CN109689026B - 使用包含生物活性莲提取物的组合物增加脂肪分解的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种促进脂肪分解、减肥、排水、平滑皮肤表面、减少局部脂肪沉积体积的美容方法，所述方法包括向待处理区域施用表面组合物，包括莲(Nelumbo nucifera)提取物。

Description

使用包含生物活性莲提取物的组合物增加脂肪分解的方法
技术领域
本发明涉及美容领域，且更具体地涉及美容减肥方法的领域。它涉及从莲(Nelumbo nucifera Gaertn)新鲜(活)植物获得的作为减肥和排水美容剂的生物活性成分的美容用途。
本发明还涉及一种美容护理方法，包括在在身体或面部的至少一部分皮肤上表面施用莲(Nelumbo nucifera)提取物，所述提取物在含有生理学上可接受的介质的组合物中，以获得减肥效果，且更具体地说是减少局部过多的体脂肪。
背景技术
皮下脂肪组织位于下皮。它是一种结缔组织，其中脂肪细胞占优势，组织在直径约5毫米的小叶中，由细的结缔桥(connective bridge)隔开。每个脂肪细胞含有大量的脂质空泡，基本上含有甘油三酯，且其直径可以为40-120μm。
脂肪组织可被认为是动态储库，不断更新，平衡膳食摄入量与身体的能量需求。因此，脂肪细胞确保脂质的合成、积累和释放。
脂质合成或脂肪生成起源于饮食来源的甘油三酯和葡萄糖。相反，存储在脂肪细胞中的甘油三酯可在脂肪分解过程中水解，以释放脂肪酸、甘油和甘油单酯和二酯。
如此释放的非酯化脂肪酸可以在血液中循环，并然后可用于身体其他细胞的能量需求，或者被脂肪细胞快速再利用，从而通过脂肪生成再次产生甘油三酯。
如果在体内发生促进脂肪生成的持续不平衡，则存储在脂肪细胞中的脂质的量增加，导致体脂肪质量的增生，且更具体地，导致局部过量体脂肪的出现。事实上，在人类成年人中，在性激素的作用下，脂肪组织根据性别分布不同并形成轮廓。脂肪组织累积在女性的胸部、髋部、臀部和大腿，以及男性的颈背和肩部。此外，局部过量的体脂肪通常与皮肤的改变有关，这会产生凹陷或“橘皮”外观。目前认为这种局部过量的体脂肪不美观。本发明旨在健康的人可能想要使用美容方法改善其皮肤和轮廓的外观、减少局部过多的体脂肪。
已经提出皮下脂肪组织的解剖结构是脂肪团(cellulite)的主要原因。男性和女性皮下组织的组织学研究表明，女性的脂肪小叶比男性更大更垂直。结果，这些较大的较少限制的小叶可以向外扩展至真皮，引起脂肪团的凸起和凹陷特征。女性的股骨皮下脂肪沉积往往比腹部皮下或内脏脂肪更具脂肪生成性和更少脂肪分解性，这是由于在这些不同区域中脂肪细胞上α和β肾上腺素能受体的分布不同。这些选定的皮下脂肪部位的脂肪分解或脂肪减少的增加可导致脂肪团的减少或预防。
在刺激脂肪分解的方法中，最常见和最常使用的是包括抑制磷酸二酯酶以防止或至少限制环AMP降解速率的方法。实际上，磷酸二酯酶通过将环AMP转化为5'AMP而破坏环AMP，使其不能作为脂肪分解活化剂起作用。已经使用表面应用来处理脂肪团的试剂，所述试剂能够通过脂肪分解作用分散或减少局部脂肪累积，从而改善皮肤的美学外观。作为减肥剂处理脂肪团的常用药剂是黄嘌呤类似物，例如咖啡因或茶碱。这些药剂阻断腺苷的抗脂肪分解作用，腺苷是一种有效的内源性脂肪分解抑制剂。
因此已经鉴定了许多对脂肪分解或脂肪生成有作用的活性剂，用于减肥效果。其中，可列举如下：黄嘌呤碱(黄嘌呤衍生物)，例如茶碱、咖啡因、可可碱(描述于专利FR 2609 395，FR 2 674 01)，用于促进脂肪细胞的脂肪分解作用。合成肽，例如序列Arg-Gly-Ser-NH2的肽(描述于专利FR 2 858 769中)，或序列Pro-Leu-Asp-Thr-Ala-Lys-Val-Arg-Leu-Gln的肽(描述于专利FR 2 879 924中)，其用于在线粒体中解耦辅酶再氧化和ADP磷酸化成ATP。植物提取物，例如Palmaria或红皮藻(Rhodymenia)属的海藻提取物(描述于专利FR 2 887 447中)、银杏叶提取物(参见专利FR 2 669 537)、或大豆黄酮或异黄酮(描述于专利WO 01/64177)。。
然而，这些产品随着时间的推移通常具有中等或有限的功效。因此，重要的是提供具有显著功效的新型活性美容剂作为减肥活性剂。发明人确实证明了莲(Nelumbonucifera)提取物在脂肪分解过程中促进甘油从脂肪细胞中的释放。
通过阅读说明书将更好地理解本发明和所得到的益处。
待解决的技术问题的解决方案在于与莲(Nelumbo nucifera)提取物相关的美容用途。发明人确实证明了莲(Nelumbo nucifera)提取物在脂肪分解过程中促进甘油从脂肪细胞中的释放。
通过阅读说明书将更好地理解本发明和所得到的益处。
上述介绍仅用于提供对本领域所面临问题的本质的更好理解，不应以任何方式解释为对现有技术的承认，也不应将本文中任何参考文献的引用解释为承认参考文献的引用构成本申请的“现有技术”。
发明内容
本发明的主要方面涉及使用从莲(Nelumbo nucifera Gaertn)新鲜(活)植物获得的生物活性植物美容组合物来增加脂肪分解、减肥和排水的方法。本发明还涉及制备这些生物活性植物美容组合物的方法，以及这些组合物在各种制剂中的用途和作为表面皮肤应用剂的用途。
附图说明
通过附图可以理解本发明的进一步的实施方案。
图1是说明制备生物活性植物剂的方法的一个实施方案的示意图。
具体实施方式
本文公开了本发明的详细实施方案；然而，应该理解，所公开的实施方案仅仅是对可以以各种形式实施的本发明的说明。因此，在此公开的具体结构和功能细节不应被解释为限制性的，而仅仅作为用于教导本领域技术人员以各种方式使用本发明的代表性基础。
