KR102160001B1

KR102160001B1 - 메틸 케톤 생성능이 우수한 락토바실러스 플란타럼 균주 및 상기 균주를 포함하는 천연 향료 조성물

Info

Publication number: KR102160001B1
Application number: KR1020180170570A
Authority: KR
Inventors: 전슬기; 김보람; 김문석; 허병석
Original assignee: 샘표식품 주식회사
Priority date: 2018-12-27
Filing date: 2018-12-27
Publication date: 2020-09-25
Also published as: KR20200080771A

Abstract

본 명세서에는 메틸 케톤(methyl ketones) 생성능을 갖는 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) 균주와 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는 미생물 제제 또는 향료 조성물 등이 개시된다. 일 측면에서 상기 균주, 미생물 제제 및 향료 조성물 등은 치즈향, 요거트향과 같은 유제품향과 과실향을 나타내는 메틸 케톤 생성능이 우수하므로 이들을 활용하여 소비자들의 기호를 증진시킬 수 있고, 이와 동시에 병원성 세균에 대한 항균성을 가지고 있어 장기보관 등에 유리하므로, 저비용으로 식품, 화장료, 약제 등 다양한 제품에서 향미가 증진된 고부가가치 제품의 생산을 가능케 한다는 이점이 있다.

Description

메틸 케톤 생성능이 우수한 락토바실러스 플란타럼 균주 및 상기 균주를 포함하는 천연 향료 조성물{Lactobacillus plantarum with excellent methyl ketones productivity and a natural perfume composition comprising the same}

본 명세서에는 메틸 케톤(methyl ketones) 생성능을 갖는 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) 균주와 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는 미생물 제제 또는 향료 조성물 등이 개시된다.

향료는 식품, 화장품, 음료, 계면활성제, 사료, 화학, 바이오의약, 제약산업 등에 있어서 매우 중요한 역할을 하고 있다. 이와 같은 향료 생산 방법은 크게 화학합성법과 생물학적인 방법으로 나뉘는데, 화학적 합성방법을 통한 향료성분의 생산은 다양한 형태의 화학구조를 가진 향의 대량 생산이 가능하지만, 원하지 않은 라세믹 혼합물(racemic mixture)로 만들어질 가능성이 있을 뿐만 아니라, 기질특이성(substrate specificity)이 낮다는 단점이 있다. 아울러, 최근 소비자들의 소비 성향은 자연 친화적이고, 인체에 무해한 향취성분이 포함된 식품, 의약, 화학제품, 의약품제품을 선호하는 방향으로 변화하고 있고, 이에 따라 화학합성법으로 생산된 향료 혹은 향취성분보다는 생물학적 방법으로 생산한 향료성분에 대해 많은 관심이 높아지고 있다.

생물학적 생산법에는 추출법과 미생물 발효법이 있으며, 식물 세포 혹은 조직으로부터 추출하여 천연 향료성분을 생산하는 추출법은 식물세포의 배양시간이 매우 길고 배양조건이 까다로워 수율이 높지 않고, 생산된 향료성분의 농도가 낮고 추출공정이 자체가 복잡하며 분리공정이 까다롭다는 등의 여러 가지 제한점들이 보고되고 있다. 이에 반해, 미생물 발효를 통한 생물공학적 방법은 자연친화적이며 낮은 단가로 높은 부가가치제품을 생산할 수 있어 화학합성법의 단점을 극복할 수 있는 대체방법으로 각광을 받고 있다. 그러나, 아직까지 미생물 발효를 통한 메틸 케톤 생산을 하는 것과 관련된 연구는 미비한 상황이며, 일부 균주인 아가리쿠스 비스포루스(Agaricus bisporus), 아스퍼질러스 니거(Aspersillus niger), 페니실리움 로크포르티(Penicillium roqueforti), 트리코더마 비리데(Trichoderma viride)에 대하여 연구된 것이 전부인 상황이다.

이를 토대로, 인위적인 화합물 합성법이 아닌 방법으로 향료를 생산하는 방법을 연구하던 중, 락토바실러스 플란타럼 균주가 식용 가능한 균주로서 병원성 세균에 대하여 항균작용을 가지며 동시에 메틸 케톤 생산능을 가지는 균주임을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

공개특허공보 제10-2012-0059825호 공개특허공보 제10-2015-0066827호

일 측면에서, 본 발명의 목적은 메틸 케톤 생성능을 갖는 락토바실러스 플란타럼 균주, 및 상기 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 첨가하는 단계;를 포함하는 메틸 케톤의 제조 방법을 제공하는 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명의 목적은 상기 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는 미생물 제제를 제공하는 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명의 목적은 상기 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는 향료 조성물, 및 상기 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 첨가하는 단계;를 포함하는, 향료 조성물의 제조 방법을 제공하는 것이다.

상기 과제를 달성하기 위하여, 일 측면에서 본 발명은 메틸 케톤 생성능을 갖는 락토바실러스 플란타럼 균주를 제공한다.

일 측면에서 본 발명은 상기 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 첨가하는 단계;를 포함하는, 메틸 케톤의 제조 방법을 제공한다.

일 측면에서 본 발명은 상기 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는 미생물 제제를 제공한다.

일 측면에서 본 발명은 상기 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는 향료 조성물을 제공한다.

일 측면에서 본 발명은 상기 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 첨가하는 단계;를 포함하는, 향료 조성물의 제조 방법을 제공한다.

