포에 처리한 후 각각의 기질에 접착 정도를 확인한 결과로, 도 5a는 콜라겐 타입 Ⅰ기질에 세포 부착 정도를 나타낸 그래프이며, 도 5b는 젤라틴 기질에 세포 부착 정도를 나타낸 그래프이며, 도 5c는 라미닌(laminin; BD) 기질에 세포 부착 정도를 나타낸 그래프이며, 도 5d는 피브로넥틴 기질에 세포 부착 정도를 나타낸 그래프이며, 각각의 접착 값은 100% 표준화하여 대조군 세포의 접착 정도의 상대값으로 나타내었으며, 그래프 값은 세 번씩 반복 실험 후 평균±표준편차(S.D.) 나타내었으며, *P<0.05; **P<0.01은 대조군 vs. LPS-처리군; ⁺ P<0.05 및⁺⁺ P<0.01은 LPS 단독 처리군 vs. LPS + 페닐-β-D-글루코피라노사이드 처리군이다.
도 6은 1 μM/ml 지질다당류(Lipopolysaccharide; LPS)로 자극된 Raw 264.7 세포에서 MMP-2 및 MMP-9 효소 활성에 미치는 페닐-β-D-글루코피라노사이드(phenyl-β-D-glucopyranoside)의 영향을 확인한 결과로, Raw 264.7 세포에 0, 200 및 500 μM 페닐-β-D-글루코피라노사이드가 처리된 Raw 264.7 세포의 MMP-2 및 MMP-9 효소 활성을 확인한 SDS-PAGE 젤라틴 자이모그래피 분석 결과이다.
도 7은 1 μM/ml 지질다당류(Lipopolysaccharide; LPS)로 자극된 Raw 264.7 세포에서 NF-κB 신호과정에 미치는 페닐-β-D-글루코피라노사이드(phenyl-β-D-glucopyranoside)의 영향을 확인한 결과로, 도 7a는 GAPDH를 대조군으로 사용하고 항-IκB 특이적 항체를 이용하여 세포질 IκB 단백질 수준을 분석한 웨스턴 블롯 결과이며, 도 7b는 Lamin-A를 대조군으로 사용하고 항-NF-κB 특이적 항체를 이용하여 핵내 NF-κB 단백질 수준을 확인한 웨스턴 블롯 결과이며, 도 7c는 NF-κB(녹색)를 면역형광 염색하고 핵을 DAPI(파랑)로 대비 염색한 결과로, 이미지는 40배 확대하여 확인하였다.

상기 염증성 질환은 아토피 피부염, 건선, 천식, 결막염, 골관절염, 퇴해성 관절염, 류마티스 관절염, 건염, 건막염, 염증성 장질환, 패혈증, 당뇨병성 망막증 및 신경병성 망막증으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 질환일 수 있으나, 이에 한정되는 것을 아니다.

본 발명의 페닐-β-D-글루코피라노사이드(Phenyl-β-D-glucopyranoside)는 염증산물인 일산화질소(N0), 염증성 사이토카인인 IL-6, IL-1β 및 TNF-α와 케모카인 CXCL1 및 NF-κB의 생성을 감소시킬 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 도 1과 같이 페닐-β-D-글루코피라노사이드의 용량의존적으로 LPS에 의해 유도되는 일산화질소(N0) 생성량이 세포 독성 없이 감소 되었으며, 도 3과 같이 염증성 인자인 IL-1β 및 TNF-α역시 페닐-β-D-글루코피라노사이드의 용량의존적으로 감소되었다. 또한 다른 염증성 인자들인 IL-6, CXCL1 및 NF-κB의 생성 역시 페닐-β-D-글루코피라노사이드의 용량의존적으로 감소되는 것을 확인할 수 있었다.

본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 백혈구의 활성 및 염증 부위로의 이동을 향상시키는 Ninj1(ninjurin 1)역시 LPS에 의해 유도되는데, 이 또한 페닐-β-D-글루코피라노사이드에 의해 증가가 억제되었으며, 이와 함께 MMP-2 및 MMP-9 활성을 억제함으로써, 세포와 기질 간의 접착 활성이 억제되는 것을 확인할 수 있었다.

