KR102092467B1 - 신속 면역크로마토그래피법을 이용한 보툴리눔 독소 진단·탐지 키트 및 이를 위한 특이항체와 항체생산세포주 - Google Patents

신속 면역크로마토그래피법을 이용한 보툴리눔 독소 진단·탐지 키트 및 이를 위한 특이항체와 항체생산세포주 Download PDF

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Abstract

본 발명은 보툴리눔 신경독소 A형 또는 B형 특이적인 단일클론 항체, 상기 보툴리눔 독소 A형 인지항체를 생산하는 신규한 세포주 rHccA 1e 32-1 (기탁번호 KCLRF-BP-00423) 또는 rHccA 1g 42-3 (기탁번호 KCLRF-BP-00424), 보툴리눔 독소 B형 인지항체를 생산하는 신규한 세포주 rHccB 1j 36-1 (기탁번호 KCLRF-BP-00430), 및 이를 이용한 보툴리눔 신경독소 A형 및 B형 탐지용 면역 크로마토그래피 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 보툴리눔 신경독소에 대하여 우수한 민감도를 나타내고 다른 병원체 및 방해물질에 대하여 교차반응을 나타내지 않는다.

Description

신속 면역크로마토그래피법을 이용한 보툴리눔 독소 진단·탐지 키트 및 이를 위한 특이항체와 항체생산세포주 {Botulinum toxin diagnostic detection kit using rapid immunochromatography, its specific antibody and antibody-producing cell lines}
본 발명은 보툴리눔 독소 A형 또는 B형의 인지항체, 상기 보툴리눔 독소 A형 인지항체를 생산하는 신규한 세포주 rHccA 1e 32-1 (기탁번호 KCLRF-BP-00423) 또는 rHccA 1g 42-3 (기탁번호 KCLRF-BP-00424), 보툴리눔 독소 B형 인지항체를 생산하는 신규한 세포주 rHccB 1j 36-1 (기탁번호 KCLRF-BP-00430), 및 상기 항체를 포함하고 민감도와 특이도가 개선된 보툴리눔 독소 탐지용 면역 크로마토그래피 키트에 관한 것이다.
보툴리눔 독소증의 병원체는 아포를 형성하는 편성 혐기성 (obligatory anaerobe) 간균인 보툴리누스균(Clostridium botulinum, C. botulinum)이다. 상기 균의 아포는 전 세계적으로 토양이나 농산물에서 흔히 발견된다. 보툴리눔 독소들은 C. botulinum에서 생산되는 분자량 150kDa 정도의 단백질이며, 기도로 흡입되거나 음식물을 통하여 위장관으로 흡수되어 근육마비증상을 일으킨다.
보툴리눔 독소는 현재까지 알려진 물질 중 사람에게 가장 독성이 강하다고 알려져 있으며, LD50은 0.001㎍/kg으로 측정된다. 보툴리눔 독소 A는 가장 잘 알려진 유기인 신경작용제인 VX보다 15,000배, 사린보다 100,000배나 더 강한 독성을 나타낸다. 이 독소는 공기 중에서 12시간 내에 비활성화되고, 장시간의 햇빛 노출 또는 열처리로 불활화할 수 있다.
흡입에 의한 보툴리눔 독소증은 노출 후 24~36시간, 또는 수 일이 지난 후 증세가 나타난다. 영장류에 대한 최근의 연구 결과에 따르면 독소를 투여하거나 다량 흡입한 경우에는 증상이 빨리 나타나지만, 소량 흡입한 경우에는 수 일이 지난 후 증세가 나타난다는 사실이 밝혀졌다. 가장 두드러진 초기 증상은 구근 마비로, 발음장애(dysarthria), 발성장애(dysphonia), 연하장애(dysphagia)가 나타난다. 아울러 동공확대에 따른 시야 흐림(blurred vision), 복시증(diplopia), 수명(photophobia), 안검하수 등과 같은 안과 증세가 나타난다. 이어서 골격근 마비가 나타나기 시작하여 대칭성, 하행성, 진행성 약화를 보이다가 급작스럽게 호흡부전를 나타내기도 한다. 증상이 시작되어 호흡부전에 이르기까지 걸리는 시간은 음식물에 의한 중독의 경우 24시간 이내일 수 있다.