일 측면에서 상기 균주, 미생물 제제 및 향료 조성물 등은 치즈향, 요거트향과 같은 유제품향과 과실향을 나타내는 메틸 케톤 생성능이 우수하므로 이들을 활용하여 소비자들의 기호를 증진시킬 수 있고, 이와 동시에 병원성 세균에 대한 항균성을 가지고 있어 장기보관 등에 유리하므로, 저비용으로 식품, 화장료, 약제 등 다양한 제품에서 향미가 증진된 고부가가치 제품의 생산을 가능케 한다는 이점이 있다.

도 1은 본 명세서에 따른 기탁번호 KCCM 12417P로 기탁된 락토바실러스 플란타럼 SMB 751의 16s rDNA 서열을 나타낸 도이다.
도 2는 본 명세서에 따른 기탁번호 KCCM 12417P로 기탁된 락토바실러스 플란타럼 SMB 751 균주의 계통도를 나타낸 도이다.
도 3은 본 명세서의 일 실시예에서 SMB 751 균주 및 KCTC 3108 균주 간의 생화학적 동정을 수행한 결과를 나타낸 도이다. +는 양성, W(weak)는 약하게 양성,-는 음성을 의미하며, 도면 내 'SMB'는 락토바실러스 플란타럼 SMB 751을 지칭하고 'KCTC 3108'은 락토바실러스 플란타럼 KCTC 3108을 지칭하는 것이다.
도 4는 본 명세서의 일 실시예에서 SPME 및 GC-MS를 통한 락토바실러스 플란타럼 SMB 751 균주 및 락토바실러스 플란타럼 KCTC 3108의 메틸 케톤 생성능을 확인한 결과는 나타낸 도이다. 도면 내 'SMB'는 락토바실러스 플란타럼 SMB 751을 지칭하는 것이다.

이하, 상세히 설명한다.

일 측면에서 본 발명은 메틸 케톤 생성능을 갖는 락토바실러스 플란타럼 균주를 제공한다.

본 명세서에서 '메틸 케톤'은 카보닐기 한쪽에 메틸기가 결합된 화합물을 총칭하는 개념으로, 요거트, 치즈, 유제품, 또는 과실향을 나타내는 향기 성분으로 알려져 있다. 일례로 메틸 케톤을 도식화하면 하기 화학식 1과 같이 표현할 수 있고, 이때, 화학식 1 내 R은 C_nH_2n+1(n은 정수), 즉 알킬기(alkyl group)일 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 n은 7, 9, 또는 11일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 즉, 일례로 상기 메틸 케톤은 2-헵타논, 2-노나논 및 2-언데카논 중 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

[화학식 1]

일 측면에서, 상기 균주를 배지 전체 중량에 대하여 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이하, 5 이하 중량%, 바람직하게는 2 중량%로 접종한 후 30℃에서 24시간 동안 배양할 때, 생성되는 메틸 케톤의 농도가 30 이상, 40 이상, 50 이상, 60 이상, 70 이상, 80 이상, 90 이상, 100 이상, 110 이상, 120 이상, 130 이상, 140 이상, 150 이상, 160 이상, 170 이상, 180 이상, 190 이상, 200 이상, 210 이상, 220 이상, 230 이상, 240 이상, 250 이상, 260 이상, 270 이상, 280 이상, 290 이상, 300 이상, 310 이상, 320 이상, 330 이상, 340 이상, 350 이상, 360 이상, 370 이상, 380 이상, 390 이상, 400 이상, 410 이상, 420 이상, 430 이상, 440 이상, 450 이상, 460 이상, 470 이상, 480 이하, 490 이하, 500 이하, 510 이하, 520 이하, 530 이하, 540 이하, 550 이하, 560 이하, 570 이하, 580 이하, 590 이하, 600 이하, 610 이하, 620 이하, 630 이하, 640 이하, 650 이하, 660 이하, 670 이하, 680 이하, 690 이하, 700 이하, 710 이하, 720 이하, 730 이하, 740 이하, 750 이하, 760 이하, 770 이하, 780 이하, 790 이하, 800 이하, 810 이하, 820 이하, 830 이하, 840 이하, 850 이하, 860 이하, 870 이하, 880 이하, 890 이하, 900 이하, 910 이하, 920 이하, 930 이하, 940 이하, 950 이하, 960 이하, 970 이하, 980 이하, 990 이하, 1000 이하 ppb(parts per billion)일 수 있고, 일례로 상기 균주를 1 내지 5 중량%로 접종한 후 30℃에서 24시간 동안 배양할 때 생성되는 2-헵타논의 농도가 30 ppb 내지 400 ppb일 수 있고, 생성되는 2-노나논의 농도가 50 ppb 내지 500 ppb일 수 있으며, 생성되는 2-언데카논의 농도가 100 ppb 내지 1000 ppb일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 측면에서, 본 발명의 균주는 내염성이 우수한 균주일 수 있으며, 일례로 0.1 이상, 0.2 이상, 0.3 이상, 0.4 이상, 0.5 이상, 0.6 이상, 0.7 이상, 0.8 이상, 0.9 이상, 1 이상, 1.1 이상, 1.2 이상, 1.3 이상, 1.4 이상, 1.5 이상, 1.6 이상, 1.7 이상, 1.8 이상, 1.9 이상, 2 이상, 2.1 이하, 2.2 이하, 2.3 이하, 2.4 이하, 2.5 이하, 2.6 이하, 2.7 이상, 2.8 이하, 2.9 이하, 3 이하, 3.1 이하, 3.2 이하, 3.3 이하, 3.4 이하, 3.5 이하, 3.6 이하, 3.7 이상, 3.8 이하, 3.9 이하, 4 이하, 4.1 이하, 4.2 이하, 4.3 이하, 4.4 이하, 4.5 이하, 4.6 이하, 4.7 이상, 4.8 이하, 4.9 이하, 5 이하 %(v/v)의 염 농도 조건에서 생육이 가능한 균주일 수 있다.

