JP5985102B2 - 牛の判別方法、及び牛の判別用キット - Google Patents
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Description
この発明の牛の判別方法は、(1)牛から体組織を採取する採取工程と、(2)採取した体組織から全蛋白質を抽出する抽出工程と、(3)抽出した全蛋白質中に含まれる特定蛋白質の量を測定する測定工程と、(4)測定した特定蛋白質の量に基づいて牛の経済形質を判別する判別工程と、を含む方法である。そこで、各工程の詳細等について以下に説明する。
採取工程は、体組織を採取する工程であり、採取する体組織としては、蛋白質を発現している体組織であればよく、具体的には、白色脂肪組織、筋肉組織、皮膚組織、血液などが挙げられる。中でも、採材時に検体への侵襲が少ない血清が好ましい。
抽出工程は、体組織から全蛋白質を抽出する工程であり、後述する測定工程で使用できる量と質の全蛋白質を抽出できる公知の方法であれば特に限定することなく使用することができる。具体的には、体組織を適当なpHを有する緩衝液に入れ、ホモジナイザーによって組織、細胞を破砕し、遠心分離して上清を得る方法などが挙げられる。なお、必要に応じて、酵素処理や有機溶媒による処理を加えてもよい。
測定工程は、抽出した全蛋白質中に含まれている特定蛋白質の量を電気泳動、抗原抗体反応等を使用して測定する工程である。測定工程の詳細については、以下に説明する。
特定蛋白質とは、具体的には、(a)配列番号1から70に記載のアミノ酸配列によって構成されている蛋白質、(b)(a)の蛋白質を構成するアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列によって構成されている牛の蛋白質、(c)は(a)及び(b)の前駆体蛋白質及び成熟体蛋白質、(d)は(a)、(b)、及び(c)の修飾蛋白質である。
電気泳動による測定は、蛋白質の電荷や等電点の違いを利用して蛋白質を分離したのち、特定蛋白質を測定する公知の方法であればよい。具体的には、下記の(a)一次元電気泳動による測定、及び(b)二次元電気泳動による測定が挙げられる。
一次元電気泳動による測定は、例えば、ウエスタンブロッティング法によって行う。より具体的には、次のようにして行う。まず、ネイディブゲルやSDSポリアクリルアミドゲルを利用する電気泳動によって蛋白質を分離し、分離した蛋白質をPVDF膜などに転写する。次に、特定蛋白質に対する抗体や当該抗体に対する抗体(二次抗体)を使用する抗原抗体反応により、PVDF膜を発色させる。最後に、発色後のPVDF膜の画像をスキャナーやCCDカメラによってコンピュータに取り込み、取込んだ画像のノイズの低減やバックグラウンドの補正をしたのち、特定蛋白質バンドを測定することにより、特定蛋白質の含有量を測定する。
二次元電気泳動による測定は、二次元電気泳動とその泳動像の分析によって行う。この発明で使用する二次元電気泳動法は、等電点と分子量という蛋白質の有する2つの物性を利用して分離する方法であれば、特に制限することなく公知の方法を利用することができる。具体的には、キャピラリーゲルやストリップゲルなどを使用して一次元目の等電点電気泳動を行い、泳動後のゲルをSDS-ポリアクリルアミドゲル(SDS-PAGE)あるいはアガロースゲルに載せ、等電点電気泳動の展開方向に対して直角の方向に電気泳動することにより行う方法が挙げられる。
抗原抗体反応による測定は、特定蛋白質と特異的に結合する抗体とを使用する公知の免疫学的測定方法であればよい。具体的には、ELISA法、RIA法、蛍光抗体法、免疫組織化学法等が挙げられる。なお、これらに使用する抗体は前記一次元電気泳動で使用したものと同一である。
判別工程は、全蛋白中の特定蛋白質の含有量に基づいて牛の経済形質を判別する工程である。具体的には、特定蛋白質の含有量について予め閾値を計算しておき、この閾値に基づいて各個体を判別する。より具体的には、例えば、以下のようにして判別する。