음식매개 보툴리눔 독소증의 진단은 혈청, 대변, 위 흡입액이나 원인 식품에서 보툴리눔 독소를 검출하거나 위액 또는 대변에서 C. botulinum을 배양하여 이루어진다. 환자 혈청을 쥐의 복강에 주사한 후 마비나 사망이 발생하는 것으로 진단하는 방법도 있다. 아포는 어느 곳에나 분포하기 때문에 식품에서 세균을 검출하는 것만으로는 충분하지 않다. 외상성 보툴리눔 독소증의 진단은 혈청에서 독소의 검출, 상처에서 원인균 배양을 통해 이루어지며, 영아 보툴리눔 증독증은 환자의 대변에서 원인균과 독소를 검출함으로써 이루어진다.
보툴리눔 독소증으로 인한 사망원인은 대개 호흡부전이므로 즉시 입원이 필요하다. 또한, 외상성 보툴리눔 독소증 환자에게는 항독소 투여 이외에도 상처의 괴사 조직을 제거하고 페니실린을 투여한다.
동물 실험에서 독소에 노출된 후 항독소 투여가 예방효과가 있는 것으로 알려져 있다. 그러나 현재 사람에 관한 자료는 없으므로 항독소를 예방 목적으로 사용하는 것은 어려운 실정이다.
이와 같이 보툴리눔 독소를 이용한 생물테러 의심상황 발생 시 현장에서 신속 탐지할 수 있는 기술의 개발은 테러상황 유무를 신속하게 판단하고 대응정책 결정을 위해 매우 중요하다. 이를 위하여 본 발명자는 보툴리눔 독소의 현장 검출을 위한 면역크로마토그래피 기술 기반 신속 탐지키트를 개발하고자 하였다.
본 발명의 목적은 생물테러 의심상황 등에서 신속한 대응을 위해, 보툴리눔 독소 현장 검출을 위한 보툴리눔 독소 탐지키트를 제공하는 것이다. 이를 위하여 본 발명은 보툴리눔 독소 A형 또는 B형의 인지항체, 상기 보툴리눔 독소 A형 인지항체를 생산하는 신규한 세포주 rHccA 1e 32-1 (기탁번호 KCLRF-BP-00423) 또는 세포주 rHccA 1g 42-3 (기탁번호 KCLRF-BP-00424), 보툴리눔 독소 B형 인지항체를 생산하는 신규한 세포주 rHccB 1j 36-1 (기탁번호 KCLRF-BP-00430), 및 이를 이용한 보툴리눔 독소 탐지용 면역 크로마토그래피 키트를 제공한다.
본 발명은 보툴리눔 독소 A형 또는 B형을 특이적으로 인지하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체를 제공한다.
상기 보툴리눔 독소 A형을 특이적으로 인지하는 단일클론 항체는 기탁번호 KCLRF-BP-00423로 기탁된 세포주 rHccA 1e 32-1 또는 기탁번호 KCLRF-BP-00424로 기탁된 세포주 rHccA 1g 42-3에 의하여 생성되는 것을 특징으로 한다.
상기 보툴리눔 독소 B형을 특이적으로 인지하는 단일클론 항체는 기탁번호 KCLRF-BP-00430로 기탁된 세포주 rHccB 1j 36-1에 의하여 생성되는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 보툴리눔 독소 A형 인지항체를 생산하는 기탁번호 KCLRF-BP-00423로 기탁된 세포주 rHccA 1e 32-1 또는 기탁번호 KCLRF-BP-00424로 기탁된 세포주 rHccA 1g 42-3에 관한 것이다.
본 발명은 또한 보툴리눔 독소 B형 인지항체를 생산하는 기탁번호 KCLRF-BP-00430로 기탁된 세포주 rHccB 1j 36-1에 관한 것이다.