일 측면에서, 본 발명의 균주는 pH 3.5 이상, 3.6 이상, 3.7 이상, 3.8 이상, 3.9 이상, 4 이상, 4.1 이상, 4.2 이상, 4.3 이상, 4.4 이상, 4.5 이하, 4.6 이하, 4.7 이상, 4.8 이하, 4.9 이하, 5 이하, 5.1 이하, 5.2 이하, 5.3 이하, 5.4 이하, 5.5 이하, 5.6 이하, 5.7 이하, 5.8 이하, 5.9 이하, 6 이하, 6.1 이하, 6.2 이하, 6.3 이하, 6.4 이하, 6.5 이하 조건에서 생육이 가능한 균주일 수 있다.

일 측면에서, 본 발명의 균주는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 16S rDNA를 갖는 균주일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 측면에서, 본 발명의 균주는 락토바실러스 플란타럼 SMB 751 균주일 수 있으며, 기탁번호가 KCCM 12417P인 균주일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 측면에서, 상기 균주는 식물 유래 균주일 수 있고, 일례로 전통 발효 식품인 김치에서 분리한 것일 수 있다.

일 측면에서, 본 발명의 균주는 병원성 세균에 대한 항균력을 갖는 균주일 수 있고, 일례로 상기 병원성 세균은 대장균 속(Escherichia species) 세균, 스타필로코커스속(Staphylococcus species) 세균, 바실러스 속(Bacillus species) 세균, 슈도모나스 속(Pseudomonas species) 세균 및 리스테리아 속(Listeria species) 세균 중 1 이상의 세균일 수 있고, 바람직하게는 대장균(Escherichia coli), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 및 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes) 중 1 이상의 균주일 수 있으며, 보다 바람직하게는 기탁번호 KCCM 12417P인 균주일 수 있으나, 이이 제한되는 것은 아니다.

일 측면에서, 상기 병원성 세균에 대한 항균력을 가진다는 것의 의미는 배지 전체 부피에 대하여 상기 병원성 세균을 5%(v/v) 접종한 다음, 상기 균주를 접종한 TSA(tryptic soy agar) 배지를 5 ml로 분주한 후 30℃에서 24시간 동안 배양할 때 생성되는 생육저지원(clear zone)의 지름이 10 이상, 11 이상, 12 이상, 13 이상, 14 이상, 15 이상, 16 이상, 17 이상, 18 이하, 19 이하, 20 이하, 21 이하, 22 이하, 23 이하, 24 이하, 25 이하, 26 이하, 27 이하, 28 이하, 29 이하, 30 이하 mm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 측면에서 본 발명은 상기 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는, 미생물 제제를 제공한다.

일 측면에서 상기 발효물은 상기 균주, 이의 파쇄물 또는 이의 배양물을 발효한 물질일 수 있다.

일 측면에서 상기 방법은 상기 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 이용하는 단계;를 포함하는, 메틸 케톤의 제조 방법을 제공한다.

일 측면에서, 상기 파쇄물, 배양물, 발효물 또는 추출물은, 제균된 것을 포함할 수 있다. 또한, 상기 배양액은, 배양액을 원심분리하여 얻은 상등액을 포함할 수 있다. 상기 추출물의 제조방법은 제한되지 않고, 업계에 알려진 주지의 방법에 의해 수행될 수 있다.

일 측면에서 상기 발효물은 상기 균주, 이의 파쇄물 또는 이의 배양물을 발효시키는 단계를 통하여 수득되는 것일 수 있고, 일 측면에서 상기 발효에 사용되는 배지는 락토바실러스 플란타럼의 배지가 될 수 있는 것이라면 제한 없이 포함되며, 일례로 Difco사의 MRS 배지를 사용할 수 있고, 또 다른 예로 당과 질소원이 포함되어 있으며 pH가 6 내지 7인 배지를 사용할 수 있고, 또 다른 예로 글루코스, 펩톤, 효모 추출물, 소듐 아세테이트, 제2 포타슘 포스페이트, 암모늄 설페이트, 마그네슘 설페이트, 망가니즈 설페이트 및 트윈 중 하나 이상을 포함하는 배지, 또는 지방 또는 지방산을 포함하는 배지일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 측면에서, 상기 발효는 상기 균주, 이의 파쇄물 또는 이의 배양물을 전체 배지 중량에 대하여 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이하, 5 이하 중량%으로 첨가하여 수행하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 일 측면에서, 상기 발효는 26 이상, 27 이상, 28 이상, 29 이상, 30 이상, 31 이상, 32 이하, 33 이하, 34 이하, 35 이하, 36 이하, 37 이하, 38 이하, 39 이하, 40 이하 ℃에서 19 이상, 20 이상, 21 이상, 22 이상, 23 이상, 24 이상, 25 이상, 26 이하, 27 이하, 28 이하, 29 이하 시간 동안 수행하는 것일 수 있고, 바람직하게는 30 내지 37 ℃에서 23 내지 25시간 동안 수행하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 측면에서 본 발명은 상기 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는 향료 조성물을 제공한다. 일례로 상기 향료 조성물은 천연 향료 조성물일 수 있다.

