JP6967852B2 - 性比スキューイング用抗体およびこの抗体の使用方法 - Google Patents
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Description
る。
レーザーキャプチャーマイクロダイセクション (LCM)を使用して、選別していない雄牛精子からY精子を単離し、精子バイオマーカーを確認した。つまり、多数のBos taurus種およびBos indicus種からのPercoll(登録商標)製凍結解凍精子を固定し、脱凝縮し、顕微鏡のガラススライドに貼着した。ウシのY染色体用のStar*FISH(著作物)ペイント系(Cambio Ltd.;Cambridge(UK))を使用するインサイチュー ハイブリダイゼーション(in situ hybridization)を製造者の使用説明書に従って精子スライドに行った。染色体プローブ上の蛍光ラベル(Cy3)によって、精子の性染色体顔料を視覚的に分類できた。LCM装備顕微鏡を使用して、目的に染色体含量の個々の精子細胞をスライドから取り出し、膜に“捕捉”した。(純粋なY染色体および混合染色体を含有する)捕捉された精子細胞の各集団から単離したトータルRNAを次にマイクロアレイ解析によって比較し、X染色体精子に対して特異的な新規バイオマーカーを確認した。
表1:qPCRに使用したプライマーの配列
次に、Bio−Synethesis Inc(Lewisville、TX)製のGX1の複数のペプチド抗原に対してウサギにポリクローナル抗精子を生成した。具体的には、GX1のDNA配列(SEQ ID No.4)からGX1タンパク質のアミノ酸配列を誘導し、抗原位置について分析した。PEG−ポリスチレン樹脂を使用して、連続流条件下でFMOC化学を使用して、GX1タンパク質(表2)内の3種類の異なる抗原位置から誘導される3種類の免疫グレードペプチドを合成した。合成終了時に、樹脂からペプチドを切断し、保護を外してから、低温ジエチルエーテルを使用して沈殿処理した。沈殿物を低温ジエチルエーテルで三回洗浄し、溶解し、凍結乾燥した。
表2:ウサギを免疫してGX1抗精子を生成した合成ペプチドの配列
以下の試験では、市販の展開/冷却(extended and cooled)精液を使用した。つまり、精液を雄牛(複数のBos taurus種、Bos indicus種、具体的にはAngus、Cross、Red Brangusを試験した)から回収し、BIOX細胞展開剤(extender、IMV Technologies、Maple Grove MN)と混合し、4〜5℃で3時間平衡してから、アイスパックを使用して一夜輸送した。実験室到着時に、HEPES−PVA緩衝液(25〜30℃に加温した114mMNaCl、3.2mMKCL、0.3mMNaH2PO4、10mM乳酸、2mMCaCl2、0.5mMMgCl2、10mMHEPES、2mMNaHCO3、0.2mMピルビン酸ナトリウム、0.1%PVA)で洗浄した。1:1000希釈比のLive/Dead(登録商標) Fixable Far Red(Life Technologies、Grand Island、NY)死細胞染料を含有するHEPES−PVAに精子ペレットを再懸濁してから、35℃で10分間インキュベーションした。HEPES−PVAで精子を一回洗浄して、過剰の染料を除去してから、10×106細胞/mLHEPES−PVAの最終濃度に再懸濁した。
50mWの488nmレーザーおよび100mWの640nmレーザーを備えたFACSAria IIスペシャルオーダーシステム(2−レーザー6−色4B−2R;BD Biosciences)を利用してウシの精子を分離した。このシステムは、保存剤を含有しないBioSure(登録商標)シース流体(sheath fluid)(BioSure;Grass Valley、CA)を使用して70psiのシース圧力において1.0中性デイフィルター(day filter)および70μmのノズル先端を使用して構成した。