MX2008007415A - Protocolo para detectar proteinas en un cultivo que contiene un embrion. - Google Patents
Protocolo para detectar proteinas en un cultivo que contiene un embrion.Info
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Abstract
Esta invención provee métodos para determinar el sexo de un embrión al detectar la presencia de una proteína asociada con el cromosoma Y en una muestra de medio de cultivo obtenido al tomar la muestra de un medio de cultivo que contiene el embrión; esta invención además provee métodos para identificar una proteína asociada con el cromosoma Y como una proteína presente en una muestra del medio del cultivo obtenido al tomar la muestra de un medio de cultivo que contiene un embrión masculino, pero ausente en una muestra de medio de cultivo obtenido al tomar la muestra de un medio de cultivo que contiene un embrión femenino.
Description
PROTOCOLO PARA DETECTAR PROTEINAS EN UN CULTIVO QUE CONTIENE UN EMBRION
Esta solicitud reclama el beneficio de la solicitud provisional de E.U.A. No. 60/748,263, presentada el 6 de diciembre de 2005, cuyos contenidos están incorporados aquí a manera de referencia en su totalidad.
CAMPO TECNICO
La presente invención provee métodos para determinar el sexo de un embrión al detectar la presencia de una proteína asociada con el cromosoma Y en una muestra del medio de cultivo obtenida al tomar la muestra de un medio de cultivo que contiene el embrión. La presente invención además provee métodos para identificar una proteína asociada con el cromosoma Y como una proteína presente en una muestra del medio de cultivo obtenido al tomar la muestra de un medio de cultivo que contiene un embrión macho, pero que está ausente en una muestra del medio de cultivo obtenida al tomar la muestra de un medio de cultivo que contiene un embrión hembra.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
En los mamíferos, el contenido genético de una célula normal está formado por pares de cromosomas autosomicos (designado por número) además de dos cromosomas sexuales (designados por las letras "X" y "Y"). El número total de cromosomas autosomicos varía ligeramente de especie a especie. Por ejemplo, una célula normal en el cuerpo humano contiene un total 44 cromosomas autosomicos en la forma de pares de cromosomas 1 a 22. En contraste, una célula normal en un ratón contiene un total de 38 cromosomas autosomicos (en la forma de pares de cromosomas 1 a 19) mientras que una célula normal en un caballo tiene un total de 62 cromosomas autosomicos (en la forma de pares de cromosomas 1 a 31 ). Para todos los mamíferos, el número total de cromosomas sexuales en una célula normal es 2. Los mamíferos hembra normales tienen dos cromosomas X en cada célula mientras que los mamíferos macho normales tienen un cromosoma X y un cromosoma Y en cada célula. Existe una variedad de técnicas bien conocidas en la técnica para la generación de embriones mamíferos in vitro, incluyendo fertilización in vitro (IVF, por sus siglas en inglés) y transferencia nuclear. Tales técnicas son utilizadas frecuentemente para generar embriones viables los cuales son transferidos al útero de una hembra portadora para la gestación y nacimiento. En particular, la fertilización in vitro (IVF) se aplica frecuentemente en
instalaciones clínicas para permitir de otra manera que la hembra no fértil se embarace y lleve a un bebé a término. Para la fertilización in vitro (IVF), los ovocitos extraídos de una hembra se fertilizan utilizando esperma extraído de un macho (por ejemplo, al mezclar simplemente el ovocito y el esperma o por medio de la inyección intracitoplásmica de esperma en el ovocito) y el desarrollo embrionario se inicia in vitro. Para la transferencia nuclear, el núcleo de una célula donadora (por ejemplo una célula somática) se transfiere en un ovocito enucleado, por ejemplo por medio de la fusión celular entre un ovocito enucleado y una célula donadora de núcleo. Después de la transferencia nuclear, el ovocito se activa para estimular el desarrollo embrionario. En otros métodos de transferencia nuclear, el núcleo de una célula donadora (por ejemplo una célula somática) se transfiere en un ovocito fertilizado enucleado sin la necesidad de la activación subsecuente del ovocito. En tal método siguiendo la generación in vitro del embrión, el embrión en desarrollo se mantiene en un cultivo in vitro, generalmente hasta la etapa celular 6 u 8 y después el embrión se transfiere al útero de una hembra portadora para la implantación y el desarrollo adicional. El diagnóstico genético de preimplantación (PGD, por sus siglas en inglés) es una técnica utilizada para proveer información genética acerca de los embriones generados in vitro antes de transferir el embrión a una hembra portadora para el embarazo. Por ejemplo, PGD se ha aplicado a
embriones in vitro para identificar aneuploidía de cromosomas autosómicos y cromosomas sexuales, para determinar el sexo de un embrión, y para el diagnóstico de una variedad de enfermedades genéticas (ver, por ejemplo, Ogilvie et al. J Histochem Cytochem 2005; 53:255-260 y Sermón. Human Reprod Update 2002; 8:1 1-20). Antes del desarrollo de la tecnología PGD, el sexo de un embrión en desarrollo podía sólo determinarse después del establecimiento de un embarazo in vitro. De manera similar, las enfermedades y condiciones genéticas sólo podían diagnosticarse después del establecimiento del embarazo. Por lo tanto, en las instalaciones clínicas humanas en donde un embarazo con un niño afectado con una enfermedad o condición genética, la pareja tenia que decidir entre el aborto o el nacimiento de un niño afectado cuya calidad de vida podría estar severamente dificultada por la condición genética. Para PGD, los embriones generados in vitro se cultivaban bajo condiciones cuidadosamente controladas hasta que se alcanza una etapa en la cual se forman seis a ocho células diferenciadas. En el caso del procedimiento IVF realizado en humanos, esta etapa generalmente se lograba tres días después de la fertilización del ovocito. En el día del diagnóstico, el embrión se coloca por medio de micromanipuladores delicados para que se pueda extraer una sola célula (biopsia) y separar de las células restantes las cuales permanecen intactas. El contenido genético de blastomero extraído por biopsia después se valora, por ejemplo, por la reacción en cadena de
polimerasa o por la hibridación in situ con fluorescencia (FISH, por sus siglas en inglés). Utilizando estas técnicas, puede determinarse el número y tipo de cromosomas presentes y deducirse la salud del embrión. Cuando se desea un embrión de un sexo en particular, tales embriones pueden identificarse por medio de un estudio para la transferencia a la hembra portadora. De manera similar, cuando se detecta una anormalidad genética, el embrión particular se remueve a partir del estudio para transferencia a la hembra portadora. Por ejemplo, para PGD basado en FISH de embriones humanos, las sondas están disponibles actualmente para analizar hasta 9 cromosomas diferentes incluyendo los cromosomas autosómicos 13, 15, 16, 17, 18, 21 y 22 y ambos cromosomas sexuales (X y Y). Por lo tanto, PGD basado en FISH puede utilizarse para determinar el sexo de un embrión antes de la transferencia. De manera similar, PGD basado en FISH puede utilizarse para diagnosticar el síndrome de Down, una condición en la cual están presentes tres copias del cromosoma 21. Sin embargo, quitar uno o más blastómeros del embrión en desarrollo para el propósito de realizar PGD puede disminuir la viabilidad del embrión, resultando en índices reducidos de supervivencia y desarrollo contino de embriones antes de la implantación y para índices reducidos de embarazo viable con la transferencia a la hembra portadora. Además, en ciertos casos, el contenido genético de un solo blastomero puede no ser representativo del embrión como un todo (por ejemplo, cuando el embrión en desarrollo es un mosaico, es decir, cuando el contenido genético de todas las
células no es idéntico). En tales casos, PGD puede proveer un diagnóstico no preciso. Por ejemplo, si el blastómero extraído por biopsia tiene un contenido cromosómico normal, mientras algunos o todos los blastómeros restantes tienen una anormalidad cromosómica, el embrión podría identificarse sin precisión como cromosómicamente normal. Por lo tanto, existe la necesidad en la técnica de métodos para valorar el contenido genético de un embrión in vitro, que no sea invasivo (es decir que no dañe al embrión) y el cual pueda reflejar de manera precisa el contenido genético del embrión como un todo. En particular, existe la necesidad en la técnica de métodos no invasivos y precisos para determinar el sexo de un embrión in vitro antes de la transferencia a una hembra portadora. La presente invención cumple esta necesidad en la técnica al proveer un método simple y no invasivo para determinar el genotipo de un embrión in vitro, en particular para identificar el sexo del embrión, por la detección de una proteína asociada con genotipo en una muestra del medio de cultivo obtenida de un medio de cultivo que contiene un embrión. Este método también se puede aplicar ampliamente para el diagnóstico de condiciones y enfermedades genéticas, por medio de la detección de proteínas asociadas con una enfermedad o condición genética en el medio de cultivo que contiene el embrión. Este método puede utilizarse para determinar el genotipo del embrión antes de la implantación sin afectar la viabilidad del embrión.
