KR102130897B1 - 돼지의 산자수 예측용 바이오마커 - Google Patents

Abstract

본 발명은 돼지 모돈의 산자수를 예측하기 위한 단백질 바이오마커에 관한 것으로, 본 발명의 바이오마커인 모에신 단백질 또는 포스포글리세르산인산화효소 단백질은 이의 발현 여부 및 정도에 따라 유전력이 낮은 경제형질인 산자수를 모돈에서 예측할 수 있으므로, 이를 산자수 형질개량에 이용하기 위한 실용화작업에 적용하면, 향후 돼지 모돈의 산자수에 관한 실질적인 형질 개량 비용과 시간을 감소시킴으로써 축산농가의 경제적 부담을 줄이고, 궁극적으로 번식효율을 예측하여 향상시켜 축산업의 발달을 촉진 시킬 수 있는 효과가 있다.

Description

돼지의 산자수 예측용 바이오마커{BIOMARKERS FOR PREDICTION OF SWINE FECUNDITY}

본 발명은 돼지의 산자수 예측용 바이오마커에 관한 것으로, 구체적으로는 돼지 모돈의 산자수를 예측하기 위한 단백질 바이오마커에 관한 것이다.

돼지의 산자수는 양돈산업에서 MSY(교배모돈당 출하두수)와 관련된 중요한 번식형질이다. 돼지의 산자수는 모돈 1두당 1년간 이유두수(PSY)에 영향을 미치어 직접적인 번식 농가의 경제성뿐만 아니라 국가적으로도 양돈 경쟁력에 큰 영향을 미치는 요인으로 작용되어진다. 돼지에서의 산자수는 양돈 전체 효율에 매우 큰 영향을 미치는 형질로써 평가되어지고 있으나, 다른 형질들에 비해 상대적으로 낮은 유전력과 성의 제한 등 기술적인 한계가 있어서 개량이 쉽지 않다. 산자수는 매우 복잡한 형질로서 배란율, 초기 배아의 생존율, 태아의 생존율, 자궁의 용량과 능력, 젖꼭지 수 등의 형질에 의해서 결정된다. 규모가 큰 모군집단에서 여러 산차에 걸쳐 번식능력을 조사하고 모돈생산능력지수(SPI)와 추정육종가를 산출하여 복당산자수와 이유시 산자체중 등이 좋은 암퇘지를 선발하여 다산성계통을 육성하고 있다. 낮은 산자수는 국내 보유 모계종돈의 개량체계가 미흡하여 자체 개량보다는 외국으로부터 종돈을 수입하고 증식시켜 보급하는 경향도 보이고 있다. 국내외에서 번식돈의 산자능력이 재인식되어 산자수가 많은 모돈의 집단을 만들고 지속적으로 우수계통을 육성하는 프로그램을 운영하고 있으며, 중국 재래종 메이시안(Meishan)과 같은 우수한 다산성 계통을 활용하여 산자수를 개량하려는 연구가 진행되고 있다.

