KR101934619B1

KR101934619B1 - Dazl 단백질 특이적 항체를 이용한 개 정원줄기세포의 확인 및 동정 방법

Info

Publication number: KR101934619B1
Application number: KR1020160149645A
Authority: KR
Inventors: 이원영
Original assignee: 건국대학교 글로컬산학협력단
Priority date: 2016-11-10
Filing date: 2016-11-10
Publication date: 2019-01-02
Also published as: KR20180052392A

Abstract

본 발명은 DAZL 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용한 개 정원줄기세포의 확인 및 동정 방법에 관한 것이다. 본 발명의 DAZL 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하는 경우, 종래 분리가 어려워 연구에 많은 제한이 있었던 미분화 정원세포를 개의 정소내 또는 체외배양한 개의 정소세포들로부터 선택적으로 확인 및 동정할 수 있다.

Description

DAZL 단백질 특이적 항체를 이용한 개 정원줄기세포의 확인 및 동정 방법{Method for Isolating Canine Spermatogonial Stem Cells Using DAZL Protein Specific Antibody}

본 발명은 DAZL 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용한 개 정원줄기세포의 확인 및 동정 방법에 관한 것이다.

정원줄기세포(SSCs, spermatogonial stem cells)는 정소에 존재하면서 정자형성(spermatogenesis)에 중요한 기능을 한다. 그 명칭에 있어 포유류 암컷에서 이들의 존재 가능성이 제기되어 이와 구분하기 위해 ‘남성생식선줄기세포’(雄性, 웅성, male germline stem cells)라고도 불리운다.

이 세포는 성체줄기세포 특유의 자가재생능력과 정자세포로의 분화능력을 동시에 가지고 있으나, 고환 내에 아주 극소수가 존재하기 때문에 그 분리와 임상적 이용에 어려움이 많고 체외에서 증식, 배양하는 기술의 확립이 미흡한 문제점이 있다. 이에, 정원줄기세포의 새로운 마커의 발굴에 의한 효율적인 분리, 최적의 배양 조건, 충분한 양의 체외 증식과 그 유지 방법에 대한 지속적인 노력이 이어져 왔으나, 아직 체외에서의 정자형성은 기술적인 한계가 있다. 정원줄기세포는 분리가 제한적이고 배양시에는 많은 수의 정원줄기세포가 죽기 때문에 배양이 어려우며, 특히 정원줄기세포와 분화된 정원세포간의 구별이 가능한 형태학적, 생화학적인 마커가 없는 것이 가장 큰 어려움이다(Nagano 등, 1998; van Pelt 등, 2002). 관련 선행기술로는 한국 등록특허 10-1027718(웅성 생식세포-특이 뉴클레오타이드 서열), 한국 등록특허 10-1173116(신규한 돼지 정조줄기세포 분리 및 배양 방법)이 있다.