无论何时通过指代范围来确定术语，该范围将被理解为明确地公开其每个要素。作为非限制性实例，1-10％的范围应理解为包括1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％和10％，和所有在1到10％之间的值。
当两个或更多个取代被称为“选自”一组列举的选择时，意指每个取代可以是该组的任何元素，与其他取代的特性无关。
除非另有规定，如本文所用，“％”是指重量％，即组分相对于组合物总重量的重量百分比(即，包括任何载剂、载体、溶剂、填充剂或在施用于皮肤之前添加的其他组分)。
除非另有说明，否则本文使用的所有术语旨在具有其普通含义。出于描述和要求保护本发明的目的，定义了以下术语：
“提取物”应理解为从天然来源提取的任何物质或分离的制剂，无论提取方法或成分如何。该术语以广义使用，包括例如可溶于水的成分或使用溶剂从天然物质中提取的有机溶剂，或天然物质的特定成分。
本发明意义上的“减肥活性剂”是指用于减少过量局部脂肪沉积的莲(Nelumbonucifera)提取物，所述过量局部脂肪沉积被认为是不美观的并且通常与皮肤的凹陷外观相关。
“消除脂质”是指脂肪分解导致甘油从脂肪细胞输出的现象。
“脂肪团”定义了皮肤的凹陷外观，由脂肪细胞推压身体的结缔组织引起。“脂肪团”一词仅指皮肤的外观，并未描述医学状况。脂肪团与许多女性大腿上出现的团块、肿块和凹陷有关。脂肪团主要存在于大腿和臀部，但也可能存在于胃和上臂。脂肪团经常被描述为“橘皮皮肤”、“床垫现象”或“干酪效果”。脂肪团的存在是一个顽固的问题，导致许多女性的情绪和心理困扰。
在本发明意义上的“排水”是指更好的血液和淋巴微循环，减少水潴留，减少腿部肿胀，减轻腿部沉重的感觉。
本发明首先涉及莲(Nelumbo nucifera.)提取物作为减肥活性剂的美容用途。
莲(Nelumbo nucifera Gaertn.)俗称印度莲或神圣莲，是睡莲科(Nelumbonaceae)物种。它原产于热带亚洲和澳大利亚昆士兰州，通常在水上花园种植。它也是印度、孟加拉国和越南的国花。
莲的所有部分如果实、种子、根和叶都是可食用的，并且长期用作食物。此外，这些植物部分已被用作民间医学中的抗发热、镇静、抗菌、止泻和止血剂。因此，莲在韩国被广泛栽培和作为食品和药品食用。
莲叶和花瓣用于茶，并且在韩国可商购。莲叶也被用作食物如Yeon Yip Bap(这是用莲叶包裹的蒸米饭)食用。这道菜源自寺庙食物，且由于莲叶的各种有益作用而广泛使用。以前的研究揭示了莲叶的药理作用，包括抗氧化、抗HIV、抗糖尿病和抗肥胖。来自这些植物部分的几种生物活性植物化合物属于不同的化学组，包括生物碱、黄酮类、糖苷、三萜类化合物和维生素(Mukherjee PK etal.“The sacred lotus(Nelumbo nucifera):phytochemical and therapeutic profile”.Journal of Pharmacy andPharmacology.2009；61(4):407–422.)。
据报道，莲的叶、根和莲的胚胎阶段含有生物碱，例如莲碱、荷叶碱、降荷叶碱、荷叶苷、番茄枝碱、5-甲氧基-6-羟基阿朴啡、莲心碱和巴婆碱(“Rastogi RP,MehrotraBN.Compendium of Indian Medicinal Plants.Vol.1.New Delhi,India:Central DrugResearch Institute,Lucknow and Publications&Information Directorate；1991.((1960–1969),pp.288-289)”)。来自莲的双苄基异喹啉生物碱在以20mg/kg的剂量口服施用给大鼠后显示出生物可利用性(Huang Y,et al.“Simultaneous determination ofliensinine,isoliensinine and neferine from seed embryo of Nelumbo nuciferaGaertn.in rat plasma by a rapid HPLC method and its application to apharmacokinetic study”.Arzneimittel-Forschung.2011；61(6):347–352)。
几位作者报道的来自莲花的几种黄酮类和非黄酮类在Mukherjee等人的综述中得到了整理。黄酮类包括从莲花瓣的乙醇提取物中分离的杨梅黄酮-3-O-b-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-3-O-b-D-葡糖苷酸、黄芪甙、槲皮素、3,4-二羟基苯甲酸、山奈酚、对羟基苯甲酸和β-谷甾醇(X.Shuangshuang,et al,“Isolation and characterization of chemicalconstituents from the petals of Nelumbo nucifera,”Asian Journal of Chemistry,vol.24,pp.4619–4622,2012)。在花提取物中鉴定出非黄酮类化合物，包括腺嘌呤、肌醇、熊果苷和谷甾醇吡喃葡萄糖苷。
来自莲叶的富含黄酮类的提取物(NLFE)在喂食C57BL/6小鼠的高脂肪饮食(HFD)中的抗肥胖作用及其通过脂质调节酶的作用，从而减弱体内脂质积累和预防肥胖证明于(Wu et al,“Improvement in high-fat diet-induced obesity and body fataccumulation by a Nelumbo nucifera leaf flavonoid-rich extract in mice,”Journal of Agricultural and Food Chemistry,vol.58,no.11,pp.7075–7081,2010)。许多研究人员在体外和体内模型中广泛研究了莲的叶子和种子的抗肥胖作用。