최근에는 산자수와 이유두수 개량을 위한 돼지 산자능력 검정사업의 중요성이 재인식되고 있다. 이에 국내는 물론 유럽에서는 산자수가 많은 모돈의 집단을 만들어 그 집단에서 계속적으로 우수계통을 육성하고 있는데, 이를 하이퍼 프로리픽 라인(Hyper-prolific line)이라고 한다. 암퇘지 개량은 주로 번식 능력과 모돈의 강건성에 주안점을 두어 개량하며, 그 주요 항목은 산자수, 포유개시두수, 생시체중, 21일령 복당체중, 21일령 육성수 등이다. 미국, 영국, 일본 등의 선진국에서도 다산성 계통의 육성을 위하여 중국 재래종인 메이시안(Meishan)종의 유전자를 수입하여 돼지 산자수 개량에 많은 연구가 활발히 진행되고 있지만, 아직은 실효성 있는 결과를 얻지 못하고 있다. 근래에 경제 형질과 연관된 유전자 다양성(RFLP)과 연관성(linkage disequilibrium)이 조사됨에 따라 산자수로 대표되는 번식형질의 개량을 가능케 해주고 있다 (Georges et al., Genome Res. 6(10):907-921(1996)., Rohrer et al., J. Anim. Sci. 77:1318-1391(1999)). 돼지에서는 ER(estrogen receptor) 유전자를 이용하여 돼지의 산자수 증진에 관한 연구가 진행되고 있다 (Rothschild et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:201-205 (1996)). 현재까지 ER의 생리적 작용이 직접적으로 산자수에 영향을 준다는 연구결과는 알려진 바 없지만, ER 유전자의 돌연변이가 사람에서 자연유산과 관련성이 있다는 결과 (Lehrer et al., Lancet 335(8690):622-624(1990)., Berkowitz et al., J. Obstet. Gynecol. 171(6):1579-1584(1994))와, 형질전환 생쥐를 이용한 실험에서 ER 유전자가 불활성화된 수컷의 경우 정상적인 정자 형성과정이 이루어지지 못하였고, 암컷에 있어서도 자궁과 난소에서 형태적 이상이 발견되어 암수 모두에서 불임의 원인이 되었다는 결과 (Korach et al., Science 266(5190):1524-1527(1994)., Eddy et al., Mol. Endocrinol. 7(3):441-452(1996))가 보고되었다. 이러한 결과들을 기초로 ER 유전자가 돼지의 산자수 증진에 영향을 줄 수 있는 후보 유전자로서 연구가 진행되고 있다.

돼지의 산자수가 증가할수록 양돈농가 및 종돈회사에게 매우 중요한 경제적 이익을 가지고 올 수 있고 개량하기 힘든 표현형질이기에 양돈 선진국과의 경쟁력을 증진시키기 위해서는 유전자 검사를 통한 조기예측법 개발이 필요하며, 산자수를 개량하기 위한 정밀한 바이오마커를 개발하여 다산성 번식 후보모돈의 선발과정에서 직접 적용함으로써 양돈농가의 경제적 이익과 국가 경쟁력을 향상시킬 수 있다.

이에, 본 발명자들은 단백질체 분석방법을 이용하여 고산자 및 저산자 모돈의 자궁단백질체의 탐구를 수행하여 산자수와 관련된 바이오마커를 동정 규명하였다.

본 발명의 목적은 모에신 단백질 또는 포스포글리세르산인산화효소 단백질, 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 돼지의 산자수 예측용 마커를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 모에신 단백질 또는 포스포글리세르산인산화효소 단백질의 발현량을 mRNA 또는 단백질 수준에서 측정하는 제제를 포함하는 돼지의 산자수 예측용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 본 발명의 돼지의 산자수 예측용 조성물을 포함하는 돼지의 산자수 예측용 키트를 제공하는 것이다.

아울러, 본 발명의 목적은 돼지의 산자수 예측 방법을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 모에신 단백질 또는 포스포글리세르산인산화효소 단백질, 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 돼지의 산자수 예측용 마커를 제공한다.

또한, 본 발명은 모에신 단백질 또는 포스포글리세르산인산화효소 단백질의 발현량을 mRNA 또는 단백질 수준에서 측정하는 제제를 포함하는 돼지의 산자수 예측용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 돼지의 산자수 예측용 조성물을 포함하는 돼지의 산자수 예측용 키트를 제공한다.

아울러, 본 발명은 돼지의 산자수 예측 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 모에신 단백질 및 포스포글리세르산인산화효소 단백질의 발현 여부 및 정도에 따라 유전력이 낮은 경제형질인 산자수를 모돈에서 예측할 수 있으므로, 이를 산자수 형질개량에 이용하기 위한 실용화작업에 적용하면, 향후 돼지 모돈의 산자수에 관한 실질적인 형질 개량 비용과 시간을 감소시킴으로써 축산농가의 경제적 부담을 줄이고, 궁극적으로 번식효율을 예측하여 향상시켜 축산업의 발달을 촉진 시킬 수 있는 효과가 있다.