최근 마우스 정소 내 정원줄기세포를 통한 키메라 마우스의 생산 이후 랫트, 소, 돼지, 닭 등의 정원줄기세포를 이용한 이식에 관한 연구 보고가 급증하고 있다. 그러나, 개를 비롯한 중대형 동물의 정원줄기세포를 이용한 형질전환 동물의 생산에 관한 연구는 아직 미미한 수준이며, 특히 개는 크기, 수명, 유전적으로도 마우스 모델보다 인간과 밀접한 관련성이 있으므로 연구의 가치가 높다. 그럼에도 불구하고 개 정원줄기세포에 관한 연구는 현재까지 많은 연구가 진행되어 있지 않은 실정이며, 따라서 개 정원줄기세포 특이발현 표면항원 발굴을 통한 마커 시스템 개발 및 이러한 기술을 기반으로 한 유전자조작 형질전환 및 질환모델 개의 생산기술 개발의 필요성이 절실히 요구되고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 개의 정원줄기세포를 확인 및 동정할 수 있는 신규한 생물학적 마커를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 개의 미분화 정원세포에서 DAZL 단백질이 특이적으로 발현되는 것을 확인하고, 본 발명의 DAZL 단백질이 개의 정원줄기세포의 확인 및 동정을 위해 사용될 수 있음을 규명하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 DAZL 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 개 정원줄기세포의 확인 및 동정용 키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 DAZL 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 표지물질을 개의 정원줄기세포에 표지하여 개의 정원줄기세포를 확인 및 동정하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 DAZL 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 개 정원줄기세포의 확인 및 동정용 키트를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 DAZL 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 개 정원줄기세포의 확인 및 동정용 키트는, PGP9.5, SCP3, C-kit 및 Acrosin으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 명세서에서 상기 DAZL(deleted in azoospermia-like) 단백질은 남성과 여성 모두에서 생식세포 발달에 필수적인 역할을 수행하는 생식세포 특이적 RNA 결합 단백질로, 특히 정자형성에 중추적인 역할을 하는 것으로 알려져 있는 단백질이다. 상기 DAZL 단백질은 mRNA의 3‘-UTR에 결합하여 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 상기 DAZL 단백질(유전자)는 생쥐 등 타 동물에서 정원줄기세포 표지인자로 알려져 있었으나, 개의 정원줄기세포 표지인자로 사용될 수 있는 기술적 특징에 대해서는 아직까지 개시된 바가 없다.

본 명세서에서 상기 PGP9.5, SCP3, C-kit 및 Acrosin 단백질은 기존에 정자형성과정에 있어서 발달단계별 표지인자로 알려진 바 있다. 보다 구체적으로 SCP3는 1차 정모세포(primary spermatocyte), C-kit는 분화된 생식세포, Acrosin은 첨체에 대한 표지인자로서 알려져 있다.

본 명세서에서 사용된 표현, “개 정원줄기세포의 확인 및 동정용 키트”는 개 정원줄기세포에 발현된 DAZL 단백질에 특이적으로 결합하는 항체가 포함된 키트를 의미한다.

본 명세서에서 사용된 표현, “확인 및 동정”은 특정 세포의 종류를 판정하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 특정 세포의 종류는 개 정원줄기세포(canine spermatogonial stem cell)이다. 상기 개의 정원줄기세포는 정소에 존재하면서 정자형성(spermatogenesis)에 중요한 기능을 하는 세포를 의미한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 면역분석 방식, 즉 항원-항체 반응 방식으로 개 정원줄기세포 등에 관한 마커(DAZL, PGP9.5, SCP3, C-kit 및 Acrosin 단백질 등)을 검출하는데 사용할 수 있다.

이 경우, 개 정원줄기세포 마커의 검출은 예를 들어, DAZL 단백질 상의 에피토프에 결합하는 검출제제를 이용하여 실시할 수 있다. 이 경우 생물학적 시료 내에 존재하는 DAZL 단백질을 검출할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 상기 항체는 본 발명의 마커 또는 상기 마커의 구성 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.

상기한 바와 같이 새로운 개의 정원줄기세포 마커가 규명되었으므로, DAZL(마커 단백질 항원)을 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.

상기 다클론 항체는 상기한 마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.

상기 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein, European Jounral of Immunology 6:511-519, 1976 참조) 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al. Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al. J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다.

상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전지영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

본 발명의 키트는 통상적인 면역분석 방법에 적용되어 정원줄기세포를 확인 및 동정하는데 이용될 수 있다. 이러한 면역분석 방법은 종래에 개발된 다양한 정량적 또는 정성적 면역분석 방법으로서, 면역분석 포맷은 웨스턴 블랏, 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 샌드위치 엘라이자, 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있다.

상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석함으로써, 개의 정원줄기세포를 확인 및 동정할 수 있다.