検出器は、順方向散乱域、散乱高さ、散乱幅(FSC−A;−H;−W)、一重項識別用側方散乱域、散乱高さ、散乱幅(SCC−A;−H;−W)、530/30nmフィルター組および上述したようにCy2(GX1タンパク質に対してポジティブな細胞)で標識化した細胞を検出する505nmロングパスミラーを有する488nmレーザー(FITC−A)、および670/30nmフィルターおよびLive/Dead(登録商標)FarRed染料の有無を判別する750nmロングパスフィルターを有する640nmレーザー(APC−A)を有していた。すべてのサンプルを4℃で処理し、シース流体中の12×75mmBSA被覆管に回収した。各サンプルの一部をBD FACSDiva6.1.3で分析してから選別を行うか、選別を行った後に分析し、GX1タンパク質に対してポジティブな膜健全精子の百分率を求めた。
使い捨て式サイトファンネル(cytofunnel)Thermo Fisher Scientific)を一つ備えたサイトセントラフュージ(cytocentrifuge、設定操作条件1000rpm/5分)を使用する汚れのない未被覆サイトスピンガラススライド上で各選別サンプル(上記の実施例4を参照)を回転した。サイトファンネルクリップから取り外した直後に、Rensなど(2001)の方法を一部変更した脱凝縮法によって各スライドを処理した。具体的には、溶液A(10mMトリス、154mMNaCl)を精子スポットに置き、等容積の溶液B(溶液A中50mMDTTで新たに調製した)を液滴に加えた。室温で2.5分後、等容積の一部変更した溶液C(1%SDS、100mMテトラホウ酸ナトリウム)を液滴に加えた。スライドを10秒間インキュベーションしてから、前冷却した100%EtOH(−20℃)に移した。次に、−20℃で15分間スライドをインキュベーションしてから、室温で乾燥した。続いて、再水和、浸透化および脱水を以下のようにして行った。DPBS中5分間(2回)、H2O中で新たに調製した200mHCl中において15分間、2X SSC中において5分間、70%EtOH中において2分間、90%EtOH中において2分間、100%EtOH中において2分間、そして室温における乾燥。ウシのY染色体用プローブ混合物をスライド処理と同時に調製した。即ち5μMのペプチド核酸プローブ[Cy3−OO−AGCCCTGTGCCCTG;SEQ ID No.8;50%脱イオンホルムアミド、10%硫酸デキシタン(dextan sulfate)、2X SSC中においてPerretなど(1990)の方法で誘導した配列]を75℃で10分間インキュベーションし、37℃において使用するまで保持した。
抗−GX1ペプチド抗体の各種の精子に結合する能力について、雄牛および雄馬だけでなく、ヒト、雄羊、イノシシおよび雄鹿(シカ科)の精子から新たに回収した精液に基づいて評価した。まず、これら種から回収した精液をDPBSで2度洗浄して、エキステンダーおよび/または精液を除去した。精液ペレットをDPBSに再懸濁し、未被覆のガラス顕微鏡スライドにスポッティングした。スライドを室温で10分間乾燥してから、−20℃のメタノール(100%ACS級;Thermo Fisher Scientific Inc.)中に固定した。−20℃で10分間スライドをインキュベーションしてから、ドラフトチャンバー内で最低10分間完全乾燥した。
牛の精巣RNAから誘導したcDNAのPCR増幅によってGX1mRNAのクローンを生成した。ほぼ349bpサイズのアンプリコンをTAクローニングベクトル(pGEM−T Easy、Promega、Madison、WI)に配位子結合した。一旦シーケンシングによって確認した後、GX1cDNA含有プラスミドをPCR処理して、cDNAフラグメントを生成した。このフラグメントは、制限酵素開裂サイトが側面に位置するGX1に対するタンパク質コーディング領域のヌクレオチド配列からなり、次に大腸菌タンパク質発現ベクトルに配位子結合を発現する。具体的には、フォワードプライマーについては、GX1コーディング域の開始コドンの直前にNdeI開裂サイトが加わるように設計し、一方リバースプライマーについては、GX1コーディング域の停止コドンをグリシンアミノ酸、インテイン−キチン結合ドメインタグおよびSpeI開裂サイトに対する配列で置換するように設計した(表3)。PCRの生成物を適切な制限酵素で加水分解してから、加水分解pTXB1ベクターに配位子結合し[New England Biolabs Inc(NEB)、Ipswich、MA]、そして大腸菌JM109細胞(NEB)に形質転換した。形質転換体からプラスミドを単離してから、制限加水分解によってGX1 cDNA挿入の存在についてスクリーニングを行った。ポジティブクローンを順に配列して、C−末端ラベリングのインテインタグに対して正しい向きにあることを確認してから、(T7RNAポリメラーゼ遺伝子を含有する)大腸菌T7発現細胞に転換した。