상기 페닐-β-D-글루코피라노사이드는 약학조성물 총 100 중량부에 대하여 0.01 내지 90 중량부를 포함할 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 페닐-β-D-글루코피라노사이드를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학조성물은 통상적인 방법에 따라 주사제, 과립제, 산제, 정제, 환제, 캡슐제, 좌제, 겔, 현탁제, 유제, 점적제 또는 액제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형을 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 페닐-β-D-글루코피라노사이드를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.

구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면 상기 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.

상기 페닐-β-D-글루코피라노사이드의 바람직한 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 이에 제한되는 것은 아니지만 1일 투여량이 0.01 내지 200 mg/kg, 구체적으로는 0.1 내지 200 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 '대상체'는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

상기 건강식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽 또는 음료의 형태로 제공될 수 있으며, 상기 건강식품은 유효성분인 본 발명에 따른 페닐-β-D-글루코피라노사이드 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를 들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

상기 건강식품에 함유된 페닐-β-D-글루코피라노사이드의 유효용량은 상기 약학조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.

상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실험예 1> 시약 및 세포배양

Raw 264.7 세포를 한국 세포주은행(Korean Cell Line Bank; KCLB)에서 얻어 10% 태아소혈청(FBS; Gibco BRL), 페니실린 100 U/ml / 스트렙토마이신 100 μg/ml)이 포함된 Dulbecco's Modified Eagle's 배지(DMEM, Gibco BRL)에 배양하였다. 지질다당류(Lipopolysaccharide; LPS), 페닐-β-D-글루코피라노사이드(phenyl-β-D-glucopyranoside) 및 그리스(Griess)시약은 시그마(Sigma-Aldrich)에서 구입하여 사용하였다.

< 실험예 2> 역 전사효소-중합효소 연쇄 반응( Reverse transcriptase -polymerase chain reaction ; RT - PCR )

RT-PCR 분석을 이미 공지되어 있는 방법(Hwang, S.J., Y.W. Kim, Y. Park, H.J. Lee, K.W. Kim. 2014 Anti-inflammatory effects of chlorogenic acid in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 cells. Inflammation research 63:81-90.)으로 수행하였다.

본 발명에서 사용된 PCR 프라이머는 Bioneer에서 구입하였다;

iNOS 5’-cagctgggctgtacaaacctt-3’(정방향), 5’-cattggaagtgaagcgtttcg-3’(역방향);

IL-1β 5’-aagggctgcttccaaacctttgac-3’(정방향), 5’-tgcctgaagctcttgttgatgtgc-3’(역방향);

TNF-α 5’-catcttctcaaaattcgagtgacaa-3’(정방향), 5’-tgggagtagacaaggtacaaccc -3’(역방향);

COX-2 5’-ttcaaaagaagtgctggaaaaggt-3’(정방향), 5’-gatcatctctacctgagtgtcttt-3’(역방향),

IL-6 5’-gaggataccactcccaacagacc-3’(정방향), 5’-aagtgcatcatcgttgttcataca-3’(역방향);

CXCL1 5’-tggggacaccttttagcatc-3’(정방향), 5’-cttgaaggtgttgccctc-3’(역방향);

β-actin 5’-agagggaaatcgtgcgtgac-3’(정방향), 5’-ggccgtcaggcagctcatag-3’(역방향)

PCR 증폭 확인을 위해서, β-actin을 내부 대조군으로 사용하여 PCR 산물을 1.5% 아가로스 겔에 분리시킨 후 RedSafe nucleic acid staining (Intron, Korea)으로 시각화하고 UV를 조사하여 확인하였다.

< 실험예 3> 웨스턴 블롯 분석( western blot analysis )

전체 세포 추출물과 세포분획을 준비하여 이미 공지되어 있는 방법(Hwang, S.J., Y.W. Kim, Y. Park, H.J. Lee, K.W. Kim. 2014 Anti-inflammatory effects of chlorogenic acid in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 cells. Inflammation research 63:81-90.)으로 웨스턴 블롯을 수행하였다.

