KR102163223B1

KR102163223B1 - 한련초 추출물을 포함하는 발모 촉진용 조성물

Info

Publication number: KR102163223B1
Application number: KR1020180002896A
Authority: KR
Inventors: 한창훈; 장지태; 송창우
Original assignee: 제주대학교 산학협력단; 아쿠아그린텍(주); 송창우
Priority date: 2017-01-09
Filing date: 2018-01-09
Publication date: 2020-10-08
Also published as: KR20180082351A

Abstract

본 발명은 식물성 오일을 이용하여 한련초의 오일 성분을 추출한 인퓨즈드 오일을 포함하는 발모 촉진용 조성물에 관한 것이다. 또는 식물성 오일을 이용한 한련초 인퓨즈드 오일을 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 인퓨즈드 오일은 식물성 오일의 성분과 한련초로부터 추출 성분을 모두 포함하여 발모 촉진의 효과가 우수하여 이를 화장료, 제약 및 식품등에 활용할 수 있다.

Description

한련초 추출물을 포함하는 발모 촉진용 조성물{A composition for promotion of hair growth comprising extracts of Eclipta prostrata}

본 발명은 식물성 오일을 이용한 한련초 추출물을 포함하는 발모 촉진용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

인체의 모발은 약 10만15만 개 정도이며 "모낭"에서 형성된다. 모낭에는 유두가 있는데, 이 부위에는 작은 혈관이 분포되어 모발의 성장에 필요한 영양분을 공급하고 유두 위의 옆으로는 모발에 윤기를 주는 기름을 공급해 주는 지루샘이 있다. 모낭(hair follicle)은 여러 다른 상피세포들(epithelial cells) 및 모유두 세포들(dermal papilla cells, DPCs)로 이루어진다. DPCs은 모낭의 기저부에 위치한 중간엽-유래 섬유아세포(mesenchymally-derived fibroblasts)이며 육모에 중요한 역할을 한다. 특히, 미녹시딜(minoxidil)은 DPCs에 증식 및 항-세포사멸 효과를 가지는 것으로 보고되었다. 유사하게, 여러 보고서들은 DPCs의 증식을 통한 육모의 증가를 보여줬다. 각각의 모발은 서로 다른 주기를 가지며 성장기(anagen), 퇴행기(catagen), 휴지기(telogen)를 거쳐서 성장하고 탈락한다. 이러한 주기는 36년에 걸쳐 반복되는데, 일일 평균 50100 개의 모발이 정상적으로 탈락하게 된다. 일반적으로 탈모증이라 함은 이러한 주기 중에서 성장기 모발의 비율이 짧아지고 퇴행기 또는 휴지기 모발이 많아져 탈락하는 모발의 숫자가 비정상적으로 많아지는 것을 일컫는다.

항암 화학요법의 부작용으로는 백혈구감소, 구토, 설사 및 탈모가 있으며, 이중 항암 화학요법에 의한 탈모 (chemotherapy induced alopecia)는 약 65% 정도 발생하는 것으로 알려져 있다(Trueb RM, 2010). 항암 화학요법에 의한 탈모를 유발하는 약물중 5-fluorouracil은 대사길항제(antimetabolite)의 일종으로 thymidylate synthase를 억제하여 DNA 합성 저해 및 세포사멸을 유도하는 것으로 알려져 있다(Longley DB etal.,2003).

이와 같이 탈모에 대한 많은 연구가 진행되어 왔음에도 불구하고, 근본적인 탈모에 대한 메커니즘은 잘 알려져 있지 않다. 또한 탈모를 치료하기 위한 노력도 진행되어 왔다. 그럼에도 불구하고, 지금까지 오직 두 개의 약물들(피나스테라이드(finasteride) 및 미녹시딜(minoxidil))만이 탈모 치료를 위해 FDA(Food and Drug Administration) (U.S.A)에서 인가되었다. 5α-reductase 억제제인 피나스테라이드는 남성의 안드로겐성 탈모증(androgenetic alopecia)에서 육모를 촉진시키기 위해 이용되어 왔다. 혈압강하제(anti-hypertensive agent)인 미녹시딜은 ATP-민감성 K+-채널 개방에 의해 육모를 촉진시킬 수 있다. 그러나, 약물의 효과는 예측불가능한 효과 및 부작용 때문에 제한적이고 일시적이다. 탈모를 예방하고 육모를 촉진시키는 더 나은 새로운 치료제가 필요하다. 지금까지 탈모를 방지하여 주고 발모촉진 및 모발에 생장에 효과를 가지고 있다고 알려져 있는 미녹시딜(minoxidil)이나 트리코사카라이드(trichosaccharide)등의 제제들의 경우, 뚜렷한 효능의 부재 및 인체 안정성, 피부자극 유발 등의 부작용 문제가 대두되고 있어 안전성 및 효능이 확보된 조성물 개발이 시급한 실정이다.

또한, 한련초, 동백나무, 유채와 같은 식물 자원의 주요 성분은 오일 성분으로 기능성식품 또는 약학적 조성물, 화장료 조성물로 이용하기 위해서는 오일성분의 추출 및 정제가 중요한 기술로 여겨진다. 상기 오일 성분들의 추출에 있어서 물을 이용할 경우 오일성분들이 충분히 추출되지 않는 단점이 있어 유기용매를 사용하여 추출하였으나 유기용매의 유해성이 문제시되어왔다.

인퓨즈드 오일은 상기와 같은 오일성분 추출의 문제점을 해결하기 위하여 식물의 오일성분을 추출할 때 추출용매로써 오일을 사용하여 추출하여 수득한 오일을 일컫는다. 상기 인퓨즈드오일은 식물의 오일성분을 추출하기 위하여 용매로 사용한 오일의 기능성 성분과, 식물로부터 추출된 오일의 유효성분이 함께 시너지 효과를 내어 유효성분의 함량이 증대되고 기능성이 향상되어 화장품 제조시 다양한 제품에 적용할 수 있는 장점을 가진다.

