KR102105483B1

KR102105483B1 - 테트라하이드로파파베린 및 il-6 억제제를 유효성분으로 포함하는 tnf-관련 질환 예방 또는 치료용 조성물 및 이를 이용한 tnf 활성 억제 방법

Info

Publication number: KR102105483B1
Application number: KR1020190132188A
Authority: KR
Inventors: 허태회; 신계정; 김희정; 박연화
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2019-10-23
Filing date: 2019-10-23
Publication date: 2020-04-28

Abstract

본 발명은 테트라하이드로파파베린 및 IL-6 억제제를 유효성분으로 포함하는 TNF-관련 질환 예방 또는 치료용 조성물 및 이를 이용한 TNF 활성 억제 방법에 관한 것으로, 본 발명에서는 TNF의 직접 결합제 및 억제제로 작용하는 테트라하이드로파파베린 및 IL-6의 억제제가 콜라겐 유도 관절염 모델에서 뼈 및 연골을 보호하고, 염증성 사이토카인을 감소시키며, Th17 세포의 분화, 섬유아세포 유사 활막세포의 증식 및 파골세포의 분화를 억제하는 것을 확인한 바, 상기 테트라하이드로파파베린 및 IL-6 억제제의 병용은 류마티스 관절염을 포함하는 TNF-관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물, TNF-관련 질환의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물 등으로 유용하게 활용될 수 있다.

Description

테트라하이드로파파베린 및 IL-6 억제제를 유효성분으로 포함하는 TNF-관련 질환 예방 또는 치료용 조성물 및 이를 이용한 TNF 활성 억제 방법{Composition for preventing or treating TNF-mediated diseases comprising tetrahydropapaverine and IL-6 inhibitor, and method for inhibiting TNF-activity with the same}

본 발명은 테트라하이드로파파베린 및 IL-6 억제제를 유효성분으로 포함하는 TNF-관련 질환 예방 또는 치료용 조성물 및 이를 이용한 TNF 활성 억제 방법에 관한 것이다.

류마티스 관절염(rheumatoid arthritis; RA)은 주로 관절 조직과 뼈에 영향을 미치는 만성 염증성 질환이다. 류마티스 관절염 환자의 관절에서 활막세포의 활성화는 IL-6, TNF 및 IL-1β를 포함하는 염증성 사이토카인의 생성을 증가시켜 연골과 뼈의 파괴를 유발한다. 상기 사이토카인 중 TNF는 주요한 전염증성 사이토카인으로 활막세포에서 IL-6, IL-8, GM-CSF 및 심지어 그 자체의 생성을 강력하게 유도한다.

현재, IL-17을 생성하는 Th17이 류마티스 관절염의 발병에 관여한다는 연구 결과가 보고되고 있다. 관절에서 IL-17의 억제 또는 과발현은 각각 관절염을 억제시키거나 악화시킬 수 있다. 건강한 대조군 및 류마티스 관절염 환자로부터 활성화된 단핵구는 시험관 내에서 IL-1β/TNF-α에 의존적으로 Th17 반응을 유도하고 류마티스 관절염의 염증 부위로부터 활성화된 단핵구는 세포 접촉에 의존적으로 증가된 Th17 반응을 유도하는 것으로 보고되었다. 마우스 콜라겐 유도 관절염 모델의 초기 단계에서 IL-17은 TNF-α에 의존하는 반면, 후기 단계에서 IL-17은 주도적이며, TNF-α 독립적으로 작용한다. 비록 류마티스 관절염의 기전이 명확하게 밝혀지지는 않았으나, Th17 반응과 IL-17 생산의 상향 조절이 중요한 역할을 하는 것으로 보고되고 있다.

TNF-α는 NF-κB 경로의 활성화를 통해 광범위한 전염증 특성을 나타내며, 류마티스 활막염에 결정적으로 관여하는 다면성 사이토카인이다. 예를 들어, TNF-α는 전염증성 사이토카인(IL-1, IL-6 등)과 케모카인(IL-8, MCP-1, MIP-1, RANTES 등)의 합성을 유도하여 대식세포를 활성화시켜 자가면역 병리학에서 전염증성 사이토카인 환경을 지속시킨다. 또한, TNF-α 수용체(TNFR1 및 TNFR2)를 통한 NF-κB의 활성화는 항-세포사멸 단백질을 상향 조절하여 염증 세포의 연장된 생존 및 지속적인 염증을 초래한다.

1988년에 활성화된 대식세포 또는 림프구에 의해 분비된 사이토카인인 TNF를 표적으로 하는 생물학적 제제가 개발되었다. 항-TNF 바이오 신약에는 etanercept(Enbrel), infliximab(Remicade), adalimumab(Humira) 등이 있고, 상이한 기전을 갖는 항염증성 바이오 신약 중 tocilizumab(Actemra)은 신호 전달을 차단하기 위해 IL-6 수용체에 결합하는 모노클로날 항체이며, Anakinra(Kineret)는 IL-1 수용체에 결합하는 길항제이다. 상기 바이오 신약은 단기간에 효과를 나타내지만 반복 주사 치료로 인한 잦은 병원 방문, 높은 저항력, 내성 면역 부작용, 고비용, 저온 저장 등의 단점을 가진다. 따라서, TNF에 직접 결합하여 류마티스 관절염과 같은 자가면역질환을 치료할 수 있는 소분자 화합물의 개발이 필요한 실정이다.

