KR102071731B1 - 갑상선 자극 호르몬 조성물 - Google Patents

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Abstract

갑상선 자극 호르몬(TSH)의 조성물로, 이때 적어도 하나의 폴리알킬렌 글리콜 고분자가 TSH의 탄수화물 부위에 부착된 조성물이 본 출원에 기술된다. 또한, 돌연변이된 갑상선 자극 호르몬(TSH) 및 적어도 하나의 폴리알킬렌 글리콜 고분자의 조성물로서, 이때, 돌연변이된 TSH는 하나 이상의 아미노산 잔기가 시스테인 잔기로 치환되었으며, 폴리알킬렌 글리콜 고분자는 치환된 시스테인 잔기 부위에서 돌연변이된 TSH에 부착된 조성물이 기술된다. 이러한 TSH 조성물을 포함하는 약학적 조성물 및 환자에 유효량의 약학적 조성물을 투여함으로써, 필요로 하는 환자에서 갑상선 병태를 치료하는 방법 또한 기술된다.

Description

갑상선 자극 호르몬 조성물{THYROID STIMULATING HORMONE COMPOSITIONS}
본 발명은, 갑상선 자극 호르몬 조성물에 관한 것이다.
갑상선 암은 갑상선으로부터 유래된 세포들의 성장이 제어되지 않는 질병들의 집합이다. 갑상선 암은 흔히 유두상암, 소포 암 및 휘르트레 세포암을 포함하는 분화 갑상선 암, 및 수질 암 및 역형성 암을 포함하는 기타 갑상선 암으로 분류된 바 있다. 시간이 지남에 따라 일부 분화 갑상선 암은 덜 고분화성이 되어, 탈분화 또는 저분화 암으로 분류될 수 있다. 환자에 대한 갑상선 자극 호르몬(TSH) 투여는 갑상선종 및 갑상선 암을 포함하는 다양한 갑상선 질병에 대한 진단적 또는 치료적 접근법에서 중요한 역할을 할 수 있다. 이러한 질병의 경우, 투여된 TSH의 약동학 프로파일은 진단 또는 치료 절차의 최적의 성과에 중요할 수 있다.
타이로젠(THYROGEN®) 갑상선 자극 호르몬(겐자임(Genzyme Corp.), NDA 2-898)으로 유통되는 재조합 인간 TSH(rhTSH)는 며칠간 연속하여 다중 주사로 투여되고, 3일과 5일차에 RAI 투여와 종양 진단을 위한 채혈이 이어진다. TSH의 상대적으로 짧은 작용기간 때문에 이러한 엄격한 투여 계획이 필요하게 되었고, 이는 또한 효능 감소와 부작용을 초래한다. 오랜 작용기간을 나타내는 TSH 조성물이라면 아마도 다양한 갑상선 질병의 치료와 검출을 개선하고 부작용을 감소시킬 것이다.
PCT 특허공보 WO 2005/056046, PCT 특허공보 WO 2004/009672, 및 미국 특허 제4,179,337호.
따라서, TSH 분비의 약동학을 최적화하고 다중 주사의 필요성을 감소시키는 개선된 TSH 함유 조성물에 대한 요구가 존재한다.
본 발명은 생체 내에서 TSH 작용기간을 연장하는, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 (하나 이상의) 폴리알킬렌 글리콜 고분자와 콘쥬게이트된 갑상선 자극 호르몬(TSH)의 조성물에 관한 것이다. 추가적으로, 본 발명은 돌연변이 TSH의 조성물에 관한 것으로, 이때, TSH는 폴리알킬렌 글리콜 고분자와 콘쥬게이트될 수 있는 추가적인 부위를 도입하도록 돌연변이된 것이다. 본 출원에 기술된 본 발명의 TSH 조성물은 약학적 조성물을 제조하는 데 유용하고, 갑상선 병태를 앓는, 필요로 하는 환자의 치료에 이용될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 본 발명은 TSH를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 이때, 적어도 하나의 폴리알킬렌 글리콜 고분자는 TSH의 탄수화물 부위에 부착된다. 특정 양태에서, 이러한 조성물의 TSH는 포유동물로부터, 예를 들어, 인간으로부터 분리되거나, TSH는 재조합 포유동물 TSH, 예를 들어, 재조합 인간 TSH(rhTSH)이다.
특정 구현예에서, TSH의 탄수화물 부위는 아미노산 위의 시알산으로, 예를 들어, rhTSH α 서브유닛의 아스파라긴 잔기 ASN52, rhTSH α 서브유닛의 ASN78, 또는 rhTSH β 서브유닛의 ASN23 및 이의 조합이다.
또 다른 구현예에서, TSH 위의 탄수화물 부위는 아미노산, 예를 들어, 아스파라긴 위의 갈락토오스이다. 특정 구현예에서, 갈락토오스 기는 TSH 위의 부위에, 예를 들어, rhTSH α 서브유닛의 아미노산 ASN52, rhTSH α 서브유닛의 아미노산 ASN78, 또는 rhTSH β 서브유닛의 아미노산 ASN23 및 이의 조합 위의 부위에 위치한다.
본 발명의 관련된 양태에서, 본 발명의 조성물은 대조군에 비해 증진된 T4 반응을 나타낸다.
본 발명의 다른 관련된 양태에서, TSH의 탄수화물 부위에 부착된 폴리알킬렌 글리콜 고분자는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다. 특정 구현예에서, PEG는 약 3,000 내지 약 100,000달톤 사이의 평균 분자량을 나타낸다. 다른 구현예에서, 하나 또는 둘 이상의 선형 또는 가지형 PEG 분자는 TSH에 부착된다.
본 발명의 또 다른 관련된 구현예에서, 돌연변이된 갑상선 자극 호르몬(TSH) 및 적어도 하나의 폴리알킬렌 글리콜 고분자를 포함하는 조성물로서, 이때, 돌연변이된 TSH는 하나 이상의 아미노산 잔기가 시스테인 잔기로 치환되고, 폴리알킬렌 글리콜 고분자는 시스테인 잔기에서 돌연변이된 TSH에 부착되며, 돌연변이된 TSH는 생물학적으로 활성이 있는 조성물이 기술된다.
특정 구현예에서, 시스테인으로 치환된 아미노산 잔기는 TSH의 알파 서브유닛 상에 위치한다. 구체적인 구현예에서, 시스테인으로 치환된 아미노산 잔기는 ASN52, ASN78, MET71, ASN66, THR69, 및 GLY22, 및 이의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 재조합 인간 TSH의 아미노산 위치에 위치한다.
또 다른 구현예에서, 시스테인으로 치환된 아미노산 잔기는 TSH의 베타 서브유닛 상에 위치한다. 구체적인 구현예에서, 시스테인으로 치환된 아미노산 잔기는 ASN23, VAL118, THR21, GLU63, 및 ASP56, 및 이의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 재조합 인간 TSH의 아미노산 위치에 위치한다. 특정 양태에서, 시스테인 변경으로 돌연변이된 TSH는 폴리알킬렌 글리콜 고분자로서 부착된 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 가지고 있다. 구체적인 구현예에서, PEG는 약 3,000 내지 약 100,000달톤의 평균 분자량을 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 하나 또는 둘 이상의 선형 또는 가지형 PEG 분자들 또는 이들의 조합은 TSH에 부착된다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 효과적인 치료적 양의 본 발명의 조성물을, 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 포함하는 약학적 조성물이 기술된다.
이러한 약학적 조성물은 필요로 하는 환자에 유효량의 본 발명의 약학적 조성물을 투여함으로써 환자의 갑상선 병태를 치료하는 방법에 이용된다. 구체적인 구현예에서, 갑상선 병태는 갑상선 암이다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 근육 내 주사로 전달된다.
또한, 본 발명은 적어도 하나의 폴리알킬렌 글리콜 고분자를 TSH의 탄수화물 부위에 부착시키는 단계를 포함하는, 페길화된, 생물학적으로 활성이 있는 갑상선 자극 호르몬(TSH)의 생산방법에 관한 것이다.