일 측면에서 상기 향료 조성물은 요거트, 치즈 등을 포함하는 유제품 향 또는 과실향을 나타낼 수 있고, 이에 따라 기호도를 증진 용도를 가질 수 있다.

일 측면에서, 상기 조성물은 상기 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상은 조성물 전체 중량에 대하여 0.1 이상, 0.5 이상, 1 이상, 1.5 이상, 2 이상, 2.5 이상, 3 이상, 3.5 이상, 4 이상, 4.5 이상, 5 이상, 5.5 이상, 6 이하, 6.5 이하, 7 이하, 7.5 이하, 8 이하, 8.5 이하, 9 이하, 9.5 이하, 10 이하, 11 이하, 12 이하, 13 이하, 14 이하, 15 이하, 16 이하, 17 이하, 18 이하, 19 이하, 20 이하 중량%로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 측면에서 본 발명의 향료 조성물에 있어서, 부수적으로 효과 증대를 위하여 팔미틱산(palmitic acid), 스테아릭산(stearic acid) 등의 지방산, 지방알콜, 직쇄와 분기쇄의 장쇄 알킬 4급 암모늄염 등의 양이온화 계면활성제, 양이온화 셀룰로오스, 양이온화 폴리비닐피롤리돈 등의 양이온화 폴리머, 실리콘 등과 혼용하여 제제화를 용이하게 할 수 있다. 또한, 일례로 제형화를 위하여 용제, 계면활성제, 증점제, 안정화제, 방부제, 착색제, pH 조절제, 금속이온 봉쇄제, 착색제, 펄화제, 외관개선제, 안료, 분체입자 등의 제제화를 위한 성분들을 부수적으로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 측면에서 상기 향료는 식품 첨가제, 화장료 첨가제, 섬유 첨가제 또는 약제학적 첨가제일 수 있으며, 향기를 부여할 수 있는 형태의 물건이라면 제한 없이 포함한다.

일례로 상기 향료는 식품 조성물의 첨가제로 사용되어 치즈, 요거트 등 유제품 등의 식품에서 풍미를 증진시키는 데 활용될 수 있고, 일례로 상기 식품은 사람에게 섭취되는 것에 제한되지 않고 사람 외 동물에게도 섭취되는 사료 등을 모두 포함하는 것이다.

일례로 상기 향료는 화장료에서 향기를 부여하는 첨가제로 사용되어 피부를 정돈, 보호용의 기초 화장품(화장수, 세럼, 에센스, 로션, 크림 등), 색조 화장품(메이크업 베이스, 파운데이션, 파우더, 아이 쉐도우, 립글로즈, 립스틱, 립밤 등), 손, 발톱용 메이크업(메니큐어, 영양제, 강화제, 탑코트 등), 세정용 화장품(폼클린싱, 클린싱 오일, 클린싱 로션, 클린싱 크림, 클린싱 젤, 팩, 마스크, 비누, 클린싱 티슈 등), 썬 케어 화장품, 바디용 화장품(바디로션, 샤워젤, 바디크림, 바디오일 등)을 모두 포함하는 화장료에 첨가될 수 있으며, 모발에 있어서도 샴푸, 린스, 트린트먼트, 헤어팩, 헤어 에센스, 왁스, 젤, 스프레이 등의 모든 제제에 첨가되어 요거트, 치즈와 같은 유제품 향 또는 과실향을 나타낼 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 측면에서 상기 향료는 섬유첨가제로서 의도하는 용도에 따라 섬유 유연제, 액상 세제, 분말 세제, 시트형 세제, 섬유 염색제, 섬유트리트먼트, 섬유린스, 표백제, 부분오염 처리제, 섬유 스타일링제, 다림질보조제, 의류 보관제 등에 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일례로 상기 향료는 약학적 조성물에서 나타날 수 있는 거북한 향을 가리거나 약학적 조성물에 특별한 향을 부여하여 소비자의 기호를 증진시키기 위하여 약제학적 첨가제로 사용될 수 있다.

일 측면에서 본 발명은 상기 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 이용하는 단계;를 포함하는, 향료 조성물의 제조 방법을 제공한다.

중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생락하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다. 또한, 본 명세서 내에서 사용된 '또는'은 명확하게 반대하는 내용을 명시하고 있지 않는 한, '및'을 포함하는 개념이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예, 실험예 및 제조예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예, 실험예 및 제조예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예, 실험예 및 제조예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예, 실험예 및 제조예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1. 내염성 및 내산성이 우수한 균주의 선별

전통 발효 식품 중 하나인 (열무)김치를 전라도 광주로부터 수집하여 액상과 함께 곱게 간 다음, 연속 희석법을 이용하여 멸균 생리식염수로 곱게 간 김치를 10⁶배로 희석한 후, 희석액 0.1 ml을 유산균 분리용 한천배지인 MRS broth(Difco사, USA)에 도말하고 30 ℃에서 48시간 동안 혐기 배양하여 1차적으로 균주들을 분리하였다. 그리고 나서, 1차적으로 분리된 균주들을 2차로 분리하기 위하여, pH 5.2 이하일 때 노란색으로 변화하는 BCP agar(Eiken사, Japan) 배지에 상기 1차적으로 분리된 균주들을 접종한 뒤, 혐기 및 30 ℃ 온도 조건에서 48시간 동안 배양하여 노란색의 환이 생기는 일부 균주들을 분리하였다.