이에 본 발명자들은 한련초를 동백 오일 또는 유채 오일로 추출한 인퓨즈드 오일의 유효성분 내에서 모발개선 효능을 확인하고 이를 이용한 화장료 조성물 및 약학 조성물을 개발하였다.

한국등록특허 제10-1238706

본 발명의 목적은 식물성 오일을 이용하여 한련초 인퓨즈드 오일을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 한련초 인퓨즈드 오일을 유효성분으로 포함하는 육모 촉진을 위한 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 한련초 인퓨즈드 오일을 유효성분으로 포함하는 육모 촉진을 위한 건강 기능 식품을 제공하는 것이다.

본 발명은 한련초 인퓨즈드 오일 제조방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은,

한련초 잎을 식물 오일과 1:10의 비율로 혼합하는 단계;

상기 혼합물을 50 내지 70℃ 수조에서 1시간 동안 온침법으로 추출하는 단계; 및

상기 추출물을 여과하는 단계;를 포함하는 한련초 인퓨즈드 오일 제조 방법일 수 있다.

또한, 본 발명은

한련초 잎을 식물 오일과 1:10의 비율로 혼합하는 단계;

상기 혼합물을 진공저온법으로 추출하는 단계; 및

본 발명에서 사용되는 용어 "한련초"는 우리나라의 중부와 남부지방의 논두렁, 개울가의 습기가 있는 곳에서 자생하는 다년초 식물로써 애장초, 목한련, 묵두초, 하련초 등으로도 불린다. 한련초에는 사포닌과 탄닌, 고미질, 에크립틴(한련초소), 비타민 A류 물질, 니코틴과 쿠마린 화합물인 웨델로락톤(wedelolactone)과 데메시웨델로락톤(demethylwedelolactone-7-glucosid)이 함유되어 있다.

상기 한련초로부터 오일 성분들의 추출에 있어서 물을 이용할 경우 오일성분들이 충분히 추출되지 않는 단점이 있어 유기용매를 사용하여 추출하였으나 유기용매의 유해성이 문제시되어왔다.

본 발명에서 정의되는 “인퓨즈드 오일”은 상기와 같은 오일성분 추출의 문제점을 해결하기 위하여 식물의 오일성분을 추출할 때 추출용매로써 오일을 사용하여 추출하여 수득한 오일을 일컫는다. 본 발명에서 상기 “인퓨주드 오일”은 한련초 추출물과 혼용하여 사용될 수 있다. 상기 인퓨즈드 오일은 식물의 오일성분을 추출하기 위하여 용매로 사용한 오일의 기능성 성분과, 식물로부터 추출된 오일의 유효성분이 함께 시너지 효과를 내어 유효성분의 함량이 증대되고 기능성이 향상되어 화장품 제조시 다양한 제품에 적용할 수 있는 장점을 가질 수 있다.

구체적으로, 본 발명은 한련초로부터 오일 성분을 추출하기 위해 식물 오일을 사용하며, 더욱 구체적으로, 동백 오일 또는 유채 오일을 사용할 수 있다.

상기 한련초 인퓨즈드 오일 제조방법에 있어서, 온침법을 이용하는 경우에 바람직하게는 60℃의 수조에서 1시간동안 추출하는 것이 바람직할 수 있다.

본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 한련초 인퓨즈드 오일을 유효성분으로 포함하는 육모 촉진을 위한 화장료 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 탈모는 두피로부터 모발이 탈락하는 현상 또는 모발이 성기거나 가늘어지는 상태를 의미하며, 탈모 방지라 함은 상술한 바와 같은 탈모 현상을 예방하고 억제하는 것을 의미하고, 육모 촉진이라 함은 새로운 모발의 생성의 촉진뿐만 아니라 기존 모발이 건강하게 자라도록 하는 것을 의미한다.

일반적으로 육모는 성장기에서 이루어지며, 휴지기에서 성장기로의 유도 및 성장기에서 퇴행기로의 지연에 의하여 촉진된다. 모발주기는 성장기, 퇴행기, 휴지기로 알려져 있는 3개의 주요 단계들로 나눌 수 있다. 성장기에는 세포의 빠른 증식과 함께 피부 안으로 깊이 모낭이 성장하면서 모발형성이 이루어진다. 다음 현상은 퇴행기인데 이것은 세포 분열의 중단이 두드러지는 과도기이며, 이 과정에서 모낭은 점차 퇴행하며 육모가 중단된다. 다음 현상인 휴지기에서는 퇴행 모낭은 조밀하게 찬 모유두(dermal papilla) 세포를 갖는 배(germ)를 포함한다. 휴지기에서 새로운 성장기 현상의 개시는 상기 배에서 빠른 세포 증식, 모유두의 팽창 및 기저막 요소의 합성에 의해 유도된다.

따라서, 성장기의 촉진 또는 연장에 의해 모발의 손실 방지, 즉 탈모를 방지하거나 모발의 재성장을 유발, 즉 육모를 촉진하는 것이 필요하며, 본 발명에 따른 조성물은 이미 존재하고 있는 모발이 빠지지 않게 하는 효과, 이미 존재하는 모발을 굵게 하는 등 개선시키는 효과, 및 새로운 모발을 생성하는 효과 중 하나 이상을 포함한다.

상기 한련초 인퓨즈드 오일의 농도는 1 내지 100 μg/ml인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 한련초 인퓨즈드 오일은 천연물로부터 추출한 것이므로 독성이 거의 없다.

상기 조성물은 헤어토닉, 헤어컨디셔너, 헤어에센스, 헤어로션, 헤어영양로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 헤어크림, 헤어영양크림, 헤어모이스처크림, 헤어맛사지크림, 헤어왁스, 헤어에어로졸, 헤어팩, 헤어영양팩, 헤어비누, 헤어클렌징폼, 머릿기름, 모발건조제, 모발보존처리제, 모발염색제, 모발용 웨이브제, 모발탈색제, 헤어겔, 헤어글레이즈, 헤어드레싱어, 헤어래커, 헤어모이스처라이저, 헤어무스 및 헤어스프레이로 이루어진 군에서 선택된 제형인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 화장료 조성물은 지방 물질, 유기용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 상기 보조제는 화장품학 또는 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입된다.