또 다른 관련된 양태에서, 본 발명은 (a) 하나 이상의 추가적인 시스테인 잔기를 TSH의 아미노산 서열로 도입하여, 돌연변이된 TSH를 생성하는 단계; (b) 하나 이상의 폴리알킬렌 글리콜 고분자를 (a) 단계에서 도입된 하나 이상의 시스테인 잔기에 부착시켜, 페길화된, 생물학적으로 활성이 있는 돌연변이된 TSH를 생성하는 단계를 포함하는, 페길화된, 생물학적으로 활성이 있는 갑상선 자극 호르몬(TSH)의 생산방법에 관한 것이다. 구체적인 구현예에서, 시스테인 잔기는 TSH의 내인성 아미노산 잔기를 대신한다.
또한, 본 발명은 페길화된, 생물학적으로 활성이 있는 갑상선 자극 호르몬(TSH) 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 필요로 하는 대상자에서 갑상선 병태를 치료하는 방법에 관한 것이다.
상이한 도면들에 걸쳐 유사한 참조 부호가 동일한 부분을 지칭하는 첨부된 도면에 제시된 바와 같이, 이상의 내용은 다음과 같은 본 발명의 예시적인 구현예의 더욱 구체적인 설명으로부터 명백해질 것이다. 도면은 반드시 일정한 비율로 그려지지는 않았으며, 그 대신 본 발명의 구현예를 예시하는 데에 주안점을 둔 것이다.
도 1a 및 도 1b는 N 말단, 리신 아미노산 잔기 및 천연 탄수화물 부위에 페길화 표적들이 있는 TSH 서브유닛의 구조적인 모형을 나타내는 선형(도 1a) 및 3차원(도 1b)의 개략도이다.
도 2a 내지 도 2d는 리신- 및 N-말단의 페길화 반응이다. 상이한 PEG:단백질 비율의 리신 페길화의 페길화 반응 혼합물의 SDS-PAGE 분석 결과를 도 2a(쿠마시 블루 염색) 및 도 2b(PEG 염색)로 나타내었다. 1:1 PEG:단백질 비율의 반응 혼합물을 네모로 강조하였고, 이를 SEC-HPLC로 더 분석하였다(도 2c). 도 2d는 2:1 PEG:단백질 비율의 N 말단 페길화 반응의 SEC-HPLC 프로파일이다.
도 3은 세 가지의 상이한 탄수화물 페길화 경로를 나타내는 개략도이다.
도 4는 선택된 돌연변이의 베타 탄소 위치를 나타내는 구조적 모형이다.
도 5는 돌연변이의 발현 수준 및 올리고머화를 평가하기 위한 은이 염색된 비 환원 SDS-PAGE이다.
도 6은 세 개의 시스테인 부위 지정 돌연변이의 페길화를 나타내는 겔이다.
도 7은 돌연변이 TSH의 여러 페길화 반응의 SEC-HPLC 프로파일의 일련의 크로마토그램이다.
도 8a 및 도 8b는 αG22C TSH 페길화 상태의 최적화이다.
도 9a 및 도 9b는 G22C TSH에 대한 서브유닛 특이적인 및 부위 특이적인 콘쥬게이션을 확인한 것이다.
도 10a 내지 도 10d는 탄수화물 페길화 반응 혼합물과 정제된 탄수화물 페길화 rhTSH 콘쥬게이트의 SDS-PAGE 분석 결과이다. 다양한 (PEG:단백질) 몰 비율의 GAM(+) 및 GAM(-) 반응 혼합물을 각각 도 10a와 도 10b에 나타내었다. 정제된 탄수화물 페길화 rhTSH 콘쥬게이트를 도 10c(PEG 염색) 및 도 10d(쿠마시 블루 염색)에 나타내었다.
도 11a 및 도 11b은 40kD SAM 반응 혼합물의 SEC-HPLC 프로파일(도 11a) 및 정제된 탄수화물 페길화 rhTSH 콘쥬게이트의 SEC-HPLC 프로파일(도 11b)이다.
도 12는 정제된 모노페길화 40kD SAM 콘쥬게이트의 트립신 분해 펩티드 지도 및 실시예 10에 설명된 수집된 페길화 트립신 분해 펩티드의 N 말단 시퀀싱 결과이다.
도 13a 내지 도 13c는 실시예 11에 설명된 바와 같이, 정제된 탄수화물 페길화 rhTSH 콘쥬게이트 각 서브유닛 상의 상대적인 페길화 양을 결정한 것이다.
도 14a 내지 도 14c는 다양한 크기의 PEG가 있는 페길화 SAM, GAM(+), GAM(-)의 수용체 결합 분석법의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 15는 실시예 13에 설명된 바와 같이, rhTSH 대조군과 비교한 시간 경과에 따른 T4 수준(㎍/dL)에 미치는 영향을 나타내는 다양한 페길화 TSH의 약력학 데이터 그래프이다.
도 16은 실시예 13에 설명된 바와 같이, 대조군과 비교한 시간 경과에 따른 혈청에서의 다양한 페길화 TSH의 농도를 나타내는 그래프이다.
도 17은 실시예 14에 설명된 바와 같이, 대조군과 비교한 시간 경과에 따른 혈청에서의 다양한 페길화 TSH의 농도를 나타내는 그래프이다.
도 18a 내지 도 18d는 실시예 16에 설명된 바와 같이, 대조군과 비교한 시간 경과에 따른 다양한 페길화 TSH에 대한 혈청에서의 T4의 농도를 나타내는 그래프이다.
도 19a 내지 도 19c는 실시예 17에 설명된 바와 같이, 대조군과 비교한 시간 경과에 따른 40kD SAM의 상이한 용량에 대한 혈청에서의 T4의 농도를 나타내는 그래프이다.
도 20a 및 도 20b는 실시예 18에 설명된 바와 같이, 대조군과 비교한 시간 경과에 따른 다양한 페길화 TSH에 대한 혈청에서의 T4 농도를 나타내는 그래프이다.
도 21a 내지 도 21f는 실시예 19에 설명된 바와 같이, 대조군과 비교한 시간 경과에 따른 다양한 페길화 TSH에 대한 혈청에서의 T4 농도를 나타내는 그래프이다.
도 22는 실시예 19에 설명된 바와 같이, 대조군과 비교한 시간 경과에 따른 다양한 페길화 TSH에 대한 혈청에서의 T4 농도를 나타내는 그래프이다.
도 23은 실시예 20에 설명된 바와 같이, 시간 경과에 따른 10kD 다중SAM 및 40kD SAM에 대한 혈청에서의 T4 농도를 나타내는 그래프이다.
도 24는 실시예 21에 설명된 바와 같이, 대조군과 비교한 시간 경과에 따른 40kD SAM 및 40kD G22C에 대한 혈청에서의 T4 농도를 나타내는 그래프이다.
타이로젠(THYROGEN®)갑상선 자극 호르몬(겐자임(Genzyme Corp.), NDA 2-898)은 갑상선 암의 진단 및/또는 치료를 위해 현재 유통되는 재조합 인간 TSH(rhTSH)이다. 타이로젠은 근육 내 투여 전에 물과 재구성시키기 위한 동결 건조된 분말로서 판매되고 있다.
그러한 기존의 TSH 제형은 엄격한 투여 계획을 가지고 있고, 다중 주사를 필요로 하며, 제한된 약동학 프로파일을 나타내고, 오심과 같은 부작용을 낳는다. 이러한 단점들은 본 발명의 TSH 조성물 및 돌연변이된 TSH 조성물로 해결된다. 주사 빈도를 줄이고, 유연성 있는 투여 계획을 제공하며, 치료 지수를 향상시키고, 갑상선 조직을 자극하는 데 더 우수한 효능을 나타내는, 더 오래 작용하는 갑상선 자극 호르몬(TSH) 조성물이 본 출원에 기술된다. 또한, TSH의 오랜 반감기 및 T4 방출의 증가된 지속기간을 포함하는 기타 효능 특성들이 본 발명의 더 오래 작용하는 TSH 조성물에 의해 긍정적으로 영향을 받는다.