이후, 상기 분리된 균주들 중에서 염이 첨가된 식품에서 생육할 수 있는 균주들을 선별하기 위해 2% NaCl을 첨가한 MRS 배지에서 30 ℃ 온도 조건 하 48 시간 동안 배양한 후 집락을 형성한 내염성 균주들만 선별하였고, 이어서 내산성 균주들을 선별하기 위해 pH 5.0으로 조절한 MRS broth에 접종한 후 30 ℃ 온도 조건 하에서 24시간 동안 배양하여 생육한 균주들만을 선별하였다. 총 4종의 균주들이 최종적으로 선발되었고, 상기 각 단계별로 선택된 균주들의 종류를 표 1에 숫자로 나타내었다.

분리시료	1차 분리	2차 분리		최종선별
		내염성(2% NaCl)	내산성(pH 5.0)
김치	15	10	4	4

실시예 2. 메틸 케톤 생성능이 우수한 균주의 선별

상기 실시예 1에서 선별한 4종의 균주 중 메틸 케톤인 2-헵타논(2-heptanone), 2-노나논(2-nonanone) 및 2-언데카논(2-undecanone) 생성능이 있는 균주를 선별하기 위하여 실험을 수행하였다. 구체적으로 글루코스 2 중량%, 펩톤 2 중량%, 효모 추출물(Yeast extract) 0.5 중량%, 소듐 아세테이트 0.5 중량%, 제2 포타슘 포스페이트 0.2 중량%, 암모늄 설페이트 0.2 중량%, 마그네슘 설페이트 0.1 중량%, 망가니즈 설페이트 0.005 중량% 및 트윈80 0.1 중량%를 포함하는 배지에 상기 실시예 1에서 선별한 균주를 각각 2 중량%로 접종한 후, 30 ℃에서 24시간 동안 배양하여 GC-MS 분석하였다. 그 결과는 표 2에 나타내었다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 락토바실러스 플란타럼 SMB 751이 가장 많은 양의 메틸 케톤을 생성하는 균주로 최종 선별되었다.

	메틸 케톤(ppb)
균주	2-헵타논	2-노나논	2-언데카논	총합
SMB751	43.15	498.6	2296.62	2838.37
YKL15	33.68	405.95	1686.2	2125.83
BML12	34.84	408.47	1783.91	2227.22
RTJL4	0	8.37	3.57	11.94

실시예 3. 선별된 메틸 케톤 생성능이 우수한 균주의 동정

유전학적 동정을 위하여, 상기 실시예 2에서 선별된 균주를 대표적인 universal primer인 27F(5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3', 서열번호 2)와 1429R(5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3', 서열번호 3) 프라미어를 사용하여 16S rDNA(서열번호 1, 도 1)에 대하여 PCR을 수행하여 해당 서열을 증폭시켰다. 그리고 나서, Wizard DNA 정제 키트를 이용하여 상기 서열들을 정제하고, 솔젠트㈜(대전)에 염기서열의 분석을 의뢰하였다. 이를 토대로 NCBI Blast와 EzTaxon server 2.1(Jongsik Chun)에서 공지된 서열들과의 상동성 비교를 통해 동정한 결과, 상기 선별된 균주는 가장 가까운 근연관계로 락토바실러스 플란타럼 KCTC 3108(Lactobacillus plantarum KCTC 3108(T))와 100%의 상동성을 보임을 확인하였다.

이후, EzTaxon server 2.1(Jongsik Chun)에서 선별 균주와 유사한 균주들의 16S rRNA 정보를 메가 프로그램(MEGA program)을 이용하여 염기서열들을 정렬하고 시각적 관찰과 수작업으로 보정한 후 Neighbor joining 방법을 사용하여 계통도를 작성하였다. 작성한 계통도는 도 2에 나타내었다.

추가적으로, 생화학적 동정을 위하여, API Kit(50CHL)를 이용한 당 이용성 테스트를 수행하였고, 그 결과로서 락토바실러스 플란타럼 SMB 751 균주와 KCTC 3108 균주 간의 활성 차이를 비교한 결과를 도 3에 나타내었다. 양성은 +, 약하게 양성은 W(weak), 음성은 -로 나타내었다.

도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 상기 두 균주 간에 L-아라비노스(L-Arabinose), α-메틸-D-글루코시드(α-methyl-D-glucoside), 멜리비오스(Melibiose), 멜레키토스(Melezitose), D-아라비톨(D-Arabitol)의 대사에서 활성 차이가 존재하였다. 이는 상기 두 균주가 상이한 균주임을 시사한다.

상기 결과들에 의해, 본 명세서에 따른 균주는 락토바실러스 플란타럼 KCTC 3108 균주와 근접한 균주로 동정이 되기는 하나, 락토바실러스 플란타럼 KCTC 3108과는 상이한 균주임을 확인하였다. 이에, 락토바실러스 플란타럼 SMB 751(Lactobacillus plantarum SMB 751)로 명명된 본 발명의 균주를 2018년 12월 11일자로 기탁기관인 한국미생물보존센터에 기탁번호 KCCM 12417P로 기탁하였다.