도 1은 고산자 모돈 및 저산자 모돈의 자궁내막 단백질 시료를 2-D 전기영동을 실시한 다음 쿠마시 염색한 이미지이다:
A: 고산자 모돈 자궁내막 샘플; 및
B: 저산자 모돈 자궁내막 샘플.
도 2는 2-D 전기영동을 실시한 이미지에서 고산자 모돈 및 저산자 모돈의 자궁내막 단백질 중 특이적 차등발현을 보이는 단백질인 Moesin 및 Phosphoglycerate kinase 스팟 부분을 확대한 이미지와 image master분석에서 고산자 및 저산자 모돈 군에서의 통계적 차이를 보여주는 도표이다:
A: 고산자 모돈 자궁내막 샘플; 및
B: 저산자 모돈 자궁내막 샘플.
도 3은 MALDI-TOF Mass Spectrometer를 이용하여 획득한 pick date그래픽 이미지이다.
도 4는 웨스턴 블랏 분석을 이용하여 Moesin 단백질 및 Phosphoglycerate kinase 단백질의 발현을 고산자/저산자 자궁내막 샘플에서 확인한 결과이다:
A: Moesin 단백질의 발현 밴드; 및
B: Phosphoglycerate kinase 단백질의 발현 밴드.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.

또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 발명을 테스트하기 위한 실행에서 사용될 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법이 본원에서 기술된다.

본 발명에서 용어, "시료(샘플)"는 대상으로부터 얻은 생물학적 시료를 의미한다. 생물학적 시료의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성분; 대상의 임신 또는 발생의 임의의 시점의 세포일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

일 측면에서, 본 발명은 모에신 단백질 또는 포스포글리세르산인산화효소 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 돼지의 산자수 예측용 마커에 관한 것이다.

일 측면에서, 본 발명은 모에신 단백질 또는 포스포글리세르산인산화효소 단백질을 포함하는 돼지의 산자수 예측용 마커에 관한 것이다.

일 구현예에서, 돼지의 산자수 예측용 마커는 모에신 단백질, 포스포글리세르산인산화효소 단백질, 또는 모에신 단백질 및 포스포글리세르산인산화효소 단백질을 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 모에신 단백질은 8두 이하의 산자수를 가지는 저산자 모돈에서 발현될 수 있다.

일 구현예에서, 포스포글리세르산인산화효소 단백질은 8두 이하의 저산자 모돈에서보다 11두 이상의 산자수를 가지는 고산자 모돈에서 발현이 감소할 수 있다.

본 발명에서 용어, "산자수 예측용 마커"란 동물의 산자수 생산능력에 따라 달리 발현되는 유기 생체 분자를 의미하는 것으로, 상기 유기 생체 분자로는 이에 한정되지는 않으나, 예를 들면, 폴리펩타이드, 단백질, 핵산(예, mRNA,DNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(예, 단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등을 포함한다.

본 발명에서는 고산자와 저산자 모돈의 자궁내막의 단백질분석을 실행하여 단백질 발현양상을 제공하며, 이를 위해, 단백질의 발현과 발현 후 변형, 기능 및 조절작용, 다른 단백질과의 상호작용, 결합 등에 ?X점을 두어 분자생화학적으로 단백질간의 기능 및 연관 네트워크를 규명하는 분야이다. 단백체학의 흐름은 크게 생물학적인 문제를 인지 하여 샘플을 수집 및 준비 과정을 거쳐, 2차원 단백질 전기영동, 이미지 분석, 단백질 절단, 질량분석 순으로 대상 단백질을 발굴하는 단백체학을 이용하였다. 일 실시예에서 많은 수의 단백질 분리를 위하여 널리 이용된 2차원 전기영동(2-Dimensional electrophoresis, 2-DE)을 위해, 1차로 각 단백질이 보유한 고유의 등전위값(pI)으로 분리 후, 2차원 분리 과정에서는 SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)을 이용하여 분자량으로 분리하였다. SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) 단백질 전기영동의 기본원리는 단백질 구성 아미노산에 존재하는 전하를 이용하여 양극에 각각 음전위와 양전위를 걸어주면 단백질이 이동하게 되어 분리하는 것이며, 이와 같은 전기영동이 완료된 단백질들을 눈으로 볼 수 있게 쿠마시블루(Commassie blue) 염색을 진행하였다. 쿠마시블루 시약의 단백질 검출 범위는 단백질 양이 10ng~100ng 정도일 때 가장 좋은 검출반응을 나타낸다. 검출된 단백질들을 이미지 분석과정 후, 단백질의 라이신(Lys)과 아르기닌(Arg) 잔기에 특이적으로 절단하는 효소인 트립신을 사용하여 단백질을 절단하여 질량 분석을 실시하였으며, 질량분석 방법으로는 매트릭스 구성물질과 단백질을 혼합하여 결정화시킨 후 레이저 빔을 쏘아 이온을 발생시켜 비행 시간차 분석을 하는 방법인 MALDI-TOF(Matrix assisted laser desorption ionization-time of flight)를 이용하였다. 이를 통해 대상 단백질 전체 질량이나 이의 절단효소에 의하여 조각난 절편들의 질량을 분석할 수 있였으며, 효소로 특이적 위치에 절단 후 질량 분석을 통해 발생되는 펩티드(Peptide)들의 고유 질량을 최종적으로 데이터베이스에 입력하여 펩티드 서열 정보를 얻어 실질적인 단백질 동정을 수행하였다.