이에 따른 화장료 조성물은 예를 들어 화장료 조성물일 수 있으며, 화장료 조성물의 외형은 화장품학 또는 피부과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유한다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로, 예를 들면, 용액, 겔, 고체, 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는, 이온형(리포좀) 및 비이온형의 소낭 분산제의 형태로, 또는 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 또한 폼(foam)의 형태로 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 사용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들면, 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 아이에센스, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 바디로션, 바디크림, 바디오일 및 바디에센스 등의 화장품으로 제형화될 수 있다.

상술한 바와 같은 화장료 조성물은 피부에 바르는 형태로 적용될 수도 있고, 마이크로 니들 등을 이용하여, 피부 내부로 흡수되는 형태로 적용될 수도 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 모발에 도포하기에 적당한 캐리어 또는 캐리어 혼합물을 포함하여 모발 조성물로 제조될 수 있다. 캐리어는 용매와 다른 캐리어 또는 모발 보호 조성물에 통상적으로 사용되는 비히클(vehicle) 성분을 포함하며, 바람직하게는 리포좀 형태일 수 있다. 전체 조성물의 조성물 중 약 0.5% 내지 99.5%, 바람직하게는 약 5.0% 내지 99.5%, 가장 바람직하게는 약 10.0% 내지 90.0%로 존재한다. 캐리어로서 용매는 제형화된 모발 조성물이 헤어 스프레이, 무스, 토닉 등과 같이 사용 후 모발에 남는 것이거나 샴푸, 컨디셔너 등과 같이 세정되는 것에 관계없이 사용하는 공중합체에 의해 선택된다. 본 발명에서 사용하는 적합한 용매는 물, 저급 알코올(에탄올, 이소프로판올 등), 하이드로알콜계 혼합물, 탄화수소(이소부탄, 헥산, 데센등), 아세톤, 할로겐화 탄화수소(프레온 등), 탄화수소 에스테르(에틸 아세테이트, 디부틸 프탈레이트 등), 휘발성 실리콘 유도체, 실록산(페닐 펜타메틸 디실록산, 메톡시프로필 헵타메틸 사이클로테트라실록산, 클로로프로필 펜타메틸 디실록산, 하이드록시프로필 펜타메틸 디실록산, 옥타메틸 사이클로테트라실록산, 데카메틸 사이클로펜타실록산 등) 및 이들의 혼합물을 포함하는 것이 바람직하다.

아울러, 본 발명은 한련초 인퓨즈드 오일을 유효성분으로 포함하는 탈모 방지 또는 육모 촉진용 건강기능 식품을 제공한다.

상기 한련초 인퓨즈드 오일의 농도는 1 내지 100 μg/ml인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 건강기능 식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 식품은 상기 한련초 인퓨즈드 오일을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 한련초 인퓨즈드 오일을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.

본 발명의 음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 0.01 ~ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 g 이다.

상기 외에 본 발명의 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일 주스, 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.001 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명은 식물성 오일을 이용하여 한련초의 오일 성분을 추출한 인퓨즈드 오일을 포함하는 발모 촉진용 조성물에 관한 것이다. 상기 인퓨즈드 오일은 식물성 오일의 성분과 한련초로부터 추출 성분을 모두 포함하여 발모 촉진의 효과가 우수하여 이를 화장료, 제약 및 식품등에 활용할 수 있다.

도 1은 한련초 추출물을 제조하는 단계를 나타낸 공정도이다.
도 2는 대조군, 미녹시딜, 동백 오일 및 동백 오일로 추출한 한련초 추출물을 마우스에 처리한 후 발모 효과를 육안으로 확인한 것이다.
도 3은 대조군, 미녹시딜, 동백 오일 및 동백 오일로 추출한 한련초 추출물을 마우스에 처리한 후 발모 효과를 Image J를 이용하여 화상 분석한 결과이다.
도 4는 대조군, 미녹시딜, 동백 오일 및 동백 오일로 추출한 한련초 추출물을 마우스에 처리한 후 발모 효과를 Image J를 이용하여 분석한 결과를 그래프화 한 것이다.
도 5는 대조군, 미녹시딜, 유채 오일 및 유채 오일로 추출한 한련초 추출물을 마우스에 처리한 후 발모 효과를 Image J를 이용하여 분석한 결과를 그래프화 한 것이다.
도 6은 대조군, 미녹시딜, 동백 오일, 동백 오일로 추출한 한련초 추출물, 유채 오일 및 유채 오일로 추출한 한련초 추출물을 처리한 마우스의 피부 속 모낭 조식을 관찰한 결과이다.
도 7은 마우스 등에서 발현되는 모발 성장 및 퇴행에 관련된 단백질의 발현을 조사하기 위한 항체 어레이(antibody array) 공정을 도식화한 것이다.
도 9은 대조군, 미녹시딜, 동백 오일 및 동백 오일로 추출한 한련초 추출물을 도포한 마우스 등 피부 내에서의 모낭의 성장 및 퇴행에 관여하는 단백질 발현율을 각각 스캔 이미지화 한 것이다.
도 9은 동백 오일로 추출한 한련초 추출물(인퓨즈드 오일)을 함유하는 헤어제품(에센스) 제조 공정도이다.
도 10는 동백 오일로 추출한 한련초 추출물(인퓨즈드 오일)을 함유하는 헤어제품(샴푸) 제조 공정도이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 통상의 기술분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<실시예 1> 동백 오일 또는 유채 오일을 이용한 한련초 추출물의 제조

<1-1> 온침법을 이용한 한련초 추출물 제조

한련초 잎만 모아서 전자저울에 40g씩 두 그룹을 정량하였다. 정량한 한련초 잎을 유채오일 또는 동백오일 (400ml) 과 섞어 10% 농도로 맞추었다. 상기 혼합물을 60℃ water bath에서 1시간 온침법으로 추출하였다. 추출 후 0.45 μm 여과지를 이용해 1차 여과를 하여 큰 잎 등을 걸러내고 0.2 μm membrane filter를 통해 2차 여과를 하였다. 추출액을 분주하여 표지 한 후 냉장 보관하였다(도 1).