본 출원에 나타난 바와 같이, 폴리알킬렌 글리콜 고분자, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜의 TSH에 대한 콘쥬게이션은 TSH의 약동학 프로파일 및 약력학 프로파일을 유익하게 변경시켰다. 아래에 더욱 상세히 기술된 바와 같이, TSH의 N 말단 페길화, 리신 페길화, 및 탄수화물 고분자 부착을 연구하였다. TSH의 N 말단 페길화는 더 오랜 작용기간을 나타내는 TSH를 가져오지만, TSH의 리신 페길화 및 탄수화물 페길화는 TSH 효능의 심각한 감소를 가져오리라고 예상되었다. 본 출원에 기술된 연구 결과는 TSH의 탄수화물 페길화는 TSH의 효능에 긍정적인 영향을 미치고, TSH의 N 말단 페길화와 리신 페길화는 TSH의 효능을 크게 감소시킴을 보여준다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 갑상선 자극 호르몬(TSH)을 포함하는 조성물로서, 적어도 하나의 폴리알킬렌 글리콜 고분자가 TSH의 탄수화물 부위에 부착되는 조성물을 대상으로 한다. 또한, TSH의 효능에 긍정적인 영향을 초래하는 페길화를 목표로 한 시스테인 잔기를 도입하도록 돌연변이된, TSH의 부위 특이적인 페길화도 본 출원에 나타내었다. 따라서, 또 다른 양태에서, 본 발명은 돌연변이된 갑상선 자극 호르몬(TSH) 및 적어도 하나의 폴리알킬렌 글리콜 고분자를 포함하는 조성물로서, 이때, 돌연변이된 TSH는 하나 이상의 아미노산 잔기가 시스테인 잔기로 치환되었고 폴리알킬렌 글리콜 고분자가 시스테인 잔기에서 돌연변이된 TSH에 부착되며 돌연변이된 TSH는 생물학적으로 활성을 나타내는 TSH를 포함하는 조성물을 대상으로 한다. 본 출원에 제공된 페길화 TSH 조성물은 폴리에틸렌 글리콜 고분자에 콘쥬게이트되지 않은 TSH에 비해, 하나 이상의 다음과 같은 향상된 치료 지수 효과를 나타낸다: 증진된 용해도, 감소된 단백질 가수분해, 감소된 면역원성, 감소된 신장 청소율, 연장된 혈액 순환 수명, 증가된 작용기간 및 변경된 분포 및 흡수.
TSH는 알파 서브유닛과 베타 서브유닛의 두 개의 서브유닛을 가지고 있는 당 단백질이다. α(알파) 서브유닛(즉, 융모성 생식선 자극 호르몬 알파)은 인간 융모성 생식선 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 및 여포 자극 호르몬(FSH)의 그것과 동일하다. β(베타) 서브유닛은 TSH에 독특하고, 그 기능을 결정한다.
rhTSH는 재조합으로 합성된 TSH를 지칭한다. 본 출원에 기술된 재조합 DNA 방법은 일반적으로 Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold String Harbor Laboratory Press, 1989, 및/또는 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al, eds., Green Publishers Inc., and Wiley and Sons 1994, with Supplements)에 기재된 것들이다. 용어 "재조합"은 시험관 내에서 합성되거나 그렇지 않으면 조작된 폴리뉴클레오티드(즉, "재조합 폴리뉴클레오티드"), 및 세포 또는 기타 생물학적 시스템 내에서 유전자 산물을 생산하기 위하여 재조합 폴리뉴클레오티드를 이용하는 방법, 및 재조합 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드("재조합 단백질")를 지칭한다.
본 출원에 기술된 방법 및 조성물에 이용되는 TSH는 자연 발생적인 포유동물 공급원, 예컨대, 소, 돼지, 영장류 또는 인간으로부터 정제될 수 있거나, 그렇지 않으면 미국 특허번호 5,840,566호 및 6,365,127호에 기술된 바와 같이, 당해 기술 분야에 공지된 방법을 이용하여 비 자연 발생적인 공급원으로부터 재조합 형태로 분리될 수 있다.
거대분자를 고분자(예컨대, 다당류, 시알산, 하이드록시에틸 전분 및 폴리알킬렌 글리콜(예컨대, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리부틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜) 및 기타 유사한 모이어티의 고분자)에 콘쥬게이션시키는 것은 약물의 약력학적 및 약동학적 성질들 사이의 균형을 변화시킴으로써 약물의 생체 내 효능을 효과적으로 변경하는 데 이용될 수 있다고 알려져 있다. 그러나 그러한 콘쥬게이션은 종종 약물의 결합 친화도의 손실 및 사실상 효능의 손실을 초래한다. 제한된 사례에서, 효능 감소는 고분자로 개질된 약물의 더 오랜 순환 반감기에 의해 상쇄되며, 그에 따라 약동학(PK) 및 약력학(PD) 프로파일이 치료에 유용하게 된다.
페길화라고 지칭되는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 특정 거대분자에 대한 콘쥬게이션은 대부분의 활성을 보유하지만, 활성이 일반적으로 세포 표면 수용체와 높은 친화도의 상호 작용을 필요로 하는 페길화 호르몬과 사이토카인은 상당한 활성 감소를 나타낸다. 자주 호르몬에 대한 페길화는 호르몬의 PD 프로파일과 PK 프로파일에 부정적으로 영향을 미친다.
폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 단백질이 체내에서 순환하는 시간의 길이를 연장하는 것으로 밝혀진 비 항원성 불활성 고분자이다. 전형적으로, 이러한 일반적인 PEG 시약은 단백질 상의 1차 및 2차 아민, 일반적으로 리신 잔기 및/또는 N 말단 아미노산에 부착된다. PEG는 상이한 크기로 상용화되어 있으며, 일단 부착되면, 다양한 크기 및 단일 약물 분자에 대한 다중 부착을 이용함으로써 개별적인 지시에 맞춤화될 수 있다. PEG는 주사된 페길화 단백질의 혈장 반감기를 향상시키는 것으로 밝혀졌으나, 위에 언급한 바와 같이, PEG에 의한 입체 장애 때문에 효능이 손실될 수 있다(Fishburn, C.S., J Pharm Sci 97:4167 (2008)). 효능 문제를 피하고, 바람직한 PD 및 PK 프로파일을 생성하기 위하여, 페길화되는 표적 단백질의 구조와 기능간 관계에 대한 상세한 이해는 최대 기능 활성을 보유하는 페길화 산물을 생성하는 데 도움이 된다.
최근, 성장 호르몬 슈퍼패밀리 구성원들의 구조 결정에 진전이 있었고, 이는 잠재적인 치료제로 이어졌다. 이러한 단백질들이 어떻게 그 표적들과 상호작용하는가에 대한 이해는 구조적 정보와 결합되어, 구조적인 정보를 각각의 표적에 대한 단백질의 치료적 이점을 최대화하는 고분자 콘쥬게이트 설계에 이용함으로써 효과적인 약물을 생성하였다. 불행히도, 수용체가 있는 TSH의 복잡한 구조에 대한 구조적인 정보는 이용할 수 없다. 그러나 FSH 수용체(FSHR)와 복합체를 이룬, TSH와 관련된 단백질인 여포 자극 호르몬(FSH)의 결정 구조가 분석되었다(Fan and Hendrickson, Nature 433:269 (2004)). TSH는 FSH와 높은 상동성을 나타내고, 동일한 알파 서브유닛과 유사한 베타 서브유닛을 공유한다. 마찬가지로, TSH 수용체와 FSH 수용체는 매우 상동성을 나타낸다. 따라서, FSH-FSH 수용체 복합체는 TSH와 그 수용체의 상호작용에 대한 초기 모델로서 기능할 수 있다.