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION
La invención está dirigida a un método para determinar un genotipo de un embrión el cual comprende: a) tomar muestra de un medio de cultivo que contiene un embrión; y b) detectar la presencia de una proteína asociada con el genotipo en la muestra del medio de cultivo, en donde la presencia o ausencia de la proteína asociada con el genotipo determina el genotipo del embrión. En ciertas modalidades, el embrión es un embrión humano. En ciertas otras modalidades, el embrión tiene un número celular total de 6 a 8 células. La invención también está dirigida a un método para identificar el sexo de un embrión el cual comprende: (a) tomar muestra de un medio de cultivo que contiene un embrión; (b) detectar la presencia de una proteína asociada con el cromosoma Y en la muestra del medio de cultivo; y (c) identificar el sexo del embrión como macho si una proteína asociada con la cromosoma Y está presente o como hembra si una proteína asociada con el cromosoma Y no está presente. En ciertas modalidades, la proteína asociada con el cromosoma Y está seleccionada del grupo que consiste en: proteína tipo factor 2 de
trascripción inducida por TGFp, Protocadherin 1 1 Y, proteína Y de región determinante de sexo, isoforma 1 de proteína S4 Y de proteína ribosomal, proteína cromosomal Zinc finger Y, Amelogenina Y, proteína Y tipo 1 transducina (beta), proteína cinasa Y, proteasa 9Y específica de ubiquitina, proteína Dead Box Y, motivo Y TPR ubicuo, Thymosin (beta) 4 Y, isoforma Y neuroligina 4, marco 15 A de lectura abierta de cromosoma Y, marco 15B de lectura abierta de cromosoma Y, SMC (ratón) homologo, factor 1 AY de iniciación de traducción, isoforma 2 de proteína S4 Y ribosomal, proteína Y específica testicular, carga Y variable, proteína Y relacionada con XK, Proteína Y cromodominio, proteína Y de factor de trascripción de choque térmico, proteína motivo Y de unión a ARN, proteína Y relacionada con PTP-BL, deleción en azoospermia (DAZ), proteína novedosa similar a lisozima C y mezclas de las mismas. En otras modalidades, la proteína asociada con el cromosoma Y es un Homosapiens similar a la proteína motivo de unión a ARN, cromosoma Y, proteína de elemento B familia 2 (LOC347598). En ciertas modalidades, el embrión es un embrión humano. En ciertas modalidades, el embrión tiene un número celular total de 6 a 8 células. La invención también está dirigida a un método para identificar una proteína asociada con el cromosoma Y, la cual comprende: (a) detectar la presencia de al menos una proteína en una muestra del medio de cultivo obtenida por medio de muestra de un medio de cultivo que contiene un embrión macho;
(b) detectar la presencia de al menos de una proteína en una muestra del medio de cultivo obtenido al tomar muestra de un medio de cultivo que tiene un embrión hembra; y (c) identificar una proteína asociada con el cromosoma Y como una proteína presente en la muestra del medio del cultivo del paso (a) pero ausente en la muestra del medio de cultivo del paso (b). En ciertas modalidades, el embrión macho y el embrión hembra son embriones humanos. En algunas modalidades el embrión macho tiene un número celular total de 6 a 8 células y el embrión hembra tiene un número celular total de 6 a 8 células. El método también está dirigido a un método para identificar el sexo de un embrión el cual comprende: (a) tomar muestra de un medio de cultivo que contiene un embrión; (b) detectar la presencia de una proteína asociada con el cromosoma Y en la muestra del medio de cultivo; y (c) identificar el sexo del embrión como macho si está presente una proteína asociada con el cromosoma Y o como hembra si una proteína asociada con el cromosoma Y no está presente, en donde la proteína asociada con el cromosoma Y se identifica de acuerdo con los métodos de esta invención. En ciertas modalidades, el embrión es un embrión humano. En ciertas modalidades, el embrión tiene un número celular total de 6 a 8 células.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
La presente invención provee métodos para determinar un genotipo de un embrión al tomar muestra de un medio de cultivo que contiene el embrión y detectar la presencia de una proteína asociada con el genotipo en la muestra del medio de cultivo en donde la presencia o ausencia de la proteína asociada con el genotipo determina el genotipo del embrión. En particular, la presente invención provee métodos para determinar el sexo de un embrión, el cual comprende los pasos de: (a) tomar muestra un medio de cultivo que contiene un embrión, (b) detectar la presencia de una proteína asociada con el cromosoma Y en la muestra del medio de cultivo; y (c) identificar el sexo del embrión como macho si está presente la proteína asociada con el cromosoma Y o como hembra si no está presente una proteína asociada con el cromosoma Y. Los embriones que van a utilizarse en el contexto de esta invención son embriones mamíferos contenidos en un medio de cultivo in vitro. Tales embriones incluyen embriones generados in vitro y embriones generados in vivo.