<1-2> 진공저온법을 이용한 한련초 추출물 제조

한련초 추출물을 제조하기 위해 동백 또는 유채오일에 한련초를 진공저온(저온고압)법으로 인퓨즈드를 하였다. 인퓨즈드 시 한련초 : 동백 또는 유채오일 의 비율은 1 : 10으로 진행하였다. 인퓨즈드한 한련초 추출물을 0.45 μm filter paper를 통해 잔사 제거 후, 0.2 μm membrane filter를 통해 다시 한 번 필터를 하였다.

<실시예 2> Liposome 제형 개발

가. 리포좀 준비작업

1) 마유를 40 ℃ 온수조에서 용융시킨다.

2) 정제수에 레시틴, 보조 유화제 등을 넣고 75℃에서 용해시킨다.

3) 50 ℃정도까지 냉각한 후 시료와 혼합 교반하여 Microfluidizer에 투입한다.

※ Microfluidizer 압력 셋팅 : 압력 gauge 밸브를 열고 압력조절 스위치를 돌려 25,000psi로 셋팅하고 압력 gauge 밸브를 잠근다.

4) 압력 셋팅이 완료되면 혼합물질을 Product Inlet Reservoir에 투입하고 Liposome을 시작한다.

나. 리포좀 작업

1) Intensifier On/Off 스위치를 당기면 Microfluidizer의 펌프가 작동을 시작한다.

2) 펌프를 7회 후 가동을 중단하고 생성물을 버린다. (라인에 차 있던 이물질 제거 작업)

3) Intensifier 스위치를 켠 후, 토출 호스를 통해 생성물을 1 차 포집한다.

4) 1차 생성물을 다시 Inlet reservoir 에 넣고, Intensifier 스위치를 켠 후, 생성물을 2 차 포집한다.

5) 2차 생성물을 다시 Inlet reservoir 에 넣고 Intensifier 스위치를 켠 후 생성물을 3차 포집한다.

상기 과정을 이용하여 입도 180 nm 크기의 리포좀 제형을 확보하였다.

<실시예 3> 한련초 추출물(인퓨즈드 오일)의 발모 효능 평가

가. C56BL/6N을 사용한 한련초의 육모효능 평가

1) C57BL/6N 마우스

성장기에는 피하 진피유두세포의 증식 이외에도, 진피유두상부에 존재하는 멜라닌 세포의 활성화가 동시에 일어나는 까닭에 등 피부색이 검으나, 휴지기로 진입하면 분홍색을 띄는 특성을 가지기 때문에 육안적으로 성장기와 퇴화기를 쉽게 분별할 수 있고, 모낭주기 가운데 성장기에 한해 멜라닌이 생성되는 특징이 있어, 모발주기를 육안적으로 추정하기 쉬운 장점을 지닌 C57BL/6N 마우스를 이용함.

- C57BL/6N 마우스의 발모 특성

C57BL/6 암컷 생쥐의 경우 출생 후 모낭 형태 발생, 2 주후 퇴행기, 3 주후 휴지기, 4 주후 성장기, 6 주후 퇴행기, 7 주후 휴지기가 되며, 12 주후 성장기가 시작되며, 암컷의 경우 수컷 보다 휴지기가 긴 특성이 있다. 유전적 요인과 함께 성별, 기온, 일광 등의 환경적 요소와 영양 요인도 모발 주기에 영향을 미침.

일반적인 표준화 모델의 C57BL/6 의 경우 제모를 한 1 일 뒤 성장기 I, 3 일후 성장기 II, 4 일후 성장기 IIIa-c, 5 일후 성장기 IV, 6 ~ 7 일후 성장기 V, 8~12 일후 성장기 VI 가 시작되며, 17 일후 퇴행기, 25 일후 휴지기가 됨. 따라서 발모 효능이 나타나 피부의 색소 침착과 털의 생장하는 변화를 가장 잘 관찰할 수 있는 발모 주기가 휴지기인 6주령의 암컷 C57BL/6N 마우스를 본 실험의 실험동물로 선정하였다.

2) 마우스의 제모

- 도구 및 재료: 제모크림, 클리퍼, 실험실 기구, 에테르

- 1.9% 농도의 0.08 ml (80ul)/L 에테르를 이용하여 5-10분간 마취를 유도하여 마우스를 마취시켰다. 마취 후 마우스를 클리퍼로 1차 제모 후 제모크림을 도포하고 5분 후에 다시 2차 제모하였다.

3) Sample application

발모 효능을 비교 확인하기 위해 아무것도 처리하지 않은 대조군(n=5), minoxidil(n=5), 동백오일(n=5), 한련초(동백오일로 추출, n=5), 유채오일(n=5) 및 한련초(유채오일로 추출, n=5)를 사용하였다. 상기 시료를 피펫으로 100ul 정량하여 제모된 마우스의 등쪽 피부에 도포하였다. 도포 후 손으로 잘 발라 흡수되도록 하였다.

4) 피부조직 분리

군별로 나누어진 마우스를 순서대로 에테르 마취하여 제모한 뒤, 안락사하여 등 피부를 채취하였다. 채취한 등 피부를 두 조각으로 나누어 하나는 antibody array 분석용 냉동 시료로, 다른 한 조각은 조직검사용 10% 포르말린 고정액에 보관하였다.

나. Image J를 사용한 한련초의 육모효능 분석

실험부위(등) 사진을 포토샵(Photoshop)을 이용하여 직사각형 모양으로 제모부위를 추출하였다.추출한 직사각형의 제모부위 사진을 Image J를 이용하여 명도를 분석하였다(도 2 및 도 3). 군별, 날짜별의 데이터를 구하여 평균을 구하였다. 표준편차를 더하여 그래프로 나타내었다(도 4 및 도 5).