웨스턴 블롯 분석을 위해, NOS, Tubulin, NF-κB, I-κB 및 GAPDH 항체를 Santa Cruz Biotechnology에서 구입하여 사용하였다.

< 실험예 4> 면역 형광현미경 분석 및 정량

면역염색을 이미 공지된 방법(Hwang, S.J., Y.W. Kim, Y. Park, H.J. Lee, K.W. Kim. 2014 Anti-inflammatory effects of chlorogenic acid in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 cells. Inflammation research 63:81-90.)으로 수행하였다.

Ninj1 (1:500, a thankful gift from Dr. K.W. Kim), iNOS (1:500, BD Biosciences) 및 p65 (1:200, Cell signaling) 항체를 이용하여 면역염색 하였으며, 핵은 4'-6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI, Invitrogen)을 이용하여 염색한 후 이미지는 Axiovert M200 현미경(Zeiss)으로 얻었다. 그 후 ImageJ를 이용하여 iNOS, Ninj1 및 DAPI의 화소 강도를 면역반응력의 백분율로 측정한 후 통계학적으로 비교하였다. 모든 화소 강도는 40× 이미지로 측정 및 비교하였다.

< 실험예 5> 데이터 분석 및 통계

모든 데이터는 평균±S.D. 및 상대백분율로 나타내었으며, 그룹간의 통계 비교는 Student's t-test를 이용하여 수행하였으며, P<0.05을 통계학적으로 유의한 값으로 고려하였다.

< 실시예 1> 페닐 -β-D- 글루코피라노사이드의 산화질소( NO ) 억제 효과 확인

생쥐 Raw 264.7 대식세포에서 LPS에 의해 유도되는 산화질소(NO) 생성에 페닐-β-D-글루코피라노사이드가 미치는 영향에 대하여 확인하였다.

산화질소(NO) 생성 분석은 이미 공지되어 있는 방법(Hwang, S.J., Y.W. Kim, Y. Park, H.J. Lee, K.W. Kim. 2014 Anti-inflammatory effects of chlorogenic acid in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 cells. Inflammation research 63:81-90.)으로 수행하였다.

1 μg/mL LPS 존재하에 Raw 264.7 세포를 24시간 동안 사전 배양한 후 페닐-β-D-글루코피라노사이드 처리군과 비처리군으로 분리하여 처리군에는 페닐-β-D-글루코피라노사이드 1시간 동안 처리하였다. 그 후 배양 배지 내 아질산염(nitrite) 양을 그리스(Griess) 시약을 이용하여 540 nm 흡광도에서 측정하였다.

그 결과, 도 1b와 같이 페닐-β-D-글루코피라노사이드의 용량의존적으로 LPS에 의해 유도되는 NO 생성이 유의하게 억제되는 것을 확인할 수 있었다.

또한 페닐-β-D-글루코피라노사이드의 NO 생성 억제 효과가 세포 독성에 의한 것인지 확인하기 위해, 세포생존율을 확인하였다.

세포 생존율 분석을 이미 공지되어 있는 방법(Hwang, S.J., Y.W. Kim, Y. Park, H.J. Lee, K.W. Kim. 2014 Anti-inflammatory effects of chlorogenic acid in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 cells. Inflammation research 63:81-90.)으로 수행하였다. Raw 264.7 세포에 각 실험에 바람직한 양의 페닐-β-D-글루코피라노사이드(phenyl-β-D-glucopyranoside)를 처리하고 24시간 후 20 μl CellTiter 96 Aqueous One Solution Reagent (Promega, Madison, WI)을 첨가하여 490 nm 흡광도에서 세포 생존율을 측정하였다.

그 결과, 도 1c와 같이 페닐-β-D-글루코피라노사이드를 1,000μM 농도까지 증가시켜도 세포생존율에 영향을 미치지 않는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터, 페닐-β-D-글루코피라노사이드는 대식세포에서 세포독성 없이 NO 생성 억제 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.