구체적으로 본 발명은 (i) 보툴리눔 독소 A 또는 B의 염기서열을 도입하여 대장균 발현벡터를 합성한 후 대장균(XL1-Blue)에 형질전환하여 항원을 발현시키는 단계; (ii) 상기 항원을 마우스에게 주입하여 면역을 진행한 후 마우스의 비장을 획득하는 단계; (iii) 상기 비장에서 수득한 B 림프구와 미엘로마(Myeloma) 세포를 융합하는 단계; 및 (iv) 상기에서 수득된 세포를 선별하는 단계를 포함하는 방법으로 제조된 세포주에 관한 것이다.
본 발명은 상기 단일클론 항체를 포함하는 보툴리눔 독소 A형 및 B형 탐지키트에 관한 것이다. 상기 키트에서 단일클론 항체는 나이트로셀룰로스 멤브레인에 코팅될 수 있다.
상기 키트는 검체패드 및 흡습패드 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 기탁번호 KCLRF-BP-00423로 기탁된 세포주 rHccA 1e 32-1 또는 기탁번호 KCLRF-BP-00424로 기탁된 세포주 rHccA 1g 42-3에 의하여 생성되고, 보툴리눔 독소 A형을 특이적으로 인지하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체; 및 기탁번호 KCLRF-BP-00430로 기탁된 세포주 rHccB 1j 36-1에 의하여 생성되고 보툴리눔 신경독소 B형을 특이적으로 인지하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체를 포함하고, 보툴리눔 독소 A형 및 B형를 동시에 탐지할 수 있는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 신경독소의 다중 탐지키트를 제공한다.
본 발명은 기존의 보툴리눔 독소 A형 및 B형 탐지키트에 사용되는 항체보다 감도와 특이도가 우수한 항체를 제공함으로써 보다 신속하고 정확하게 보툴리눔 독소 A형 및 B형을 탐지 및 검출할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 항체를 이용한 탐지키트는 종래의 제품과 비교하여 월등하게 우수한 민감도를 가지며, 타 병원체 및 독소 등에 대한 교차반응이 없어 매우 우수한 특이도를 갖는다.
도 1a는 기존 상용화된 탐지키트(제품명: 생물테러 병원체 및 독소 다중 탐지키트 9, 제조사: 주식회사 에스디)와 보툴리눔 A 독소에 대한 본 발명의 탐지키트의 감도를 비교평가한 결과이다.
도 1b는 보툴리눔 B 독소에 대한 본 발명의 탐지키트의 감도를 평가한 결과이다.
도 2는 특이도 평가를 위하여 균체 및 독소 9종에 대한 교차반응 유무를 비교 평가한 결과이다.
도 3은 탐지키트가 방해물질에 대한 영향을 받는지 여부를 시험한 결과이다.
도 4는 탐지키트의 재현성을 평가하기 위해 각 항목별 20회의 감도 및 특이도 시험을 실시한 결과이다.
본 발명에서 사용되는 모든 용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다.　 또한 본 명세서에는 바람직한 방법, 시료 등이 기재되어 있으나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다.　
본 발명에서 용어, "항체(antibody)"란 항원과 특이적으로 결합하는 단백질이며, 본 발명의 목적상 보툴리눔 독소 A형 또는 B형에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체이다.
본 발명에서 "재조합 벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 유전자를 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하고, 바람직하게는 플라스미드 벡터일 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서와 같은 발현조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함할 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.
구체적 태양에서, 본 발명은 기탁번호 KCLRF-BP-00423로 기탁된 세포주 rHccA 1e 32-1 또는 기탁번호 KCLRF-BP-00424로 기탁된 세포주 rHccA 1g 42-3에 의하여 생성되는 보툴리눔 독소 A형 특이적 단일클론 항체 또는 기탁번호 KCLRF-BP-00430로 기탁된 세포주 rHccB 1j 36-1에 의하여 생성되는 보툴리눔 독소 B형에 특이적인 단일클론 항체에 관한 것이다.