実施例7の記載に従って調製したGX1−Eタンパク質に対してウサギ中にポリクローナル抗血清を生成した。具体的には、GX1−Eタンパク質を完全フロイントアジュバントに乳化し、完全フロイントアジュバント中でGX1−Eタンパク質を乳化し、2週間おきにニュージーランド産白ウサギに注射し、合計で5回の同時免疫を行い、GX1−E抗精子生成を誘導した。一次免疫(前免疫)の前(ウィーク0)、4回目のブースター注射(ウィーク8)の前、4回目のブースター注射2週間後(ウィーク10)、7回目のブースター注射の前(ウィーク14)、7回目のブースター注射1週間後(ウィーク15)、および試験終了時(ウィーク17)に血清を回収した。
GX1mRNAのクローン(実施例7)をPCRし、cDNAフラグメントを生成した。このフラグメントは制限酵素裂開サイトの側面に位置するGX1に対するタンパク質コーティング域のヌクレオチド配列からなり、これらが次に配位子結合してタンパク質発現ベクターになる。具体的には、フォワードプライマーについて、GX1コーティング域の開始コドンの直前にNdeI裂開サイトを加えるように設計し、一方リバースプライマーについては、GX1コーディング域の停止コドンの直後にXhoIを加えるように設計した(表4)。
変異型については、SEQ ID No.4に記述された配列から一つかそれ以上のアミノ酸残基分逸脱していると決定されたアミノ酸配列からなることが確認された。なお、生成した変異型タンパク質の抗原特性への影響は最小であった。各変異形タンパク質は、本明細書でSEQ ID No.1、2、3として記述したペプチド域を一つかそれ以上含有していた。変異型の場合、BLASTNPソフトウェア(NCBI)によって少なくとも79%、85%、90%または95%がSEQ ID No.4に記述されたアミノ酸配列と一致していた。X−染色体を有する哺乳動物の精子細胞蛋白質は、SEQ IDNo.9〜16に記述されているアミノ酸配列からなり、そしてX−染色体を有する哺乳動物の精子細胞タンパク質の変異型のタンパク質の場合、SEQ ID No.17〜24に記述されているヌクレオチド配列によって遺伝子情報を指定(コード化)することが可能である。
GX1−Eタンパク質に対してウサギ中にBio−Synthesis Incによってポリクローナル抗血清を生成した。具体的には、完全フロイントアジュバント中でGX1−Mタンパク質を乳化し、2週間おきにニュージーランド産白ウサギに注射し、合計で5回の同時免疫を行い、GX1−M抗精子生成を誘導した。一次免疫(前免疫)の前(ウィーク0)、4回目のブースター注射(ウィーク8)の前、4回目のブースター注射2週間後(ウィーク10)、および試験終了時(ウィーク14)に血清を回収した。ウィーク0およびウィーク8に血清を回収し、ELISAタイター評価によって分析し、抗血清の特異性を確認した。タンパク質抱合樹脂カラムを使用して、GX1−M抗血清(免疫親和性クロマトグラフィー)からの抗体を精製し、かつ濃縮して、精製抗−GX1−Mタンパク質抗体を生成した。実験室到着時に、単一のタンパク質に対する特異性をウェスタンブロット分析によって決定し、雄牛の精子溶解物上で免疫前血清および抗−GX1−Mタンパク質抗体および予め吸収処理した抗−GX1−Mタンパク質抗体の反応性を比較した。