抗原抗体反応による特定蛋白質の測定に必要な抗体、二次抗体、発色剤、緩衝液等は、市販のものを別々に購入して使用してもよい。しかし、これらを組み合わせて予めキットとしておけば、各構成要素を別々に購入する手間を省き、抗原抗体反応による測定を容易に行うことができる。また、蛋白質の抽出に必要な緩衝液なども併せてキット化しておけば、牛個体の経済形質の判別をより容易に行うことができる。
血統・肉質が既に分かっている牛白色脂肪組織サンプル(去勢)から、全蛋白質(プロテオーム)を抽出して、各個体の肉質などの形質とプロテオームとを相関分析することによって、バイオマーカーとして利用可能な蛋白質を探索した。以下にその詳細を示す。なお、特に記載しない限り、以下の%は体積%を意味する。
牛白色脂肪組織サンプルには、血統、枝肉重量、ロース芯面積、バラの厚さ等の経済形質が判明している飛騨牛個体から採取され、岐阜県畜産試験場から近畿大学生物理工学部に輸送され冷凍保存されている白色脂肪組織サンプル200検体を使用した。
1)一次元目(等電点電気泳動)
(1)で得たサンプルを膨潤液(420mg/ml尿素, 140.3mg/mlチオ尿素, 40mg/ml CHAPS,0.5% IPG緩衝液(IPG Buffer pH 3-11 NL(GEヘルスケア社製),0.05% TBP,0.1 mg/ml BPBを含む。)に蛋白質濃度が0.375mg/mlとなるように混和・希釈した。サンプルを含む膨潤液400μl(蛋白質150μg)を膨潤トレイ(GEヘルスケア社製)に注入し、その上側からドライストリップゲル(Immobiline DryStrip pH3-11 NL 18cm,GEヘルスケア社製)で覆った。
等電点電気泳動が完了したドライストリップをSDS平衡化緩衝液(a)(6.057mg/ml Tris-HCl(pH8.8), 360.4mg/ml 尿素, 30%グリセロール, 20mg/ml SDS, 10mg/ml DTTを含む。)に15分間浸透し、SDS平衡化緩衝液(a)を捨てSDS平衡化緩衝液(b)(6.057mg/ml Tris-HCl(pH8.8), 360.4 mg/ml尿素, 30% グリセロール, 20mg/ml SDS, 25mg/ml ヨードアセトアミドを含む。)に15分間浸透して平衡化した。平衡化したドライストリップをSDS-PAGEゲル(ゲル濃度10%)の上部に置いた。
電気泳動が完了したゲルをプラスチック容器に移し、ゲルが充分に浸る量の固定液(10%メタノール、7%酢酸水溶液)を加え、室温で約30分間静かに振盪した。固定液を新しいものに交換し、さらに、室温で約30分間静かに振盪した。
染色したゲルからゲル画像撮影装置(アルファイメージャー, アルファイノテック社製)を使用して泳動画像を取り込んだ。取込んだ画像は、画像処理ソフト(Progenesis TT900, Nonlinear Dynamics社製)を使用して画像のゆがみを補正した。その後、画像解析ソフト(Progenesis PG220, Nonlinear Dynamics社製)を使用して蛋白質スポットの測定、ゲル間(個体間)での蛋白質スポットのマッチング、各スポットの定量、ゲル間での定量値比較を行った。
画像解析により検出された879個の蛋白質スポットのうち、経済形質等に関係する蛋白質スポットを選抜し、選抜した蛋白質スポットを染色したゲルから抽出し、質量分析法を利用して同定した。具体的には、以下の手順で行った。
まず、経済形質ごとに、上位群と下位群とを選抜した。つぎに、蛋白質スポットごとに、上位群に属する個体の含有量の平均値と下位群に属する個体の含有量の平均値を計算した。そして、上位群に属する個体含有量の平均値と下位群に属する個体の含有量の平均値との間で、統計学的に有意な差(t検定, p<0.05)がある蛋白質スポットを選抜した。