그 결과 제모한 C57BL/6 마우스의 등에 양성 대조군인 미녹시딜과 동백오일, 동백오일 추출 한련초를 도포하여 16일간 육모도를 Image J로 화상분석한 결과, 동백오일로 추출한 한련초의 육모 효능이 대조군 대비 p<0.05 수준에서 유의성 있게 증가하였으며, 양성대조군인 미녹시딜과 비슷한 육모 효능을 보였다. 동백오일 단독으로는 유의성 있는 증가를 나타내지 않았다.

제모한 C57BL/6 마우스의 등에 양성 대조군인 미녹시딜과 유채오일, 유채오일 추출 한련초를 도포하여 16일간 육모도를 관찰한 결과, 유채 및 유채오일로 추출한 한련초의 육모 효능이 대조군 대비 p<0.05 수준에서 유의성 있게 증가하였으나 day4, day8의 결과에만 유의성이 있었으며 day14, day16에서는 유의성 있는 결과를 나타내지 않았다.

<실시예 4> 한련초 추출물(인퓨즈드 오일)의 발모 효능 평가를 위한 모낭의 조직학적 분석

시료의 적용으로 그룹간의 모낭의 조직학적 변화를 평가하기 위하여 H&E staining을 통하여 비교 분석하였다. 구체적인 방법은 이하와 같다.

가. 조직표본 제작

1) 고정

세포에 산소공급이 중단되면 세포내 가수분해효소(hydrolitic enzymes)를 가두어 놓고 있던 세포막(cell membrane)성분이 유지되지 못하여 가수분해 효소가 나와 세포소기관이 분해(digestion)하므로 세포의 구조가 모두 파괴된다. 이를 방지하기 위해 일정한 농도의 포르말린(formalin)을 사용하여 처리하면 세포 내 성분은 더 이상 분해되지 않고 그 상태대로 유지된다.

조직 고정의 목적은 조직내의 단백질을 변성(denaturation), 응고(coagulation)시킴으로써 조직에 어느정도의 경도를 부여함과 동시에 효소의 작용을 정지시켜 세포 또는 조직의 상태를 고정시의 상태로 보존하도록 하는 것이다.

2) 조직다듬기(Tissue triming) 및 조직처리(Tissue processing)

조직 슬라이드로 만들기 위하여 전체 조직중 일부를 잘게 자르는 과정이다. 조직을 조직 처리, 포매, 박절하기에 적당한 크기로 다듬고 카세트에 군별로 분류하여 넣는다.

조직 처리는 탈수와 투명화 과정이 주로 이루어지는 과정으로 시작하기전에 후고정한 조직을 수세하여야 한다. 탈수는 점차 고농도의 에탄올 용액으로 조직내 수분을 제거시키는 일이 이루어지는데 에탄올 외에 다른 유기 용매제인 아세톤 같은 물질을 쓰기도 한다. 그러나 탈수과정으로 인하여 조직내 지방조직이 용해되어버리는 단점도 있다. 탈수가 완전히 이루어지면 그 다음 투명화 과정이 시작되는데 주로 xylene을 사용하며 이 과정으로 조직내 투명제가 침투하여 파라핀의 침투도를 높인다. 조직처리 과정은 총 16시간 정도 걸리므로 자동 조직처리기를 이용하여 수행한다.

* 조직처리기 프로토콜

70% EtOH 3-6시간

80% EtOH 1시간

90% EtOH 1시간

95% EtOH 1시간

100%EtOH 1시간

100%EtOH(2단계) 1시간

100%EtOH(3단계) 1시간

Xylene 1시간

Xylene(2단계) 1시간

Xylene(3단계) 1시간

Paraffin 1시간

3) 조직 포매 (Tissue embedding)

조직을 광학현미경으로 관찰하기 위해서는 그 두께가 빛을 투과할 수 있을 정도로 충분히 얇아야 한다. 이를 위해서 조직을 균일한 두께로 얇게 절단하는 박절기(microtome)를 사용하는데 조직은 얇게 절단할 수 있을 정도로 단단하지 않고 모양도 불규칙 하기 때문에 먼저 파라핀(paraffin)을 조직내로침투시킨 다음, 이를 굳혀 적당한 크기로 잘라 박절기를 이용하여 절단한다. 파라핀을 조직에 침투시켜 단단한 조직으로 만드는 과정을 포매(embedding)이라고 한다.

조직에 맞는 조직 몰드를 선택 후 파라핀을 조직 몰드위로 따르고 조직을 적절하게 배열한다. 자른면이 아래로 가도록 한다.

몰드위에 카세트를 올리고 파라핀을 더 따른다. 카세트와 파라핀이 서서히 고정되도록 냉각판 위에 몰드를 올리고 굳힌다.

4) 조직 절편 제작

조직을 현미경으로 보기 위해서 얇게 자르는 과정이다. 포매된 파라핀 조직을 얇게 자르기 위해서는 특수한 기계인 조직 박절기(microtome)가 사용된다. 파라핀 조직은 포매후 냉동실에 보관하여야 하는데 충분히 차가워 져야 박절이 잘 이루어진다. 또한 원하는 만큼 얇게 박절하기 위해서도 파라핀 조직은 냉동보관 되어야한다. 냉동된 조직을 박절기에 고정시킨후 손잡이를 돌리며 조직이 나올 때까지 파라핀을 깍아내는 1차 박절을 해준다. 이후 다시 냉동보관을 하여 조직을 원하는 크기로 잘라준다 일반장기의 적절 박절 두께인 3-4

로 박절한다. 박절된 조직을 충분히 펴지도록 항온 수조에 옮긴다 이때 조직이 찢어지거나 다른 artifact가 발생하지 안도록 조심스럽게 작업을 하여야한다. 만약 조직이 찢어지거나 주름이 심하게 발생하면 조직 박절 날을 교체하여야 한다.

조직을 항온수조에 올리게 되면 조직이 관찰하기 용이하도록 펴지게 되는데 충분히 펴졌을 경우 슬라이드 글라스를 사용하여 조직에 옮겨야 한다. 이때 조직을 늦게 슬라이드 글라스로 옮길 경우 조직이 과도하게 펴져 찢어지게 된다.