다음으로, 페닐-β-D-글루코피라노사이드가 LPS에 의해 유도되는 iNOS 유전자 발현에 영향을 미치는지 생쥐 Raw 264.7 대식세포에서 RT-PCR 및 웨스턴 블롯으로 확인하였다.

그 결과, 도 2a 및 도2b와 같이 LPS에 의해 유도되는 iNOS 유전자 및 iNOS 단백질 발현 역시 페닐-β-D-글루코피라노사이드의 용량의존적으로 매우 감소된 것을 확인할 수 있었다.

또한, 면역형광염색을 수행하고 iNOS 화소 강도(면역활성구역 %)를 정량한 결과, 도 2c 및 도 2d와 같이 LPS에 의해 유도되는 iNOS 증가가 페닐-β-D-글루코피라노사이드 처리에 의해 억제되는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 페닐-β-D-글루코피라노사이드가 iNOS 유발 효과를 억제하는 것이 확인되었다.

< 실시예 2> 페닐 -β-D- 글루코피라노사이드의 염증성 사이토카인 발현 억제 효과 확인

페닐-β-D-글루코피라노사이드가 IL-1β 및 종양 괴사 인자-α(tumor necrosis factor-α; TNF-α)를 포함하는 염증성 사이토카인의 발현에 미치는 영향을 확인하기 위해, 1 μg/mL LPS 존재하에 Raw 264.7 세포를 24시간 동안 사전 배양한 후, 500μM 페닐-β-D-글루코피라노사이드를 24시간 처리하고 RT-PCR로 수행하였다.

그 결과, 도 3a와 같이 LPS에 의해 유도되는 IL-1β 및 TNF-α의 발현이 유의하게 억제되는 것이 확인되었다.

상기 결과와 같이, 페닐-β-D-글루코피라노사이드의 항염증 효과를 확인하기 위해, 추가로 페닐-β-D-글루코피라노사이드가 미치는 다른 염증관련 유전자들의 발현을 RT-PCR로 확인하였다.

그 결과, 도 3b와 같이 LPS에 의해 유도되는 cyclooxygenase 2 (COX -2), IL -6, chemokine ligand 1 (CXCL1) 및 MCP -1 mRNA 발현이 페닐-β-D-글루코피라노사이드에 의해 유의하게 감소 되는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과들로부터 페닐-β-D-글루코피라노사이드가 염증성 사이토카인(cytokines) 및 케모카인(chemokines)의 발현을 감소시키는 것으로 확인되었다.

< 실시예 3> 페닐 -β-D- 글루코피라노사이드의 ninjurin 1( Ninj1 ), 세포-기질 간 접착 및 matrix metalloproteinase ( MMP ) 활성 억제 효과 확인

세포 접착 단백질 act는 염증시 백혈구와 세포 또는 세포 기질 단백질 사이의 인식시스템에서 중요한 역할을 한다. 그 중 Ninj1(ninjurin 1)은 발육과정 및 염증 반응에서 백혈구의 활성 및 염증 부위로의 이동을 향상시킨다.

따라서, 본 발명자들은 페닐-β-D-글루코피라노사이드가 Ninj1 발현 및 대식 세포의 접착 활성에 어떠한 영향을 미치는지 RT-PCR 및 웨스턴 블롯으로 확인하였다.

그 결과, 도 4a 및 도 4b와 같이 LPS에 의해 유도되는 Ninj1 mRNA 및 단백질의 발현이 페닐-β-D-글루코피라노사이드의 용량의존적으로 유의하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 면역형광 염색 및 Ninj1 화소 강도를 통한 정량 분석 결과, 도 4c 및 도 4d와 같이 페닐-β-D-글루코피라노사이드가 LPS 처리에 의해 유도되는 Ninj1 증가를 억제하는 것이 확인되었다.

다음으로, Raw 264.7 세포에서 세포-기질간 접착에 페닐-β-D-글루코피라노사이드가 미치는 영향을 확인하였다.