본 출원에 나타난 바와 같이, TSH 서열이 FSH-FSHR 복합체의 3D 구조적 모델 위로 중첩될 때(PDB 좌표 1XWD), N 말단은 수용체 상호작용 영역으로부터 거리가 가장 멀어 보이며, 따라서 아마도 페길화 시 PEG 부착이 수용체 결합의 손실을 최소화하는 데 이상적인 부위이다(도 1b). TSH에는 많은 리신이 존재하며, 그것들 중 일부는 수용체 결합 부위 근처에 있으므로, 리신에서의 PEG 부착은 수용체 결합을 방해할 것으로 예상된다.
TSH는 글리코실화 단백질이다. 탄수화물 사슬은 그 중량의 15~25%를 구성하고, 아스파라긴이 연결된 탄수화물 사슬 세 개를 포함한다. 이러한 사슬들 중 두 개는 TSH의 알파 서브유닛 위에서 발견되며, 각각 아스파라긴 52(ASN 52)와 아스파라긴 78(ASN 78)에 연결되고, 세 번째는 TSH의 베타 서브유닛 위에서 발견되며, 아스파라긴 23(ASN 23)에 연결된다. 아스파라긴에 연결된 탄수화물 사슬은 잠재적인 PEG 콘쥬게이션 부위이지만, TSH 단백질 상에서, 수용체 상호작용 영역, 특히, ASN 52에 대한 그것들 각각의 근접성은 그러한 부위에서의 PEG 콘쥬게이션이 수용체 결합에 부정적인 영향을 미칠 가능성이 높으리라는 점을 시사한다. 따라서, TSH에 대한 고분자 콘쥬게이션을 위한 잠재적인 부위의 선정은 많은 불확실성을 제공하였다.
나아가, TSH의 탈글리코실화는 수용체 결합 시 효율적인 신호 전달의 손실을 가져온다는 점은 오래 전부터 알려져 있었다(Szkudlinski et ai, Physiol Rev. 82:473 (2002)). TSH의 탄수화물로부터 말단의 시알산을 제거하면 시험관 내 활성을 향상시키지만, 생체 내에서 순환 시간이 크게 감소되는 것이 관찰되었으며, 이는 아마도 간의 아시알로당단백질 수용체에 의한 제거 때문일 것이다. Thotakura, N.R., Szkudlinski, M.W. and Weintraub, B.D., Glycobiology 4, 525-533 (1994). 개별적인 탄수화물 부위의 소거 또한 시험관 내 기능적 활성, 특히, 알파 사슬 아미노산 위치 52번에 대한 기능적 활성을 증진시켜, 다시금 시알산의 음 전하와 수용체 상의 음 전하 사이의 정전기적 반발력에 대해 탄수화물이 수용체와 충분히 가까울 수 있음을 시사하였다. 전부 종합하자면, TSH의 이러한 구조 기능 분석 결과는 기능적 효능에 미치는 영향을 최소화하는 데에는 탄수화물 페길화보다는 N 말단의 페길화가 훨씬 더 바람직하다는 점을 보여주었다. 본 출원에 기술된 바와 같이, N 말단 페길화, 리신 페길화 및 탄수화물 고분자 부착을 연구하였다.
따라서, 고분자가 콘쥬게이트된 TSH를 생산하기 위한 탄수화물 고분자 방법론은 본 발명의 일 양태이다. 일 구현예에서, 고분자는 폴리알킬렌 글리콜이다. 본 출원에 사용된 "폴리알킬렌 글리콜(PAG)"은 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜(PPG), 폴리부틸렌 글리콜 등을 포함한다. 고분자는 선형 또는 가지형일 수 있다. PAG는 분자에 공유적으로 부착된다. 본 맥락에서 사용된 용어 "부착" 또는 "부착된"은 예컨대, 서로 직접적으로 공유적으로 연결되거나, 그렇지 않으면, 가교, 스페이서, 또는 연결 모이어티 또는 모이어티들과 같은, 중개 모이어티 또는 모이어티들을 통해 서로 간접적으로 공유적으로 연결된, TSH 단백질의 부위 또는 모이어티 및 폴리알킬렌 글리콜과 같은 고분자의 결합 또는 콘쥬게이션을 지칭한다. TSH에 부착된 또는 콘쥬게이트된 고분자는 혼합된, 뒤섞인 고분자, 또는 TSH와의 용액 상태의 고분자와는 구별된다.
"탄수화물 부위"는 TSH 위에서 발견되는 탄수화물 측쇄를 지칭한다. 이 부위는 천연적으로 글리코실화된 부위 또는 효소적으로 제공되었던 부위일 수 있다. 특정 구현예에서, 탄수화물 부위는 수용체와의 최적의 TSH 상호작용 또는 단백질의 접힘 또는 이동성과 같은 기타 기능적인 요건들을 위한 바람직한 기준을 충족시키기 위해 특별히 선택된다. 탄수화물 부위는 PEG와 같은 고분자 모이어티의 부착을 위해 이용 가능하다. 단백질 상의 전형적인 탄수화물 부위는 아스파라긴, 세린 또는 트레오닌이다. TSH는 아스파라긴이 연결된 탄수화물 사슬 세 개를 가지고 있다.
특정 구현예에서, 단일 고분자가 TSH에 부착된다. 다른 구현예에서, 다수의 고분자가 TSH에 부착된다. 다수의 부착된 고분자는 단일 종 또는 여러 종일 수 있다. 예를 들어, 단일 PEG 분자가 단백질에 부착되는 경우, 이러한 단백질은 "모노페길화" 라고 지칭되고, 둘 이상의 PEG 단백질이 부착되는 경우, 이러한 단백질은 "멀티페길화" 라고 지칭된다. 단백질이 멀티페길화될 때, (다른 부착된 PEG들과 관련하여) 단백질에 부착된 개별적인 PEG는 동일하거나 상이한 분자량을 나타낼 수 있고, 선형 또는 가지형 구조일 수 있다. PEG 분자의 분자량 범위는 3,000~10,000달톤이다. 특정 구현예에서, 부착된 PEG의 분자량은 5kD, 10kD, 20kD, 30kD, 40kD, 또는 60kD 또는 이의 조합이다.
TSH의 탄수화물 페길화를 위한 세 가지의 대안적인 경로가 본 출원에 제공된다: (i) 시알산 매개 페길화("SAM" 이라 함), (ii) 갈락토오스 매개 페길화("GAM(-)" 이라 함) 및 (iii) 갈락토오스 매개 페길화와 결합된 시알산 제거("GAM(+)" 이라 함). 간략하게는, 도 3에 나타난 바와 같이, 시알산 매개 SAM 페길화에서는, 시알산이 산화된 다음, PEG의 화학적 부착이 이어진다. GAM(-) 페길화에서는, 갈락토오스 모이어티가 산화된 다음, PEG의 화학적 부착이 이어진다. 그리고 GAM(+)에서는, 시알산 모이어티가 효소적으로 제거되고, 그런 다음, 노출된 갈락토오스 잔기가 산화된 다음, PEG의 화학적 부착이 이어진다.
TSH에 대한 부위 특이적인 페길화 방법 또한 본 발명에 포함된다. 한 가지의 그러한 방법은 PEG를 시스테인 반응성 PEG들을 이용하여 시스테인 잔기에 부착시킨다. 상이한 반응기(예컨대, 말레이미드, 비닐설폰)와 상이한 크기의 PEG(2~40kDa)를 가지고 있는 다수의 매우 특이적인, 시스테인 반응성 PEG들이 상업적으로 이용 가능하다. 중성 pH에서, 이러한 PEG 시약들은 선택적으로 "자유로운" 시스테인 잔기, 즉, 표적 단백질에서 이황화 결합에 연루되어 있지 않은 시스테인 잔기에 부착된다. 대안적으로, 자연 이황화 결합과 관련된 두 개의 시스테인 중 하나는 제거되거나 다른 아미노산으로 치환될 수 있어, 자연 시스테인(보통 제거되거나 치환된 시스테인 잔기와 이황화 결합을 형성하는 단백질 내의 시스테인 잔기)을 자유롭게 두어 화학적 변경에 이용될 수 있게 할 수 있다. 바람직하게는 시스테인에 대해 치환된 아미노산은 세린 또는 알라닌과 같은 중성 아미노산일 것이다.