ゲルから蛋白質スポットを含む部分をピンセットで切り出し、切り出したゲルを96穴MTP プレートのウェルに入れ、脱色液A(メタノールと100mM炭酸水素アンモニウム水溶液とを等量混合した液)0.1ml中に20分間3回浸した。脱色液Aを除去し、100%アセトニトリル0.1ml中に5分間浸した。アセトニトリルを蒸発させ、ゲルを完全に乾燥させた。乾燥させたゲルに、トリプシン溶液(0.83μg/mlトリプシン(Sequencing grade Trypsin,Promega社製),25mM炭酸水素アンモニウム)30μlを加え、30℃で一晩反応させ、抽出液を得た。
マイクロピペットの先端にZipTipμC18ピペットチップ(登録商標,日本ミリポア社製)を取り付け、90%アセトニトリル水溶液を数回ピペッティングしてピペットチップを洗浄したのち、0.1%トリフルオロ酢酸(以下、TFAと省略する。)水溶液を数回ピペッティングしてピペットチップを平衡化した。洗浄・平衡化したピペットチップで抽出液を数回ピペッティングして、抽出液に含まれる蛋白質分解物をピペットチップ中の樹脂に結合させた。このピペットチップで洗浄液(0.1%TFA水溶液)を数回ピペッティングして、ピペットチップに残っている塩分を洗い流した。最後に、このピペットチップからマトリックス溶液(2mg/ml CHCA,0.1%TFA,70%アセトニトリルを含む溶液)1μlで蛋白質を溶出した。
蛋白質を含む溶出液1μlをMALDI-TOF/TOF型質量分析計(Applied Biosystems 4700 Proteomics Analyzer,アプライドバイオシステムズ社製)のターゲットプレートに添加し、常温で静置して結晶化させ、MSスペクトルとMS/MSスペクトルを測定した。
質量分析によって得られたMSスペクトルとMS/MSスペクトルのデータをMASCOT(Matrix Science社)に入力して、Swiss Prot (http://au.expasy.org/sprot/)やNCBInr (http://au.expasy.org/sprot/)などの公共の蛋白質配列データベースに対して、ペプチドマスフィンガープリント(PMF)分析、MS/MSイオンサーチ分析し、蛋白質を同定した。
1)全般的なまとめ
「上位群」、「下位群」に属する個体を選抜する基準とした数値及び各群に属する個体数を下記の表1に示す。また、「上位群」と「下位群」の間で含有量に有意差のある蛋白質スポットの数を下記の表2に示す。さらに、有意差のある蛋白質スポットのうち、各経済形質間で共通する蛋白質スポットの数を表3に示す。
枝肉重量と関連する蛋白質スポットを明示した二次元電気泳動写真を図1に示す。また、図1中の蛋白質スポットの散布図を図7〜図10に示す。なお、図7は、上位群に含まれる牛のほうが、発現量が有意に減少する蛋白質スポットの散布図である。反対に、図8〜図10は、上位群に含まれる牛のほうが、発現量が有意に増加する蛋白質スポットの散布図である。
ロース芯面積と関連する蛋白質スポットを明示した二次元電気泳動写真を図2に示す。また、図2中の蛋白質スポットの散布図を図11〜図14に示す。なお、図11は、上位群に含まれる牛のほうが、発現量が有意に減少する蛋白質スポットの散布図である。反対に、図12〜図14は、上位群に含まれる牛のほうが、発現量が有意に増加する蛋白質スポットの散布図である。
バラの厚さと関連する蛋白質スポットを明示した二次元電気泳動写真を図3に示す。また、図3中の蛋白質スポットの散布図を図15〜図16に示す。なお、図15は、上位群に含まれる牛のほうが、発現量が有意に減少する蛋白質スポットの散布図である。反対に、図16は、上位群に含まれる牛のほうが、発現量が有意に増加する蛋白質スポットの散布図である。
皮下脂肪の厚さと関連する蛋白質スポットを明示した二次元電気泳動写真を図4に示す。また、図4中の蛋白質スポットの散布図を図17〜図23に示す。なお、図17〜図20は、上位群に含まれる牛のほうが、発現量が有意に減少する蛋白質スポットの散布図である。反対に、図21〜図23は、上位群に含まれる牛のほうが、発現量が有意に増加する蛋白質スポットの散布図である。
歩留基準値と関連する蛋白質スポットを明示した二次元電気泳動写真を図5に示す。また、図5中の蛋白質スポットの散布図を図24に示す。なお、図24は、上位群に含まれる牛のほうが、発現量が有意に減少する蛋白質スポットの散布図である。