Embriones Los embriones pueden ser generados in vitro por cualquiera de las técnicas conocidas en la técnica, tales como fertilizaciones in vitro (IVF), que
incluye IVF realizada por la simple mezcla del ovocito y el esperma o por la inyección intracitoplásmica del esperma en un ovocito y transferencia nuclear. Para fertilización in vitro (IVF), los ovocitos extraídos de una hembra son fertilizados utilizado esperma extraído de un macho (por ejemplo, al mezclar simplemente el ovocito con el esperma o por la inyección intracitoplásmica del esperma en el ovocito), y el desarrollo embrionario se inicia in vitro. Los protocolos y métodos para la IVF están bien establecidos en la técnica para una variedad de mamíferos incluyendo humanos (ver, por ejemplo, Boiso et al. Retrod Biomed Online. 2002;5:328-350; Frydman et al. Hum Reprod. 1988;3:559-561 ; Tarín y Pellicer. Ann Acad Med Singapor 1992; 21 :492-497; Kenny. Br J Obstet Gynaecol. 1995;102:317-325; Mansour. Hum Reprod. Update. 1998:4:43-56; y Evans et al Obstet Gynecol Surv. 1980;35:71 -81 ), ratones (ver, por ejemplo, Yanagimachi. Hum ReprodA 998; 13:87-98 y Sato et al Hum fíes.1995;44 Suppl 2:4-8), ovejas (ver, por ejemplo, Armstrong et al. Reprod.. Fértil Dev. 1997;9:333-339), vacas (ver por ejemplo, Hoshi. Theriogenology. 2003;59:675-685 y Marquant-Leguienne y Humblot. Theriogenoloy. 1998;49:3-1 1 ), hámsters (ver, por ejemplo, Bavister. Gamete Res. 1989;23:139-158); caballos (ver, por ejemplo, Squires. Vet Clin North Am Equine Pract. 1996; 12:31 -45 y Hinrichs. Theriogenology. 1998;49:13-21 ) y cerdos (ver, por ejemplo, Niemann y Rath. Theriogenology. 2001 ;56:1291 -1304 y Robl y First. J Reprod Fértil Suppl. 1985;33:101 -1 14).
Los protocolos de la IVF pueden resumirse generalmente con cuatro etapas de la siguiente manera: Etapa 1 : Estimulación y monitoreo ovárico Para mejorar las oportunidades del paciente de una fertilización exitosa, un paciente bajo IVF toma hormonas en la forma de inyecciones para aumentar el número de huevos producidos en un mes dado. El monitoreo se realiza para seguir continuamente la respuesta ovárica de una hembra permitiendo que el médico ajuste y dosifique adecuadamente el medicamento.
Etapa 2: Extracción del óvulo Con el paciente sedado y cómodo, el óvulo o huevos se retiran a través de la vagina bajo una guía de ultrasonido.
Etapa 3: Cultivo y fertilización Los ovocitos se fertilizan con esperma de la pareja masculina. A veces, el esperma se deposita en la parte superior del ovocito. En otros casos, especialmente cuando existe menos de un millón de espermas vivos, ICSI o la inyección intracitoplásmica de esperma se utiliza para obtener un solo esperma e inyectarlo directamente en el ovocito.
Etapa 4: Transferencia embrionaria Ya sean tres o cuatro de los mejores embriones se transfieren directamente en el útero y permite su implante. El resto de los embriones
saludables puede cric-conservarse (congelados). La prueba de embarazo se realiza a los 11 días después de la transferencia embrionaria. En un buen programa, con un laboratorio de alta calidad, una mujer de menos de 40 años puede embarazarse aproximadamente 50% de las veces. Para la transferencia nuclear, el núcleo de una célula donadora
(por ejemplo, una célula somática) se transfiere aun ovocito enucleado, por ejemplo, por medio de la fusión celular entre un ovocito enucleado y una célula donadora de núcleo. Después de la transferencia nuclear, el ovocito se activa para estimular el desarrollo embrionario. En otros métodos de transferencia nuclear, el núcleo de una célula donadora (por ejemplo, una célula somática) se transfiere a un ovocito fertilizado enucleado sin la necesidad de activación subsecuente del ovocito. Pueden emplearse varios tipos de células como donadoras para los núcleos que se van a transferir a los ovocitos, incluyendo células adultas, fetales o embrionarias en varias etapas de diferenciación que varían de no diferenciadas a completamente diferenciadas en varias etapas del ciclo celular, por ejemplo tanto células inactivas como proliferantes y obtenidas de tejidos somático y de línea germinal. Los núcleos donadores pueden introducirse en ovocitos por medio de la fusión, inducida eléctricamente o químicamente o por microinyección. Los protocolos y métodos para transferencia nuclear están bien establecidos en la técnica (ver, por ejemplo Wilmunt et al. Nature 1997;385:810-813; Prather y First. J. Reprod. Fert. 1990; Suppl 41 :125-134; Cibelli et al Science 1998;280:1256-8; patente de E.U.A. No. 6,600,087:
Dominko et al Biol. Reprod 1999;6:1496-1502; Solicitud de PCT publicada WO 99/37143; Solicitud de PCT publicada WO 98/07841 ; Solicitud de PCT publicada WO 97/07669; Solicitud de PCT publicada WO 98/30683; Solicitud de PCT publicada WO 98/39416; patente de E.U.A. No. 6,147,276; patente de E.U.A. No. 6,781 ,030; patente de E.U.A. No. 6,635,802; y patente de E.U.A. No. 5,945,577). Por ejemplo, los protocolos de transferencia nuclear están establecidos en la técnica para ovejas (ver, por ejemplo, Campbell et al Nature 996;380:64-66 y Liu et al. Mol Reprod Dev. 1997;47:255-264) vacas (ver, por ejemplo, Cibelli et al. Science 1998;280:1256-8; Bordignon et al. Mol Reprod Dev 998;49:29-36; Tanaka et al. Jpn. J. Vet. Res. 1995;43, 35-143; Kato et al Science 1998;282:2095-2098; Wells et al Biol Repord. 1999;60:996-1005; Kubota et al. Proc. Nati. Acad. Sci. £. L/.A2000;97:990-995; y Vignon et al. Life Sciences 1998;321 :735-745), conejos (ver, por ejemplo, Collas et al Biol Reprod 992;46:492-500) cabras (ver, por ejemplo, Baguisi ef al. Nature Biotech 1999; 17:456-461 y Keefer et al Biology of Reproduction 2001 ;64:849-856), cerdos (ver, por ejemplo, patente de E.U.A. No. 6,700,037 y Lui ef al. Int J. Dev. Biol. 1995;39:639-644), y ratones (ver, por ejemplo, Wakayama ef al. Nature 1998;394:369-374 y Wakayama y Yanagimachi. Nature Genetics 1999;22:127-128). Alternativamente, los embriones generados in vivo pueden extraerse de un mamífero embarazado (por ejemplo, un ratón hembra de laboratorio sacrificado 1.5 días después del coito) y mantenido en un cultivo in vitro. Las técnicas para el apareamiento de mamíferos (incluyendo ratones,
vacas, cerdos y cabras) y recolección de embriones se establecen en la técnica (ver, por ejemplo, . Murray et al., eds. Transqenic Animáis in Agricultura Oxford University Press, Hogan et al. Manipulatinq the Mouse Embryo 2nd Edition. Cold Spring Harbor Press, 1994; Jackson and Abbott, eds. Mouse Genetics and Transgenics: A Practical Approach. Oxford University Press, 2000; patente de E.U.A. No. 5,633,076; patente de E.U.A. No. 6,271 ,436; patente de E.U.A. No. 5,907,080). Por lo tanto, los embriones generados in vitro o in vivo son subsecuentemente cultivados in vitro para desarrollarse en embriones, los cuales pueden implantarse en el ovioducto del animal hembra seudo embarazado. Los métodos para el cultivo in vitro de gametos mamíferos y de otras células mamíferas, y para el cultivo de embriones mamíferos está bien establecidos en la técnica (ver, por ejemplo, Cohén et al.Br Meó Bull 1990;46;643-653). Por ejemplo, tales métodos de protocolos están bien establecidos para ratones (ver, por ejemplo, Hogan et al. Manipulatinq the Mouse Embryo 2nd Edition. Cold Spring Press, 1994), conejos (ver, por ejemplo, Hammer et al. Nature 1985;315:680) ovejas (ver, por ejemplo, Hammer et al. Nature 1985, 315:680; Gandolfi et al. J. Reprod. Fert. 1987; 81 :23-28; y Rexroad et al. J. Anim. Sci. 1998;66:947-953), cerdos (ver, por ejemplo, Hammer et al. Nature 1985,315:680; vacas (ver, por ejemplo, Eyestone et al. J Reprod. Fert 1989;85:715-720 y Goto. Mol Reprod Devel. 1993;36:288-290),y humanos (ver, por ejemplo, Bioso et al. Reprod Biomed
Online. 2002;5:328-350; Devreker and Englert. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 2000;92:51 -56; y Garder and Lañe. Hum Reprod. 1998:13:148-159). En modalidades preferidas, el embrión es un embrión humano generado in vitro. En modalidades preferidas, el embrión es un embrión de preimplantación. En modalidades particularmente preferidas, el embrión tiene de 6 a 8 células.