재조합 DNA 기법을 이용한 시험관 내 돌연변이화를 통해 단백질 상의 임의의 유용한 위치에 추가적인 시스테인 잔기가 도입될 수 있다. 그러면, 새롭게 첨가된 "자유로운" 시스테인은 시스테인 반응성 PEG를 이용한 PEG 분자의 특이적인 부착을 위한 부위로 기능할 수 있다. 첨가된 시스테인 잔기는 단백질 내의 기존 아미노산의 치환체이다. 시스테인 잔기는 단백질의 아미노 말단 전에, 단백질의 카르복시 말단 후에 첨가될 수 있거나, 단백질 내의 두 아미노산 사이에 삽입될 수 있다. 본 출원에 사용된 용어 "돌연변이 TSH"는 야생형 TSH의 하나 이상의 아미노산이 TSH 분자 위에서 하나 이상의 글리코실화 부위의 형성을 허용하는 다른 아미노산으로 치환되었을 경우의 TSH를 지칭한다. 따라서, TSH의 아미노산 치환은 폴리알킬렌 글리콜과 같은 적어도 하나의 고분자의 부위 특이적인 결합을 가능하게 한다. 예를 들어, PEG 분자와의 돌연변이 TSH에 대한 부위 특이적인 결합은 폴리에틸렌 글리코실화 TSH의 약동학 및 약력학적 이점을 보유하는 TSH의 생성을 가능하게 한다.
특정 구현예에서, 시스테인과의 아미노산 치환은 표 1과 표 2의 돌연변이에 대해 나타낸 위치에 있을 수 있다.
바람직한 구현예에서, 치환은 자연 TSH의 구조적인 특징을 실질적으로 변경시키지 않는다. 특정 구현예에서, 시스테인으로 치환된 아미노산 잔기는 TSH의 알파 서브유닛 또는 베타 서브유닛 상에 위치한다. 특정 구현예에서, 시스테인으로 치환된 아미노산 잔기는 ASN52, ASN78, MET71, ASN66, THR69, 및 GLY22, 및 이의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 재조합 인간 TSH의 알파 서브유닛 상의 아미노산 위치에 위치하거나, ASN23, VAL118, THR21, GLU63, 및 ASP56, 및 이의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 재조합 인간 TSH의 베타 서브유닛 상의 아미노산 위치에 위치한다.
본 출원에 기술된 TSH 조성물은 생물학적으로 활성이 있다. "생물학적으로 활성이 있는"은 본 발명의 TSH 조성물이 하나 이상의 다음과 같은 효과를 나타냄을 의미한다: 더 긴 작용시간, 오래 계속되는 반감기, T4 방출의 증가된 지속시간, 더 높은 AUEC, Tmax의 양의 이동(positive shift), 및 부작용을 감소시킬 수 있는 더 낮은 최고점 대비 최저점(peak-to-trough) 노출. 특정 구현예에서, 조성물은 대조군과 비교되고, 그 효과는 실질적으로 유사하거나, 다소 적거나 다소 크거나, 실질적으로 더 크다. 본 발명에 따라 생산된 TSH 조성물의 생물학적 활성은 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 다양한 기법을 이용하여 평가할 수 있다.
본 발명의 TSH 조성물의 생물학적 활성을 평가할 때, 생물학적 활성을 대조군과 비교할 수 있다. 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 인정하는 바와 같이, 다양한 적절한 대조군이 이용될 수 있다. 일 구현예에서, 본 출원에 사용된 ?陸떡?은 자연(야생형) TSH 또는 rhTSH를 지칭한다.
본 발명의 조성물은, 필요로 하는 환자(예컨대, 갑상선 근전절제술 또는 전절제술을 겪은 갑상선 암 환자)에 투여될 때, 명시된 용도에 맞춰진 TSH의 혈청 농도를 제공할 것이다. 특정 구현예에서, 본 출원에 기술된 조성물의 작용기간은 rhTSH보다 적어도 2배 증가된다. 또 다른 구현예에서, TSH 조성물의 작용기간은 rhTSH보다 적어도 3배 증가된다. 증가된 작용기간을 나타내는 그러한 구현예는 효과적으로 투여 빈도를 감소시키지만, 현재의 rhTSH 제형과 비교할 만한 효능을 유지한다.
일 구현예에서, 조성물은 rhTSH에 비해 더 긴 반감기(t1/2)를 제공한다. 구체적인 구현예에서, t1/2은 랫트에서 rhTSH보다 23배까지 더 길다.
또 다른 구현예에서, T4 수준은 rhTSH에 비해 더 큰 지속 효과를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 랫트에서, rhTSH군의 T4 수준은 용량 투여 후 48시간까지 용제 수준으로 되돌아갔으나, 일 구현예에서 T4는 용량 투여 후 168시간 동안 지속되었다.
본 출원에 사용된 "유효 Tmax"는 "최고 높이 농도의 시간"을 지칭하며, 이는 참조 시 조성물의 특징이다. 본 출원에 사용된 "유효 Cmax"는 "최고 높이 농도"를지칭하며, 이는 참조 시 조성물의 특징이다. 여러 상황에서, 유효 Tmax와 Cmax는 약물의 농도가 치료적 범위 내인 혈액(또는 혈청 또는 혈장) 농도 시간 곡선을 제공한다. "t1/2" 은 약물의 작용시간이 알려져 있을 때, 체내에서 약물의 농도 또는 양이 2분의 1로 감소되는 데 필요한 시간을 지칭한다.
인간 TSH의 알파 서브유닛의 핵산 서열은
gctcctgatgtgcaggattgcccagaatgcacgctacaggaaaacccattcttctcccagccgggtgccccaatacttcagtgcatgggctgctgcttctctagagcatatcccactccactaaggtccaagaagacgatgttggtccaaaagaacgtcacctcagagtccacttgctgtgtagctaaatcatataacagggtcacagtaatggggggtttcaaagtggagaaccacacggcgtgccactgcagtacttgttattatcacaaatct(SEQ ID NO: 1)이다.
인간 TSH의 알파 서브유닛의 아미노산 서열은
APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQKNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKS(SEQ ID NO: 2)이다.
인간 TSH의 베타 서브유닛의 핵산 서열은
ttttgtattccaactgagtatacaatgcacatcgaaaggagagagtgtgcttattgcctaaccatcaacaccaccatctgtgctggatattgtatgacacgggatatcaatggcaaactgtttcttcccaaatatgctctgtcccaggat gtttgcacatatagagacttcatctacaggactgtagaaataccaggatgcccactccatgttgctccctatttttcctatcctgttgctttaagctgtaagtgtggcaagtgcaatactgactatagtgactgcatacatgaagccatca agacaaactactgtaccaaacctcagaagtcttatctggtaggattttctgtc(SEQ ID NO: 3)이다.
인간 TSH의 베타 서브유닛의 아미노산 서열은
FCIPTEYTMHIERRECAYCLTINTTICAGYCMTRDINGKLFLPKYALSQDVCTYRDFIYRTVEIPGCPLHVAPYFSYPVALSCKCGKCNTDYSDCIHEAIKTNYCTKPQKSYLVGFSV(SEQ ID NO: 4)이다.