테트라하이드로파파베린(tetrahydropapaverine; THP)은 테트라하이드로이소 퀴놀린 중 하나로, 살소리롤(salsolinol) 및 테트라하이드로파파베롤린의 유사체이며, 도파민 뉴런에 신경 독성을 나타내는 것으로 알려져 있다. TNF 억제 효과 또는 자가면역질환 치료에 있어서 테트라하이드로파파베린의 효과는 아직까지 밝혀진 바가 없다.

대한민국 공개특허 제10-2012-0093534호 (2012.08.23. 공개)

본 발명의 목적은 TNF-관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 다른 목적은 TNF-관련 질환 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 TNF-관련 질환을 치료하는 방법을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 인 비트로(in vitro)에서 TNF 활성을 억제하는 시약 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 TNF 활성 억제 방법을 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 테트라하이드로파파베린(tetrahydropapaverine) 및 IL-6 억제제를 유효성분으로 포함하는 TNF-관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 테트라하이드로파파베린(tetrahydropapaverine) 및 IL-6 억제제를 유효성분으로 포함하는 TNF-관련 질환 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 테트라하이드로파파베린(tetrahydropapaverine) 및 IL-6 억제제를 약학적으로 유효한 양으로 처리하는 단계를 포함하는, TNF-관련 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 테트라하이드로파파베린(tetrahydropapaverine) 및 IL-6 억제제를 유효성분으로 포함하며, 인 비트로(in vitro)에서 TNF 활성을 억제하는 시약 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 사람을 제외한 동물에 테트라하이드로파파베린(tetrahydropapaverine) 및 IL-6 억제제를 처리하는 단계를 포함하는, TNF 활성 억제 방법을 제공한다.

본 발명에서는 TNF의 직접 결합제 및 억제제로 작용하는 테트라하이드로파파베린 및 IL-6의 억제제가 콜라겐 유도 관절염 모델에서 뼈 및 연골을 보호하고, 염증성 사이토카인을 감소시키며, Th17 세포의 분화, 섬유아세포 유사 활막세포의 증식 및 파골세포의 분화를 억제하는 것을 확인한 바, 상기 테트라하이드로파파베린 및 IL-6 억제제의 병용은 류마티스 관절염을 포함하는 TNF-관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물, TNF-관련 질환의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물 등으로 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 콜라겐 유도 관절염(CIA) 모델에서 THP 및 LMT-28의 치료 효과에 관한 것으로, (A)는 TNF-TNF 수용체 결합 ELISA를 이용한 천연 단일 화합물의 스크리닝, (B)는 테트라하이드로파파베린의 화학 구조, (C)는 TNF에 대한 THP의 직접 결합 활성, (D)는 LM 세포에서 THP의 TNF 특이적 중화 활성, (E)는 관절염 점수 및 발병률, (F)는 혈청 사이토카인 수준, (G)는 조직학적 이미지를 나타낸 결과이다.
도 2는 마우스 비장세포 및 인간 PBMC를 이용한 Th17 세포의 분화 및 기능에서 THP 및 LMT-28의 억제 효과에 관한 것으로, (A)는 마우스 비장세포 및 유세포 분석을 이용한 IL-17A의 발현, (B)는 ELISA 및 qRT-PCR을 이용한 IL-17A의 발현, (C)는 qRT-PCR을 이용한 RORγt의 발현, (D)는 인간 PBMC 및 유세포 분석을 이용한 IL-17A의 발현, (E)는 ELISA 및 qRT-PCR을 이용한 IL-17A의 발현, (F)는 qRT-PCR을 이용한 RORγt의 발현을 나타낸 결과이다.
도 3은 MH7A 세포에서 THP 및 LMT-28에 의한 세포 증식 억제 및 Hyper-IL-6/TNF 유도 신호 억제 효과에 관한 것으로, (A)는 MTT 분석을 이용한 세포의 증식 억제, (B)는 웨스턴 블랏을 이용한 단백질 발현을 나타낸 결과이다.
도 4는 RANKL 유도 파골세포 형성에서 THP 및 LMT-28에 의한 억제 활성을 나타낸 결과이다.