根据本发明使用的莲(Nelumbo nucifera)提取物特别提供以下优点：
·它促进脂肪分解、脂质消除和脂肪细胞中甘油的输出，
·它平滑皮肤和皮肤的微起伏、减少“橘皮”外观，
·它减少多余的局部脂肪沉积、塑型和紧致经处理的皮肤区域，
·它在处理区域恢复血液流动、限制淤滞、改善皮肤微循环、减少水分潴留、排水。
“表面施用”是指将根据本发明的活性剂或含有它的组合物施用或涂抹在皮肤或粘膜的表面上。
“生理学上可接受的”是指根据本发明的活性剂或含有它的组合物适于与皮肤或粘膜接触而不引起毒性或不耐受的反应。
“生理学上可接受的”是指适于与皮肤或粘膜接触而不引起毒性或不耐受反应的任何化合物。
“过量的局部脂肪沉积”是指皮下脂肪组织的肥大区域，其可具有“橘皮”外观。在下面的描述中，术语“减肥活性剂”和“莲(Nelumbo nucifera)提取物”。将互换使用。
根据本发明的活性剂可以通过专利申请US2015/0258012中描述的方法获得。
本发明涉及一种美容护理方法，包括表面施用从新鲜植物生物质获得的莲(Nelumbo nucifera)提取物的植物级分。此类植物级分的制备描述于专利申请US2015/0258012中，其通过引用并入本文。
图1是说明制备用于本发明的生物活性植物美容组合物的方法的一个实施方案的示意图。
来自活莲植物的生物活性成分是根据美国专利No.7,442,391；7,473,435；7,537,791；8,043,635；8,101,212；8,277,852；8,318,220；美国专利申请20150258012；和PCT/EP2013/073565中描述的Zeta级分技术方法获得的。该制造方法采用研磨和挤压新鲜活植物以获得植物细胞汁(细胞内胶体分散体)，并且用电磁波以有效引起膜级分与细胞汁分离的频率处理它以产生细胞细胞质/细胞溶质级分，其基本上不含膜级分。
在有效将细胞质/细胞溶质级分分离成其组成部分(如细胞质级分和细胞溶质级分)的条件下进一步加工细胞质/细胞溶质级分。细胞溶质级分主要含有溶解在细胞内水中的低分子量组分。然后将细胞溶质级分精炼并稳定化以产生生物活性成分莲(Nelumbonucifera)提取物(它也称为莲精华级分、
Figure GDA0003730434770000061
NN和HarmonianceTM)。
从本发明中使用的新鲜植物生物质制备植物级分的方法包括研磨(或浸渍)和挤压新鲜植物生物质以获得细胞内植物材料，在本文中称为植物细胞汁，含有膜级分，并且用电磁波以有效引起膜级分与细胞汁分离的频率处理所述细胞汁以产生细胞细胞质/细胞溶质级分，其基本上不含膜级分。有利地进行上述处理，使得在所述处理期间所述细胞汁的温度不超过40℃。
然后可以使用膜级分以提供稳定的植物美容组合物，其显示出抗蛋白水解、细胞生长抑制活性，和/或抗蛋白水解以及细胞生长抑制活性二者，其中抗蛋白水解活性是由于至少一种蛋白酶的抑制，且细胞生长抑制活性是由于抑制至少一种细胞的细胞生长。
可以使用细胞质/细胞溶质级分以提供适合用作药物、美容、营养、处理和/或个人护理制剂等中的组分的植物组合物。
制备本发明植物级分的总体方法
举例来说，下面参考图1描述制备本发明的生物活性植物美容组合物的整体方法。如图1所示，收获、收集和洗涤新鲜植物以产生新鲜植物生物质2。将该新鲜植物生物质进行研磨、浸渍和挤压4以产生细胞内植物材料(细胞汁)6和富含纤维的材料(滤饼)8。然后将细胞汁6通过尼龙网10过滤，得到过滤的植物细胞汁12。将过滤的细胞汁12以一定频率暴露于电磁波处理14，以引发其去稳定化。然后将去稳定化的细胞汁进行离心18，以产生沉淀的膜级分20和上清液，其为细胞质/细胞溶质级分30。膜级分20是生物活性植物美容组合物，其可以添加到美容产品中，例如如美国专利No.7,442,391,8,101,212,8,277,852和8,318,220所述。植物细胞质/细胞溶质级分30用于进一步的过程，如下所述。
细胞质/细胞溶质级分30可任选地进行额外的处理：i，ii，iii或iv总结如下。作为非限制性实例，处理(i)可包括等电点沉淀32和离心34后，使得能够将沉淀的细胞质级分36与含有细胞溶质级分38的上清液分离，如例如美国专利No.7,442,391,8,101,212,和8,277,852中所述。或者，由于(ii)额外的电磁处理(频率>7GHz)，随后离心或过滤，或(iii)膜过滤，或(iv)超滤，或其组合，可进一步分离细胞溶质/细胞质级分(i，ii，iii，iv)。细胞质/细胞溶质级分组分可以“原样”使用，或者可以进一步分离和利用。它们也可以用防腐剂和抗氧化剂稳定，例如，如美国专利No.7,442,391；7,473,435；7,537,791；8,043,635；8,101,212；8,277,852和8,318,220中所述。
植物细胞汁可以从所有类型的植物制备。可用于实现本发明的合适植物包括但不限于来自睡莲科(Nelumbonaceae)的植物。本发明的一个优选实施方案使用莲(Nelumbonucifera)全植物。
可以使用各种分离技术分离植物细胞汁。然而，产生植物细胞汁的分离技术保留植物的生物活性组分。制备用于提取植物细胞汁的植物生物质的示例性方法包括收获、收集和洗涤新鲜植物。制备新鲜植物生物质的合适步骤包括，例如以下：(1)保持植物细胞的固有水分含量；(2)收获期间保持植物完整性；(3)最小化对植物生物质的环境影响和生物降解的时间因素；(4)在加工之前(例如，在研磨和浸渍之前)清洁植物生物质。
下面讨论这些步骤中的每一步。
保持固有的水分含量：
收获植物应当避免由于水分流失而萎蔫。最佳条件是保持和保存天然水分含量的那些条件。
本发明的一个优选实施方案在提取植物细胞汁之前使用收获的莲(Nelumbonucifera)全植物。
收获期间植物完整性的保存：