Genotipos Los genotipos que se van a determinar de acuerdo con el método de la invención incluyen pero no están limitados al número cromosómico total (es decir, ploidía), sexo (es decir, como se define por la presencia de los cromosomas sexuales), estructura cromosómica (por ejemplo, la presencia o ausencia de translocaciones, inversiones, duplicaciones y/o deleciones) secuencia y/o estructura genética endógena (por ejemplo, identificación de alelos genéticos y/o de la presencia o ausencia de mutaciones) y presencia de secuencias de ácido nucleico exógeno (por ejemplo, presencia de un transgen o retrovirus). En modalidades particulares, el genotipo que se va a determinar es la presencia o ausencia del cromosoma Y.
Proteína asociada con un genotipo Por el término "proteína asociada con un genotipo" se quiere decir cualquier proteína cuya presencia o ausencia está correlacionada con un
genotipo específico. Tales proteínas incluyen proteínas endógenas tipo silvestre (por ejemplo, una proteína codificada en un cromosomas 1 el cual sólo está expresado cuando el cromosoma 1 está presente u Ornitina Transcarbamilasa (OTC) la cual no está presente en la deficiencia de Ornitina Transcarbamilasa enlazada por X debido a la mutación del gen OTC), las proteínas endógenas mutantes (por ejemplo, proteína de fusión BCR-ABL de leucemia mieloide crónica formada por una translocación recíproca entre los brazos largos de cromosomas 9 y 22), y proteínas exógenas (por ejemplo, proteína fluorescente verde codificada por un transgen cromosómicamente integrado). En el contexto de esta invención, es preferible que la proteína asociada con un genotipo sea una proteína secretada. Está dentro de la habilidad de cualquier experto en la técnica determinar si una proteína es una proteína secretada. Por ejemplo, el análisis de la secuencia de aminoácido de una proteína puede utilizarse para determinar si la proteína contiene una secuencia de señal para dirigir la secreción (ver por ejemplo, von Heijne Nucí. Acid. Res. 1986; 14:4683-4690; Harcus et al. Genome Biol 2004;5:R39; and Klee and Ellis. BMC Bioinformatics 2005;6:256). En otro ejemplo, una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína puede ser clonada, la proteína codificada expresada recombinantemente en una célula huésped mamífera y la distribución extracelular e intracelular de la proteína expresada determinada. Las técnicas para la clonación de secuencias nucleótidos, la expresión recombinante de
proteínas y la determinación de distribución celular de una proteína expresada están establecidas en la técnica (ver, por ejemplo Glover, ed DNA Cloninq: A Practical Approach. 2nd Edition Volumes l-IV. Oxford University Press, 1999; Ausubel et al., eds. Current Protocols in Molecular Bioloqy. John Wiley & Sons, Inc., 1994; Dieffenbach and Dveksler, eds. PCR Primer: A Laboratorv Manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2003; Sambrook et al. Molecular Cloninq: A Laboratorv Manual. Third Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001 ; McPherson et al., eds. PCR: A Practical Approach. Oxford University Press, 1991 ; McPherson et al., eds. PCR 2: A Practical Approach. Oxford University Press, 1995; Higgins and Hames, eds. Protein Expression: A Practical Approach. Oxford University Press, 1999); Freshney, ed Animal Cell Culture. 1986; Masters, ed. Animal Cell Culture: A Practical Approach. Oxford University Press, 2000; Davis, ed Basic Cell Culture 2nd Edition. Oxford University Press, 2002; Hiqh Resolution Chromatoqraphy: A Practical Approach. Oxford University Press, 1999; Oliver, ed. HPLC of Macromolecules: A Practical Approach. Oxford University Press, 1998; Matejtschuk, ed, Immunoassavs: A Practical Approach. Oxford University Press, 2000; Hames, ed Gel Electrophoresis of proteins: A Practical Approach. Oxford University Press, 1998; Harlow and Lañe. Usinq Antibodies: A Laboratorv Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999; Coligan et al., eds Current Protocols in Immunoloqy, Vol.1. Wiley & Sons, 2000; Hockfield et al. Selected Methods for Antibody and Nucleic Acid Probes. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993; and Higgins and Hames, eds. Post-
Translational Processing: A Practica! Approach. Oxford University Press, 1999). Por ejemplo, la proteína puede estar expresada en una célula mamífera, tal como una línea celular ovárica humana, fluido extracelular recolectado y la presencia por ausencia de la proteína en el fluido extracelular valorado por un inmunoensayo utilizando un anticuerpo etiquetado el cual se enlaza específicamente con la proteína. En el contexto de esta invención, es además preferible que la proteína asociada con un genotipo esté expresada en el embrión. Por ejemplo, la proteína puede ser una proteína que esté expresada ubicuamente (es decir, expresada en todos los tipos celulares en todo momento). En otro ejemplo, la proteína puede ser una proteína que esté expresada en una manera de tejido específico y/o etapa específica en donde la proteína está expresada en al menos un tipo celular del embrión en la etapa examinada. Por ejemplo, en las modalidades en donde el embrión es un embrión de implantación que tiene de 6 a 8 células, es preferible que la proteína esté expresada en al menos un blastómero de 6 a 8 células embrionarias. Se encuentra dentro de la técnica de cualquier experto determinar el patrón de expresión de una proteína en un embrión de una etapa de desarrollo dada. Por ejemplo, la expresión de un ARNm que codifica la proteína puede valorarse, por ejemplo por Northern blotting, RT-PCR o hibridación in situ. Por ejemplo, la expresión de la proteína puede valorarse, por ejemplo por inmunohistoquímica. Tales técnicas también están
establecidas en la técnica (ver, por ejemplo Glover, ed. DNA Cloning: A Practical Approach. 2nd Edition. Volumes l-IV. Oxford University Press, 1999; Ausubel et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc., 1994; Dieffenbach and Dveksler, eds. PCR Primer: A Laboratory Manual. 2nd Edition. Coid Spring Harbor Laboratory Press, 2003; Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition. Coid Spring Harbor Laboratory Press, 2001 ; McPherson et al., eds. PCR: A Practical Approach. Oxford University Press, 1991 ; McPherson et al., eds. PCR 2: A Practical Approach. Oxford University Press, 1995; Herrington and O' Leary, eds. PCR 3: PCR In Situ Hvbridization. Oxford University Press, 1998; Higgins and Hames eds. Protein Expression: A Practical Approach. Oxford University Press, 1999); Freshney, ed. Animal Cell Culture. 1986; Masters, ed. Animal Cell Culture: A Practical Approach. Oxford University Press, 2000; Davis, ed Basic Cell Culture 2nd Edition. Oxford University Press, 2002; Hiqh Resolution Chromatography: A Practical Approach. Oxford University Press, 1999; Oliver, ed. HPLC of Macromolecules: A Practical Appoach. Oxford University Press, 1998; Matejtschuk, ed, Immunoassays: A Practical Approach. Oxford University Press, 2000; Hames, ed Gel Electrophoresis of Proteins: A Practical Approach. Oxford University Press, 1998; Harlow and Lañe. Usinq Antibodies: A Laboratory Manual. Coid Spring Harbor Laboratory Press, 1999; Coligan et al., eds. Current Protocols in Immunoloqy, Vol. 1. Wiley & Sons, 2000; and Hockfield et el. Selected Methods for Antibody and Nucleic Acid Probes. Coid Spring Harbor Laboratory Press, 993).