본 발명의 발명자들은 천연 단일 화합물 라이브러리에서 TNF 결합 스크리닝을 통해 테트라하이드로파파베린을 동정하였으며, 상기 테트라하이드로파파베린이 TNF에 결합하여 TNF 활성을 억제하는 것을 확인하였다. 더불어, 상기 테트라하이드로파파베린과 GP130에 결합하여 IL-6 신호를 억제하는 LMT-28을 병용 처리 시, 염증성 사이토카인의 분비, Th17 세포의 분화, Th17 세포와 관련된 분자의 발현, FLS 세포의 증식, 파골세포의 분화가 억제되어 류마티스 관절염을 개선시키는 것을 확인하며 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 테트라하이드로파파베린(tetrahydropapaverine) 및 IL-6 억제제를 유효성분으로 포함하는 TNF-관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 테트라하이드로파파베린은 종양괴사인자(TNF)에 직접 결합하여 TNF 활성을 억제할 수 있다.

상기 IL-6 억제제는 LMT-28, MDL-A, SC144, 랄록시펜(raloxifene) 및 바제독시펜(bazedoxifene)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

상기 LMT-28은 옥사졸리돈의 유도체로, IL-6 수용체 β 서브유닛인 당단백질 130(gp130)을 표적으로 하는 IL-6 길항제이다.

상기 MDL-A(madindoline A)는 메틸기에 결합된 디케토사이클로펜텐(diketocyclopentene)을 갖는 fuloindoline 구조를 가지며, gp130에 결합하는 것으로 알려져 있다.

상기 SC144는 구강 활성 소분자 gp130 억제제로, gp130에 결합하여 gp130 인산화 및 탈당화(deglycosylation)를 유도하는 것으로 알려져 있다.

상기 랄록시펜은 2세대 선택적 에스트로겐 수용체 조절제이며, 상기 바제독시펜은 3세대 선택적 에스트로겐 수용체 조절제로, IL-6/gp130 상호작용 억제제이다.

상기 TNF-관련 질환은 자가 면역 질환, 염증성 질환, 심혈관 질환, 대사성 질환, 면역 장애, 신경 질환, 안과 질환, 피부 질환, 정신 질환, 감염 질환 및 암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

상세하게는, 상기 TNF-관련 질환은 류마티스 관절염, 소아류마티스관절염, 염증성 장질환, 크론병, 궤양성 대장염, 건선, 판상건선, 소아판상건선, 건선성관절염, 다관절형소아특발성관절염, 베체트장염, 강직성척추염, 축성척추관절염, 소아골부착부위염관련관절염, 류마티스다발근통, 다발성경화증, 갑상선염, 지연과민증, 알레르기, 접촉성피부염, 아토피성피부염, 전신성홍반루푸스, 전신경화증, 성인형스틸병, 천식, 자가면역성갑상선장애, 쇼그렌증후군, 가와사키병, 췌장염, 신장염, 간염, 폐렴, 만성폐쇄성폐질환, 중이염, 맥관증식신염, 골수형성이상증후군, 골관절염, 유육종증, 고리육아종, 베게너육아종증, 낭창, 용혈성요독증후군, 동맥경화증, 혈관염, 심부전, 뇌졸중, 심근경색, 심근허혈-재관류손상, 성기능장애, 비만, 고혈압, 당뇨병 및 당뇨합병증, 고지혈증, 자간전증, 신장병, 간장병, 신장 손상, 간손상, 뱀교상, 동종이식거부, 장기이식, 이식편대숙주병, 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 근위축성측색경화증, 통증, 중추신경계질환, 포도막염, 베체트병, 당뇨황반부종, 황반변성, 안와병증, 녹내장, 화농성한선염, 다중심성망상조직구증식증, 모공성홍색비강진, 호산구성근막염, 지방층염, 당뇨병성유지방성괴사생성, 흉터유사천포창, 괴저성농피증, 스위트증후군, 각질하농포성피부증, 피부경화증, 호중구성피부염, 독성표피괴사융해, 농포성피부염, 피부근염, 다발근육염, 물집피부병, 결절홍반, 탈모증, 우울증, 양극성장애, 불안장애, 결핵, 바이러스감염, 박테리아감염, 진균감염, 원충감염, 뇌말라리아, 패혈증, 패혈성 쇼크, 전립선암, 피부암, 대장암, 신장암, 췌장암, 난소암, 유방암, 방광암, 전립선암, 림프종, 교종, 골육종, 백혈병, 다발성골수종 및 악액질로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

상기 조성물은 TNF, IL-6 및 IL-1β의 발현을 감소시킬 수 있고, Th17의 분화, 섬유아세포 유사 활막세포의 증식 및 파골세포의 분화를 억제시킬 수 있다.

본 발명의 조성물이 약학 조성물인 경우, 투여를 위하여, 상기 기재한 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 상세하게는 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 고형 제제는 상기 유효성분 외에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 과제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로솔, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 시간에 따라 다르지만, 당 업자에 의해 적절하게 선택될 수 있는 바, 상기 조성물의 일일 투여량은 바람직하게는 0.001 mg/kg 내지 50 mg/kg이며, 필요에 따라 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.

본 발명의 조성물이 건강식품 조성물인 경우, 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일 주스, 합성 과일 주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 건강식품 조성물은 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 차, 기능수, 드링크제, 알코올 및 비타민 복합제 중 어느 하나의 형태일 수 있다.