以避免或最小化植物的切碎、捣碎、压碎或其他类型损伤的方式进行植物生物质的收获。例如，在本发明的一个实施方案中，手工收集整株植物。本发明的一个优选实施方案使用莲(Nelumbo nucifera)全植物。
最小化环境影响和降解的时间因素：
应当最小化切割植物材料到处理设施和生物质暴露于阳光、高温和其他负面环境因素的递送时间，以防止如上所述的不希望的降解过程的影响。在一个实施方案中，将经历长距离运输的植物处理至切割后程序，包括立即将植物生物质放入含有冷冻凝胶袋的聚苯乙烯泡沫冷却器中，以帮助在过夜递送至处理设施期间保持新鲜度和天然水分含量。也可以使用实现上述结果的其他收获后程序。作为非限制性实例，对于许多植物物种而言，不仅最小化加工的递送时间，而且如果必要的话还通过冷藏保持切割的植物材料冷却以在处理过程之前和/或处理过程中防止和/或最小化不希望的降解是有益的。
研磨和浸渍之前的清洁步骤：一旦收获植物组织，就进行洗涤步骤以在进一步处理之前从植物中除去土壤颗粒和其他碎屑。在一定条件下使用低压冲洗实现洗涤，目的是防止细胞汁从生物质中释放、防止引起伤害或防止去除有价值的组分。
例如，在本发明的一个实施方案中，植物生物质的洗涤在小于或等于S分钟内完成，水压小于或等于1kg/cm2。残留水洗不含任何绿色或黄色颜色，这表明没有后续损伤。从洗涤过的生物质中除去过量的水，以保持干物质含量接近自然水平。在收获植物组织生物质后，如上所述，进行植物组织生物质的进一步处理以产生植物细胞汁。在一个实施方案中，对收获的植物组织生物质进行研磨、浸渍和挤压以分离细胞内含量，即细胞汁，并将其与主要含有细胞壁的富含纤维的滤饼分离。
合适的处理方案的实例涉及下面描述的步骤。锤磨机可用于研磨植物以在短时间内产生小尺寸的植物组织颗粒并且不会显著增加生物质温度。在一个实施方案中，改进的锤磨机用于在小于或等于10秒的处理期间产生最大尺寸小于或等于0.5厘米的浸渍植物颗粒，其中生物质温度的增加小于或等于5℃。
如上所述，最小化研磨和浸渍植物生物质的暴露以防止不需要的分解代谢过程的影响。在研磨和浸渍植物生物质后，尽快开始从富含纤维的材料(或滤饼)中分离植物细胞汁。植物生物质在短时间内加工而不会显著升高温度。在一个实施方案中，在研磨和浸渍之后，立即使用水平连续螺旋挤压机(Compact Press“CP-6”，Vincent Corporation，FL)挤压植物生物质。锥体上的压力保持在24kg/cm2水平，螺杆速度为12rpm，且生物质温度升高小于或等于5℃。
初始细胞汁通常含有小纤维颗粒，它可以吸收有价值的细胞汁组分，且也可以阻塞软管和泵。应通过过滤或低速离心除去上述颗粒。
例如，在使用本发明方法中的植物细胞汁之前，在压制步骤之后产生的初始细胞汁通过四层尼龙织物过滤。
一旦分离出植物细胞汁，植物细胞汁就是相对稳定的胶体分散体，其中细胞器代表分散相，且细胞质代表连续相。
然后处理细胞汁，涉及(1)触发上述胶体分散体的去稳定化的过程，进行“开始膜级分聚集步骤”以产生去稳定化的细胞汁，和(2)对去稳定的细胞汁混合物进行“膜级分分离步骤”以产生膜级分(含有核子、或叶绿体、或色素体、或线粒体、或其组合)和细胞汁上清液。在一个实施方案中，通过对所述细胞汁进行频率大于2.45GHz的电磁波来完成膜级分去稳定化的引发。在实现去稳定化后，进行膜级分分离步骤。该步骤包括，例如，使用包括过滤、离心或其组合的分离技术将去稳定的细胞汁分离成膜级分和细胞汁上清液。
在本发明的方法中可以采用各种仪器，以产生使细胞汁去稳定所必需的电磁波：磁控管、电网管、速调管(klystron)、速调管(klystrode)、交叉场放大器、行波管和陀螺仪。一种这样的仪器包括但不限于高功率磁控管。
传统和工业磁控管的工作频率为915MHz和2.45GHz。然而，在那些频率下产生不希望的热量，这会使细胞汁组合物变性。在本发明的方法中，电磁波的工作频率远高于传统或工业磁控管的频率，这使得细胞汁去稳定而不会由于发热而发生不希望的变性。在本发明的去稳定步骤中所述电磁波的频率高于传统微波磁控管的频率，即高于2.45GHz，在另一个实施方案中高于2.45GHz且低于约7GHz；以及在另一个实施方案中，从大约3到大约6GHz。在本发明的去稳定步骤期间，细胞汁的温度有利地保持在40℃以下，在另一个实施方案中低于约25℃，在另一个实施方案中低于约30℃，在另一个实施方案中低于约25℃。在另一个实施方案中，低于约20℃。
本领域通常称为“蛋白质-维生素浓缩物”的新鲜获得的膜级分是具有强烈颜色和特定气味的糊状物，其是植物原料来源特异性的。膜级分主要由存在于植物的绿色部分中的叶绿体或主要由存在于花中的色素体表示。
膜级分的组合物主要包括磷脂、膜蛋白、叶绿素、细胞核、线粒体和类胡萝卜素。制备基本上不含膜组分的细胞质/细胞溶质级分衍生的美容组合物的方法。
制备表现出抗氧化活性、细胞生长刺激活性或抗氧化剂和细胞生长刺激活性二者的基本上不含膜组分的细胞质/细胞溶质级分衍生的美容组合物的方法涉及提供已从新鲜植物生物质中分离的细胞汁，如上文关于膜衍生美容组合物所述。然后在有效地将植物细胞汁分离成膜级分和细胞质/细胞溶质级分的条件下处理植物细胞汁。
然后可任选地在有效地将细胞质/细胞溶质级分分离成其组成部分即细胞质级分和细胞溶质级分的条件下进一步加工细胞质/细胞溶质级分。细胞质级分主要包括白色可溶性蛋白质；在C3植物中，这些蛋白质主要由核酮糖-5-二磷酸羧化酶加氧酶组成。细胞溶质级分含有低分子量可溶性组分。在有效产生具有各种生物活性的细胞精华级分的条件下精炼细胞溶质级分。细胞精华级分在有效产生稳定的生物活性植物美容组合物的条件下稳定，所述植物美容组合物显示出生物活性，如美国专利No.7,442,391；7,473,435；7,537,791；8,043,635；8,101,212；8,277,852和8,318,220所述。