5) 조직 염색

조직을 빛이 투과할 정도로 얇게 자르게 되면 조직성분의 색채대비정도(contrast)는 매우 낮아져, 광학 현미경을 관찰 했을 경우 조직 내의 여러 구조가 구별되어 보이지 않는다. 조직성분의 색채 대비효과를 높이기 위해 조직성분을 염색(staining)한다. 일반적인 조직표본의 염색에는 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin)의 두 종류의 염료를 사용하여 세포의 핵과 세포질을 쉽게 구별하는 염색방법을 사용한다.

① 조직의 파라핀을 xylene으로 제거한다.

② 수용성 염색약이 조직에 잘 염색 되도록 고농도의 알콜에서 저농도의 알콜 수용액으로 처리하면서 함수(hydration)시킨다.

③ 헤마톡실린(hematoxtlin)수용액으로 일차 염색을 한다. 처음에는 진하게 염색한 후 알코올 용액으로 과도하게 염색된 표본의 염색 정도를 적당하게 맞추는 분별(differentiation)과정을 거쳐 염색한다.

④ 에오신으로 이차 염색을 한다. 헤마톡실린은 세포의 핵을 에오신은 세포질을 염색하게 된다.

⑤ 표본이 염색된후 수분이 있을 경우 진균류 또는 세균의 번식이 용이해져 조직이 파괴될수 있다. 이를 방지하기 위해 다시 고농도의 알코올을 거치는 과정으로 탈수 시킨후 커버글라스를 balsam으로 덮어 봉입한다.

6) Hematoxylin & Eosin 염색

조직을 염색하기 위하여 염색용 시약들을 준비하여 염색 한다 염색은 조직을 잘 보기 위한 과정이며 상황에 따라 염색 프로토콜은 변경될 수 있으나 일반적인 프로토콜은 다음과 같다

① xyleneⅠ 5분

② xyleneⅡ 5분

③ 100% 에탄올 3분

④ 95% 에탄올 3분

⑤ 90% 에탄올 3분

⑥ 80% 에탄올 3분

⑦ 70% 에탄올 3분

⑧ 흐르는 물에 수세 5분

⑨ Hematoxylin 5분

⑩ 흐르는 물에 수세 3분

⑪ Eosin 2분

⑫ 80% 에탄올 2~3회 dipping

-염색성을 육안으로 확인

⑬ 95% 에탄올 3분

⑭ 100% 에탄올 3분

⑮ Xylene Ⅲ 5분

Xylene Ⅳ 5분

나. 현미경 관찰과 평가

조직을 광학현미경을 이용하여 관찰한다. 조직의 종류에 따라 실험의 종류에 따라 분석하는 방법은 다양하다. 본 실험의 육모효능을 평가하기 위해서는 모낭의 깊이, 한 시야내에서 보이는 모낭의 수, 모낭의 성장기 단계 등이 평가 되어야한다. 성장기로의 진입을 시사하는 모낭의 수가 많은 실험군일수록 시료의 육모효능있음을 의미한다. 퇴행기로의 진입된 모낭의 수가 적을수록 그 시료의 퇴행기 유도가 늦음을 의미한다. 현미경을 통해 조직을 전반적으로 살펴보고 모낭이 어느 단계에 진입하였는지 모낭의 수와 깊이는 어떻게 다른지 비교하여 점수를 매긴다.

일반적으로 성장기를 진행하면서 모낭은 표피층과 진피층의 경계에서부터 진피층으로 진입하며 깊어진다. 성장기로 진입하게되면 dermal papilla fibroblast로부터 dermal papilla가 형성되게 되며 여기서부터 inner root sheat가 형성되며 그안으로 모발이 자라게 된다. 성장기 모낭은 hair shaft가 활발하게 성장을 하며 부속기관인 sebaceous gland 또한 발달하게 된다. 성장기 stage 6으로 돌입시 모낭은 진피층에서 피하층으로 도달하게 되며 모발은 Stage 8일 때 모공 밖으로 돌출된다.

상기 과정을 통해서 상기 시료가 도포된 마우스의 등 피부의 모낭을 현미경을 통해 40배 배율로 관찰 한 결과 대조군이 모낭이 가장 적게 관찰되었으며 전반적인 모낭이 성장기 초기 단계에 있었다. 미녹시딜 군의 경우 모낭의 수는 컨트롤 대비 많이 보였으며 컨트롤대비 성장기가 더 진행되어 있었다. 동백 오일군의 경우 성장기 단계는 미녹시딜과 유사했으며 모낭의 수도 많이 관찰되었다. 동백 한련 군의 경우 모낭이 가장 많이 관찰되었으며 성장기로 진입된 모낭 또한 많이 관찰되었다. 퇴행기로 진입한 모낭은 많이 관찰되지 않았다. 유채 오일과 유채 한련의 경우 컨트롤 대비 성장기의 모낭이 많이 관찰되었으나 동백한련 만큼 많이 관찰되지는 않았다(도 6). 또한 동백 한련군에서 성장기의 모낭이 가장 많이 관찰되었다. 성장기 모낭을 비롯하여 전체적인 모낭의 수가 동백 한련 군에서 가장 많이 관찰된 것은 동백오일로 추출한 한련초가 모낭의 성장 주기 자체를 왕성하게 하는 것으로 사료된다. 특히 성장기의 마지막 단계이며 곧 퇴행기로 접어들 long anagen이 적게 관찰된 것을 보았을 때 성장기가 진행 중인 모낭이 많은 것을 시사한다. 동백오일, 유채오일, 유채 한련의 경우 동 백한련만큼은 아니지만 컨트롤대비 모낭이 많이 관찰되며 성장기 모낭 또한 많이 관찰 되었다(표 1)

시료별 모낭의 비교평가

		모낭의 단계
시료	ID	Long anagen	Anagen #	Telogen #	Others
컨트롤	1	+	+	+
	2	+	+	+
	3	-	++	+
	4	+	+	-
미녹시딜	1	+	+	-
	2	+	+	+
	3	+	+	+
	4	+	+	+
	5	+	+	-
동백오일	1	+	++	+
	2	+	+	-
	3	-	++	+
	4	-	-	+
	5	+	+	-
동백한련	1	-	+++	++
	2	+	++	+
	3	-	++	+
	4	-	+++	++
	5	-	+++	++
유채오일	1	+	++	+
	2	+	+	++
	3	+	+	+
	4	+	++	+
	5	+	+	+
유채한련	1	+	+	+
	2	+	+	-
	3	-	++	+
	4	-	++	+
	5	+	++	+

< 실시예 5> 한련초 추출물( 인퓨즈드 오일)의 발모 효능 평가를 위한 Antibody array를 사용한 모발의 성장 및 퇴행에 관여하는 단백질 발현 분석

시료를 도포한 마우스의 등 피부를 절개하여 단백질의 발현을 관찰하기 위하여 도 7에 나타낸 것과 같이 antibody array를 실시 하였다.