또한, 상기 건강식품 조성물은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, 식품첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품안전처에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반 시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 식품첨가물공전에 수재된 품목으로 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산 칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성품, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고랭색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류 첨가 알칼리제, 보존료제제, 타르색소 제제 등의 혼합 제제류 등을 들 수 있다.

이때, 건강식품 조성물을 제조하는 과정에서 식품에 첨가되는 본 발명에 따른 조성물은 필요에 따라 그 함량을 적절히 가감할 수 있다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 마우스

6주령 수컷 DBA/1J 또는 C57BL/6 마우스는 Orientbio(Gyeonggi-do, Korea)에서 구입하였다. 마우스는 12시간 명/암 주기, 온도(22 ± 3℃) 및 습도(40-60%)가 조절된 환경에서 사육하였으며, 식이 및 물은 자유롭게 섭취할 수 있게 하였다. 마우스는 1주일의 순응 기간을 거친 후 실험에 사용하였다. 모든 동물실험은 가톨릭대학교 동물실험윤리위원회(IACUC)가 승인한 프로토콜(허가번호: 2016-018-02)을 준수하였다.

실시예 2: 콜라겐 유도 관절염 동물모델 제작 및 약물 주사

콜라겐 유도 관절염(collagen-induced arthritis; CIA)은 하기와 같이 유도되었다. 간략하게, 소 타입 II 콜라겐(CII)(Chondrex, ES) 및 Complete Freund’s adjuvant(Sigma, US) 50 μg를 꼬리 기저에 피내 주사하였다. 2주 후, CII 및 Incomplete Freund’s adjuvant(Sigma, US) 50 μg를 피내 주사하여 부스팅하였다. LMT-28(1 mg/kg), THP(5 mg/kg), 이의 병용 또는 비히클 대조군(10% DMSO가 포함된 증류수)은 첫 면역 후 CIA 마우스(N = 10)에 주 6회 경구 투여하였다.

실시예 3: CIA의 임상 관절염 점수 평가

마우스의 4개 발에서 관절염의 중증도는 하기의 방법을 이용하여 3명의 맹검 관찰자에 의해 평가되었다. 앞발 및 뒷발의 관절염의 중증도는 첫 면역 후 0 내지 70일 사이에 주 2회 평가하였다: 0 = 정상 발, 1 = 1개의 발에 염증이 있고 부어오름, 2 = 1~3개의 발에 염증이 있고 부어오름, 3 = 발 전체에 염증이 있고 부어오름, 4 = 염증이 심하고 부어오르거나 유착된 발. 각 마우스의 관절염 점수는 4개 발의 관절염 중증도의 합으로 나타내었다. 가장 높은 점수는 16점이다.

실시예 4: 조직학적 분석

뒷발을 절개하고 10% 포름산으로 21일 동안 탈석회 과정을 수행하였다. 탈석회 후, 표본을 파라핀에 포매시킨 후 조직 절편을 제작하였다. 조직 절편은 탈파라핀 후 재수화시킨 다음, 헤마톡실린 & 에오신, 또는 사프라닌 O로 염색하였다.

실시예 5: 생체 외 마우스 Th17 세포 분화

naive 마우스를 희생시킨 후, 비장을 적출하여 단일세포로 분리하였다. 이후 세포를 얼음 위에 놓고 3분 동안 RBC 용해 완충액(Thermo, US)과 반응시켰다. PBS로 세척한 후, 마우스 CD4 MACS 마이크로비드(MiltenyiBiotec, Germany)를 사용하여 naive CD4⁺ T 세포를 분리하였다.

마우스 Th17 분화 키트(R&D system, US)를 사용하여 마우스 비장세포에 대한 생체 외 실험을 수행하였다. naive CD4⁺ T 세포(1 X 10⁶ 세포/ml)를 마우스 Th17 분화 배지에 현탁시켰다. 부유 세포(1 X 10⁵ 세포/웰)를 96 웰 플레이트(Gibco, US)에 접종하고 미리 코팅된 햄스터 항-CD3 마우스 항체로 자극시켰다. 이들 세포를 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 3일 동안 배양하였다. 3일째에 동일한 부피의 새로운 마우스 Th17 분화 배지를 첨가하여 Th17 분화 배지를 교체하고, 2일 동안 추가 배양하였다. 이후, 세포 및 배양 상층액을 회수하고, 수집된 세포는 유세포 분석을 이용하여 Th17 세포 분화 여부를 측정하였다. 또한, 배양 상층액은 IL-17A ELISA 키트(Biolegend, US)를 사용하여 마우스 IL-17A 분비를 측정하였다.