구체적으로, 개의 정소시료에서 본 발명의 마커에 대한 시그널이 정원줄기세포 시료(양성 대조군)와 같거나 그 이상으로 나오는 경우에는 개의 정원줄기세포인 것으로 동정할 수 있고, 개의 정소시료에서 얻은 마커에 대한 시그널이 정원줄기세포 시료에서 얻은 마커에 대한 시그널 보다 약하게 나오는 경우 개 정원줄기세포가 아닌 것으로 동정할 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 DAZL 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 표지물질을 개의 정원줄기세포에 표지하여 개의 정원줄기세포를 확인 및 동정하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 방법에서 개의 정원줄기세포는 개의 정소 내 정원줄기세포 또는 체외 배양된 개의 정원줄기세포일 수 있다.

상기 개의 미분화 정원줄기세포 마커를 검출하는 방법과 상기 개의 미분화 정원줄기세포의 확인 및 동정용 키트는 동일한 마커를 사용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 회피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명은 개의 정원줄기세포를 조직학자의 조직에 대한 형태학적 소견에 의한 판단이 아니라, 분자 진단 방법으로 판단한다. 본 발명의 마커는 개 정원줄기세포에서 저농도로 존재하는 생체 분자이다. 구체적으로, 본 발명의 마커인 DAZL은 개의 정소 내 또는 체외배양된 정원줄기세포에서 적은 양으로 존재한다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 항원-항체 반응 방식으로 실시할 수 있다.

본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다:

(a) 개의 정소를 수득하는 단계;

(b) 상기 수득된 정소 조직에서 정소세포를 분리하는 단계;

(c) 상기 분리된 정소세포를 배양하는 단계; 및

(d) 상기 배양된 정소세포에 DAZL 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 확인 및 동정하는 단계.

본 발명에 따르면, 간편하면서도 신속하게 개의 정원줄기세포 여부를 용이하게 결정할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 본 발명은 DAZL 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 개 정원줄기세포의 확인 및 동정용 키트를 제공한다.

(b) 본 발명은 DAZL 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 표지물질을 개 정원줄기세포에 표지하여 개의 정원줄기세포를 확인 및 동정하는 방법을 제공한다.

본 발명의 DAZL 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하는 경우, 종래 분리가 어려워 연구에 많은 제한이 있었던 미분화 정원세포를 개의 정소 내 또는 체외배양한 개의 정소세포들로부터 선택적으로 확인 및 동정할 수 있다.

도 1은 개의 정소를 H&E 염색하여 발달단계별(1, 2, 4, 7개월령)로 나타낸 도이다(SC: sertoli cell, SG: spermatogonia, SCT: spermatocyte, ESTD: elongated spermatocyte).
도 2는 개의 정소 내에서 개의 미분화 정원세포 표지인자인 PGP9.5 단백질과 본 발명의 DAZL 단백질의 발현 양상을 발달 단계별(1, 2, 4, 7개월령)로 나타낸 도이다.
도 3는 정자형성과정에 있어서 발달단계별 표지인자로 알려진 SCP3, C-kit, Acrosin 단백질의 개 정소 내에서의 발현 양상을 발달 단계별(1, 2, 4, 7개월령)로 나타낸 도이다.
도 4는 성숙한 개 정소에서의 PGP9.5, DAZL, SCP3, C-kit, Acrosin 의 발현을 형광면역염색 후 공초점 현미경으로 관찰하여 나타낸 도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 개 정소의 발달단계별 생식세포의 형태학적 비교

먼저 1개월령, 2개월령, 4개월령 및 7개월령의 수컷 개에서 정소조직을 수거한 뒤 조직절편을 제작하여 H&E 염색을 한 뒤 관찰하였다.

결과는 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 발달 시기별 1개월령, 2개월령, 4개월령, 7개월령의 개 정소에서 생식세포의 발달을 형태학적으로 확인한 결과, 1개월, 2개월, 및 4개월의 개 정소에서는 정원줄기세포(spermatogonial stem cell)와 세르토리 세포(Sertoli cell)만 존재하는 것이 확인되었다. 이로부터 개의 성 성숙이 4개월 이후에 진행되는 것을 알 수 있었다.