본원에 사용된 용어 ?SH의 서브유닛의 아미노산 잔기에 해당하는 아미노산 잔기는 서열을 정렬하였을 때 야생형 TSH 서브유닛의 서열에 해당하는 아미노산 잔기(SEQ ID NO: 2와 4)를 나타내고자 한 것이다. 아미노산 서열 상동성/동일성은 예컨대, ClustalW 프로그램, 버전 1.8, 1999(Thompson et al, 1994, Nucleic Acid Research, 22: 4673-4680)와 같은, 서열 정렬을 위한 적절한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 정렬된 서열로부터 편리하게 결정한다.
실시예
실시예 1. rhTSH 의 시알산 매개(SAM) 페길화
과요오드산 나트륨 산화: 알루미늄 포일로 둘러싼 유리 바이알 내에서 100mM 아세트산 나트륨 내 25mM 과요오드산 나트륨 (시그마(Sigma), 311448), pH 5.6을 100mM 아세트산 나트륨 내 4.5mg/ml TSH, pH 5.6에 첨가하여 0.2mM 내지 2mM 범위의 최종 농도가 되도록 하였다. 혼합물을 30분 동안 암소의 얼음 위에서 부드럽게 진탕하였다. 30분 후, 50% 글리세롤을 반응 부피의 3%에 첨가한 다음, 15분 동안 진탕하였다. 그런 다음, 혼합물을 100mM 아세트산 나트륨, pH 5.6으로 완충액 교환을 하고, 페길화를 수행하기 위하여 적어도 4.3mg/ml의 TSH 농도로 농축시켰다.
페길화: 적당한 크기의 아미녹시 PEG(dH2O 내에 100mg/ml)를 여러 가지 (PEG:단백질) 몰 비율로 산화된 TSH에 첨가하였다. 반응 부피를 100mM 아세트산 나트륨 , pH 5.6을 이용하여 4mg/ml의 최종 TSH 농도로 조정하였다. 그런 다음, 혼합물을 25℃에서 16시간 동안 또는 8℃에서 16시간 동안 조심스럽게 진탕하면서 항온배양하였다. 항온배양 후, 반응 혼합물에 50몰의 초과 0.05M 하이드록실아민을 첨가하여 반응 혼합을 종료시키고 조심스럽게 진탕하면서 25˚C에서 6시간 동안 항온배양하였다.
실시예 2. 탈시알화된 rhTSH 의 갈락토오스 매개(GAM(+)) 페길화
뉴라민가수분해효소 처리: TSH mg당 20mU 뉴라민가수분해효소(His6-클로스트리듐 뉴라민가수분해효소(520mU/ul))를 첨가하고, 37˚C에서 6시간 동안 항온배양하였다.
카탈라아제/갈락토오스 산화효소 처리: 뉴라민가수분해효소 처리된 TSH에 TSH mg당 2U 카탈라아제(시그마 442U/㎕)를 첨가하였다. 혼합물에 TSH mg당 4㎍ 갈락토오스 산화효소(워싱턴(Worthington) GAO, 1.2mg/ml)를 첨가한 다음, 37˚C에서 16시간 동안 항온배양하였다. 항온배양 후, 혼합물을 완충액 교환하고, 페길화를 수행하기 위하여 100mM 아세트산 나트륨, pH 5.6으로 적어도 5.5mg/ml의 농도로 농축시켰다.
페길화: 산화되고 완충액 교환시킨 TSH에 적당한 크기의 아미녹시 PEG(dH2O 내에 100mg/ml)를 (PEG:단백질) 몰 비율 1:1로 첨가하였다. 반응 부피를 100mM 아세트산 나트륨, pH 5.6으로 조정하여, 반응액 내의 최종 TSH 농도가 5mg/ml가 되게 하였다. 그런 다음, 혼합물을 조심스럽게 진탕하면서 25℃에서 16시간 동안 항온배양하였다. 반응 혼합물에 50몰의 초과 0.05M 하이드록실아민(m.w. 69.49)을 첨가하고, 조심스럽게 진탕하면서 25℃에서 6시간 동안 항온배양하였다.
실시예 3. rhTSH 의 갈락토오스 매개(GAM(-)) 페길화
카탈라아제/갈락토오스 산화효소 처리: TSH에 mg당 2U 카탈라아제(시그마 442U/㎕)와 mg당 4㎍ 갈락토오스 산화효소(워싱턴 GAO, 1.2mg/ml)를 첨가하였다. 그런 다음, 혼합물을 37˚C에서 16시간 동안 항온배양하였다. 항온배양 후, 혼합물을 완충액 교환하고, 페길화를 수행하기 위하여 100mM 아세트산 나트륨, pH 5.6으로 적어도 5.5mg/ml의 최종 농도로 농축시켰다.
페길화: 산화되고 완충액 교환시킨 TSH에 적당한 크기의 아미녹시 PEG(dH2O 내에 100mg/ml)를 (PEG:단백질) 몰 비율 1:2로 첨가하였다. 반응 부피를 100mM 아세트산 나트륨, pH 5.6으로 조정하여, 반응액 내의 최종 TSH 농도가 5mg/ml가 되게 하였다. 그런 다음, 혼합물을 조심스럽게 진탕하면서 25˚C에서 16시간 동안 항온배양하였다. 반응 혼합물에 50몰의 초과 0.05M 하이드록실아민(m.w. 69.49)을 첨가하고, 조심스럽게 진탕하면서 25℃에서 6시간 동안 항온배양하였다.
실시예 4. rhTSH 의 N 말단 페길화
적당한 크기의 알데히드 PEG(반응 완충액 내에 100mg/ml)를 20mM 소디윰 시아노보로하이드라이드를 함유하는 100mM 아세트산 나트륨 (pH 5 또는 pH 5.6) 내에 다양한 (PEG:단백질) 비율로 5mg/ml rhTSH의 최종 농도까지 첨가하였다. 1M 트리스(Tris), pH 7.5, 0.1부피로 반응을 25℃에서 3시간 동안 종료시키기 전에, 25˚C에서 16시간 동안 또는 8˚C에서 최대 2일까지 항온배양을 수행하였다.
N 말단에서의 페길화는 탄수화물 콘쥬게이션보다 더 큰 TSH 수용체 결합 친화도를 상실한 콘쥬게이트를 생산하였다. 40kD PEG를 이용한 N 말단 모노페길화는 rhTSH 대조군에 비해, 시험관 내 TSH 수용체 결합 친화도의 11.1배 감소를 초래했다.
실시예 5. rhTSH 의 리신 페길화
적당한 크기의 NHS(N-하이드록시석신이미드) PEG(dH2O 내에 50mg/ml)를 PBS(인산 완충 식염수) 완충액, pH 7.2에 다양한 (PEG:단백질) 비율(예컨대, (0.5:1), (1:1), (2:1), (4:1), (8:1))로 0.8mg/ml rhTSH의 최종 농도까지 첨가하였다. 25˚C에서 1.5시간 동안 항온배양을 하였다.
N-하이드록시석신이미드 에스테르(NHS) PEG를 이용한 리신 콘쥬게이션을 분석하였다. 40kDa PEG에 대해, 상이한 (PEG:단백질) 비율 및 상이한 항온배양 시간을 PBS(인산 완충 식염수) 완충액, pH 7.2에 시험하였다. 최종 TSH 농도는 ml당 0.8mg이었다. 25˚C또는 37˚C에서 1.5시간 또는 19.5시간 동안 페길화를 수행하였다. 시험했던 짧은 항온배양 시간(1.5시간)은 긴 항온배양 시간(19.5시간)과 동일한 결과를 나타냈다. 이것은 아마도 수성 용액 내에서 NHS PEG의 빠른 가수분해 때문이다. 페길화 정도는 (PEG:단백질) 몰 비율에 의존하였으며, 더 높은 PEG 몰 초과는 더 다수의 페길화된 콘쥬게이트를 생성하였다.