단백질 추출 및 정제는 Raybiotech sample preparation protocol에 따라 수행하였다. 단백질 발현을 비교에 사용될 시료를 표 2와 같이 준비하였다.

시료 및 농도

시료	OD	AVR.	평균 농도. (ug/ml)	dilution factor	Stock conc. (ug/ul)	vol (ul)	total (ug)
1.대조군	0.1926 0.1960 0.1998	0.196	56.2	10	0.562	100	56.2
2.미녹시딜	0.1686 0.1729 0.1749	0.172	34.4	10	0.344	100	34.4
3.동백오일	0.2018 0.2012 0.2120	0.205	64.3	10	0.643	100	64.3
4.동백+한련	0.2061 0.2081 0.2116	0.209	67.5	10	0.675	100	67.5
5.유채오일	0.1544 0.1591 0.1576	0.157	20.7	10	0.207	100	20.7
6.유채+한련	0.2120 0.2118 0.2160	0.213	71.8	10	0.718	100	71.8
7.물+한련	0.2342 0.2354 0.2379	0.236	92.3	10	0.923	100	92.3
8.마유	0.2934 0.2881 0.2940	0.292	143.2	10	1.432	100	143.2

Pierce BCA Protein Assay Kit를 사용하여 마우스 등 피부 내 단백질의 농도를 측정한 뒤 이를 기준으로 표 2의 시료를 도포하여 실험을 진행하였다. 결과는 하기 표 3에 따라 antibody array 데이터를 분석하였다.

어레이 데이터 분석

스캐닝
검출	Detection은 one color (Cy-3 Streptavidin)로 이루어지며, 빛에 민감한 fluorescent dye 특성상 차광된 상태에서 실험이 진행
스캐너	GenePix 4000B (Agilent)
이미지 분석	GenePix Pro 6.0 (Agilent)
분석
평준화(Normalization)	Positive control normalization을 수행 Raybiotech에서 권장하는 normalization수행 방법 *X(Ny) = X(y)P1/P(y) Where: P1 = mean signal intensity of POS spots on all arrays P(y) = mean signal intensity of POS spots on Array "y" X(y) = mean signal intensity for spot "X" on Array "y" X(Ny) = normalized signal intensity for spot "X" on Array "y"**

분석 결과를 이미지화 하여 도 8과 같이 나타내었다.

성장기로의 진입을 시사하는 beta-Catenin, FGF R3, FGF R4, FGF R5 beta, FGF-21, HGF, IGF-I, Shh-N, VEGF-D에 대해 분석을 실시한 결과, FGF R5 beta와 VEGF-D에서는 동백오일, 동백오일로 추출한 한련초 군에서 모두 대조군 대비 발현도가 증가한 것을 확인할 수 있었으며, 동백오일에서는 FGF R3, IGF-I, Shh-N의 발현도가 증가하였다(표 4).

성장기를 촉진하는 단백질의 발현도

Probe name	미녹시딜/control	동백오일/control	동백+한련/control
beta-Catenin	1.021	0.928	0.947
FGF R3	1.237	1.044	0.977
FGF R4	1.087	0.978	0.945
FGF R5 beta	1.112	1.051	1.001
FGF-21	1.132	0.963	0.954
HGF	1.225	0.970	0.968
IGF-I	1.095	1.037	0.930
Shh-N	0.957	1.154	0.920
VEGF-D	1.056	1.182	1.348

퇴행기로의 진입을 시사하는 FGF R3, FGF R4, FGF R5 beta, FGF-21, IFN-g, IL-1 Ra, IIL-1 Rb, IL-1 R4/ST2, IL-1 R6 / IL-1 R rp2 / IL-1RL2, IL-1 R9, IL-1 RI, IL-1 RII, TACI/TNFRSF13B, TGF-b1, TGFb2에 대해 분석을 실시한 결과, FGF R4, FGF-21, IL-1 Ra, IL-1 R4/ST2, IL-1 RI에서는 동백오일, 동백오일로 추출한 한련초 군에서 모두 control대비 발현도가 감소한 것을 확인할 수 있었으며, 동백오일로 추출한 한련초 군에서는 추가적으로 FGF R3, IFN-g, IL-1 R9, TACI/TNFRSF13B의 발현도가 감소하였다(표 5).

퇴행기를 촉진하는 단백질의 발현도

Probe name	미녹시딜/control	동백오일/control	동백+한련/control
FGF R3	1.237	1.044	0.977
FGF R4	1.087	0.978	0.945
FGF R5 beta	1.112	1.051	1.001
FGF-21	1.132	0.963	0.954
IFN-g	1.112	1.076	0.975
IL-1 Ra	1.341	0.939	0.838
IL-1 Rb	1.186	1.086	1.000
IL-1 R4/ST2	1.077	0.998	0.872
IL-1 R6 / IL-1 R rp2 / IL-1RL2	1.207	1.193	1.043
IL-1 R9	1.128	1.017	0.962
IL-1 RI	1.324	0.999	0.969
IL-1 RII	1.227	1.041	1.044
TACI/TNFRSF13B	1.196	1.140	0.973
TGF-b1	1.094	1.112	1.030
TGFb2	1.007	1.152	1.543