기탁번호 KCLRF-BP-00423, 기탁번호 KCLRF-BP-00424및/또는 기탁번호 KCLRF-BP-00430의 하이브리도마 세포주에서 생산되는 항체는 기존의 보툴리눔 독소 검출키트에 사용된 항체보다 항원에 대한 친화도가 높은 신규한 항체이다. 항원에 대해 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포주는 표준 기술에 따라 대량으로 배양할 수 있다. 상기한 하이브리도마 세포주가 생산하는 단일클론 항체는 정제하지 않고 사용할 수도 있으나, 당업계에 널리 공지된 방법에 따라 고순도로 정제하여 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명은 상기한 항체를 포함하는 보툴리눔 독소 A형 및 B형 다중 탐지 키트에 관한 것이다. 상기의 항체를 포함하는 키트를 이용하여 생물테러 의심상황에서 보툴리눔 독소 A형 및 B형의 현장 검출을 신속하게 할 수 있다.
이러한 탐지키트에는 본 발명의 단일클론 항체뿐만 아니라 면역학적 분석에 사용되는 당해 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함될 수 있다. 이러한 도구 및 시약은 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제, 완충제 및 안정화제 등을 포함되나 이에 제한되지 않는다.
적합한 담체로는, 가용성 담체, 예를 들어 당해 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리 에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
항원-항체 복합체 형성은 조직면역 염색, 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법 (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), 웨스턴 블럿팅(Western Blotting), 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산 분석법 (Immunodiffusion Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS 및 단백질 칩(protein chip)에 의해 제조될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정할 수 있도록 하는 라벨에는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다.
검출 라벨로 이용가능한 효소는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시퍼라제, 포스포 프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트, 데카복실라제, β-라타마제 등을 포함하며, 이에 제한되지 않는다.
형광물은 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등을 포함하며, 이에 제한되지 않는다.
리간드는 바이오틴 유도체 등을 포함하고, 발광물은 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라제 등을 포함하며, 이에 제한되지 않는다.
미소입자는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등을 포함하며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 키트에서, 상기 단일클론 항체는 통상의 탐지키트의 재료로 사용되는 멤브레인에 코팅된 것일 수 있으며, 멤브레인은 나이트로 셀룰로스, 셀룰로우즈, 셀룰로우즈 아세테이트, 폴리에틸렌 등의 각종 합성 중합체를 사용할 수 있다.
본 발명자는, 멤브레인 종류별(제조사별, pore size 별) 및 검사선용 항체 농도별 시험을 실시하여 감도 및 특이도가 높은 멤브레인 및 항체 농도를 선별하였다. 그 결과 본 발명품 키트는 나이트로셀룰로스 멤브레인에 검사선과 대조선 위치 부위에 항원 특이적 단일클론 항체 및 대조선용 항체를 각각 코팅하였다.
본 발명은 검체 패드 시험을 통해 소, 마우스 혈청과 같은 동물 혈청 처리를 통해 비특이 반응을 제거하며 BSA, Casein등과 같은 안정제 등으로 전처리하여 선별 조건에 최적화된 패드 조성을 선별하였다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] - 보툴리눔 신경독소(BoNT) 재조합 항원의 제조
항체 개발을 위한 면역원 조사 및 준비를 위해 [유전자변형생물체의 국가 간 이동 등에 관한 법률]에 의거하여 보툴리눔은 유전자변형 생물체 실험 및 개발 국가승인 심사를 통해 승인 받았으며, 모든 실험과정은 신고된 생물안전 연구시설에서 생물안전 운영지침을 준수하여 실시하였다.
보툴리눔균(Clorostridium botulinum)에서 생성된 신경독소인 보툴리눔 신경독소 A 및 B(Botulinum neurotoxin A 및 B, 이하 BoNT/A, BoNT/B)의 유전자가 도입된 재조합 항원 발현벡터들을 제조하고자 해당 유전자합성을 진행하였다.
합성된 유전자는 신경독소부위 중 C-말단 수용체 결합 부위(Heavy chain C: Binding domain)로 cloning 작업을 위해 5', 3'에 각각 BamHI과 SalI restriction enzyme site를 추가하여 복제가 가능한 플라스미드(plasmid) 형태로 합성하였다.