피브로넥틴(Invitrogen), 콜라겐 타입 I (BD), 라미닌(laminin; BD) 및 젤라틴(Sigma)과 같은 EMC을 사용하여, 이미 공지되어 있는 방법(Hwang, S.J., Y.W. Kim, Y. Park, H.J. Lee, K.W. Kim. 2014 Anti-inflammatory effects of chlorogenic acid in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 cells. Inflammation research 63:81-90.)으로 세포 접착 분석을 수행하였다.

접착된 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색한 후 두 번 반복하여 세척하고 0.2% NP-40로 세포 용해시킨 후 용해물을 ELISA를 이용하여 590 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 5와 같이 LPS에 의해 유도되는 염증 조건에서 대조군보다 Raw 264.7 세포가 콜라겐 타입I, 젤라틴, 라미닌(laminin), 및 피브로넥틴(fibronectin) 기질에 접착 정도가 증가된 것을 확인할 수 있었다. 반면, 페닐-β-D-글루코피라노사이드가 처리된 Raw 264.7 세포군에서는 페닐-β-D-글루코피라노사이드의 용량의존적으로 LPS에 의해 유도되는 접착 활성이 억제되는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 페닐-β-D-글루코피라노사이드에 의한 MMP-2 및 MMP-9 활성 효과를 확인하기 위해 배지내 MMP-2 및 MMP-9의 효소 활성을 젤라틴 자이모그래피 분석으로 확인하였다.

먼저, 세포 배양 배지를 단백질 함량에 따라서 표준화한 후 1.5 mg/ml 젤라틴이 포함된 10% SDS-PAGE 전기영동하고, SDS를 제거하기 위해 2.5% 트리톤 X-100 및 50 mM Tris-HCl (pH7.5)로 실온에서 1시간 동안 겔을 세척하였다.

그 후, 겔을 150 mM NaCl, 5 mM CaCl₂ 및 50 mM Tris-HCl (pH7.6)가 포함된 버퍼에서 담궈 37 ℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하고 0.1% 쿠마시 브릴리언트 블루 R- 250(Coomassie Brilliant Blue R- 250)로 염색한 후 10% 메탄올로 탈색하고 5% 빙초산(glacial acetic acid)으로 젤라티나아제(gelatinase) 활성영역을 나타내었다. 그 결과를 Image J software (NIH)를 이용하여 분석하였으며, 모든 자이모그래피 실험은 세 번씩 반복 수행되었다.

그 결과, 도 6과 같이 페닐-β-D-글루코피라노사이드를 처리한 RAW 264.7 세포군에서는 페닐-β-D-글루코피라노사이드 용량의존적으로 MMP-2 및 MMP-9 활성이 억제된 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터, 페닐-β-D-글루코피라노사이드는 Ninj1 발현 및 MMP 활성을 감소시켜 Raw 264.7 세포의 접착 활성을 억제하는 것으로 확인되었다.

< 실시예 4> 페닐 -β-D- 글루코피라노사이드의 NF -κB 억제 효과 확인

LPS에 의한 NF-κB 활성화는 염증성 매개인자들의 발현을 유도하기 때문에, 본 발명자들은 LPS에 의해 유도된 염증조건에서 NF-κB 신호 전달 과정에 페닐-β-D-글루코피라노사이드가 미치는 영향을 확인하였다.

먼저, 페닐-β-D-글루코피라노사이드가 IκB 단백질의 전환 및 세포내 분포와 같은 NF-κB 활성에 영향을 나타낼 수 있는지 확인하기 위해, 면역블롯 분석을 통하여 세포질 내 IκBα양을 측정하였다.

그 결과, 도 7a와 같이 페닐-β-D-글루코피라노사이드를 처리한 실험군의 경우, LPS에 의해 유도된 IκB 단백질의 감소가 페닐-β-D-글루코피라노사이드 존재하에서 억제되는 것을 확인하였다. 또한, LPS가 처리된 세포에서 p65(NF-κB)의 주요 핵 축적이 확인되었으나, 도 7b 및 도7c와 같이 페닐-β-D-글루코피라노사이드를 처리한 세포군에서는 페닐-β-D-글루코피라노사이드에 의해 핵 전좌가 매우 감소한 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터, 페닐-β-D-글루코피라노사이드에 의한 NF-κB 신호과정 억제는 LPS에 의해 유도된 NO 및 염증성 사이토카인 억제 반응에 의한 것임이 확인되었다.