En modalidades particulares, el genotipo es la presencia o ausencia del cromosoma Y y la proteína asociada con el genotipo es una proteina asociada con el cromosoma Y.
Proteína asociada con el cromosoma Y Por el termino "proteína asociada con el cromosoma Y" se quiere decir cualquier proteína cuya presencia está específicamente correlacionada con la presencia del cromosoma Y. Las proteínas asociadas con el cromosoma Y incluyen proteínas cuyas secuencias codificadoras están contenidas en el cromosoma Y, tal como en la ausencia de cromosoma Y, las proteínas no están expresadas. Las proteínas asociadas con el cromosoma Y también incluyen proteínas cuyas secuencias codificadoras están contenidas en un cromosoma diferente al cromosoma Y, pero el cual no está expresado en la ausencia del cromosoma Y. Las proteínas cuyas secuencias codificadoras están contenidas en el cromosoma Y incluyen aquellas establecidas en el cuadro 1.
CUADRO 1
Proteínas únicas para cromosoma Y
Por lo tanto, en modalidades particulares, proteína tipo factor 2 de trascripción inducida por TGFp, Protocadherin 1 1 Y, proteína Y de región determinante de sexo, isoforma 1 de proteína S4 Y de proteína ribosomal, proteína cromosomal Zinc finger Y, Amelogenina Y, proteína Y tipo 1 transducina (beta), proteína cinasa Y, proteasa 9Y específica de ubiquitina, proteína Dead Box Y, motivo Y TPR ubicuo, Thymosin (beta) 4 Y, isoforma Y neuroligina 4, marco 15 A de lectura abierta de cromosoma Y, marco 15B de lectura abierta de cromosoma Y, SMC (ratón) homologo, factor 1AY de iniciación de traducción, isoforma 2 de proteína S4 Y ribosomal, proteína Y específica testicular, carga Y variable, proteína Y relacionada con XK, Proteína Y cromodominio, proteína Y de factor de trascripción de choque térmico, proteína motivo Y de unión a ARN, proteína Y relacionada con PTP-BL, deleción en azoospermia (DAZ), proteína novedosa similar a lisozima C y mezclas de las mismas. En otras modalidades, la proteína asociada con el cromosoma Y es un Homosapiens similar a la proteína motivo de unión a ARN, cromosoma Y, proteína de elemento B familia 2 (LOC347598). Las secuencias ejemplares de nucleótidos y aminoácidos para esta proteína están establecidas en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, respectivamente.
SEQ ID NO: 1 >gi ) 3CU 4 £895 | ref | ??_293472. 2 |÷«?-*.f?? veihr ; lip-steia pefe ii OTÓÍ J A¾. «.-ce»*»» Y.ptfafa &
«farsista 8, ¾wfri Í a05$i?i¾ ¿j$fc¡ ATGCCTGGAS'CTCaGTCTGGACCCAAGCCr ^L^i^iw^^ J< AAAGTCCTGGAA?TGTGCAAW.CGGCACCTG7ICCAT GCTCAAGCTGAATGAACTCACTTTCTGGGTGGAG-GC ^ GTGFICACAGTCTAGCTATGCTCCC7GGTAJ AGCAAGGG^ CAGTCTCTACCTCTACAAATGCTTCAGCTTTTACCTCCACCI TGCTTC CTTTGGCCACACTTCTCTCT GCK¾CAGCCTC¾GAGTAAGG TCAAAAACTTGGTAGAGATCAGATTÍATCTG CGAT ATGCCATGCOTTGG AA-^TGTA¾TCATCATCRG?GGGAG7C^GA?CTGCAGTGGTTCC^^ CAGCTGCCC-^TGTE CAGGAACAFGGATCC GAAGACACTGCTGTGATACTGGGCCTGAGGCACCCTGA GGCNCCACTGAG?«L GTGJYIGGTGTCTACCATTC ACTGCATGACAGATTCTGGRRGG GACTGAGGCA GCAAGAAATA!TCTGGAATTGCTACTCCRCCACGATGTCCAGACTCCCNTTTGGCRCTTATCACTCTTGG G TATCTGAGW-CCTGA^^TTCAGAATGCTGGCTCTCTAGGCC^XATARTGTRACACCAGCIGTCCR GCTTAGACACCCCTGGGCCCCAGGGGGACCGCA^CCTCACCCAGIJCLCTGGFTCCACTCCCACAGATT AG GCTC¾GO\GCC^AACCTGCAMRCCARCATG?AGCTCAGCAGG ¡CTTCATCAA'T7GTGACCL-TGGRCCAT
ATCTGGGCCCAAGTCT GAGCACCATGTGTTTCTGG GCCGCCCTCTCCCGCAGAGCCTCCAGACTTAAC