일 측면에서, 본 발명은 모에신 단백질 또는 포스포글리세르산인산화효소 단백질의 발현량을 mRNA 또는 단백질 수준에서 측정하는 제제를 포함하는, 돼지의 산자수 예측용 조성물에 관한 것이다.

일 구현예에서, 단백질의 발현량을 단백질 수준에서 측정하는 제제는, 상기 마커의 단백질 전장 또는 그 단편을 특이적으로 인식하는 항체, 항체단편, 앱타머, 아비머 또는 펩티도모방체일 수 있다.

본 발명에서 용어, "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커인 모에신 또는 포스포글리세르산인산화효소 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 상기 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler et al, European Journal of Immunology, 6:511-519, 1976), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991) 등에 의해 제조될 수 있다. 본 발명에 사용되는 항체는 단클론 또는 다클론 항체, 면역학적으로 활성인 단편(예를 들어, Fab 또는 (Fab)2 단편), 항체 중쇄, 인간화 항체, 항체 경쇄, 유전자 조작된 단일쇄 Fν 분자, 키메릭 항체 등일 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함된다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다.

일 구현예에서, 측정은 웨스턴블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사면역확산법, 면역 전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 질량분석 또는 단백질 마이크로어레이로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법으로 수행될 수 있다.

본 발명에서 용어, "단백질 수준에서 측정"은 종래 알려진 임의의 단백질 측정 또는 검출 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커 유전자로부터 발현된 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용한 분석방법이 사용될 수 있다. 항체를 이용한 단백질 분석 방법에는, 웨스턴 블롯팅, ELISA, 방사선 면역분석, 방사면역확산법, 오우크테로니 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역기 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 등이 포함되나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 상기 ELISA에는 직접적 ELISA, 간접적 ELISA, 직접적 샌드위치 ELISA, 간접적 샌드위치 ELISA 등이 포함된다. 웨스턴 블롯팅이란, 전체 단백질을 분리하고, 전기영동하여, 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀룰로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시키고, 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법이다. 그 외에 단백질 수준을 측정하는 방법에는, 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 효소, 기질, 조효소, 리간드 등을 이용하는 방법이 사용될 수 있다.

본 발명에서 용어, "검출" 또는 "측정"은 검출 또는 측정 여부 및, 검출 또는 측정된 대상의 농도를 정량하는 것을 의미한다.

일 구현예에서, 단백질의 발현량을 mRNA 수준에서 측정하는 제제는, 상기 마커의 핵산서열, 상기 핵산서열에 상보적인 핵산서열, 상기 핵산서열 및 상보적인 서열의 단편을 특이적으로 인식하는 프라미어 쌍, 프로브, 또는 프라이머 쌍 및 프로브일 수 있다.

본 발명에서 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기 (free 3 hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍 (base pair)를 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응 (즉, DNA 폴리머레이트 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다.