실시예 6: 인간 말초혈액 단핵세포(PBMC)에서 CD4 ⁺ T 세포 분리 및 Th17 세포 분화

건강한 기증자 3명의 시료는 적십자로부터 제공받았으며, TrimaAccel 자동 혈액 수집 시스템을 사용하여 혈액을 수집하였다. 키트에 부착된 LRS(Leukoreduction system) 챔버는 상용화 제품을 구입하여 사용하였다. LRS 챔버에 연결된 input 및 output 튜브는 알코올로 멸균하고 절단하여 사용하였다. 세포를 50 ml 튜브에 넣고, 동량의 2% 우태아혈청(FBS, Corning, US)이 포함된 인산완충식염수(PBS, Welgene)를 첨가하였다. 이어서 SepMateTM-50 튜브(STEMCELL technology, Canada)에 Ficoll-Poque^TM PLUS ratio 1.077(GE Healthcare, US) 15 ml을 첨가하고, 그 위에 LRS 챔버로 분리된 15 ml의 세포를 포개어 넣었다. 브레이크 오프 상태에서 1200 g로 20분 동안 원심분리한 후, 말초혈액 단핵세포를 새로운 50 ml 튜브로 옮겼으며, 2% FBS가 포함된 PBS로 2회 세척하였다.

인간 PBMC를 얼음 위에 놓고 5분 동안 RBC 용해 완충액(Thermo, US)과 반응시켰다. PBS로 세척한 후, 인간 CD4 MACS 마이크로비드(MiltenyiBiotec, Germany)를 사용하여 naive CD4⁺ T 세포를 분리하였다. 인간 Th17 분화 키트(R&D system, US)를 사용하여 PBMC에 대한 생체 외 실험을 수행하였다. 수집된 세포는 유세포 분석을 이용하여 Th17 세포 분화 여부를 측정하였다. 또한, 배양 상층액은 IL-17A ELISA 키트(Biolegend, US)를 사용하여 인간 IL-17A 분비를 측정하였다.

실시예 7: 생체 외 IL-17A 분비 분석

ELISA 플레이트를 마우스 또는 인간 IL-17A 포획 항체가 포함된 PBS로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 코팅 후, 플레이트를 PBST(0.05% 트윈-20이 포함된 PBS)로 세척하고, 1% BSA가 포함된 PBS와 상온에서 진탕하면서 1시간 동안 반응시켜 블로킹하였다. PBST로 세척한 후, PBSA(1% BSA가 포함된 PBS)로 희석된 배양 상층액을 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 4℃에서 진탕하면서 밤새 반응시켰다. 세척 후, 1X 검출 항체를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 상온에서 진탕하면서 1시간 동안 반응시켰다. PBST로 세척한 후, 검출 항체(avidin-HRP)를 첨가하고 플레이트를 상온에서 진탕하면서 1시간 동안 반응시켰다. 세척 후, TMB 용액을 각 웰에 첨가하고 플레이트를 실온에서 진탕하면서 반응시켰다. 이후, 정지 용액(2N HCl)을 각 웰에 첨가하고, 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

실시예 8: 효소면역분석법

CIA 마우스에서 TNF, IL-6 및 IL-1β 분비를 확인하기 위해, CIA 실험 70일째에 마우스로부터 혈청을 채취하였다. ELISA 플레이트(Nunc, Denmark)를 1X 마우스 TNF, IL-6 또는 IL-1β 포획 항체가 포함된 PBS로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 코팅 후, 플레이트를 PBST(0.05% 트윈-20이 포함된 PBS)로 세척하고, 1% BSA가 포함된 PBS와 상온에서 진탕하면서 1시간 동안 반응시켜 블로킹하였다. PBST로 세척한 후, PBSA(1% BSA가 포함된 PBS)로 희석된 배양 상층액을 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 4℃에서 진탕하면서 밤새 반응시켰다. 세척 후, 1X 검출 항체를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 상온에서 진탕하면서 1시간 동안 반응시켰다. PBST로 세척한 후, 검출 항체(avidin-HRP)를 첨가하고 플레이트를 상온에서 진탕하면서 1시간 동안 반응시켰다. 세척 후, TMB 용액을 각 웰에 첨가하고 플레이트를 실온에서 진탕하면서 반응시켰다. 이후, 정지 용액(2N HCl)을 각 웰에 첨가하고, 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

실시예 9: 유세포 분석

수집된 마우스 또는 인간 Th17 세포를 ep 튜브에 넣고 원심분리한 후 PBS로 세척하였다. 세척 후, 단일세포를 1X stimulation cocktail 및 1X monensin과 37℃에서 4시간 동안 자극시켰다. 자극된 세포를 원심분리하고, 항-마우스 또는 인간 CD4-PEcy7 염색 완충액과 빛 차단 하에 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. 세척 후, 시료에 fixation/permeabilization 용액을 첨가하고 빛 차단 하에 4℃에서 18시간 동안 반응시켰다. 세척 후, 세포를 항-마우스 또는 인간 IL-17A-PE가 포함된 1X permeabilization 용액과 빛 차단 하에 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. FACS 완충액으로 세척한 후, 세포를 FACS 완충액에 재현탁시키고 유세포 분석기로 세포를 분석하였다.