実施例2、8および/または11の抗体または抗原−結合フラグメントを検出可能な物質で標識化する。なお、標識は限定するものではなく、蛍光標識、放射性標識、酵素標識、タンパク質標識などを使用することができる。抗体または抗原−結合フラグメントは、制限するものではないが、管、ビーズおよび/またはプレートなどの固形支持体に抱合化することができる。次に、抗体がX−染色体を有する精子細胞に結合する条件下で、標識化および/または抱合化抗体または抗原−結合フラグメントを哺乳動物の精液および/または精子の正味の、あるいは希釈したサンプルに添加する。次に、抗体に結合した精子細胞を未結合の精子細胞から分離する。任意の適当な分離法を使用することができるが、例示すると、蛍光活性化細胞選別法、磁気細胞選別法、抗体被覆管への接着法、抗体被覆プレートへの接着法、抗体被覆ビーズへの接着法、他の固形マトリックスへの接着法がある。分離した精子細胞を直接使用して、生体外で雌に精液を注入するか、卵母細胞に受精させるか、公知な方法を使用して処理、凍結して、後日の生体外精液注入および/または受精に備える。
抗体/抗原結合フラグメントがX−染色体を有する精子細胞に結合し、抗体結合精子細胞が卵母細胞に受精することを防止する物理的なバリヤを与える条件下で、実施例2、8および/または11で説明したように誘導した抗体または抗原−結合フラグメントを哺乳動物の精液および/または精子の正味の、あるいは希釈したサンプルに添加する。次に、一部が抗体、あるいはこれの抗原−結合フラグメントが結合し、そして一部がこのような結合抗体/抗原−結合フラグメントを有しない精子細胞の混合物を含有する精液を直ちに使用して、雌に注入するか、あるいは卵母細胞に生体外で受精させるか、あるいは公知方法を使用して処理および/または凍結して、後日の注入および/または受精に備える。この方法では、未結合精子、即ちY−染色体を有する精子分に富む集団は卵母細胞に受精でき、得られた子孫集団を雄にスキューイングでき、一方結合精子、即ちX−染色体を有する精子分に富む集団は抑制を受ける。
実施例2、8および/または11と同様に誘導した抗体、あるいはこれの抗原−結合フラグメントを公知方法によって阻害性物質に抱合する。この阻害性物質としては、限定するわけではないが、化学剤、薬剤および/または細胞毒を例示することができる。次に、抗体/抗原−結合フラグメントがX−染色体を有する精子細胞に結合する条件下で、哺乳動物の精液および/または精子の正味の、あるいは希釈したサンプルに添加する。阻害性物質が結合しているため、抗体/抗原−結合フラグメント−結合精子細胞が卵母細胞に受精することはない。次に、一部が抗体、あるいはこれの抗原−結合フラグメントが結合、抱合し、そして一部がこのような結合抗体/抗原−結合フラグメントを有しない精子細胞の混合物を含有する精液を直ちに使用して、雌に注入するか、あるいは卵母細胞に生体外で受精させるか、あるいは公知方法を使用して処理および/または凍結して、後日の注入および/または受精に備える。この方法では、未結合精子、即ちY−染色体を有する精子分に富む集団は卵母細胞に受精でき、得られた子孫集団を雄にスキューイングでき、一方結合精子、即ちX−染色体を有する精子分に富む集団は抑制を受ける。
Claims (31)
- SEQ ID No.4およびSEQ ID No.9〜16からなる群から選択される配列、またはSEQ ID No.4に対して少なくとも90%の同一性を示す配列を有する哺乳動物のX−染色体を有する精子細胞タンパク質に選択的に結合することを特徴とする精製抗体、またはこれの抗原結合フラグメント。
- SEQ ID No.5およびSEQ ID No.17〜24からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する遺伝子によって前記の哺乳動物のX−染色体を有する精子細胞タンパク質をコード化する請求項1に記載の精製抗体、またはこれの抗原結合フラグメント。
- 前記抗体がモノクローナル抗体かポリクローナル抗体、あるいはこれらの抗原結合フラグメントである請求項1に記載の精製抗体、またはこれの抗原結合フラグメント。
- SEQ ID No.4およびSEQ ID No.9〜16からなる群から選択される配列、またはこれに対して少なくとも90%の同一性を示す抗原配列からなる群から選択される天然または合成抗原アミノ酸配列を有する抗原ペプチド組成物によってホスト(ヒトを除く)を免疫化することによって前記の抗体またはこれの抗原結合フラグメントを誘導する請求項3に記載の精製抗体、またはこれの抗原結合フラグメント。
- SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、およびSEQ ID No.3のうちの一つかそれ以上からなる群から選択されるペプチドを有する抗原ペプチド組成物によってホスト(ヒトを除く)を免疫化することによって前記の抗体またはこれの抗原結合フラグメントを誘導する請求項3に記載の精製抗体、またはこれの抗原結合フラグメント。
- 前記哺乳動物がヒト、雄牛、ウマ科の動物、羊、シカ科の動物、ラクダ科の動物、および豚からなる群から選択される請求項1に記載の精製抗体、またはこれの抗原結合フラグメント。
- 前記哺乳動物がBos TaurusおよびBos indicusのいずれか一つ、あるいはこれらの交配種である請求項6に記載の精製抗体、またはこれの抗原結合フラグメント。
- SEQ ID No.4およびSEQ ID No.9〜16からなる群から選択される配列、またはSEQ ID No.4に対して少なくとも90%の同一性を示す配列を有する天然の、あるいは合成した、哺乳動物のX−染色体を有する精子細胞タンパク質に対して選択的に結合する抗体、あるいはこれの抗原結合フラグメントに哺乳動物の精子の正味の、あるいは希釈サンプルを接触させ、そして、
結合した抗体、あるいはこれの抗原結合フラグメントを直接または間接検出するX−染色体を有することを特徴とする哺乳動物の精子細胞の集団を同定する方法。
- SEQ ID No.5およびSEQ ID No.17〜24からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する遺伝子によって前記の哺乳動物のX−染色体を有する精子細胞タンパク質である天然の、あるいは合成したペプチドをコード化する請求項8に記載の方法。
- モノクローナル抗体かポリクローナル抗体、あるいはこれらの抗原結合フラグメントである抗体に前記サンプルを接触させる請求項8に記載の方法。
- SEQ ID No.4およびSEQ ID No.9〜16からなる群から選択される配列、またはSEQ ID No.4に対して少なくとも90%の同一性を示す抗原配列からなる群から選択される天然または合成抗原アミノ酸配列を有する抗原ペプチド組成物によってホスト(ヒトを除く)を免疫化することによって誘導した抗体またはこれの抗原結合フラグメントに前記サンプルを接触させる請求項10に記載の方法。
- SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、およびSEQ ID No.3のうちの一つかそれ以上からなる群から選択される天然または合成ペプチドを有する抗原ペプチド組成物によってホスト(ヒトを除く)を免疫化することによって誘導する抗体、あるいはこれの抗原結合フラグメントに前記サンプルを接触させる請求項10に記載の方法。
- 前記哺乳動物が、雄牛、ウマ科の動物、羊、シカ科の動物、ラクダ科の動物、および豚からなる群から選択される哺乳動物から前記サンプルを得る請求項8に記載の方法。
- 前記哺乳動物がBos Taurus(ウシ)およびBos indicus(コブウシ)のいずれか一つ、あるいはこれらの交配種である請求項13に記載の方法。
- X−染色体を有する精子細胞およびY−染色体を有する精子細胞を有する精子細胞の集団を有する哺乳動物(但しヒトを除く、以下同様)の精液のサンプルを得てから、
SEQ ID No.4およびSEQ ID No.9〜16からなる群から選択される配列、またはSEQ ID No.4に対して少なくとも90%の同一性を示す配列を有する天然の、あるいは合成した、哺乳動物のX−染色体を有する精子細胞タンパク質に対して選択的に結合する抗体、あるいはこれの抗原結合フラグメントに前記精液のサンプルおよび/または前記の精子細胞の集団を接触させて、前記抗体、あるいはこれの抗原結合フラグメントを有する精子の一部を含むことを特徴とする精子細胞の混合集団を生成する性比のスキューイング方法。
- 前記の哺乳動物のX−染色体を有する精子細胞タンパク質が、SEQ ID No.5およびSEQ ID No.17〜24からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する遺伝子によって前記の哺乳動物のX−染色体を有する精子細胞タンパク質をコード化した天然の、あるいは合成したペプチドである請求項15に記載の方法。