ACGG GCCCTCCTAG<^CRCCCACAGACCAAGGGCICACAGTCTGCGTGTGCCTGAACCCACCACCACCT TGCHC¾AGCATCTTCTCAGAGGAGGACTACCGCGGGRGGATC^AGCTG ½GCC^CCCAGGGGAGGGGCT CCTCAGSAGACGCCTACCGCTCTTOCAATAATRGGCAGATGCCCACTGCCRRCCCAATGATTGGCTGGAG CACAATGGTAGAAGCAGATTGT CATGGCAAGCTTTTCATTGGTGGCC CAATAGAGAAGCCAATGAAAAG GTGCTTA GAAG?ATR"GC¾AMCATGG CCCC TTTGCAAG?^ AG†CCAGAGATCTTG:'GGTCATTAN TRGA¾?ATGCTGCAG.FI.TGCTA GAATGCTGCCAGAGATATGAA
TGGA\¾GTCnrGGA-'GGAAn, -AAATAJU^-GTAG AGGCGGAGACCACCACCa CCTCR GAAACAGAAGC Cl CfcG^^ GTGGAGGAACMGftCCGTGGC GCCC-'CACAJGAAGGA fiCTT^GGATGATGGTGGATACGC'rcrTGATCT CT^CACG GTTCTtCll-AGGGGAGCCATTCC Tro^ CCF AAAACAT CTGCTCCT TCTG CTATC GCAAGAAGCAATAGTTGGATGGGAGGC C AAGGTCCCATATCAC
GTGGFTAGAGAGAATTATGGAGGTCCT CCATGCAGAGAGCCAATCTCTTCCTGGAGAAATGACCGTATGTC
AC AAGAGATGATGG?RATGCAATT?-FTGGAAAGAAATCATCCACTTTCCCGAGAATCTAGC CCACTGTCTAGAGAC7A GCATAC TGA?TATGGRCA' CTAGTTGG ^¾TGAACRTTTCTCTAGAGGAX
ATAGGRATTACAACATTTCCTGGACTTGTCAAATAGAATT 'TAAA GCT C TCCCTTCCCATTATCCT
GCTGCTGGGAAAGA^GGCAGGACCCTGGAATGGAGAAGGGCCCTGGGTTGTTGACAGTGCCTGTGGGTGG
TCATGTAC AGGAGGAGAGTOCTCACTGAGCCTGCTGTGÍIGC?TG<ÍAGGCTGGGAÑ-^AACACTTARGGG
GCACTGGCTGTTCCAC¾GTCCAGG3GC TGTCCCGGAGAAGCCTG GC^G?^TCGRTAAGCCTGTGGTT
CTECAATCTAGGTGGAAGAGCTGTATCTGCCATGECTGACATCARCÍIGGGCAAGACACCCACTGGGRGFJA
GAGCTGGACTTATGCATTTTTATCCC GTCCTGAAC^GACCCTGCMGCCRGCCTCTCCGGGGACCKGTC
ATCC7GGGCACCCCCRCTCTGGGACCACT ¾TGACCATAAGCRTÑGGCTCT 3TGTGCCTTGCT?CCRGT
CVGCCCAGTGGTCN£GSTCAGCCAACCAGCGG<\¾GAAGCT^^^ GTCTTILTCCTGCATGACTCTAGAAACACTGGACTAC-AGTAGAGACAGA^ AGATTTGGGACTTCGTCATGGTRTCTGAA CCTGCCGACA^CTGGGTGTGCGGCACAATCTGCCXCTGGT
CAAGGAGCCTCCAC-ATGACTGGGTCACCCICAAGCAAGCIGCCCTACTATCTGCAGTATCCTTGCCTCAG
CTCCCCTCGCTGTCTCCCATCCCCTGCCTCC GGCTGACCCTGTGTGCCCCTGGCCTGGCTCCGTTGCTC
CCCGCCCCCGGAAGCCCGACTGCCFICCTCCTGCTGCCAGTCATCCCGAATGGGCAGTTACAAAGATA?GG
CTCRGGCCTAC-AAGC SGAGATGCCCRGGATGATGGCCCCTGTGCCCTCCAGCCCAGGCAGAGACTTCTG
ACAAAGCTTCTGCCTCAGCCATGGGCAGGGCATGTGGCCTGGGG ATTCPICGGAGCCCAG I-CCCTGTGA
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PKTSAPSAMARSNSWMGGQGPIS GRENYGGPPCREPISSWRNDRMSP DDGYAIKERNHPLSRESRDYA PLSRDYAYHDYGHSSWDEHFSRGYRYyNIS TCQIEFLNALSLPIILLLG MAGP NGEGP WDSACG SCTRRRVLTEPPVSLEAG EHLWGTGCSRVQGPVPEKPGGKSLSLWFCNLGGRAVSAMADIIRARHPLGG ELDLCIFIPVLKGPCMPASPGTSHPGDPLSGTTHDH LRLLCALLPVCPWTVSQPAEEAQLGCVLPEAG VFCCMTLETLDYSRDRCHVSWS KIWDFLMVSETCRHLGVRHNLPLV EPPDDWVTLKQAALLSAVSLPQ LPSLSPIPCLIADPVCPWPGSVAPRPRKPDSHLLLPVIPNGQLQRYGSGLEAGDALDDGPCALQARQTLL TKLLPQPWAGHVAWGIHGAQLPV DLQRLCGRLGHAGARAGCVHWSSTCRSMSAFSSTTT
La invención también provee un método para identificar una proteína asociada con el cromosoma Y, la cual comprende: (a) detectar la presencia de al menos una proteína en una muestra del medio de cultivo obtenida al tomar la muestra de un medio de cultivo que contiene un embrión macho; (b) detectar la presencia de al menos una proteína en una muestra del medio de cultivo obtenida al tomar la muestra de un medio de cultivo que contiene un embrión hembra; y (c) identificar una proteína asociada con el cromosoma Y como una proteína presente en la muestra del medio de cultivo del paso (a) pero ausente en la muestra del medio de cultivo del paso (b). Se encuentra dentro de la técnica del experto proveer (por ejemplo, por PGD de un embrión generado por IVF o la selección sexual del esperma ante de la IVF) un embrión macho que se va a utilizar en el contexto de este método de la invención. Por lo tanto, en el método para identificar un sexo de un embrión, la proteína asociada con el cromosoma Y puede ser una proteína asociada con el cromosoma Y como se identifica de acuerdo con el método para identificar una proteína asociada con el cromosoma Y.