실시예 10: 정량적 실시간 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR) 분석

qRT-PCR은 ABI StepOnePlus Real-Time PCR 시스템(Applied Biosystems, US)에서 SYBR® Green 실시간 PCR 키트(Mbiotech, Korea)를 사용하여 수행하였다. 유전자의 발현 수준은 GAPDH로 정규화하여 분석하였다.

실시예 11: 세포 배양

MH7A 인간 류마티스 관절염 활막세포는 Cho YY 교수(Catholic University, Korea)로부터 제공받았다. MH7A 세포는 10% FBS, 페니실린(최종 농도, 100 U/ml), 스트렙토마이신(최종 농도, 0.1 mg/ml) 및 L-글루타민이 포함된 RPMI 1640 배지(Corning)를 이용하여 37℃, 5% C0₂ 배양기에서 배양하였다.

LM 세포는 마우스 섬유아세포(fibroblast)로 Kim TS 교수(Korea university, Korea)로부터 제공받았다. LM 세포는 10% FBS, 페니실린(최종 농도, 100 U/ml), 스트렙토마이신(최종 농도, 0.1 mg/ml)이 포함된 DMEM 배지(Welgene)를 이용하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다.

실시예 12: 세포 생존율 분석

세포 증식을 측정하기 위해, 세포(1 X 10⁴ 세포/200 μl/웰)를 96 웰 플레이트에 접종하고, 일반 배지를 첨가하여 72시간 동안 배양하였다. 이후, tetrazolim salt WST-1[2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium]-based EZ-cytox 용액(Daeillab, Korea)을 사용하여 제조사에서 제공한 프로토콜에 따라 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 간략하게, 20 μl의 EZ- cytox 용액을 각 웰에 첨가하고, 37℃, 5% C0₂ 배양기에서 1시간 동안 배양한 후, 450 nm에서 즉시 흡광도를 측정하였다.

실시예 13: TNF 중화 활성 분석

TNF에 대한 독성 중화 활성을 측정하기 위해, 세포(5 X 10⁴세포/100 μl/웰)를 96 웰 플레이트에 접종하고, 일반 배지를 사용하여 Actinomycin-D(AD) 0.5 μg/ml, AD+TNF 20 ng/ml, AD+TNF+THP(200 μM부터 1 nM까지 1/2씩 희석)를 처리한 후, 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 이후, thiazolyl blue tetrazolium bromide(MTT, 5 mg/ml, Sigma, US)를 각 웰 당 10 μl씩 첨가하고 4시간 동안 추가 배양하였다. 이후, 상층액을 제거하고 200 μl의 DMSO를 각 웰에 첨가한 후 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

실시예 14: 파골세포 형성 분석

골수 유래 대식세포(bone marrow derived macrophage; BMM)는 M-CSF(20 ng/mL)가 포함된 α-MEM 배지에서 4일 동안 배양하였다. 이어서 BMM에 M-CSF, M-CSF + RANKL(40 ng/mL), LMT-28, THP 및 이의 병용으로 3일 동안 처리한 후, 동일한 농도가 포함된 α-MEM 배지로 교체하여 2일 동안 추가 배양하였다. 이후, 제조사에서 제공한 프로토콜에 따라 TRACP 단일-염색 키트(Takara Bio, Japan)로 세포를 염색하였다. 3개 이상의 핵을 가지는 TRAP⁺ 세포를 성숙한 파골세포로 계산하였다.

실시예 15: 웨스턴 블랏 분석

MH7A 세포를 6 웰 플레이트에 5 X 10⁵ 세포/웰 농도로 접종하였다. 세포 용해물을 8% SDS-PAGE 겔에서 분리한 후 PVDF 막으로 이동시켰다. 막을 superblock 용액으로 1시간 동안 블로킹시킨 후, p-STAT3(Cell Signaling Technology, CST, US), STAT-3, p-ERK, ERK, p-gp130(Santacruz, US)에 대한 1차 항체와 4℃에서 밤새 반응시켰다. 이후, 막을 HRP가 접합된 2차 항체와 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 막을 세척하고 ECL 시약(Thermo, US)을 처리한 후 화학 발광 신호를 Chemidoc(Bio-Rad, US)로 시각화하여 발현을 분석하였다.

실험예 1: 천연 단일 화합물에서 TNF-TNF 수용체의 결합을 억제하는 소분자 화합물 검출

TNF-TNF 수용체 사이의 결합을 억제하는 소분자 화합물을 검출하기 위해, TNF 경쟁 분석으로 스크리닝을 수행하였다. 플레이트를 TNF로 코팅한 후 TNFR2-Fc(etanercept, Enbrel)를 라이브러리의 각 천연 소분자 화합물과 동시에 첨가하여 TNF에 대한 경쟁적 결합을 유도하고, 대조군과 비교하여 OD 감소를 통해 TNF와 결합된 TNFR2를 검출하였다. TNF 경쟁 분석을 이용하여, 천연 단일 화합물 라이브러리(502 유형)를 스크리닝하였다. 도 1A와 같이, 두 가지 스크리닝 과정을 통해 TNF 표적 소분자 화합물인 THP를 동정하였으며, THP의 화학 구조는 도 1B에 나타내었다.