모노페길화 종의 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 분획을 수집하여, 시험관 내 TSH 수용체 결합 분석법을 수행하였다. 시험관 내 TSH 수용체 결합 분석법 결과, 모노-40kDa NHS PEG-TSH(리신 페길화)는 출발물질인 대조군 TSH보다 31.2배 더 낮은 친화도를 나타내지만, 모노-40kDa 아미녹시 PEG-TSH(SAM 페길화)는 5.3배 더 낮은 친화도를 나타냈다.
실시예 6. 부위 특이적인 콘쥬게이션을 위한 시스테인 돌연변이 생산
TSH 단일 돌연변이를 설계하고 제조하여 부위 특이적인 페길화를 위하여 시스테인을 도입하였다. 이러한 돌연변이는 단백질 접힘, 수용체 결합에 미치는 그 영향을 최소화하기 위하여, 그리고 그것들의 잠재력이 효과적으로 콘쥬게이트되도록 하기 위하여 설계되었다.
TSH/TSH 수용체의 구조적인 모델을 기초로 하여 시스테인 돌연변이를 도입할 부위를 설계하기 위하여 다음과 같은 고려사항을 적용하였다: 1) 돌연변이 부위는 수용체 결합 부위에 또는 그에 인접하게 위치해서는 안 된다: 2) 돌연변이 부위는 알파/베타 서브유닛 이합체화 계면에 또는 그에 인접하게 위치해서는 안 된다; 3) 돌연변이 부위는 이황화 결합에 또는 그에 인접하게 위치해서는 안 된다; 4) 돌연변이되었을 때, 보고된 문헌을 기초로 하여 특이적인 활성의 극적인 감소를 초래하는 부위를 피한다; 5) 돌연변이 부위는 이후의 페길화를 위해 용매 노출되어야 한다; 6) 각 영역에서의 페길화 실현 가능성을 완전히 평가하기 위하여 수용체 결합 부위의 반대쪽 TSH 표면 대부분을 고르게 다룰 부위를 선택한다. 이러한 고려사항 중 일부를 표 1로 요약하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이 우리의 구조적 모델에서 선택된 돌연변이의 베타 탄소 위치를 용매에 노출시켰다. 이는 시스테인으로 돌연변이되었을 때 이러한 위치가 페길화 시약에 대해 접근 가능성이 높을 것으로 예상하는 것이다. 표 1에서 선택된 처음 세 개의 부위가 TSH에서의 자연 글리코실화 부위이다.
돌연변이 ID 돌연변이 서브유닛 이전에 보고된 돌연변이화 데이터
1 N52C(a) 알파 Gln으로 변경되었을 때 특이적 활성 6x↑
2 N78C(a) 알파 Gln으로 변경되었을 때 특이적 활성 2~3x↑
3 N23C(b) 베타 Gln으로 변경되었을 때 특이적 활성 2~3x↑
4 V118C(b) 베타
5 M71C(a) 알파 산화되었을 때 특이적 활성 <2x↓
6 N66C(a) 알파 Lys으로 변경되었을 때 특이적 활성 약간 증가
7 T69C(a) 알파
8 G22C(a) 알파
9 T21C(b) 베타
10 E63C(b) 베타
11 D56C(b) 베타 돌연변이되었을 때 특이적 활성 약간 변화
rhTSH 유전자(이의 신호 펩티드를 포함)를 암호화하는 DNA를 합성하여, 게이트웨이 도입 벡터(예를 들어, pDONOR221)로 클로닝하였다.
TSH 서브유닛 상의 여러 부위에 Cys 돌연변이를 도입하기 위하여 올리고뉴클레오티드 기반 부위 특이적인 돌연변이 유도를 이용하였다. 그에 따른 야생형 및 돌연변이 벡터를 게이트웨이 클로닝을 통해 발현 벡터(예를 들어, pCEP4.DEST) 내로 셔플링하였다. 일시적으로 형질감염시킨 HEK293 세포 배지로부터 단백질을 제조하고, 생화학 및 세포 기반 분석법, 예컨대, 겔 전기영동법, 웨스턴 블롯팅, SEC-HPLC 크로마토그래피, PEG 변경 수율법 및 세포 리포터 분석법으로 특징을 분석하였다.
결과를 평가하고, 발현 수준, 응집(이합체화) 경향, 페길화 효율 및 TSH 기능에 대한 변화를 비교하였다. 예를 들어, 정제된 돌연변이 TSH의 은 염색 분석법 결과는 돌연변이 TSH N66C(알파), TSH G22C(알파), TSH M71C(알파), TSH T69C(알파), 및 TSH V118C(베타)가 최고의 발현 수준을 나타냄을 밝혀냈다(도 5 참조). 페길화 실험 결과는 TSH G22C(알파), TSH N66C(알파), TSH T69C(알파), 및 TSH V118C(베타)가 효과적으로 페길화되었음을 시사한다(대표적인 페길화 결과로는 도 6 참조). M71C(알파)는 페길화 항온배양에서 응집체를 형성하는 것으로 보였다(데이터 미도시). 선택된 돌연변이(예컨대, G22c)를 대규모 생산 및 생체 내 연구를 향해 이동시키기 위한 결정을 내렸다(표 2 참조).
# 돌연
변이		 서브
유닛		 발현 단량체 페길화 TSHR로부터 먼 정도 선택된 리드
1 WT *** ***
2 N52C(a) 알파 ND
3 N78C(a) 알파 ND
4 N23C(b) 베타 ND
5 V118C(b) 베타 * *** *
6 M71C(a) 알파 ** *
7 N66C(a) 알파 ** ** ** **
8 T69C(a) 알파 ** ** *** ** #2
9 G22C(a) 알파 ** *** *** *** #1
10 T21C(b) 베타 ND
11 E63C(b) 베타 ND
12 D56C(b) 베타 ND
CHO 풀로부터 더 큰 규모의 Cys 돌연변이를 제조하였다. 야생형(WT) 및 돌연변이 rhTSH 유전자를 암호화하는 DNA를 코돈 최적화하여 합성하였다. 이러한 유전자들을 CHO 세포로의 일시적인 형질감염을 위해 CHO 발현벡터(예를 들어, pGEN600, pGEN620) 내로 클로닝하였다. 형질감염된 CHO 세포를 메토트렉세이트(MTX) 선택으로 증폭시켰다. 그에 따른 CHO 풀을 규모를 확대한 단백질 생산에 이용하였다.
시스테인 TSH 돌연변이는 발현 및 정제 후에 도입된 시스테인에서 캡핑되는 것으로 밝혀졌고, 따라서 페길화된 돌연변이 TSH를 생성하기 위하여 추가적인 환원 방법이 필요했다. 돌연변이 TSH는 먼저, 단백질을 불활성화시킬 자연의 이황화 결합을 비가역적으로 파괴하지 않고 도입된 시스테인으로부터 캡을 분리시키기 위해 약한 환원제로 환원될 필요가 있었다.
따라서, 캡핑된 시스테인을 환원시키기 위한 노력으로 여러 가지 방법들이 이용되었다. 예를 들어, 환원을 위해 다양한 농도의 TCEP(트리스(2-카르복시에틸)포스핀 HCl) 용액을 rhTSH 돌연변이와 함께 항온배양시켰다. 이 방법을 이용한 시스테인 캡 제거는 효율적이었지만, 나중에 비 특이적인 페길화로 이어지는 다른 이황화 결합의 일부 환원도 일어났다. TCEP가 있는 고정화 비즈를 이용한 또 다른 환원 방법은 rhTSH를 환원시키는 데 더 약한 것으로 보였지만, 이 방법 또한 어느 정도 낮은 수준의 이황화 환원을 초래하였다. 본 발명자들은 (환원제로서) 1~10mM 시스테인이 rhTSH에서 기존의 이황화 결합을 파괴하지 않고, 캡핑된 Cys을 환원시키는 데 특히 효과적임을 발견했다.