Toma de muestra de un medio de cultivo que contiene un embrión Las técnicas para el cultivo in vitro de células mamíferas están establecidas en la técnica (ver por ejemplo Freshney, ed. Animal Cell Culture. 1986; Masters, ed. Animal Cell Culture: A Practical Approach. Oxford University Press, 2000; Davis, ed Basic Cell -Culture 2nd Edition. Oxford University Press, 2002), incluyendo técnicas para el cultivo in vitro de embriones mamíferos que incluyen embriones de preimplantación (ver, por ejemplo Cohén et al. Br Med Bull 1990;46:643-653; Wilmut et al. A/a/ure;385:810-813; Cibelli et al. Science 1998;280:280:1256-8; Keefer et al. Biology of Reproduction 2001 ;64:849-856; Hogan et al. Manipulatin the Mouse Embrvo 2nd Edition. Col Spring Harbor Press, 1994; Jackson and Abbott, eds. Mouse Genetics and Transqenícs: A Practical Approach. Oxford University Press, 2000; patente de E.U.A. No. 5,633,076; patente de E.U.A. No. 6,271 ,436; patente de E.U.A. No. 5,907,080 y patente de E.U.A. No. 6,147,276;). Por ejemplo, las técnicas para el cultivo in vitro de embriones están establecidas para ratones (ver por ejemplo, Hogan et al. Manipulatinq the Mouse Embrvo 2nd Edition. Cold Srping Harbor Press, 1994), conejos (ver, por ejemplo, Hammer et al. Nature 1985;315:680) ovejas (ver, por ejemplo, Hammer et al. Nature 1985;315:680; Gandolfi et al. J. Reprod. Fert. 1987;81 :23-28; y Rexroad et al. J. Anim. So. 1988;66:947-953), cerdos (ver, por ejemplo, Hammer et al. Nature 1985;315:680); vacas (ver, por ejemplo,
Evestone et al. J. Reprod. Fert 1989;85:715-720 y Goto. Mol Reprod Devel. 1993;36:288-290), y humanos (ver, por ejemplo, Boiso et al. Reprod Biomed Online. 2002;5:328-350; Devreker and Englert. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 2000;921 :51 -56; and Gardner and Lañe. Hum Reprod. 1998;13:148-159). Por lo tanto, el medio de cultivo que contiene un embrión puede ser cualquier medio de cultivo conocido en la técnica y utilizado para el cultivo de células y/o embriones mamíferos. Puede tomarse muestra convenientemente del medio de cultivo que contiene el embrión utilizando cualquiera de los métodos conocidos en la técnica, incluyendo aspiración, decantación y pipeteado. Detección de una proteína asociada con un genotipo en una muestra del medio de cultivo La presencia de una proteína asociada con un genotipo puede detectarse en la muestra del medio de cultivo a través de cualquiera de los medios establecidos en la técnica, incluyendo cromatografía [tal como cromatografía líquida de alta presión (HPLC)], separación de afinidad. Tales técnicas están descritas en la técnica (ver, por ejemplo Millner, ed. High Resolution Chromatography: A Practical Approach. Oxford University Press, 1999; Oliver, ed. HPLC of Macromolecules: A Practical Approach. Oxford University Press, 1998; Matejtschuk, ed, Affinity Separations: A Practical Approach. Oxford University Press, 1997; Gosling, ed. Immunoassavs: A Practical Approach. Oxford University Press, 2000; Johnstone and Turner, eds. Immunochemistry 1 and 2: A Prarctical Approach. Oxford University
Press, 1997; McCafferty et al., eds. Antibodv Enqineerinq: A Practical Approach. Oxford University Press, 1996; Shepherd and Dean, eds. Monoclonal Antibodies: A Practical Approach. Oxford University Press, 2000; Coligan et al., eds. Current Protocols in Immunoloqy, Vol. 1 . Wiley & Sons, 2000; Harlow and Lañe. Usinq Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999; Hockfield et al. Selected Methods for Antibodv and Nucleic Acid Probes. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993; Hames, ed. Gel Electrophoresis of Proteins: A Practical Approach. Oxford University Press, 1998; Gore ed. Spectrophotometry and Spectrofluorimetry: A Practical Approach. Oxford University Press, 2000. En modalidades particulares, la presencia de la proteína asociada con un genotipo puede detectarse en el medio de cultivo al utilizar un ¡nmunoensayo, tal como el ensayo ¡nmunoabsorvente enlazado con enzimas, utilizando uno o más anticuerpos dirigidos contra la proteína. Tales anticuerpos pueden generarse por medio de cualquiera de las técnicas descritas en la técnica (ver, por ejemplo Immunoassavs: A Practical Approoach. Oxford University Press, 2000; Johnstone and Tuner, eds. Immunochemistry 1 and 2; A Practical Approach. Oxford University Press, 1997; McCafferty et al., Antibodv Enqineerinq: A Practical Approach. Oxford University Press, 1996; Shepherd and Dean, eds. Monoclonal Antibodies: A Practical Approach. Oxford University Press, 2000; Coligan et al., eds. Currents Protocols in Immunoloqy, Vol. 1 . Wiley & Sons, 2000; Harlow and Lañe. Usinq Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory
Press, 1999; Hockfield et al. Selected Methods for Antibodv and Nucleic Acid Probes. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993.) Por ejemplo, la presencia de la proteína puede detectarse al utilizar un anticuerpo etiquetado (por ejemplo un anticuerpo radioetiquetado, etiquetado por cromóforo, etiquetado por fluoróforo, o etiquetado por enzimas) un anticuerpo conjugado (por ejemplo un anticuerpo conjugado con un sustrato o con la proteína o ligando de un par de proteína-ligando, por ejemplo biotína-estreptavidina), o un fragmento de anticuerpo (por ejemplo un anticuerpo de una cadena, un dominio hipervariable de anticuerpo aislado, etc.) o derivado el cual se une específicamente con la proteína o fragmento del mismo, que incluye una proteína que ha sufrido una modificación total o una porción de su modificación post-traduccional normal. Los ejemplos de enzimas adecuadas para el etiquetado de anticuerpo incluyen peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, beta galactosidasa, o acetilcolinesterasa. Los ejemplos de fluoróforos adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, fluoresceína de diclorotriazinilamina, cloruro de dansilo o ficoeritrina. En otra modalidad, la presencia de la proteína puede detectarse por medio de la transferencia de energía fluorescente (ver, por ejemplo patente de E.U.A. No. 5,631 ,169 y patente de E.U.A. No. 4,868,103).
Otras modalidades del método de la invención
En otras modalidades de la invención, este método puede también aplicarse para determinar un genotipo de un embrión en donde el genotipo está asociado con un nivel más alto o más bajo de expresión de una proteína particular más que la presencia o ausencia estricta de la proteína. En este caso, el genotipo de un embrión está determinado al tomar la muestra de un medio de cultivo que contiene el embrión y al detectar el nivel de una proteína asociada con el genotipo en la muestra del medio de cultivo, y al comparar el nivel de la proteína asociada con el genotipo detectado en la muestra del medio de cultivo con un nivel de dicha proteína detectada en una muestra del medio de cultivo de un embrión control del genotipo conocido (por ejemplo como se determina por PGD), en donde si los niveles detectados de dicha proteína son aproximadamente equivalentes, entonces el genotipo del embrión se identifica de la misma manera que el embrión control. En incluso otras modalidades, la invención provee un método para diagnosticar una enfermedad o condición genética en un embrión al tomar una mezcla de un medio de cultivo que contiene el embrión y al detectar la presencia de una proteína asociada con la enfermedad o condición genética en la muestra del medio cultivo, en donde la presencia o ausencia de la proteína asociada con la enfermedad o condición genética sirve para diagnosticar la enfermedad o condición genética en el embrión. De manera similar, la invención además provee un método para diagnosticar una enfermedad o condición genética en un embrión en donde la enfermedad o condición genética está asociada con un nivel más bajo o más
alto de expresión de una proteína particular, más que la presencia o ausencia estricta de la proteína. En este caso, la enfermedad o condición genética se diagnostica en un embrión al tomar la muestra de un medio cultivo que contiene el embrión y detectar el nivel de una proteína asociada con la enfermedad o condición genética en la muestra del medio de cultivo, y al comparar el nivel de la proteína asociada con la enfermedad o condición genética detectada en la muestra del medio de cultivo con un nivel de dicha proteína detectada en una muestra del medio de cultivo de un embrión control que tiene dicha enfermedad o condición genética (por ejemplo, como se determina por PGD), en donde si los niveles detectados de dicha proteína son aproximadamente equivalentes, entonces el embrión se diagnóstica con la enfermedad o condición genética. La presente invención también provee métodos para identificar una proteína asociada con una enfermedad o condición genética al: (a) tomar la muestra del medio de cultivo que contiene un embrión el cual no tiene la enfermedad o condición genética, (por ejemplo, como se determina por PGD), y detectar el nivel de al menos una proteína en el medio de cultivo de donde se tomó muestra y (b) tomar la muestra del medio de cultivo que contiene un embrión el cual no tiene la enfermedad o condición genética (por ejemplo, como se determina por PGD) y detectar el nivel de al menos una proteína en el medio de cultivo tomado, en donde una proteína detectada en (a) pero no en (b) se identifica como una proteína asociada con la enfermedad o condición genética o en donde una proteína detectada en (b) pero no en (a) se
identifica como una proteína asociada con la enfermedad o condición genética.