합성된 유전자는 XL1-Blue에 형질 전환하여 다량 확보 후, 제한효소로 처리하여 대장균 발현벡터에 접합시켰다. 이렇게 얻은 재조합 항원 발현 벡터는 XL1-Blue에 형질 전환시킴으로써 위의 항원을 발현시키는 대장균을 얻었다. 단백질 발현에 사용되는 시작코돈, 종결코돈은 벡터 내에 존재하는 것으로 대체하였다.
BoNT/A의 경우 1227bp, BoNT/B의 경우 1260bp의 염기서열로 이루어져 있다.
[실시예 2] - 보툴리눔 신경독소(BoNT) 재조합 항원 생산 및 정제
클로닝이 확인된 형질전환체는 LB배지에서 37℃, 220rpm으로 배양하였으며, OD600에서 흡광도 값이 0.5일 때, IPTG(Isopropyl β- D -1-thiogalactopyranoside)로 induction하고 27℃, 220rpm에서 24시간동안 단백을 과발현 하였다. 정제를 위해 배양액에서 상층액을 제외한 펠렛은 sonication하여 파쇄하였다. 원심 후, 불용성 단백질을 6M 구아니딘(guanidine)으로 용해시켜 Ni-affinity 정제를 진행하였으며 신경독소 A 및 B는 각각 약 45.4kDa (BoNT/A) 및 46.6kDa (BoNT/B)에 해당하는 단일 밴드의 단백질 Fraction을 모아서 20mM Carbonate buffer (pH9.6)으로 투석하여 면역원으로 사용하였다.
[실시예 3] - 단일클론 항체 제조
1. 면역 및 세포 융합
단일클론 항체 제조를 위해 재조합 항원을 Freund's adjuvant로 emulsion을 만든 후 마우스에 면역하였다. 마우스 면역량은 10~100㎍/dose의 농도로 1~2주 간격으로 4~8회 복강면역을 진행하였고, 세포 융합 1~3일 전에 항원을 미정맥으로 접종하였다.
세포 융합 하루 전에 미정맥으로 전채혈을 실시하여 단일클론 항체의 ELISA 검사시 사용하였다. 세포 융합에 사용할 비장은 무균조건 하에서 채취하여 폴리에틸렌글리콜(PEG 1500 시약)을 이용하여, 미엘로마(myeloma) 세포와의 세포 융합을 유도한 후 HAT 배지 및 HT 배지에서 세포 배양하였다.
2. 스크리닝, 복수생산 및 항체 정제
96 well에 배양된 융합 세포는 ELISA에 의한 1차 및 2차 스크리닝을 통하여 교차반응이 없는 양성 클론을 선별하였다. 그 결과 얻어진 세포주를 2018.04.17. 자로 한국세포주은행에 기탁하였다 (기탁번호 KCLRF-BP-00423, 기탁번호 KCLRF-BP-00424또는 기탁번호 KCLRF-BP-00430). 이들 세포주를 마우스 복강 접종하여 복수 생산을 하였다. 복강 접종 10~20일 후 복강 내 복수가 생산되면 마우스 당 약 2~4㎖의 복수를 채취하였다. 채취한 복수는 원심분리로 혈구 및 피브린 등을 제거하고 이를 정제에 사용하였다. 마우스 복수 정제는 Protein G chromatography gel을 이용하여 protein G에 특이적인 항체인 마우스 IgG를 정제하였다. 마우스 IgM은 특이적인 gel affinity chromatography 방법을 사용하지 않고, 투석 및 DEAE gel 정제 방법으로 IgM을 정제하여 제제화에 사용하였다. 정제된 단일클론 항체 후보군은 골드(gold)를 이용한 스크리닝으로 선별하였다.
[실시예 4] - 보툴리눔 신경독소 A/B 다중 탐지키트의 제조
한 개의 키트의 서로 다른 위치에 보툴리늄 독소 A에 특이적인 항체 및 보툴리늄 독소 B에 특이적인 항체를 코팅하여 한 개의 키트에서 두 개의 타입이 구분되어 검출될 수 있도록 개발하였다.