植物细胞汁可以从所有类型的植物中获得。可用作本发明新鲜植物生物质来源的合适植物的实例包括但不限于来自睡莲科(Nelumbonaceae)的植物。可以使用植物的各种部分。在一个优选的实施方案中，使用莲(Nelumbo nucifera)全植物
如上所述，一旦将植物细胞汁分离成膜级分和细胞汁上清液，即细胞质/细胞溶质级分30，其经受另外的处理：i，ii，iii或iv(图1)，使得能够将细胞质级分与细胞溶质级分分离。
评估细胞质级分完全分离的定量标准是不存在可检测水平的高分子量蛋白质和/或在细胞溶质级分中不存在核酮糖1,5-二磷酸羧化酶加氧酶。
细胞溶质级分是透明液体，具有轻微的黄色和轻微的特征气味。在几个小时内，不稳定的细胞溶质级分不可逆地转化为深棕色悬浮液，含有重沉淀和强烈的非特征性气味。结果，细胞溶质级分不能用作美容成分。下面描述的方法允许细胞溶质级分的精炼以产生稳定且有活性的精华级分，其是稳定的美容成分。这是通过从细胞溶质级分中除去导致不可逆转化的主要组分而实现的，所述不可逆转化导致产生不希望的沉淀和颜色和气味的劣化。该方法包括：pH调节、热处理、冷却、真空过滤和稳定化，如美国专利No.7,442,391,8,101,212,8,277,852和8,318,220中所述，它们都通过引用并入本文。
在产生细胞精华级分后，然后对其进行稳定化步骤以产生精华衍生的美容组合物。在一个实施方案中，稳定化步骤包括将细胞精华级分在至少一种防腐剂和至少一种抗氧化剂的混合物中孵育，以产生稳定的细胞精华级分。适用于本发明的防腐剂包括例如山梨酸钾、苯甲酸钠。用于本发明的合适的抗氧化剂的实例是偏亚硫酸氢钠。
本发明涉及一种美容护理方法，包括在身体或面部的至少一部分皮肤上表面施用莲(Nelumbo nucifera)提取物(它也称为莲精华部分、HarmonianceTM和
Figure GDA0003730434770000122
NN)以获得减肥效果，更具体地说是为了减少过多的局部体脂肪，所述莲提取物在含有生理学上可接受的介质的组合物中。
本发明涉及莲(Nelumbo nucifera)提取物(它也称为莲精华部分、HarmonianceTM和
Figure GDA0003730434770000123
NN)的用途，以促进脂肪分解、从脂肪细胞释放甘油。
本发明的特征性生物活性在体外通过减肥活性剂减少脂肪细胞中脂滴的大小和数量的能力来定义。
本发明还涉及一种美容护理方法，包括在身体或面部的至少一部分皮肤上表面施用莲(Nelumbo nucifera)提取物以获得减肥效果，更具体地说是为了减少多余的局部脂肪沉积，所述莲(Nelumbo nucifera)提取物在含有生理学上可接受的介质的组合物中。
本发明涉及一种用于减肥、紧致和平滑皮肤的美容方法，特别是在脂肪团的情况下，该美容组合物是表面施用的。
减肥、紧致和平滑皮肤的方法和手段是一项重要的美容挑战。在皮肤中形成脂肪组织的不良后果为且尤其是脂肪团。
脂肪团是非炎性体质(性别典型)肥胖的术语，在结缔组织区域中轻度形成浮肿(所谓的Adipositas circumscripta oedematosa)。脂肪团存在且尤其存在于女性的髋部、大腿和臀肌区域。在大多数情况下，所谓的“被子综合征”(结缔组织隔膜导致表面的网状凹陷)和所谓的“橘皮皮肤综合征”(挤压后的漏斗状泡状收缩)。这导致皮下组织的结缔组织紊乱和脂肪腔中脂质的体积增加。然而，脂肪团症状不是病理性的。
根据本发明，“减肥”或“变薄”或“减少局部超重”是指如上所述避免或至少减少皮下脂肪形成的作用。该作用尤其导致减少难看的多余或储备，通过加速去除多余的来改善轮廓，通过更好地限定身体的轮廓或重新雕刻的轮廓。
根据本发明，通过“美容处理以抵抗局部超重”并“改善/促进平滑皮肤表面”的方法意指实施美容处理以视觉上测量上述作用。
因此，根据本发明的包含有效量的莲(Nelumbo nucifera)提取物(它也称为莲精华部分、HarmonianceTM和
Figure GDA0003730434770000121
NN)的表面组合物可以应用于易于形成这种局部超重的皮肤区域，即已经形成或正在形成这些过载的区域。
本发明公开了莲(Nelumbo nucifera)提取物(它也称为莲精华部分、HarmonianceTM和
Figure GDA0003730434770000131
NN)以减少过量局部脂肪沉积的用途。出于本发明的目的，除非进一步限制，否则术语“减少”意指减小物质的体积、尺寸、质量、容积、密度、量和/或数量。例如，减少脂肪可包括减少脂肪细胞量(例如，脂肪细胞数)、减少脂肪细胞体积、减少脂肪细胞成熟和/或脂肪细胞去分化。
具体地，本发明设想当将莲(Nelumbo nucifera)提取物(它也称为莲精华部分、HarmonianceTM和
Figure GDA0003730434770000132
NN)表面施用于皮肤，特别是在个体例如，哺乳动物，例如人的过量脂肪沉积区域中时的新用途。
进一步预期本发明可用于在腹部、胸部、臀部、髋部、大腿、腿部、膝盖、手臂、下巴、面部或颈部具有明显或不期望的脂肪沉积的个体。
本发明还被认为对受病理影响的个体有益，所述病理例如肥胖库欣综合征、假库欣综合征、药物诱导的肥胖、HIV相关的脂肪营养不良、甲状腺功能减退症、假性甲状旁腺功能减退症、下丘脑肥胖症、多囊性卵巢疾病、抑郁症、暴饮暴食、Prader-Willi综合征、Bardet-Biedl综合征、Cohen综合征、唐氏综合症、特纳综合征、生长激素缺乏、生长激素抵抗或瘦素缺乏或抵抗。进一步预期本发明可用于使用皮质醇和类似物、其他皮质类固醇、梅格施、磺酰脲类、三环抗抑郁药、单胺氧化酶抑制剂、选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(selective serotonin reuptake inhibitor)、口服避孕药、胰岛素、利培酮、氯氮平和噻唑烷二酮类的个体。