EJEMPLOS
La presente invención se describe a continuación por medio de los siguientes ejemplos. Sin embargo, el uso de éstos y otros ejemplos en cualquier parte de la especificación son solamente ilustrativos y no limita el alcance y significado de la invención o de cualquier forma ejemplificada. De igual manera, la invención no está limitada a ninguna modalidad particular aquí descrita. De hecho, pueden ser evidentes muchas modificaciones y variaciones de la invención para los expertos en la técnica al leer esta especificación y pueden hacerse sin alejarse del espíritu y alcance. La invención, por lo tanto, está limitada sólo por los términos de las reivindicaciones anexas junto con el alcance total de los equivalentes autorizados para las reivindicaciones.
EJEMPLO 1 Determinación del sexo del embrión por la detección del cromosa Y asociado con la proteína en muestras de medios de cultivo de embriones generados por IVF
Los embriones humanos están generados por fertilización ¡n vitro (IVF) de acuerdo con los protocolos estándar. Los embriones generados por IVF están colocados en frascos individuales que contienen el medio de cultivo. En el día 3, se retira 35 µ? de los medios expuestos de cada frasco. Como control, se toma la muestra de gotas que no contienen un embrión de una cantidad igual del medio (35 µ.?). El procedimiento de recolección de medios se repite en el día 5 (día en el que normalmente se realiza la transferencia del embrión a la mujer portadora). Todas las muestras se recolectan utilizando puntas de pipeta estéril y una pipeta de 20-200 µ?. Todos los medios que se tomaron muestra se congelan en recipientes Nalgene cryo al inyectar los medios tomados de muestra en nitrógeno líquido. Las muestras pueden analizarse en el lugar o transportarse a otro lugar utilizando un tanque de transporte de nitrógeno líquido estándar. Las muestras del medio de cultivo se analizan para la presencia o ausencia de una proteína asociada con el cromosa Y. Los embriones cuyas muestras contienen el cromosoma Y asociado con la proteína se identifican como machos, mientras que los
embriones cuyas mezclas no contienen el cromosoma Y asociado con la proteína se identifican como hembras. La biopsia embrionaria para el diagnóstico genético de preimplantación (PGD) también se realiza en los días 3 y 5. El PGD se realiza para determinar la presencia o ausencia del cromosoma Y en cada blastómero extraído por biopsia de acuerdo con los protocolos estándar. Los embriones cuyos blastomeros contienen el cromosoma Y se identifican como machos, mientras que los embriones cuyos blastomeros no contienen el cromosoma Y se identifican como hembras. Los resultados de cada biopsia de PGD de embrión en cuanto a la presencia o ausencia del cromosa Y se comparan con los resultados de cada embrión para la ausencia del cromosoma Y asociado con la proteína en las muestras del medio de cultivo. Se hacen las comparaciones para los datos del día 3 y día 5. Los resultados confirman que la presencia o ausencia de la proteína asociada con el cromosoma en la muestra del medio de cultivo para un embrión dado correlaciona con la presencia o ausencia del cromosoma Y en los blastomeros extraídos por biopsia para el mismo embrión, lo cual confirma que el sexo del embrión se identifica con precisión por la presencia o ausencia del cromosoma Y asociado con la proteína del medio de cultivo. La presente invención no está limitada en alcance por las modalidades específicas aquí descritas. De hecho, serán evidentes para aquellos expertos en la técnica las modificaciones de la invención además de aquellas aquí descritas a partir de la descripción anterior y las figuras anexas.
Tales modificaciones están provistas para estar dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Además, se entiende que todos los valores son aproximados y que están provistos para la descripción. Las patentes, solicitudes de patente, publicaciones, descripciones de productos y protocolos están citados a través de esta solicitud, cuyas descripciones están incorporadas aquí a manera de referencia en su totalidad para todos sus propósitos.
Claims (1)
- NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1 .- Un método para determinar un genotipo de un embrión el cual comprende: detectar la presencia de una proteína asociada con el genotipo en una muestra del medio de cultivo, en donde la presencia o ausencia de la proteína asociada con el genotipo determina el genotipo del embrión. 2. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el embrión es un embrión humano. 3. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el embrión tiene un número celular total de 6 a 8 células. 4. - Un método para identificar el sexo de un embrión el cual comprende: a) detectar la presencia de una proteína asociada con el cromosoma Y en la muestra del medio de cultivo; y (b) identificar el sexo del embrión como macho si una proteína asociada con el cromosoma Y está presente o como hembra si una proteína asociada con el cromosoma Y no está presente. 5.- El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque la proteína asociada con el cromosoma Y está selecciona del grupo que consiste en: proteína tipo factor 2 de trascripción inducida por TGF , Protocadherin 1 1 Y, proteína Y de región determinante de sexo, isoforma 1 de proteína S4 Y de proteína ribosomal, proteína cromosomal Zinc finger Y, Amelogenina Y, proteína Y tipo 1 transducina (beta), proteína cinasa Y, proteasa 9Y específica de ubiquitina, proteína Dead Box Y, motivo Y TPR ubicuo, Thymosin (beta) 4 Y, isoforma Y neuroligina 4, marco 15 A de lectura abierta de cromosoma Y, marco 15B de lectura abierta de cromosoma Y, SMC (ratón) homologo, factor 1 AY de iniciación de traducción, isoforma 2 de proteína S4 Y ribosomal, proteína Y específica testicular, carga Y variable, proteína Y relacionada con XK, Proteína Y cromodominio, proteína Y de factor de trascripción de choque térmico, proteína motivo Y de unión a ARN, proteína Y relacionada con PTP-BL, deleción en azoospermia (DAZ), proteína novedosa similar a lisozima C y mezclas de las mismas. 6. - El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque la proteína asociada con el cromosoma Y es un Homosapiens similar a la proteína motivo de unión a ARN, cromosoma Y, proteína de elemento B familia 2 (LOC347598). 7. - El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque el embrión es un embrión humano. 8. - El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque el embrión tiene un número celular total de 6 a 8 células. 9. - Un método para identificar una proteína asociada con el cromosoma Y el cual comprende: (a) detectar la presencia de al menos una proteína en una muestra de un medio de cultivo previamente obtenido de un medio de cultivo que contiene un embrión macho; (b) detectar la presencia de al menos una proteína en una muestra de un medio de cultivo previamente obtenido de un medio de cultivo que contiene un embrión hembra; y (c) identificar una proteína asociada con el cromosoma Y como una proteína presente en la muestra de un medio de cultivo del paso (a) pero ausente en la muestra del medo del cultivo del paso (b). 10. - El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque el embrión macho y el embrión hembra son embriones humanos. 1 1 . - El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque el embrión macho tiene un número celular total de 6 a 8 células y el embrión hembra tiene un número celular total de 6 a 8 células. 12.- Un método para identificar el sexo de un embrión el cual comprende: (a) detectar la presencia de una proteína asociada con el cromosoma Y en una muestra del medio de cultivo y (b) identificar el sexo del embrión como macho si una proteína asociada con el cromosoma Y está presente o como hembra si una proteína asociada con el cromosoma Y no está presente, en donde la proteína asociada con el cromosoma Y se identifica de acuerdo con el método de la reivindicación 9. 13.- El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque el embrión es un embrión humano. 14.- El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque el embrión tiene un número celular total de 6 a 8 células.
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