실시예 2: 개 정소의 발달단계별 생식세포 마커(PGP9.5, DAZL 등) 발현 확인

2-1. PGP9.5 및 본 발명의 DAZL 유전자 발현의 비교

미분화 정원줄기세포(Spermatogonial stem cell)는 PLZF, GFRa1, PGP9.5 등의 유전자를 특이적으로 발현하는 것으로 알려져 있다. 개 정소의 발달단계별 생식세포 마커들의 발현을 확인하기 위하여, 개 정원줄기세포 특이적 발현인자로 알려진 PGP9.5와 본 발명의 DAZL을 면역염색한 후 발현 정도와 위치를 비교하였다.

먼저 1개월령, 2개월령, 4개월령 및 7개월령의 수컷 개에서 정소조직을 수거한 뒤 PGP9.5 (AbD Serotec, 7863-1004), DAZL (Santa Cruz Biotechnology, SC-27333), SCP3 Ab(Santa Cruz Biotechnology, SC-33195), C-kit Ab(Santa Cruz Biotechnology, SC-1494), Acrosin Ab(Santa Cruz Biotechnology, SC-51504)를 사용하여 면역 염색을 하였다.

결과는 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 개의 정소 발달단계별 정원줄기세포 특이적 발현인자로 알려진 PGP9.5를 확인한 결과 1개월과 2개월령의 개 정소에서는 세정관(seminiferous tubule)의 중앙부분에 정원줄기세포(spermatogonial stem cell)가 위치하는 것을 확인하였다. 그러나 4개월과 7개월령의 개 정소에서는 정원줄기세포가 세정관의 외곽으로 이동하여 위치하는 것을 확인하였다. 또한, 생쥐 등 타 동물의 정원줄기세포 표지인자로 알려져 있지만 개에서는 아직 알려지지 않은 본 발명의 DAZL의 유전자를 개의 정소조직에서 확인한 결과, 모든 발달시기에서 PGP9.5가 발현하는 세포와 100% 일치하는 것을 확인할 수 있었다.

2-2. SCP3, C-kit 및 Acrosin 유전자 발현의 비교

개 정소조직 내에서 발달단계별 정소조직 및 정자의 분화 양상을 추가적으로 확인하기 위하여, 정자형성과정에 있어서 발달단계별 표지인자로 알려진 SCP3(1차 정모세포), C-kit(분화된 생식세포), Acrosin(첨체)을 면역염색한 후 발현 정도와 위치를 비교하였다.

상기 SCP3, C-kit, Acrosin의 면역염색은 PGP9.5 Ab와 DAZL Ab 대신 SCP3 Ab(Santa Cruz Biotechnology, SC-33195), C-kit Ab(Santa Cruz Biotechnology, SC-1494), Acrosin Ab(Santa Cruz Biotechnology, SC-51504)를 사용한 것을 제외하고는 상기 1-1과 동일한 방법으로 수행하였다.(네. 동일한 항체를 사용하였습니다.)

결과는 도 3에 나타내었다.

분석 결과, 초기 정모세포 (primary spermatocyte) 시기에 진행되어지는 감수분열 표지인자로 알려진 SCP3 유전자 발현세포는 7개월령 조직에서 특이적으로 발현하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 기존에는 분화된 정모세포(spermatocyte)의 표지인자로 알려져 있던 C-kit는, 개의 정소 내에서 성성숙 이전(1, 2, 4개월령)에는 미분화된 정원줄기세포에서 발현하는 것을 확인할 수 있었고, 성성숙(7개월령) 이후에는 정모세포에서 발현하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 긴정자세포(elongated spermatid) 표지인자로 알려진 Acrosin의 발현세포는 성성숙 이후의 7개월 정소조직에서만 발현하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3: 성 성숙한 개 정소의 생식세포 마커 발현 확인

성숙한 개의 정소조직에서 정자형성과정을 통한 세포의 분화과정을 확인하기 위하여, PGP9.5/DAZL, PGP9.5/SCP3, PGP9.5/C-kit, C-kit/SCP3, C-kit/Acrosin의 공동염색을 통해 각 유전자의 발현양상을 비교분석 하였다.