有利地，根据本发明的莲(Nelumbo nucifera)提取物以适于表面使用的生理学上可接受的浓度存在。
根据本发明的莲(Nelumbo nucifera)提取物在高达100％的浓度(未稀释)进行测试，并且发现其没有刺激性，在人体中具有非常好的耐受性，并且此外，它在光毒性体外研究中未显示出光毒性。有利地，莲(Nelumbo nucifera)提取物在生理学上可接受的介质中以浓度为组合物总重量的0.001％至10％，优选0.1％至2.5％，更优选0.2％至1％的浓度存在。
用于实施本发明的组合物尤其可以是水溶液、水醇溶液或油溶液形式；和水包油乳状液、油包水乳状液或多重乳状液；它们也可以是悬浮液或粉末形式，适用于施用在皮肤、粘膜、嘴唇和/或头发上。
这些组合物可以或多或少是流体并且具有乳膏、乳液(lotion)、乳、精华、膏剂(pomade)、凝胶、糊剂或泡沫的外观。它们也可以是固体形式如棒，或以气溶胶的形式施用于皮肤上。
这些组合物还可包括在所设想的应用领域中常用的任何添加剂，以及它们配制所必需的佐剂，例如溶剂、增稠剂、稀释剂、抗氧化剂、着色剂、防晒剂、美黑剂(self-tanningagent)、色素、填充剂、防腐剂、香料、气味吸收剂、化妆品或药物活性剂、精油、维生素、必需脂肪酸、表面活性剂、成膜聚合物等。
在每种情况下，本领域技术人员将确保选择的所述佐剂及其比例，以便不干扰本发明组合物的期望的有利性质。这些佐剂可以例如相当于组合物总重量的0.01至20％。当本发明的组合物是乳状液(emulsion)时，相对于组合物的总重量，脂肪相可占5至80重量％，且优选5至50重量％。组合物中使用的乳化剂和助乳化剂选自所考虑领域中常规使用的那些。例如，相对于组合物的总重量，它们可以以0.3至30重量％的比例使用。
有利地，除了根据本发明的减肥活性剂之外，能够用于本发明的组合物可以包括至少一种具有与本发明的那些类似和/或互补的美容效果的其他活性剂。根据本发明，该活性剂将被定义为“额外的活性剂”。
例如，(一种或多种)额外的活性剂可选自：抗衰老、调理、淡化、保湿、排水和微循环促进剂、药物、去角质、擦洗、细胞外基质刺激、能量代谢-活化、抗菌、抗真菌、镇静、抗自由基、抗紫外线和抗痤疮剂、抗炎剂、麻醉剂、温热剂、清凉剂和减肥剂。
此类额外的活性剂可选自下组：
维生素A，且特别是类维生素A、视黄醇、视黄醇丙酸酯、视黄醇棕榈酸酯，
维生素B3，且特别是烟酰胺、生育酚的烟酸盐(niconitate)，
维生素B5、维生素B6、维生素B12，
维生素C，尤其是抗坏血酸、抗坏血酸葡糖苷、抗坏血酸四棕榈酸酯、抗坏血酸磷酸镁和抗坏血酸磷酸钠，
维生素E、F、H、K、PP和辅酶Q10，
金属蛋白酶抑制剂、TIMP活化剂，
DHEA，其前体或衍生物，
氨基酸，例如精氨酸、鸟氨酸、羟脯氨酸、羟脯氨酸二棕榈酸盐(hydroxyprolinedipalmate)、棕榈酰甘氨酸、羟赖氨酸、甲硫氨酸及其衍生物、N-酰基氨基酸化合物、天然或合成肽、包括二-、三-、四-、五-和六肽以及亲脂衍生物、异构体和与其他物质如金属离子(如铜、锌、锰、镁等)络合。例如，肽以以下商品名已知：MATRIXYLTM、ARGIRELINETM、COLLAXYLTM、PEPTIDE VINCI 02TM、CHRONOGENTM、LAMINIXYL ISTM、PEPTIDE Q10TM、基于植物的肽提取物，例如大豆、斯佩尔特小麦(spelt)、葡萄藤、油菜籽、亚麻籽、大米、玉米、豌豆、酵母提取物、卤虫藻(Artemia Salina)提取物、脱氢乙酸(DHA)、合成或天然来源的植物甾醇、水杨酸及其衍生物、α-和β-羟基酸、氨基糖、葡萄糖胺、D-葡萄糖胺、N-乙酰基-葡萄糖胺、N-乙酰基-D-葡萄糖胺、甘露糖胺、N-乙酰甘露糖胺、半乳糖胺、多酚的N-乙酰基半乳糖胺提取物、异黄酮、黄酮类如葡萄提取物、松树提取物和橄榄提取物、脂质如神经酰胺或磷脂、动物来源的油如角鲨烯或角鲨烷；植物油如扁桃仁、椰子、蓖麻、荷荷巴、橄榄、油菜籽、花生、向日葵、小麦胚芽、玉米胚芽、大豆、棉籽、苜蓿、罂粟、冬南瓜、月见草、小米、大麦、黑麦、红花、西番莲果、榛子、棕榈、甜杏仁、鳄梨和金盏花油；乙氧基化植物油、以及牛油树脂(shea butter)、所有防紫外线剂和防晒剂。
特别有利的是，本发明可包括至少一种已知其减肥作用、抑制脂肪生成或刺激脂肪分解作用的其它活性剂，例如：环AMP及其衍生物、腺苷酸环化酶活化剂和磷酸二酯酶抑制剂、积雪草提取物(centalla asiatica extract)、积雪草苷和积雪草酸、甲基黄嘌呤、茶硷、茶碱、可可碱、forskoline、七叶苷和七叶苷糖、ACE抑制剂、肽Val-Trp、神经肽Y抑制剂、脑啡肽、银杏叶提取物、甘薯提取物、芦丁、马鞭草提取物(verba mate extract)、瓜拉那提取物、低聚糖、多糖、肉碱、常春藤提取物、岩藻提取物、水解夏枯草提取物、水解鸡冠花提取物、光滑果榆绿木提取物(Anogeissus leiocarpus extract)、苦木薯叶提取物、棕榈酰肉碱、肌肽、牛磺酸、接骨木提取物、藻类提取物如Palmaria Palmata提取物、序列Arg-Gly-Ser-NH2的合成肽(以名称ATPEPTIDETM销售)、序列Pro-Leu-Asp-Thr-Ala-Lys-Val-Arg-Leu-Gln的合成肽(以名称UCPEPTIDETM销售)。
根据本发明使用的组合物可以通过任何合适的途径能够施用，特别是口服或外部表面施用，并且组合物的制剂将由本领域技术人员调整。
有利地，根据本发明的组合物是适于表面施用的形式。因此，这些组合物必须含有生理学上可接受的介质，即与皮肤和皮肤附属物相容，并覆盖所有化妆品形式。
明显的是，本发明一般涉及哺乳动物，且更具体地涉及人类。
该美容处理方法的具体实施方案也由以上描述得出。在阅读为说明性和非限制性目的而提供的实施例时，本发明的其他优点和特征将更加明显。