실시예 4. 동정된 균주의 메틸 케톤 생성능 확인

상기 실시예 3에서 동정된 락토바실러스 플란타럼 SMB 751 균주와 락토바실러스 플란타럼 KCTC 3108 균주의 메틸 케톤인 2-헵타논, 2-노나논, 2-언데카논의 생성량을 분석 및 비교하였다.

4-1. SPME(Solid Phase Micro Extraction) 및 GC-MS(Gas chromatography-mass spectrometry)을 통한 메틸 케톤의 성분 분석

글루코스 2 중량%, 펩톤 2 중량%, 효모 추출물 0.5 중량%, 소듐 아세테이트 0.5 중량%, 제2 포타슘 포스페이트 0.2 중량%, 암모늄 설페이트 0.2 중량%, 마그네슘 설페이트 0.1 중량%, 망가니즈 설페이트 0.005 중량% 및 트윈80 0.1 중량%를 포함하는 배지에, 상기 락토바실러스 플란타럼 SMB 751 및 락토바실러스 플란타럼 KCTC 3108을 각각 2 중량%로 접종한 후, 30 ℃에서 24시간 동안 발효를 진행하였다. 그 후 하기 실험예 1에 기술한 방식으로 SPME 및 GC-MS을 수행하였다. 그 결과는 도 4에 나타내었고, 상기 SPME 및 GC-MS 분석 방식은 하기 실험예 1에 기술해두었다.

도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 발효 전 배지에서는 2-헵타논, 2-노나논, 2-언데카논이 검출되지 않았으나, 락토바실러스 플란타럼 SMB 751 균주를 이용한 배양물에서 2-헵타논, 2-노나논, 2-언데카논의 농도가 각각 2-헵타논, 2-노나논, 2-언데카논의 농도가 각각 100 ppb, 200ppb, 400ppb 이상으로 다량 검출되는 것을 확인하였다. 락토바실러스 플란타럼 KCTC 3108 균주를 이용한 발효물에서 2-헵타논, 2-노나논, 2-언데카논이 검출되기는 하였으나, 미량으로만 검출되었다.

4-2. 표준 첨가법(Standard addition method)을 통한 메틸 케톤 정량 분석

보다 정확한 정량 분석을 위하여, 상기 SPME 및 GC-MS 분석 결과를 바탕으로 표준 첨가법을 수행하여 상기 발효물 내 메틸 케톤인 2-헵타논, 2-노나논 및 2-언데카논의 함량을 확인하였다. 그 결과는 표 3에 나타내었으며, 상기 표준 첨가법을 수행한 방식은 하기 실험예 1에 기술해두었다.

	함량(ppb)
균주/물질	2-헵타논	2-노나논	2-언데카논
SMB 751	102.82±13.01	202.05±18.35	448.04±18.17
L. plantarum (KCTC 3108)	72.52±8.67	132.54±13.68	202.66±5.36

표 3에 나타낸 바와 같이, 첨가 농도별 Area 값 비교를 통하여 계산한 결과, 락토바실러스 플란타럼 SMB 751 균주에서는 2-헵타논, 2-노나논, 2-언데카논의 농도가 각 100 ppb, 200ppb, 400ppb 이상 검출되었고, 기준주에서는 2-헵타논, 2-노나논, 2-언데카논의 농도가 각 70ppb, 100ppb, 200ppb 이상이 검출되어, 본 발명의 락토바실러스 플란타럼 SMB 751 균주가 플란타럼 KCTC 3108 균주보다 적게는 1.5배에서 많게는 2배 이상 많은 양의 메틸 케톤을 만드는 것을 확인하였다.

실시예 5. 동정된 균주의 항균 활성 확인

식품에서 질병을 일으키는 미생물로 알려진 대장균(Escherichia coli KCTC 2441), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus KCTC 3881), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa KCTC 1750), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes KCTC 3569) 및 바실러스 세레우스(Bacillus cereus KCTC 3624)의 총 5종의 균주를 한국생명공학연구원 생물자원센터로부터 분양 받아, 상기 실시예를 통하여 동정된 락토바실러스 플란타럼 SMB 751 균주와 기준주인 락토바실러스 플란타럼 KCTC 3108 균주의 항균력을 확인하였다.

구체적으로, MRS(Difco사, USA) agar 배지에 락토바실러스 플란타럼 SMB 751 균주와 락토바실러스 플란타럼 KCTC 3108 균주를 중앙에 점 모양으로 각각 접종한 후 37 ℃에서 24시간 동안 선 배양하였다. 향균력 조사를 위한 상기 5종의 병원성 세균들을 Tryptic soy(Difco사, USA) broth 배지에 접종하여 30 ℃에서 24시간 동안 배양하고, 한천을 0.5 중량% 첨가시킨 TSA(Tryptic soy agar) 배지 10 ml에 상기 배양해둔 병원성 세균을 5%(v/v)씩 접종하였다. 그리고 나서, 상기 락토바실러스 플란타럼 SMB 751 균주와 락토바실러스 플란타럼 KCTC 3108 각각을 선 배양해 놓은 MRS 배지 위에 상기 TSA 배지를 5 ml로 분주하여 굳힌 후, 30 ℃에서 24시간 동안 배양하여 생성된 생육저지원(clear zone)의 크기를 측정하였다. 락토바실러스 플란타럼 SMB 751 균주와 락토바실러스 플란타럼 KCTC 3108 균주에 대한 항균력 테스트 결과는 표 4에 나타내었다(단위: 밀리미터(mm)).