나이트로셀룰로스 멤브레인의 검사선과 대조선 위치에 선별된 항원 특이적 항체 및 대조선용 항체를 각각 코팅하였다. 선별된 항체를 접합한 금접합체를 패드에 분주하여 건조한 후 절단하여 골드패드를 제조하였다. 라미네이터를 이용하여 플라스틱 카드에 멤브레인, 골드패드, 검체패드, 흡습패드를 부착하여 키트를 제조하였다.
[시험예 1] - 감도(검출한계) 시험
보툴리눔 신경독소의 검출 한계를 시험하기 위하여, 보툴리눔 신경독소의 농도를 희석하면서 감도 평가를 실시하였다. 기존 상용화된 SD 탐지 키트(제품명: 생물테러 병원체 및 독소 다중 탐지키트 9, 제조사: 주식회사 에스디)와 실시예 4에서 제조된 탐지키트의 감도 비교평가를 실시하여, 보툴리늄 독소 A 및 B의 감도시험 결과를 도 1a 및 1b에 나타내었다.
도 1a에 나타낸 바와 같이, 보툴리늄 독소 A에 대해 총 10회 반복 시험한 결과 실시예 4의 탐지키트의 검출한계가 6ng/ml로 측정되어, 기존 제품 50 ng/ml 대비 감도가 8배 개선되었음을 확인할 수 있었다.
또한, 도 1b에 나타낸 바와 같이, 보툴리늄 독소 B에 대해 총 10회 반복 시험한 결과 실시예 4의 탐지키트의 검출한계가 12ng/ml로 측정되어 높은 감도를 가지는 것을 확인할 수 있었다.
[시험예 2] - 특이도 시험 1
특이도 평가를 위하여 리신, 브루셀라 등 균주 및 독소 9종에 대한 교차 반응(cross reactivity)을 평가하였으며, 그 결과를 하기 표 1 및 도 2에 나타내었다.
항목 농도 보툴리늄 독소 A/B 검출키트 반응
1 페스트균 5X106 cfu/ml 음성
2 리신 1ug/ml 음성
3 야토균 1X108cfu/ml 음성
4 탄저균 1X107cfu/ml 음성
5 보툴리늄 독소 A 400ng/ ml 양성
보툴리늄 독소 B 400ng/ ml 양성
6 브루셀라균 1X108cfu/ml 음성
7 콜레라균 O1 1X107cfu/ml 음성
콜레라균 0139 1X108cfu/ml 음성
8 SEB 1ug/ml 음성
9 유비저 균 1X108cfu/ml 음성
10 두창바이러스 1X107pfu/ml 음성
상기 표 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 다른 검체와의 교차 반응이 발생하지 않음을 확인할 수 있었다.
[시험예 3] - 특이도 시험 2
상기 시험예 2의 9종의 균주 및 독소 이외의 다른 균주 및 독소와의 교차반응 여부를 확인하기 위해 하기 표 2에 개시된 27종의 균주(>1x108 cfu/ml) 또는 독소물질(>100ng/ml)과의 교차반응 시험을 실시하였다. 하기 표 2에 나타낸 바와 같이, 교차반응 시험 균주 및 물질 27종에 대하여 교차반응이 나타나지 않음을 확인하였다.
Figure 112018090396538-pat00001
[시험예 4] - 방해물질 시험
소혈청, 사람 혈청, 설탕, 밀가루, 집먼지 등과 같은 탐지 키트의 성능에 영향을 미칠 수 있는 예상 저해(방해)물질을 선정하여 특이도 테스트를 진행하여, 방해물질의 영향 유무를 확인하였다.
상기 실험결과를 하기 표 3 및 도 3에 나타내었다.