实施例1：生物活性莲精华级分(细胞质/细胞溶质级分或细胞精华级分)的分析
来自活莲植物的生物活性成分是根据美国专利No.7,442,391；7,473,435；7,537,791；8,043,635；8,101,212；8,277,852；8,318,220；美国专利申请20150258012；和PCT/EP2013/073565中描述的Zeta级分技术方法获得的。该制造方法采用研磨和挤压新鲜活植物以获得植物细胞汁(细胞内胶体分散体)，并且用电磁波以有效引起膜级分与细胞汁分离的频率处理它以产生细胞细胞质/细胞溶质级分，其基本上不含膜级分。
在有效将细胞质/细胞溶质级分分离成其组成部分(如细胞质级分和细胞溶质级分)的条件下进一步加工细胞质/细胞溶质级分。细胞溶质级分主要含有溶解在细胞内水中的低分子量组分。然后将细胞溶质级分精炼并稳定化以产生生物活性成分莲(Nelumbonucifera)提取物(它也称为莲精华级分、
Figure GDA0003730434770000161
NN和HarmonianceTM)。
莲(Nelumbo nucifera)提取物中的总可溶性糖分析基于比色法，其描述于：Yemmand Willis的“Estimation of Carbohydrates in Plant Extracts”by Anthrone,Biochem J.；57(3):508–514(1954)。样品分析采用以下方法进行：标准(双糖混合物)由各自约200ppm的果糖和葡萄糖的组合制成，总共414ppm的单糖。用水连续稀释该原液标准品，并使1mL各溶液与5mL冰冷的2000ppm蒽酮在72％硫酸中反应。将试剂加热至100℃持续10分钟，并由这些溶液在680nm处的吸光度值产生四点校准曲线。将测试样品在水中稀释至基于重量的0.5％溶液并进行相同的反应。将这些溶液在680nm处的吸光度与校准曲线进行比较，以确定它们的总糖浓度。对于样品和标准品，使用石英1cm比色皿，并用纯水取空白吸光度值。
莲(Nelumbo nucifera)提取物中的总酚类化合物含量通过以下方法测定：Ainsworth and Gillespie的“Estimation of total phenolic content and otheroxidation substrates in plant tissues using Folin–Ciocalteu reagent”,NatureProtocols；2:875-877(2007)。本文中描述的总酚类比色测定法使用Folin-Ciocalteu(F-C)试剂。F-C测定依赖于碱性介质中电子从酚类化合物转移至磷钼酸/磷钨酸络合物，其在765nm处通过光谱测定。根据该方法进行样品分析-从步骤5开始。将步骤5、6和7中的体积加倍，以产生足够体积用于减小体积的一次性比色皿。每个用于测量的样品在单独的比色皿中制备。在步骤6中，加入F-C试剂，将样品和试剂混合并静置约10分钟，然后加入碳酸盐。在两小时结束时，样品和标准(绿原酸)溶液在765nm处相对于空气进行测量；使用绿原酸(标准)校准曲线计算样品中的总酚含量。
使用详细描述的方法评估莲(Nelumbo nucifera)的安全性和毒理学特征(profile)
莲(Nelumbo nucifera)提取物在高达100％的浓度(未稀释)进行测试。
结果发现它是：
-无刺激性(在皮肤刺激研究中证明：重建的人类表皮)
-耐受性良好(对10名志愿者进行人体48小时贴剂测试)：
-实际上无刺激性(眼睛刺激研究Het-Cam测试)
-无刺激性(重组人角膜上皮(RHCE)长时间暴露时间处理试验)
此外，它在光毒性研究中证明没有光毒性潜力(对3T3细胞的中性红摄取光毒性试验，3T3 NRUPT体外方法)
表1：分析数据和范围*显示在下表中。
Figure GDA0003730434770000171
Figure GDA0003730434770000181
*莲(Nelumbo nucifera)提取物按“原样”进行分析。
非常有可能两组化合物均有助于莲(Nelumbo nucifera)提取物的生物活性。
实施例2：莲(Nelumbo nucifera)提取物对脂肪分解的评价
本研究旨在通过评估甘油在前脂肪细胞上的释放来评估莲(Nelumbo nucifera)提取物对脂肪分解的体外作用。脂肪分解是甘油三酯水解成甘油和脂肪酸。甘油释放量将与储存的甘油三酯的量和脂肪分解程度成比例
方案：3T3-L1前脂肪细胞(ATCC)在补充有10％FBS(Lonza)，2mM L-谷氨酰胺(Lonza)和100μg/ml Primocin(InvivoGen)的DMEM 4.5g/L葡萄糖(Lonza)中培养。
细胞汇合后2天，通过在培养基中加入0.5mM IBMX、1μM地塞米松和10μg/ml胰岛素(Sigma)3天诱导分化成脂肪细胞。然后，取出IBMX和地塞米松，并仅维持胰岛素3至4天；然后，除去胰岛素，并将细胞在培养基中再保持3天。
分化后，将细胞用实施例1的莲(Nelumbo nucifera)提取物处理，在培养基中以1/10,000当量稀释，进一步记录为莲0.01％(体积/体积)或2mM咖啡因阳性对照，每天两次，进行48小时。然后根据制造商的说明书使用Adipolysis Assay Kit(Cayman Chemical)测量甘油释放。
结果：表1中的结果显示，与未处理的条件相比或与咖啡因阳性对照条件相比，用莲(Nelumbo nucifera)提取物处理后甘油释放显著增加。
表2：用莲(Nelumbo nucifera)提取物处理后的甘油释放
甘油释放(％未处理)
未处理 100
咖啡因2mM 131
莲0.01％ 173
结论：0.01％的莲(Nelumbo nucifera)提取物刺激脂肪细胞体外脂肪分解。
实施例3：莲(Nelumbo nucifera)提取物对减肥效果的体内研究