이하, 본 발명의 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

< 제제예 1> 주사제의 제조

페닐-β-D-글루코피라노사이드 10 mg, 소디움 메타비설파이트 3.0 mg, 메틸파라벤 0.8 mg, 프로필파라벤 0.1 mg 및 주사용 멸균증류수 적량을 혼합하고 통상의 방법으로 최종 부피가 2 ㎖이 되도록 제조한 후, 2 ㎖ 용량의 앰플에 충전하고 멸균하여 주사제를 제조하였다.

< 제제예 2> 정제의 제조

페닐-β-D-글루코피라노사이드 10 mg, 유당 100 mg, 전분 100 mg 및 스테아린산 마그네슘 적량을 혼합하고 통상의 정제 제조방법에 따라 타정하여 정제를 제조하였다.

< 제제예 3> 캡슐제의 제조

페닐-β-D-글루코피라노사이드 10 mg, 유당 50 ㎎, 전분 50 ㎎, 탈크 2 ㎎ 및 스테아린산 마그네슘 적량을 혼합하고 통상의 캡슐제 제조방법에 따라 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

이하, 본 발명에 따른 플라스마로젠 또는 이의 유사체를 이용한 건강식품 제조예를 설명하나, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아니라 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

< 제조예 1> 건강식품의 제조

페닐-β-D-글루코피라노사이드 10 mg, 비타민 혼합물 적량(비타민 A 아세테이트 70 ㎍, 비타민 E 1.0 ㎎, 비타민 B 1 0.13 ㎎, 비타민 B 2 0.15 ㎎, 비타민 B 6 0.5 ㎎, 비타민 B 12 0.2 ㎍, 비타민 C 10 ㎎, 비오틴 10 ㎍, 니코틴산아미드 1.7 ㎎, 엽산 50 ㎍, 판토텐산 칼슘 0.5 ㎎), 무기질 혼합물 적량(황산제1철 1.75 ㎎, 산화아연 0.82 ㎎, 탄산마그네슘 25.3 ㎎, 제1인산칼륨 15 ㎎, 제2인산칼슘 55 ㎎, 구연산칼륨 90 ㎎, 탄산칼슘 100 ㎎, 염화마그네슘 24.8 ㎎)을 혼합한 다음 과립을 제조하고 통상의 방법에 따라 건강식품을 제조하였다.

<제조예 2> 건강음료의 제조

페닐-β-D-글루코피라노사이드 10 mg, 구연산 1000 ㎎, 올리고당 100 g, 매실농축액 2 g, 타우린 1 g 및 정제수를 가하여 전체 900 ㎖가 되도록 하며, 통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

페닐-β-D-글루코피라노사이드(Phenyl-β-D-glucopyranoside)를 유효성분으로 함유하고, 상기 페닐-β-D-글루코피라노사이드는 Ninj1 발현을 억제시키며, 염증성 장질환, 건선, 패혈증, 천식, 당뇨병성 망막증 및 신경병성 망막증으로 이루어진 군에서 선택된 질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
삭제
청구항 1에 있어서, 상기 페닐-β-D-글루코피라노사이드(Phenyl-β-D-glucopyranoside)는 일산화질소(N0), 염증성 사이토카인인 IL-6, IL-1β및 TNF-α와 케모카인 CXCL1 및 NF-κB의 생성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 염증성 장질환, 건선, 패혈증, 천식, 당뇨병성 망막증 및 신경병성 망막증으로 이루어진 군에서 선택된 질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
페닐-β-D-글루코피라노사이드(Phenyl-β-D-glucopyranoside)를 유효성분으로 함유하고, 상기 페닐-β-D-글루코피라노사이드는 Ninj1 발현을 억제시키며, 염증성 장질환, 건선, 패혈증, 천식, 당뇨병성 망막증 및 신경병성 망막증으로 이루어진 군에서 선택된 질환 예방 또는 개선용 건강식품.