본 발명에서 용어, "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링 되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 상기 C16orf45, NHS, GSN, SIPA1L1, PALLD, ZFAND5, SSBP2 또는 SH3BP4 유전자와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 상기 유전자 발현 정도를 진단할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 통상의 기술분야에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있으므로 본 발명에서는 이에 대해 특별히 한정하지 않는다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포네이트, 포스소트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

본 발명에서, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시키는 적합한 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, NucleicAcidHybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 상기 엄격조건 중에서 고 엄격조건은 0.5 M NaHPO4, 7% SDS(sodium dodecyl sulfate),1mM EDTA에서 65℃ 조건으로 혼성화하고, 0.1 x SSC(standard saline citrate)/0.1% SDS에서 68℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 또는, 고 엄격조건은 6 x SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에서 48℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 저 엄격조건은 예를 들어, 0.2 x SSC/0.1% SDS에서 42℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다.

일 구현예에서, 측정은 중합효소연쇄반응, 실시간 RT-PCR, 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소연쇄반응, Nuclease 보호 분석, in situ 교잡법, 핵산 마이크로어레이, 노던블랏 또는 DNA 칩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법으로 수행될 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 조성물을 포함하는 돼지의 산자수 예측용 키트에 관한 것이다.

일 구현예에서, RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트일 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 1) 모돈의 시료에서 모에신 또는 포스포글리세르산인산화효소의 단백질 또는 mRNA 수준을 측정하는 단계; 및 2) 상기 mRNA 또는 단백질 발현량의 증가 또는 감소를 분석하는 단계를 포함하는 돼지의 산자수 예측 방법에 관한 것이다.

일 구현예에서, 예측은 검체의 유전자 프로필이 나타내는 양상을 통계적으로 분석하여 처리하는 것일 수 있다.

일 구현예에서, 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함할 수 있으며, 혈액, 자궁내막 조직, 타액, 뇨 또는 유즙일 수 있고, 자궁내막 조직인 것이 더욱 바람직하다.

일 구현예에서, 모에신 단백질이 발현되면 돼지의 산자수가 낮은 저산자 모돈인 것으로 예측하고, 모에신 단백질이 발현되지 않으면 산자수가 높은 고산자 모돈인 것으로 예측하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 포스포글리세르산인산화효소 단백질의 발현이 감소하면 돼지의 산자수가 높은 고산자 모돈인 것으로 예측하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 포스포글리세르산인산화효소 단백질의 발현이 저산자 모돈보다 고산자 모돈에서 감소할 수 있다.

일 구현예에서, 고산자 모돈은 11두 이상의 산자수를 가질 수 있으며, 저산자 모돈은 8두 이하의 산자수를 가질 수 있다.

하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 자궁내막 단백질체 비교 분석

1-1. 고산자/저산자 선별

충남축산기술연구소와 다비육종 디앤디 종돈장의 종빈돈의 번식자료를 분석하여, 종빈돈에서 렌드레이스와 대요크셔에서 산차별 평균 8두 이하의 모돈을 저산자 모돈으로, 산차별 11두 이상을 고산자로 선정하였으며 (표 1), 이들 두 품종의 모돈들을 이유 후 4일경인 발정 초기에 마취 후 개복시술을 통해 혈액 샘플 및 자궁 샘플을 확보하였다.

1-2. 모돈의 자궁내막 단백질 분리

상기 실시예 1-1에서 선별한 고산자/저산자 모돈의 자궁 단백질을 분리해 내기 위해, 자궁 샘플 시료 200㎕당 200㎕의 파쇄 버퍼 (1% SDS, 프로테아제 억제제 칵테일 (complete; Roche) 및 100mM Tris-HCl, pH 7.0)를 넣고 초음파 분쇄기(sonicator)를 이용하여 분쇄한 후 아이스에 식혔다. 그 후, 쉐이커에서 1시간 동안 상온에서 반응시키고 15000rpm, 4℃ 및 20분의 조건으로 원심분리하여 상등액을 분리하였다. 분리한 상등액을 Bio-Rad사의 Bradford 단백질 분석을 이용하여 단백질을 정량한 뒤 약 2mg씩 단백질을 분주하여 -70℃에 보관하였다.