결합 동역학을 측정하기 위해, biacore T200을 사용하여 SPR 분석을 수행하였다. 도 1C와 같이, THP는 CM5 칩에 고정화된 TNF에 대해 농도 의존적이고 특이적으로 포화 결합된 센서그램을 나타내었고, 결합 친화도(KD) 값은 1.663E^-5였다. THP의 TNF 결합이 TNF의 시험관 내 세포독성을 억제할 수 있는지 여부를 평가하였다. 악티노마이신 D, TNF 및 THP를 마우스 섬유아세포인 LM 세포주에 처리하여 세포 독성을 유도하였다. 그 결과, 도 1D와 같이, THP는 농도 의존적으로 TNF의 세포독성을 차단하고, THP의 IC50 값은 0.4 μM임을 확인하였다.

실험예 2: CIA 모델에서 THP 및 LMT-28에 의한 증상 억제 효과

CIA 동물 모델에서 THP 및 LMT-28의 병용 치료 효과를 평가하기 위해, 2차 면역 후 비히클, THP(5 mg/kg), LMT-28(1 mg/kg) 또는 이의 조합을 매일 경구 투여하였다. 그 결과, 도 1E와 같이, 비히클이 투여된 군에 비해 THP 또는 LMT-28이 투여된 군에서 관절염 점수 및 발병률이 유의하게 감소하고, 특히, 단독 투여보다 THP 및 LMT-28이 병용 투여된 군에서 관절염 점수 및 발병률이 더 효과적으로 감소하는 것을 확인하였다.

다음으로, 비히클, THP, LMT-28 또는 이의 조합이 투여된 마우스의 혈청으로부터 염증성 사이토카인 분비를 평가하였다. 그 결과, 도 1F와 같이, 비히클이 투여된 군에 비해 THP 또는 LMT-28이 투여된 군에서 IL-6, TNF 및 IL-1β의 수준이 유의하게 감소하고, 특히, 단독 투여보다 THP 및 LMT-28이 병용 투여된 군에서 IL-6, TNF 및 IL-1β의 수준이 더 효과적으로 감소하는 것을 확인하였다.

또한, 뒷다리 관절을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하여 조직학적 분석을 수행한 결과, 도 1G(상부)와 같이, THP 및 LMT-28이 병용 투여된 군에서 활막 증식증, 판누스 형성, 연골 손상 및 뼈의 침식이 약화되는 것을 확인하였고, 사프라닌-O로 염색한 결과, 도 1G(하부)와 같이, 연골 손실이 방지되는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 3: THP 및 LMT-28에 의한 마우스 및 인간 Th17 세포의 분화 및 기능 억제 효과

분화/활성화된 Th17 세포는 염증성 사이토카인인 IL-17A를 분비하고, 분비된 IL-17A는 관절 조직의 활막 섬유아세포에 영향을 미쳐 염증 반응을 유발하는 것으로 알려져 있다.

이에, 마우스 비장세포 및 인간 PBMC를 사용한 Th17 세포 분화에서 THP 및 LTM-28의 병용 효과를 평가하였다. 그 결과, 도 2A 및 도 2B와 같이, 마우스 비장세포에서, THP 및 LMT-28의 병용은 단독에 비하여 Th17 세포의 분화를 더 유의하게 억제하고, Th17 세포에 의해 분비된 IL-17A 단백질 및 mRNA의 발현을 더 효과적으로 감소시키는 것을 확인하였다. 또한, 도 2C와 같이, Th17 관련 분자인 RORγT의 mRNA 발현에서도 더 효과적인 감소를 나타내었다.

마찬가지로, 도 2D 및 도 2E와 같이, 인간 PBMC에서, THP 및 LMT-28의 병용은 단독에 비하여 Th17 세포의 분화를 더 유의하게 억제하고, Th17 세포에 의해 분비된 IL-17 단백질 및 mRNA의 발현을 더 효과적으로 감소시키는 것을 확인하였다. 또한, 도 2F와 같이, Th17 관련 분자인 RORγT의 mRNA 발현에서도 더 효과적인 감소를 나타내었다.

실험예 4: 류마티스 관절염의 섬유아세포 유사 활막세포에서 THP 및 LMT-28에 의한 세포 증식 및 IL-6 신호 전달 억제 효과

THP 및 LMT-28의 병용이 류마티스 관절염의 섬유아세포 유사 활막세포(fibroblast like synoviocyte; FLS)의 증식을 억제할 수 있는지 여부를 평가하기 위해, 인간 류마티스 관절염 환자의 FLS 세포주인 MH7A 세포를 사용하여 MTT 분석을 수행하였다. 그 결과, 도 3A와 같이, THP 및 LMT-28의 병용이 단독에 비하여 MH7A 세포의 증식을 더 유의하게 억제하는 것을 확인하였다.