BMSナンバーと関連する蛋白質スポットを明示した二次元電気泳動写真を図6に示す。また、図6中の蛋白質スポットの散布図を図25〜図31に示す。なお、図25〜図28は、上位群に含まれる牛のほうが、発現量が有意に減少する蛋白質スポットの散布図である。反対に、図29〜図31は、上位群に含まれる牛のほうが、発現量が有意に増加する蛋白質スポットの散布図である。
Claims (7)
- (1)牛から白色脂肪組織を採取する採取工程と、
(2)採取した白色脂肪組織から全蛋白質を抽出する抽出工程と、
(3)抽出した全蛋白質中に含有される下記(a)及び(b)に記載のBMSナンバーに係る特定蛋白質のうちの1つ以上の含有量を測定する測定工程と、
(a)配列番号57から70に記載のアミノ酸配列によって構成されている蛋白質、
(b)(a)の蛋白質と同じ機能を有し、(a)の蛋白質を構成するアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列によって構成されている蛋白質、
(4)測定工程で測定されたBMSナンバーに係る特定蛋白質の含有量に基づいて、BMSナンバーの高い牛個体を判別する判別工程と、
を含む、牛の判別方法。 - 前記測定工程において、前記抽出工程で抽出した全蛋白質中に含有される下記(a2)及び(b2)に記載のバラの厚さに係る特定蛋白質のうちの1つ以上の含有量をも測定し、
(a2)配列番号25から30に記載のアミノ酸配列によって構成されている蛋白質、
(b2)(a2)の蛋白質と同じ機能を有し、(a2)の蛋白質を構成するアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列によって構成されている蛋白質、
前記判別工程において、前記測定工程で測定されたバラの厚さに係る特定蛋白質の含有量に基づいて、バラの厚さが厚い牛個体をも判別する、
請求項1に記載の牛の判別方法。 - 前記測定工程において、前記抽出工程で抽出した全蛋白質中に含有される下記(a3)及び(b3)に記載の皮下脂肪の厚さに係る特定蛋白質のうちの1つ以上の含有量をも測定し、
(a3)配列番号31から53に記載のアミノ酸配列によって構成されている蛋白質、
(b3)(a3)の蛋白質と同じ機能を有し、(a3)の蛋白質を構成するアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列によって構成されている蛋白質、
前記判別工程において、前記測定工程で測定された皮下脂肪の厚さに係る特定蛋白質の含有量に基づいて、皮下脂肪の厚さが薄い牛個体をも判別する、
請求項1又は2に記載の牛の判別方法。 - 前記測定工程において、前記抽出工程で抽出した全蛋白質中に含有される下記(a4)及び(b4)に記載の歩留基準値に係る特定蛋白質のうちの1つ以上の含有量をも測定し、
(a4)配列番号54から56に記載のアミノ酸配列によって構成されている蛋白質、
(b4)(a4)の蛋白質と同じ機能を有し、(a4)の蛋白質を構成するアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列によって構成されている蛋白質、
前記判別工程において、前記測定工程で測定された歩留基準値に係る特定蛋白質の含有量に基づいて、歩留基準値の高い牛個体をも判別する、
請求項1から3までのいずれかに記載の牛の判別方法。 - 前記測定工程において、特定蛋白質を電気泳動により測定する、請求項1から4までのいずれかに記載の牛の判別方法。
- 前記測定工程において、特定蛋白質を抗原抗体反応により測定する、請求項1から4までのいずれかに記載の牛の判別方法。
- 少なくとも請求項1に記載のBMSナンバーに係る特定蛋白質に対して特異的に結合する抗体を含む、BMSナンバーの高い牛個体を判別する判別用キット。
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