1-3. 자궁내막 단백질 2차원 전기영동 분석 및 동정

고산자/저산자 모돈의 자궁 단백질 샘플에서 2-DE(2-dimensional electrophoresis, 2차원전기영동분석)을 이용하여 단백질체를 비교분석하였다. 구체적으로, 상기 실시예 1-2에서 준비한 모돈의 자궁내막 단백질 시료 2㎎을 pH 3-10의 스트립 젤(strip gel)에서 1차 전기영동(Isoelectricfocusing, IEF)을 각 3반복씩 수행하여 단백질들이 자신의 등전점(pI value)에 해당하는 pH부분으로 이동할 수 있도록 하였다. 1차 전기영동(IEF)가 끝난 스트립(strip)를 DTT 평형화 버퍼 (1% DTT, 6M 요소, 2% SDS, 375mM Tris pH8.8, 20% 글리세롤 및 2.5% 아크릴아마이드) 10㎖을 넣고 15분간 가볍게 흔들어 주면서 반응시겼다. DTT 평형화 버퍼를 버린 후 요오드아세트아마이드 평형화 버퍼 (4% 요오드아세트아마이드, 6M 요소, 2% SDS, 375mM Tris pH8.8, 20% 글리세롤 및 2.5% 아크릴아마이드) 10㎖을 넣고 15분간 가볍게 흔들어 주면서 평형화(equilibration)시켰다. 평형화가 끝난 스트립을 고정된 8%-16% 그레디언트 젤(gradient gel)의 상층에 넣고, SDS PAGE 러닝 버퍼 (1.44% 글라이신, 0.1% SDS 및 0.3% Tris-base)가 들어 있는 Ettan DALTtwelve Large vertical system (Amersham Bioscience)에 고정시켜 150mA의 전류로 16시간 동안 2차 전기영동을 실시하였다. 전기영동 후, 젤을 증류수로 세척한 후 고정용액 (40% v/v 메탄올, 5% v/v 인산) 1ℓ을 넣고 가볍게 흔들어 주면서 1시간 고정한 뒤 용액을 제거하였다. 그 후, CBB(Commassie brilliant blue) G-250 염색용액 (17% g/v 황산암모늄, 3% v/v 인산, 0.1% g/v 쿠마시(Coomassie G-250) 및 34% v/v 메탄올) 1ℓ를 넣고 가볍게 흔들어 주면서 12시간 이상 염색하였다. 염색한 젤을 탈염색용액(1% 아세트산)에 넣어 12시간 이상 탈염색을 실시하였다. 젤 이미지 분석을 위해, 젤을 스캐너를 이용하여 스캔한 후, Image Master 2D platinum software version 5.0 프로그램을 이용하여 분석하였으며, 약 1000개의 구분 가능한 단백질 스팟들이 나타나 정상적인 2차원 전기영동 시스템이 확립되었음을 알 수 있었다. 고산자와 저산자 모돈의 자궁단백질 각각의 샘플들에 대해 각각 2반복을 실시하여 비교한 결과, 2-DE 젤의 비교분석에서 고산자와 저산자의 단백질발현 패턴이 다른 것을 확인할 수 있었다. 특히 분자량 30-60 kD 사이의 단백질 패턴과 분자량 14 kD 부위에서 존재하는 단백질 패턴들이 차이가 나는 것을 볼 수 있었다 (도 1). 이에, 이미지 분석을 통해 1.5배 이상 차등발현을 보이는 단백질 스팟 18개를 선별하였으며, 이들 18개의 스팟들 중 9개의 단백질 스팟은 고산자 모돈 그룹에서 더 많이 발현되었고, 8개의 단백질 스팟은 저산자 모돈 그룹에서 더 많이 발현되었음을 확인하였으며, 1개의 단백질 스팟이 저산자 모돈 그룹에서 특이적으로 발현하는 것을 확인하였다. 또한, 이미지 분석 후 이미지 분석 후 차이를 보인 단백질 스팟들을 잘라 내여 1.5㎖ 마이크로튜브(microtube)에 넣고 washing buffer(50% v/v 아세토나이트릴, 25mM 탄산암모늄, pH7.8) 120㎕를 첨가하여 CBB의 청색이 살아 질 때까지 반복하여 탈염색한 겔 스팟(gel spot)조각을 진공원심분리기를 이용하여 동결건조하였다. 건조한 스팟 조각에 5㎕의 trypsin buffer(0.02㎍ 트립신/㎖, 25mM 탄산암모늄)을 넣고 1시간 동안 재수화(rehydration)하고 겔 조각에 25mM 탄산암모늄 완충제(ammonium bicarbonate buffer)를 추가 하여 12시간 이상 37℃에서 12시간 반응시켰다. Extraction buffer(50% 아세토나이트릴, 0.1% Trifluoro acetic acid(TFA), 3차 증류수) 5㎕를 넣고 30분간 초음파처리(sonication)를 실시하고 1㎕의 시료를 취하여 메트릭스(matrix)용액(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid 10㎎/㎖ in 50% v/v 아세토나이트릴, 0.1% TFA) 1㎕를 추가하여 섞은 후 96웰 플레이트(well plate)(Perseptive Biosystems, Framingham, MA, USA)에 깔고, 30분간 건조시켜 시료를 준비하였다. 96 웰 플레이트에 있는 펩타이드를 MALDI-TOF(Perseptive Biosystems, Framingham, MA, USA)로 분석하여 트립신으로 분해된 펩타이드 분자량을 측정하였다. 측정된 펩타이드 분자량 데이터를 ProFound(http://prowl.rockefeller.edu/prowl-cgi/profound.exe)사이트의 데이터베이스를 이용하여 차등발현을 보이는 19개의 스팟 단백질을 동정하였다 (표 2).