- 前記サンプル、またはこれから単離した精子細胞の前記集団をモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である抗体、あるいはこれの抗原結合フラグメントに接触させる請求項15に記載の方法。
- SEQ ID No.4およびSEQ ID No.9〜16からなる群から選択される配列、またはSEQ ID No.4に対して少なくとも90%の同一性を示す抗原配列からなる群から選択される天然または合成抗原アミノ酸配列を有する抗原ペプチド組成物によってホスト(ヒトを除く)を免疫化することによって誘導した抗体またはこれの抗原結合フラグメントに前記サンプルを接触させる請求項17に記載の方法。
- SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、およびSEQ ID No.3からなる群から選択される天然または合成ペプチドを有する抗原ペプチド組成物によってホスト(ヒトを除く)を免疫化することによって誘導した抗体またはこれの抗原結合フラグメントに前記サンプルを接触させる請求項17に記載の方法。
- さらに、前記の精子細胞の混合集団の一部を使用して卵母細胞(ヒトを除く)に受精する請求項15に記載の方法。
- さらに、前記抗体、またはこれに結合した抗原結合フラグメントを有する精子細胞を、前記受精ステップの前に、前記混合集団の他の精子細胞から分離して、精子細胞のX−染色体に富む集団およびY−染色体に富む集団を生成する請求項20に記載の方法。
- 前記分離を、蛍光活性化細胞選別法、磁気細胞選別法、抗体被覆管への接着法、抗体被覆プレートへの接着法、抗体被覆ビーズへの接着法、およびこれらを組み合わせた方法のうちの一つかそれ以上の方法によって行う請求項21に記載の方法。
- 前記哺乳動物が雄牛、ウマ科の動物、羊、シカ科の動物、ラクダ科の動物、および豚からなる群から選択される哺乳動物から前記精液サンプルを得る請求項15に記載の方法。
- 前記哺乳動物がBos TaurusおよびBos indicusのいずれか一つ、あるいはこれらの交配種である請求項23に記載の方法。
- SEQ ID No.4およびSEQ ID No.9〜16からなる群から選択される配列を有する哺乳動物のX−染色体を有する精子細胞タンパク質に対して選択的に結合する精製抗体またはこれの抗原結合フラグメント。
- SEQ ID No.5およびSEQ ID No.17〜24からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する遺伝子によって前記の哺乳動物の精子細胞タンパク質をコード化する請求項25に記載の精製抗体またはこれの抗原結合フラグメント。
- 前記抗体がモノクローナル抗体かポリクローナル抗体、あるいはこれらの抗原結合フラグメントである抗体である請求項25に記載の精製抗体またはこれの抗原結合フラグメント。
- 前記抗体またはこれに結合した抗原結合フラグメントを、SEQ ID No.4およびSEQ ID No.9〜16からなる群から選択される天然または合成抗原アミノ酸配列を有する抗原ペプチド組成物によりホスト(ヒトを除く)を免疫化することによって誘導する請求項27に記載の精製抗体またはこれの抗原結合フラグメント。
- 前記抗体またはこれに結合した抗原結合フラグメントを、SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、およびSEQ ID No.3の1以上からなる群から選択される抗原ペプチド組成物によりホスト(ヒトを除く)を免疫化することによって誘導する請求項27に記載の精製抗体またはこれの抗原結合フラグメント。
- 前記哺乳動物が、ヒト、雄牛、ウマ科の動物、羊、シカ科の動物、ラクダ科の動物、および豚からなる群から選択される請求項25に記載の精製抗体またはこれの抗原結合フラグメント。
- 前記哺乳動物がBos TaurusおよびBos indicusのいずれか一つ、あるいはこれらの交配種である請求項30に記載の精製抗体またはこれの抗原結合フラグメント。
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