	Clear zone 크기(mm)
	대장균 KCTC244	스타필로코커스 아우레우스 KCTC3881	슈도모나스 에루지노사 KCTC1750	리스테리아 모노사이토게네스 KCTC3569	바실러스 세레우스 KCTC3624
락토바실러스 플란타럼 SMB 751	20	19	20	15	18
락토바실러스 플란타럼 KCTC 3108	17	18	23	12	17

표 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 락토바실러스 플란타럼 SMB 751 균주는 식중독 또는 설사를 유발하는 식품 유래의 병원성 미생물 5종 모두에 대해 우수한 항균 활성을 가지며, 특히 기준주인 락토바실러스 플란타럼 KCTC 3108 균주보다 우수한 항균 활성을 가진다. 이는 병원성 세균인 상기 5종의 유해균의 생장 억제력을 가지는 본 명세서에 따른 락토바실러스 플란타럼 균주는 유해한 세균의 오염 없이 신선한 발효물 등을 제공할 수 있는 유산균으로 활용될 수 있음을 나타낸다.

실험예 1. 상기 실시예 4의 메틸 케톤 생성능 확인 방법

1-1. 고체상 미세 추출법(Solid phase microextraction)(SPME) 수행 방법

(a) SPME 섬유는 다이비닐벤젠(divinylbenzene)/카르복센 (carboxen)/폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane)을 사용하였다.

(b) 발효 전후의 샘플은 8 mL를 20 mL 헤드스페이스 바이알에 넣고 테플론 캡으로 밀봉하였다.

(c) 60 ℃에서 20분간 방치하여 평형상태에 도달시킨 후, SPME 섬유를 노출시켜 20분 동안 시료의 휘발성 성분을 섬유에 흡착시켰다.

(d) 섬유를 GC의 주입부(injection port)(250℃에 5분간 탈착 후 추출은 중복(duplicate)으로 실시하였다(하기 표 5 참고).

1-2. GC-MS에 의한 성분 분석 방법

(a) 알릴 메르캅탄 성분은 Thermo Fisher Scientific ISQ series single quadrupole, 질량 선택적 검출기(mass selective detector)(MSD)(Thermo Fisher Scientific Co., USA)를 사용하여 동정하였다.

(b) 컬럼(Column)은 DB-ffap(30m length X 0.25mm i.d X 0.25㎛ film thickness : J & W Scientifie, Folson, CA, USA)를 사용하였다.

(c) 오븐 온도는 40 ℃에서 1분간 유지한 후 200 ℃까지 온도를 단계별로 승온시켜 10분간 유지하였다(표5 참고).

(d) 주입기(injector) 온도는 250 ℃, 이온소스(ion source) 온도는 270 ℃로 유지하고 운반 기체(carrier gas)로는 헬륨을 사용하였으며 유속은 1 mL/min으로 하였다.

(e) 이온화 전압(ionization voltage)은 70 eV, 분석할 분자량의 범위(m/z)는 35-450으로 하여 3회(triplicate) 분석을 실시하였다(표 5 참고).

SPME 조건
섬유	DVB/CAR/PDMS
흡착	60℃, 250rpm, 20분
배양	60℃, 250rpm, 20분
탈착	250℃, 5분
표본	8g 표본
GC-MS(Quadrupole) 조건
컬럼	DB-FFAP (30 m 길이 x 0.25 mm I.D x 0.25 ㎛ 필름 두께)
운반 기체	He (유량 1 ml/분)
오븐 온도	40℃(1분 유지) → 10℃/분 → 75℃ → 1℃/분 → 90℃ → 10℃/분 → 135℃ → 1℃/분 → 150℃(10분 유지) → 5℃/분 → 200℃(10분 유지)
주입기 온도	250℃
MS 트랜스퍼 라인 온도	250℃
이온소스 온도	270℃
스플릿 비율(Split ratio)	스플릿리스(Splitless)
질량 스펙트럼 이온화 에너지	70eV
질량 스캔 범위(Mass scan range)	35-450 a.m.u

1-3. 표준 첨가법을 통한 메틸 케톤 정량 분석 방법

(a) SPME와 Standard addition법을 이용하여 정량을 실시하였다.

(b) 2-Heptanone, 2-Nonanone, 2-Undecanone 표준품을 배양액과 함께 3가지 범위의 농도로 첨가하여 SPME로 추출하였다(표6 참고).

(c) 첨가된 표준품의 농도에 대한 타겟 물질의 Area값과의 관계식을 얻고 이 직선을 외삽하여 실제 배양액에 존재하는 물질의 농도를 구했다.