고산자/저산자 모돈의 자궁내막 단백질 샘플에서 발현량의 차이를 나타내는 단백질체 분석 결과, 임신 특이적으로 발현되고 있는 단백질 스팟들을 찾아 각각의 반복샘플들에서 일정하게 보이는 스팟들을 확인하였으며, 고산자/저산자 모돈 자궁내막 단백질 중 특이적 차등발현을 보이는 단백질인 Moesin (저산자 모돈에서 발현 발생) 및 Phosphoglycerate kinase (저산자 모돈에서 발현량 증가)를 동정할 수 있었다 (도 2 및 도 3).

실시예 2. 고산자/저산자 모돈에서의 Moesin 및 Phosphoglycerate kinase 발현량 확인

상기 실시예 1에서 고산자/저산자 모돈에서 차등 발현을 나타낸 것으로 동정된 Moesin 및 Phosphoglycerate kinase 단백질의 단백질 발현량 차이를 정확히 판명할 수 있는지 분석하기 위해, 고산자와 저산자 모돈 자궁내막 샘플의 웨스턴 블랏(western blot)을 실시하여 분석하였다. 구체적으로, SDS-PAGE를 12% 젤에 자궁 내막 단백질을 30ug를 넣어 전기영동을 실시하고, SDS-PAGE의 전기영동이 끝나면 젤 상의 단백질을 PDVF 멤브레인으로 트랜스퍼하였다. 트랜스퍼한 멤브레인에 TBS-T 블로킹 용액 (25mM Tris-base, 0.8% NaCl, 0.002% KCl, 5% 탈지분유, 0.1% Tween-20, pH 7.4)을 부은 뒤 실온에서 2 내지 3 시간 동안 쉐이킹하였다. TBS-T 버퍼 (25mM Tris-base, 0.8% NaCl, 0.002% KCl, 0.1% Tween-20 pH 7.4)로 10분 2번 세척한 후 항-Moesin 항체 (TBS-T 버퍼와 1:5000 희석) 또는 항-PGK2 항체 (TBS-T 버퍼와 1:5000 희석)와 한 시간 동안 반응시켰다. 그 후, TBS-T 버퍼로 15분 동안 2회 세척한 뒤, 2차 항체 (TBS-T 버퍼와 1:10000로 희석한 rabbit IgG)와 한 시간 동안 반응시켰다. 그 후 TBS-T 버퍼로 10분씩 3회 세척한 뒤 ECL 검출 키트 (Amersham Bioscience, Piscataway, USA)를 사용하여 단백질 발현 밴드를 확인하였다. 모든 실험은 3번 반복되었다.