方案：20名23至48岁的健康女性志愿者参加了这项比较性双盲研究。志愿者使用含有0.5％实施例1的莲(Nelumbo nucifera)提取物的乳膏配方#TCAAG06在一条大腿上，并且在另一条使用安慰剂，每天两次(早晨和晚上)，持续8周。莲(Nelumbo nucifera)提取物效果的结果由大腿上部和下部的厘米测量(周长)、大腿上部的温度评估以及训练有素的专家和志愿者的视觉评估测定。根据数据是否遵循正态分布，使用学生t检验(单尾)或Wilcoxon符号秩检验(单尾)。控制访问(control visite)已在D0、D28和D56完成。关于统计分析，根据数据是否遵循正态分布，使用学生t检验(单尾)或Wilcoxon符号秩检验(单尾)。
结果：
厘米测量：关于大腿上部的厘米测量，我们观察到在施用2个月后大腿周长显著减少。
表3
Figure GDA0003730434770000191
在大腿的下部，我们注意到在施用一个月后周长显著减小。应用2个月后，这种下降情况持续改善。
表4
Figure GDA0003730434770000192
Figure GDA0003730434770000201
温度测量：脂肪团是由于肥胖中的甘油三酯储存导致结节，其导致血管压迫和淋巴组织充血。这种压迫导致血流减慢和水潴留，它伴随皮肤温度的不均匀性。
为了观察皮肤温度的不均匀性，在大腿上部20cm的长度上每厘米进行一次测量。然后，比较每个志愿者的温度最小值和温度最大值之间的差异，以便观察两个处理区域的温度幅度。
由于0.5％莲(Nelumbo nucifera)提取物2个月的施用，我们注意到皮肤温度幅度的显著降低突出了与安慰剂侧相比更好的皮肤温度均匀性。这些结果表明，0.5％的莲(Nelumbo nucifera)提取物可能有助于恢复血液流动和限制水潴留。
表5
Figure GDA0003730434770000202
训练有素的专家和志愿者评估：在D56，60％的志愿者、训练有素的专家发现用含0.5％莲(Nelumbo nucifera)提取物的乳膏处理的大腿更细和触感更舒适。
60％的志愿者发现用含0.5％莲(Nelumbo nucifera)提取物的乳膏处理的大腿更细，55％发现在施用0.5％莲(Nelumbo nucifera)提取物2个月后，皮肤触感更加好。
结论：施用乳膏一个月后，我们注意到，与安慰剂相比，以0.5％配制的莲(Nelumbonucifera)提取物显著降低了大腿下部的周长。在两个月的施用后，通过两个测量区域的大腿周长的显著减少证实了这种改善。
我们还注意到在施用0.5％莲(Nelumbo nucifera)提取物2个月后，皮肤温度均匀性的显著改善，表明莲(Nelumbo nucifera)提取物可以帮助恢复血液流动和限制性淤滞。
此外，大多数志愿者发现，在处理2个月后，用0.5％莲(Nelumbo nucifera)提取物处理的大腿更细，触感更舒适。
所有这些参数突出了莲(Nelumbo nucifera)提取物通过其对大腿周长的有益作用和皮肤温度的均匀性来促进减肥和排水的潜力。
实施例4：临床测试乳膏–莲#TCAAG06
Figure GDA0003730434770000211
Figure GDA0003730434770000221
步骤
1.将A相加入主容器中并开始均质化。在70至75℃加热。
2.在UltraThix P-100上喷洒并充分混合约30分钟。
3.将D相成分加入侧烧杯中并在70至75℃加热。
4.将预先混合的C相加入A相中直至均匀
5.在70至75℃，将D相加入主容器中并充分混合。乳液应该是均匀的。
6.开始冷却。
7.在约50℃加入预先混合的E相并充分混合。
8.在30℃以下加入F相并充分混合
9.停在25℃
典型属性
外观：白色乳膏
pH：5.20-5.80
粘度(D0)23000-40000(Brookfield RVT/Spindle B/5RPM/1分钟/25℃)
该配方已通过3个月的加速实验室稳定性和28天的攻击效力测试。然而，防腐剂系统尚未优化至其最低有效水平。

Claims (7)

1.一种促进脂肪分解、减肥、排水、平滑皮肤表面、减少局部脂肪沉积体积的美容方法，所述方法包括向待治疗区域施用表面组合物，包括：
I.得自整株植物的0.2至1质量％的莲(Nelumbo nucifera)提取物，其具有6.59-6.78质量％的干物质，2.29-2.54质量％的总可溶性糖和1.33-1.58质量％的总酚化合物；以及
II.皮肤病学上可接受的载体；
其中莲(Nelumbo nucifera)提取物通过以下制备方法获得：
a.研磨和挤压新鲜莲(Nelumbo nucifera)生物质以获得含有膜级分的细胞内植物材料；
b.用电磁波以有效引起所述膜级分与所述细胞汁级分分离的频率处理所述细胞汁，以产生基本上不含膜级分的细胞质/细胞溶质级分。
2.根据权利要求1所述的美容方法，其中所述待治疗区域选自面部、下巴、颈部、手臂、胸部、腹部、臀部、髋部、大腿和腿部。
3.根据权利要求1所述的美容方法，其中表面施用包括每天两次施用组合物，所述组合物减少局部过量的局部脂肪沉积。
4.根据权利要求1所述的美容方法，其中表面施用包括施用组合物，所述组合物促进脂肪分解、脂质消除和从脂肪细胞输出甘油。
5.根据权利要求1所述的美容方法，其中表面施用包括施用组合物，所述组合物抵抗脂肪团或橘皮外观或使皮肤更紧致和更光滑或改善面部轮廓。
6.根据权利要求1所述的美容方法，其中表面施用包括施用组合物，所述组合物减少脂肪团的外观，并使皮肤更紧致和更光滑。
7.根据权利要求1所述的美容方法，其中所述表面组合物选自溶液、乳膏、软膏、凝胶、乳液、泡沫、喷雾剂、贴剂和可植入储剂。
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