<제조예 1> 헤어에센스

헤어에센스 조성물

구분	성분명 (국문)	INCI 명
원료내역	해바라기씨유	Sunflower Oil
	동백오일	Camellia Japonica Seed Oil
	아르간오일	Argan Oil
	달맞이오일	Evening Primrose Oil
	마유	Horse Fat
	토코페롤	Tocopheryl Acetate
	부틸렌글라이콜	1,3-Butylene Glycol
	향료	ARTE-73H
	감태추출물	Ecklonia Cava Extract
	한련초추출물	Eclipta Prostrata Leaf Extract

헤어에센스 공정과정은 먼저 한련초 추출물을 제조하기 위해 동백오일에 한련초를 진공저온법으로 인퓨즈드를 하였다. 인퓨즈드 시 한련초 : 동백오일 의 비율은 1 : 10으로 진행하였다. 인퓨즈드한 한련초 추출물을 0.45 μm filter paper를 통해 잔사 제거 후, 0.2 μm membrane filter를 통해 다시 한 번 필터를 하였다. 먼저, 헤어에센스를 제작하기 위해 원료내역서 중 가장 많이 들어가는 해바라기 오일, 동백오일을 호모믹서를 이용하여 혼합 및 교반하였다. 그 후 추가적으로 아르간 오일, 달맞이 오일과 마유 순으로 혼합하였으며 오일성질상 산패 가능성이 높아 산화방지로 토코페롤과 부틸렌글라이콜을 혼합하였다. 호모믹서를 통해 원료들이 혼합이 잘 되도록 충분한 교반을 시켰다. 오일 혼합 후 향 테스트를 한 결과, 오일만의 향이 제품을 사용하는 자에게 다소 거부감을 줄 수 있을 것이라 사료되었다. 따라서 오일만의 향을 감추기 위해 향료를 첨가하였다. 헤어에센스의 공정도는 도 9에 나타내었다.

<제조예 2> 헤어 샴푸

헤어샴푸 조성물

구분	성분명 (국문)	INCI 명
원료내역	정제수	Water
	소듐코코일글루타메이트	Sodium Cocoyl Glutamate
	데실글루코사이드	Decyl Glucoside
	소듐코코일이세치오네이트	Sodium Cocoyl Isethionate
	코코-글루코사이드	Coco-glucoside
	피이지-150펜타에리스리틸테트라스테아레이트	PEG-150 Pentaerythrityl Tetrastearate
	피이지-6카프릴릭/카프릭글리세라이드	PEG-6 Caprylic/Capric Glycerides
	피이지-120메칠글루코오스디올리에이트	PEG-120 Methyl Glucose Dioleate
	시트릭애씨드	Citric Acid
	폴리쿼터늄-10	Polyquaternium-10
	카프릴릴글라이콜	Caprylyl Glycol
	p-아니식애씨드	p-Anisic Acid
	감태추출물	Ecklonia Cava Extract
	호오스팻	Horse Fat
	한련초추출물	Eclipta Prostrata Extract
	동백오일	Camellia Japonica Seed Oil
	향료	Fragrance

모발개선용 기능성 샴푸의 공정과정은 먼저 한련초 추출물을 제조하기 위해 동백오일에 한련초를 진공저온법으로 인퓨즈드를 하였다. 인퓨즈드 시 한련초 : 동백오일 의 비율은 1 : 10으로 진행하였다. 인퓨즈드한 한련초 추출물을 0.45 μm filter paper를 통해 잔사 제거 후, 0.2 μm membrane filter를 통해 다시 한 번 필터를 하였다. 먼저, 모발개선용 기능성 샴푸를 제작하기 위해 정제수를 이용해 감태분말을 분산 및 용해를 시켰다. 분말이 상태에서 들어갈 수 가 없기 때문에 용해시켜야 한다. 그 다음으로 PHASE B인 정제수와 폴리쿼터늄-10을 분산시켰다. PHASE C인 소듐코코일글루타메이트, 데실글루코사이드, 소듐코코일이세치오네이트, 코코-글루코사이드, 피이지-120메칠글루코오스디올리에이트, 시트릭애씨드, p-아니식애씨드, 호오스팻 원료들을 같이 혼합하기 전에 용해시켰다. PHASE D인 정제수, 피이지-150펜타에리스리틸테트라스테아레이트, 피이지-6카프릴릭/카프릭글리세라이드를 첨가하여 혼합시켰다. 마지막으로 PHASE E인 동백오일에 인퓨즈드한 한련초 추출물과 향을 첨가하였다. 샴푸의 경우 계면활성제를 이용한 제품으로 오일성분이 추가되게되면 계면활성제의 효과가 줄어들게 되어있다.따라서 모발개선용 기능성 샴푸의 경우에 한련초 추출물(오일상)를 첨가하게 되어 제품의 안정성과 효과를 보장할 수 없어 소량으로 첨가하였다. 모발 개선용 기능성 샴푸의 공정도는 도 10에 나타내었다.

Claims

삭제
한련초 잎을 동백 오일과 1:10의 비율로 혼합하는 단계;
상기 혼합물을 진공저온법으로 추출하는 단계; 및
상기 추출물을 여과하는 단계;를 포함하는 한련초 인퓨즈드 오일 제조 방법.
삭제
제 2항의 방법에 따라 제조된 한련초 인퓨즈드 오일을 유효성분으로 포함하는 육모 촉진을 위한 화장료 조성물.
제 4항에 있어서,
상기 조성물은 헤어토닉, 헤어컨디셔너, 헤어에센스, 헤어로션, 헤어영양로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 헤어크림, 헤어영양크림, 헤어모이스처크림, 헤어맛사지크림, 헤어왁스, 헤어에어로졸, 헤어팩, 헤어영양팩, 헤어비누, 헤어클렌징폼, 머릿기름, 모발건조제, 모발보존처리제, 모발염색제, 모발용 웨이브제, 모발탈색제, 헤어겔, 헤어글레이즈, 헤어드레싱어, 헤어래커, 헤어모이스처라이저, 헤어무스 및 헤어스프레이로 이루어진 군에서 선택된 제형인 것인, 육모 촉진을 위한 화장료 조성물.