항목 검체 농도
음성 양성 양성
독소 A 독소 B 독소 A 200ng 독소 B 200ng 독소 A 50ng 독소 B 50ng
미처리 음성 음성 양성 양성 양성 양성
소 혈청
(Normal calf serum 10%)		 음성 음성 양성 양성 양성 양성
사람 혈청
(Normal human serum 10%)		 음성 음성 양성 양성 양성 양성
소 알부민(Bovine seum alboumin 10%) 음성 음성 양성 양성 양성 양성
설탕 (Sucrose 10%) 음성 음성 양성 양성 양성 양성
애 기분 (Skim milk 10%) 음성 음성 양성 양성 양성 양성
베이킹파우더 10% 음성 음성 양성 양성 양성 양성
밀가루 10% 음성 음성 양성 양성 양성 양성
세제 10% 음성 음성 양성 양성 양성 양성
집먼지 1% 음성 음성 양성 양성 양성 양성
토양 20% 음성 음성 양성 양성 양성 양성
상기 표 3 및 도 3에 나타낸 바와 같이, 10종의 방해물질로부터 방해 작용을 받지 않음을 확인하였다(도3).
[시험예 5] - 재현성 시험
실시예 4에서 제조된 탐지키트가 재현성이 있는지 확인하기 위해 총 20회의 감도 및 특이도 시험을 진행하였다. 감도 시험을 위해서는 양성 검출 한계 농도에서, 특이도 시험을 위해서는 검체희석액을 음성검체로 하여 실험하였다.
상기 실험결과를 도 4에 나타내었으며, 모두 재현성이 있는 것으로 확인되었다.
[시험예 6] - 가속 안정성 시험
실시예 4에서 제조된 탐지키트의 유효기간 설정을 위해, 키트를 55℃, 7주간 보관한 후 1주차 간격으로 꺼내 실온 보관한 키트와의 감도 및 특이도 비교시험을 실시하였다.
감도 시험을 위해서는 양성 검출 한계 농도에서, 특이도 시험을 위해서는 검체희석액을 음성 검체로 하여 실험을 진행하였다. 실험결과 7주간의 가속 안정성 시험 이후에도 감도와 특이도 모두 이상 없음을 확인하였다.
기탁기관명 : 한국세포주연구재단
수탁번호 : KCLRFBP00423
수탁일자 : 20180417
기탁기관명 : 한국세포주연구재단
수탁번호 : KCLRFBP00424
수탁일자 : 20180417
기탁기관명 : 한국세포주연구재단
수탁번호 : KCLRFBP00430
수탁일자 : 20180417

Claims (9)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 기탁번호 KCLRF-BP-00423로 기탁된 세포주 rHccA 1e 32-1 또는 기탁번호 KCLRF-BP-00424로 기탁된 세포주 rHccA 1g 42-3에 의하여 생성되고, 보툴리눔 독소 A형을 특이적으로 인지하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체; 또는
    기탁번호 KCLRF-BP-00430로 기탁된 세포주 rHccB 1j 36-1에 의하여 생성되고 보툴리눔 신경독소 B형을 특이적으로 인지하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
  4. 기탁번호 KCLRF-BP-00423로 기탁된 세포주 rHccA 1e 32-1, 기탁번호 KCLRF-BP-00424로 기탁된 세포주 rHccA 1g 42-3 또는 기탁번호 KCLRF-BP-00430로 기탁된 세포주 rHccB 1j 36-1.
  5. 삭제
  6. 제3항의 단일클론 항체를 포함하는 보툴리눔 신경독소의 탐지키트.
  7. 제6항에 있어서, 상기 단일클론 항체는 나이트로셀룰로스 멤브레인에 코팅된 것을 특징으로 하는 보툴리눔 신경독소의 탐지키트.
  8. 제6항에 있어서, 검체패드 및 흡습패드 중 하나 이상을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 신경독소의 탐지키트.
  9. 기탁번호 KCLRF-BP-00423로 기탁된 세포주 rHccA 1e 32-1 또는 기탁번호 KCLRF-BP-00424로 기탁된 세포주 rHccA 1g 42-3에 의하여 생성되고, 보툴리눔 독소 A형을 특이적으로 인지하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체; 및
    기탁번호 KCLRF-BP-00430로 기탁된 세포주 rHccB 1j 36-1에 의하여 생성되고 보툴리눔 신경독소 B형을 특이적으로 인지하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체를 포함하고, 보툴리눔 독소 A형 및 B형를 동시에 탐지할 수 있는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 신경독소의 다중 탐지키트.
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