또한, Hyper-IL-6(IL-6/sIL-6R 융합 단백질) 및 TNF를 사용하여 THP 및 LMT-28의 병용이 IL-6 신호 경로를 억제하는지 여부를 평가하기 위해, 류마티스 관절염 FLS를 사용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다. 그 결과, 도 3B와 같이, THP 및 LMT-28 병용에 의해 gp130, STAT3 및 ERK의 인산화가 효과적으로 억제되는 것을 확인하였다.

실험예 5: THP 및 LMT-28에 의한 파골세포 분화 억제 효과

염증성 사이토카인인 IL-1, TNF, IL-17 및 IL-6은 활막 세포에서 RANKL의 발현 및 합성을 조절하고, RANKL은 파골세포의 활성화 및 분화를 촉진하며, 파골세포의 재흡수를 증가시키는 것으로 알려져 있다.

마우스 BMM에서 naive M-CSF 및 RANKL은 파골세포 형성을 유도하는데, 도 4A와 같이, THP 및 LMT-28의 병용에 의해 파골세포 분화가 억제되는 것을 확인하였다.

또한, TRAP, Nfatc1 및 c-fos를 포함한 파골세포 특이 유전자의 mRNA 수준을 분석하여 파골세포 분화에서의 분자 메커니즘을 측정하였다. 그 결과, 도 4B와 같이, LMT-28 및 THP 병용에 의해 TRAP 발현이 감소하고, LMT-28에 의해 Nfatc1 및 c-fos 발현이 감소하는 것을 확인하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

테트라하이드로파파베린(tetrahydropapaverine) 및 LMT-28을 유효성분으로 포함하는, 자가 면역 질환, 염증성 질환, 심혈관 질환, 대사성 질환, 면역 장애, 신경 질환, 안과 질환, 피부 질환, 정신 질환, 감염 질환 및 암으로 이루어진 군에서 선택되는 TNF-관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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제 1항에 있어서, 상기 TNF-관련 질환은 류마티스 관절염, 소아류마티스관절염, 염증성 장질환, 크론병, 궤양성 대장염, 건선, 판상건선, 소아판상건선, 건선성관절염, 다관절형소아특발성관절염, 베체트장염, 강직성척추염, 축성척추관절염, 소아골부착부위염관련관절염, 류마티스다발근통, 다발성경화증, 갑상선염, 지연과민증, 알레르기, 접촉성피부염, 아토피성피부염, 전신성홍반루푸스, 전신경화증, 성인형스틸병, 천식, 자가면역성갑상선장애, 쇼그렌증후군, 가와사키병, 췌장염, 신장염, 간염, 폐렴, 만성폐쇄성폐질환, 중이염, 맥관증식신염, 골수형성이상증후군, 골관절염, 유육종증, 고리육아종, 베게너육아종증, 낭창, 용혈성요독증후군, 동맥경화증, 혈관염, 심부전, 뇌졸중, 심근경색, 심근허혈-재관류손상, 성기능장애, 비만, 고혈압, 당뇨병 및 당뇨합병증, 고지혈증, 자간전증, 신장병, 간장병, 신장 손상, 간손상, 뱀교상, 동종이식거부, 장기이식, 이식편대숙주병, 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 근위축성측색경화증, 통증, 중추신경계질환, 포도막염, 베체트병, 당뇨황반부종, 황반변성, 안와병증, 녹내장, 화농성한선염, 다중심성망상조직구증식증, 모공성홍색비강진, 호산구성근막염, 지방층염, 당뇨병성유지방성괴사생성, 흉터유사천포창, 괴저성농피증, 스위트증후군, 각질하농포성피부증, 피부경화증, 호중구성피부염, 독성표피괴사융해, 농포성피부염, 피부근염, 다발근육염, 물집피부병, 결절홍반, 탈모증, 우울증, 양극성장애, 불안장애, 결핵, 바이러스감염, 박테리아감염, 진균감염, 원충감염, 뇌말라리아, 패혈증, 패혈성 쇼크, 전립선암, 피부암, 대장암, 신장암, 췌장암, 난소암, 유방암, 방광암, 전립선암, 림프종, 교종, 골육종, 백혈병, 다발성골수종 및 악액질로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 TNF-관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 TNF, IL-6 및 IL-1β의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 TNF-관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 Th17의 분화, 섬유아세포 유사 활막세포의 증식 및 파골세포의 분화를 억제하는 것을 특징으로 하는 TNF-관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
테트라하이드로파파베린(tetrahydropapaverine) 및 LMT-28을 유효성분으로 포함하는, 자가 면역 질환, 염증성 질환, 심혈관 질환, 대사성 질환, 면역 장애, 신경 질환, 안과 질환, 피부 질환, 정신 질환, 감염 질환 및 암으로 이루어진 군에서 선택되는 TNF-관련 질환 예방 또는 개선용 건강식품 조성물.
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테트라하이드로파파베린(tetrahydropapaverine) 및 LMT-28을 유효성분으로 포함하며, 인 비트로(in vitro)에서 TNF 활성을 억제하는 시약 조성물.
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