먼저 성숙한 7개월령의 수캐로부터 정소조직을 수거한 후 조직절편을 제작하였다. 수거된 조직은 Bouin’s solution (Sigma-Aldrich, HT10132)에 침지하여 고정하였고 70-100% 에탄올을 이용해 탈수 시켰다. 탈수된 조직은 자일렌(xylene) (JUNSEI, 25165-0480)에 의해 투명화 되었고 파라핀 블록을 제작하였다. 이어서 조직절편을 0.1 % Triton X 100, 2 % BSA가 첨가된 PBS에 10 분간 상온에서 침지시킨 후, 2 % BSA가 첨가된 PBS에 1:100으로 PGP9.5 (AbD Serotec, 7863-1004), SCP3 Ab(Santa Cruz Biotechnology, SC-33195), C-kit Ab(Santa Cruz Biotechnology, SC-1494), Acrosin Ab(Santa Cruz Biotechnology, SC-51504)를 각각 첨가하여 4 ℃에서 12 시간 동안 반응시켰다. 이후, Alexa Fluor 568 Donkey Anti-rabbit IgG (Life Technologies, A-11042), Aexa Fluor 488 Goat Anti-mouse IgG (Life Technologies, A-11001)를 1:2000으로 희석하여 반응시키고 DAPI (Sigma-Aldrich, D9542)를 이용하여 핵을 염색한 후 공초점 현미경을 이용하여 관찰하였다.

결과는 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, PGP9.5와 DAZL을 발현하는 정원줄기세포는 정소 내 세정관의 최외각에 위치하였고 동일한 발현양상을 보였다. 그러나 초기정모세포 표지인자인 SCP3는 정원줄기세포의 위치보다 조금 아래 혹은 동일선상에서 발현하지만 서로 다른 세포에서 발현되는 것을 확인하였다. C-kit 발현세포 역시 PGP9.5 발현세포에 비하여 세정관의 중심부에 위치하는 것으로 나타났다. 또한, C-kit과 SCP3 발현세포를 비교분석한 결과, SCP3 발현세포와 C-kit 발현세포의 위치는 완전히 일치하지는 않는 것으로 확인되었다. 성성숙 이후 분화된 정모세포의 표지인자로 알려진 C-kit는 정원줄기세포들보다 안쪽에서 발현하였지만, SCP3 발현세포에 비해서는 더욱 세정관 중심부에 가까운 곳에 위치하는 것으로 나타났다. 마지막으로 긴정자세포 표지인자인 Acrosin은 C-kit를 발현하는 세포보다 더욱 분화된 세포에서 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 정자형성과정에 따라 PGP9.5와 DAZL이 발현되는 세포에서, SCP3를 발현하는 세포, C-kit를 발현하는 세포, Acrosin을 발현하는 세포의 순으로 점차 정자의 분화가 진행되어 지는 것을 알 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

DAZL 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 C-kit 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 4개월령 이전의 개 정소에서 유래한 개 정원줄기세포의 확인 및 동정용 키트.
제 1 항에 있어서, 상기 키트는 PGP9.5, SCP3 및 Acrosin으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
DAZL 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 C-kit 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 표지물질을 개 정소세포에 표지하여 개의 정원줄기세포를 확인 및 동정하는 방법에 있어서, 상기 정원줄기세포는 4개월령 이전의 개 정소에서 유래한 정원줄기세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서, 상기 개의 정원줄기세포는 개의 정소 내 정원줄기세포 또는 체외 배양된 개의 정원줄기세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서, 상기 방법은 하기의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
(a) 생후 4개월령 이전의 개의 정소를 수득하는 단계;
(b) 상기 수득된 정소 조직에서 정소세포를 분리하는 단계;
(c) 상기 분리된 정소세포를 배양하는 단계; 및
(d) 상기 배양된 정소세포에 DAZL 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 C-kit 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 정원줄기세포를 확인 및 동정하는 단계.