물질명	락토바실러스 플란타럼 균주	첨가 농도 (ppb)
2-헵타논	SMB 751	50, 200, 300
2-헵타논	KCTC 3108	50, 150, 200
2-노나논	SMB 751	200, 400, 600
2-노나논	KCTC 3108	200, 400, 600
2-언데카논	SMB 751	500, 1000, 1500
2-언데카논	KCTC 3108	250, 500, 750

이상, 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM12417P

20181211

<110> SEMPIO FOODS COMPANY <120> Lactobacillus plantarum with excellent methyl ketones productivity and a natural perfume composition comprising the same <130> 18p682ind <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1412 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16s rDNA for lactobacillus plantarum SMB 751 <400> 1 gtcgaacgaa ctctggtatt gattggtgct tgcatcatga tttacatttg agtgagtggc 60 gaactggtga gtaacacgtg ggaaacctgc ccagaagcgg gggataacac ctggaaacag 120 atgctaatac cgcataacaa cttggaccgc atggtccgag cttgaaagat ggcttcggct 180 atcacttttg gatggtcccg cggcgtatta gctagatggt ggggtaacgg ctcaccatgg 240 caatgatacg tagccgacct gagagggtaa tcggccacat tgggactgag acacggccca 300 aactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccacaatg gacgaaagtc tgatggagca 360 acgccgcgtg agtgaagaag ggtttcggct cgtaaaactc tgttgttaaa gaagaacata 420 tctgagagta actgttcagg tattgacggt atttaaccag aaagccacgg ctaactacgt 480 gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttgtcc ggatttattg ggcgtaaagc 540 gagcgcaggc ggttttttaa gtctgatgtg aaagccttcg gctcaaccga agaagtgcat 600 cggaaactgg gaaacttgag tgcagaagag gacagtggaa ctccatgtgt agcggtgaaa 660 tgcgtagata tatggaagaa caccagtggc gaaggcggct gtctggtctg taactgacgc 720 tgaggctcga aagtatgggt agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc ataccgtaaa 780 cgatgaatgc taagtgttgg agggtttccg cccttcagtg ctgcagctaa cgcattaagc 840 attccgcctg gggagtacgg ccgcaaggct gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca 900 caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gctacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac 960 atactatgca aatctaagag attagacgtt cccttcgggg acatggatac aggtggtgca 1020 tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct 1080 tattatcagt tgccagcatt aagttgggca ctctggtgag actgccggtg acaaaccgga 1140 ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga cctgggctac acacgtgcta 1200 caatggatgg tacaacgagt tgcgaactcg cgagagtaag ctaatctctt aaagccattc 1260 tcagttcgga ttgtaggctg caactcgcct acatgaagtc ggaatcgcta gtaatcgcgg 1320 atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccatga 1380 gagtttgtaa cacccaaagt cggtggggta ac 1412 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> universal primer 27F <400> 2 agagtttgat cmtggctcag 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> universal primer 1429R <400> 3 tacggytacc ttgttacgac tt 22

Claims

2-헵타논, 2-노나논 및 2-언데카논의 메틸 케톤(methyl ketones) 생성능을 갖고,
기탁번호가 KCCM 12417P이며,
배지 전체 중량에 대하여 1 내지 5 중량%로 접종한 후 30℃에서 24시간 동안 배양할 때, 생성되는 2-헵타논의 농도가 30 ppb 내지 400 ppb이고, 생성되는 2-노나논의 농도가 50 ppb 내지 500 ppb이며, 생성되는 2-언데카논의 농도가 100 ppb 내지 1000 ppb인, 락토바실러스 플란타럼 SMB 751(Lactobacillus plantarum SMB 751) 균주.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
제1항에 있어서,
상기 균주는 0.1 내지 5%(v/v)의 염 농도 조건에서 생육이 가능한, 균주.
제1항에 있어서,
상기 균주는 pH 3.5 내지 6.5 조건에서 생육이 가능한, 균주.
제1항에 있어서,
상기 균주는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 16S rDNA를 갖는, 균주.
삭제
삭제
제1항에 있어서,
상기 균주는 대장균 속(Escherichia species) 세균, 스타필로코커스속(Staphylococcus species) 세균, 바실러스 속(Bacillus species) 세균, 슈도모나스 속(Pseudomonas species) 세균 및 리스테리아 속(Listeria species) 세균 중 1 이상의 병원성 세균에 대한 항균력을 갖는, 균주.
제12항에 있어서,
배지 전체 부피에 대하여 배지에 상기 병원성 세균을 5%(v/v)로 접종한 다음, 상기 균주를 접종한 TSA(tryptic soy agar) 배지를 5 ml로 분주한 후 30℃에서 24시간 동안 배양할 때 생성되는 생육저지원(clear zone)의 지름이 10 내지 30 mm인, 균주.
삭제
제12항에 있어서,
상기 병원성 세균은 대장균(Escherichia coli), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 및 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes) 중 1 이상의 균주인, 균주.
제1항, 제7항 내지 제9항, 제12항, 제13항 및 제15항 중 어느 한 항에 따른 균주를 포함하는 미생물 제제.
제1항, 제7항 내지 제9항, 제12항, 제13항 및 제15항 중 어느 한 항에 따른 균주를 이용하는 단계;를 포함하는, 2-헵타논, 2-노나논 및 2-언데카논의 메틸 케톤(methyl ketones)의 제조 방법.
제1항, 제7항 내지 제9항, 제12항, 제13항 및 제15항 중 어느 한 항에 따른 균주를 포함하는 향료 조성물.
제18항에 있어서,
상기 향료는 식품 첨가제, 화장료 첨가제, 섬유 첨가제 및 약제학적 첨가제 중 하나 이상인 조성물.
제1항, 제7항 내지 제9항, 제12항, 제13항 및 제15항 중 어느 한 항에 따른 균주를 이용하는 단계;를 포함하는, 향료 조성물의 제조 방법.