그 결과, Moesin 단백질이 고산자 모돈에서는 발현되지 않는 반면, 저산자 모돈에서는 강하게 발현되는 것으로 확인되었으며 (도 4A), Phosphoglycerate kinase 단백질은 고산자 모돈에서보다 저산자 모돈에서 발현이 증가된 것을 확인할 수 있었다 (도 4B).

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5. 모에신(Moesin) 단백질 및 포스포글리세르산인산화효소 2(Phosphoglycerate kinase 2) 단백질의 발현량을 mRNA 또는 단백질 수준에서 측정하는 제제를 포함하는, 돼지의 산자수 예측용 조성물.
6. 제 5항에 있어서, 단백질의 발현량을 단백질 수준에서 측정하는 제제는,
   상기 모에신 단백질 및 포스포글리세르산인산화효소 2 단백질 전장 또는 그 단편을 특이적으로 인식하는 항체, 항체단편, 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 또는 펩티도모방체(peptidomimetics)인, 돼지의 산자수 예측용 조성물.
7. 제 6항에 있어서, 측정은 웨스턴블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 면역 전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 질량분석 또는 단백질 마이크로어레이로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법으로 수행되는, 돼지의 산자수 예측용 조성물.
8. 제 5항에 있어서, 단백질의 발현량을 mRNA 수준에서 측정하는 제제는,
   상기 모에신 단백질 및 포스포글리세르산인산화효소 2의 핵산서열, 상기 핵산서열에 상보적인 핵산서열, 상기 핵산서열 및 상보적인 서열의 단편을 특이적으로 인식하는 프라미어 쌍, 프로브, 또는 프라이머 쌍 및 프로브인, 돼지의 산자수 예측용 조성물.
9. 제 8항에 있어서, 측정은 중합효소연쇄반응, 실시간 RT-PCR (Real-time RT-PCR), 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소연쇄반응(Competitive RT-PCR), Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, 핵산 마이크로어레이, 노던블랏 또는 DNA 칩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법으로 수행되는, 돼지의 산자수 예측용 조성물.
10. 제 5항의 조성물을 포함하는 돼지의 산자수 예측용 키트.
11. 제 10항에 있어서, RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인, 돼지의 산자수 예측용 키트.
12. 1) 모돈의 시료에서 모에신 및 포스포글리세르산인산화효소 2의 단백질 또는 mRNA 수준을 측정하는 단계; 및
    2) 상기 mRNA 또는 단백질 발현량의 증가 또는 감소를 분석하는 단계를 포함하는 돼지의 산자수 예측 방법.
13. 제 12항에 있어서, 시료는 혈액, 자궁내막 조직, 타액, 뇨 또는 유즙인, 돼지의 산자수 예측 방법.
14. 제 12항에 있어서, 모에신 단백질이 발현되면 돼지의 산자수가 낮은 저산자 모돈인 것으로 예측하는 단계를 추가로 포함하는, 돼지의 산자수 예측 방법.
15. 제 14항에 있어서, 저산자 모돈은 8두 이하의 산자수를 가지는, 돼지의 산자수 예측 방법.
16. 제 12항에 있어서, 포스포글리세르산인산화효소 2 단백질의 발현이 감소하면 돼지의 산자수가 높은 고산자 모돈인 것으로 예측하는 단계를 추가로 포함하는, 돼지의 산자수 예측 방법.
17. 제 16항에 있어서, 고산자 모돈은 11두 이상의 산자수를 가지는, 돼지의 산자수 예측 방법.
18. 제 16항에 있어서, 포스포글리세르산인산화효소 2 단백질의 발현이 8두 이하의 저산자 모돈보다 고산자 모돈에서 감소하는, 돼지의 산자수 예측 방법.

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