이황화물이 다시 형성되도록 하기 위하여 시스테인 환원제를 캡과 함께 제거하였다. 그런 다음, "캡을 제거한" 도입된 시스테인을 시스테인 반응성 PEG 시약에 선택적으로 콘쥬게이트시켰다. 이 방법은 FVIII(Mei et al., Blood 116:270-9 (2010)) 및 항체 단편(Yang et al., Protein Engineering 16:761-770 (2003))과 같은 다른 단백질에서는 증명된 바 있지만, 이를 시스테인 노트를 함유하는 단백질 상에서 시도한 보고는 공지된 바 없다.
이전에 보고된 예는 겨우 1~2% 시스테인 함량을 나타냈지만, TSH는 11% 시스테인 함량(23/210개 아미노산)을 나타내며, 이는 자연의 이황화물을 뒤섞지 않고 24번째 시스테인을 TSH로 도입하는 것(그리고 따라서, 수용체 결합 친화도를 극적으로 낮추는 것)을 특히 어렵게 한다. 결과적으로, 본 발명자들은 시스테인 돌연변이를 도입하기 위한 여러 가지 위치들을 스크리닝해야 했고, 다만 몇 가지만이 PEG와 성공적으로 콘쥬게이트될 수 있었다.
부위 특이적인 Cys 페길화 : 부위 특이적인 페길화를 위해 CHO 세포로부터 G22C rhTSH를 생산하였다. 도 8에 나타난 최적화 실험 후에, G22C rhTSH(1~2mg/ml)에 시스테인을 2mM의 최종 농도까지 첨가하였다. Cys22 상의 캡을 제거하기 위하여 단백질을 4℃에서 밤새 항온배양하였다. 혼합물을 페길화 완충액(10mM 인산 나트륨, 2mM EDTA, pH 7.0)으로 정용 여과시켰다. PEG를 단백질에 5x 몰 초과로 첨가하고, 25℃에서 2시간 동안 항온배양하였다. 2x 시스테인으로 페길화를 정지시키고, SEC-HPLC로 수확률을 확인하였다. 작용 혼합물의 pH를 pH 5.0으로 낮춘 다음, 정제를 위해 모노S 컬럼상에 로딩하였다.
여러 가지 페길화 반응의 SEC-HPLC 프로파일을 도 8에 나타내었다. 대략 75%의 모노페길화된 G22C TSH가 얻어졌는데, 이는 매우 효과적인 콘쥬게이션이다. G22C의 서브유닛 특이적인 콘쥬게이션 및 부위 특이적인 콘쥬게이션 확인 내용을 도 9a 및 도 9b에 나타내었다.
실시예 7. 페길화된 rhTSH 의 모노S AKTA 정제
시료를 모노S 컬럼(GE 헬스케어)로 정제하고, 4ml/분의 유속으로 10mM 아세트산 나트륨 pH 5와 10mM 아세트산 나트륨, 1M 염화나트륨 pH 5의 기울기로 용리시켰다. 기울기는 0% 이동상 B(10mM 아세트산 나트륨, 1M 염화나트륨 pH 5)로 출발하여, 25의 컬럼 부피에 걸쳐 50% 이동상 B로 증가시킨 다음, 컬럼을 세척하기 위하여 100% 이동상 B로 하였다.
실시예 8. SDS-PAGE 분석 및 염색
4~5㎍ TSH와 함께 미리 부어둔 기울기 겔(4~12% 비스 트리스(Bis Tris), 인비트로겐(Invitrogen))을 로딩하였다. MOPS(3-(N-모르폴리노)프로판설폰산) 러닝 완충액(인비트로겐)을 제조하였다. 전기영동 장치를 얼음이 든 얼음통에 위치시켰다. 겔을 200V에서 대략 50분 동안 전개시킨 다음, 증류수로 5분씩 3회 헹구었다. 50ml 5% 염화바륨을 겔에 첨가한 다음, 10분 동안 진탕하였다. 겔을 증류수로 5분 동안 헹구어 염화바륨을 제거하였다. 그런 다음, 증류수를 제거하고, 밴드가 보일 때까지 겔을 먼저 PEG에 대해 1 x 요오드화칼륨/요오드 용액으로 염색하였다. 그런 다음, 겔을 증류수로 탈색시키고 즉시 스캔하였다. 단백질 염색을 위해, 쿠마시 디스테인(10% 아세트산, 20% 메탄올)을 이용하여 PEG 염색의 모든 흔적을 제거한 다음, 겔을 쿠마시 블루 스테인으로 염색하였다. 정제된 탄수화물 페길화 rhTSH 콘쥬게이트의 SDS-PAGE 분석 결과를 도 10c(PEG 염색) 및 도 10d(쿠마시 블루)에 나타내었다.
실시예 9. 페길화 rhTSH 의 SEC- HPLC 분석
시료를 수퍼덱스(Superdex) 200 10/300GL 컬럼(GE 헬스케어) 상에 전개시키고, 50mM 인산나트륨, 150mM 염화나트륨 완충액 pH 7에서 분당 0.4ml의 유속으로 용리시켰다. 40kD SAM 반응 및 정제된 페길화 rhTSH 콘쥬게이트의 대표적인 SEC-HPLC 프로파일을 각각 도 11a 및 도 11b에 나타내었다.
실시예 10. 페길화 rhTSH 의 펩티드 맵핑 및 N 말단 시퀀싱
각 시료 20마이크로그램을 6M 구아니딘 하이드로클로라이드 및 38mM 디티오트레이톨을 함유하는 0.1M 트리스, pH 8.5로 희석시키고, 질소를 덧씌우고, 25℃에서 밤새 항온배양하였다. 항온배양 후, 요오드아세트아미드를 50mM로 첨가하였다. 그런 다음, 시료에 질소를 덧씌우고 25˚C에서 2시간 동안 항온배양하였다. 1/1 (v/v) 0.25% 트리플루오로아세트산을 첨가하여 알킬화 반응을 종료시키고, 시료를 3,500 MWCO 슬라이드-A-라이저(Slide-A-Lyzer) 미니 투석 유닛(서모 사이언티픽(Thermo Scientific))을 이용하여 0.1M 트리스, pH 8.5로 투석시켰다. 시료를 1:25 (효소:시료) 비율로 37˚C에서 밤새 분해하였다. 1/1 (v/v) 0.25% 트리플루오로아세트산으로 분해 반응을 종료시켰다. 트립신 분해된 시료를 자동화 주입기 및 분획 수집기, 이원 용매 펌프, 온도 조절 컬럼 구획, 및 가변 파장 검출기를 구비한 애질런트(Agilent) 1200 HPLC를 이용하여 분획화하였다. 시료를, 50˚C로 유지되며, 98% 용매 A(물 내의 0.1% 트리플루오로아세트산) 및 2% 용매 B(아세토니트릴 내 0.08% 트리플루오로아세트산)에 미리 평형을 유지시킨 포로셸(Poroshell) 300SB-C8 컬럼(2.1 x 75 mm, 5㎛ 입자, 애질런트 테크놀로지(Agilent Technologies, 미국 캘리포니아 주)) 상으로 로딩하였다. 트립신 분해 펩티드를 0.4ml/분의 유속으로 25분에 걸쳐 용매 B의 2%에서 60%로의 선형 기울기를 이용하여 용리시켰다. 페길화되지 않은 단편보다 더 큰 %B에서 용리하는 페길화 단편을 수집하고, 원심분리 농축기(서모 사이언티픽(Thermo Scientific), 미국 매사추세츠 주)으로 건조시켰다. 프로사이즈(Procise) 단백질 시퀀서(어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems), 미국 캘리포니아 주)를 이용하여 자동화 N 말단 서열 분석을 수행하였다. 200pmol의 시료와 대조군을 대상으로 사전에 프로그램된 펄스 액체법을 이용하는 자동화 에드먼 분해법을 18회 사이클 시행하였다. 도 12는 40kD SAM 콘쥬게이트의 펩티드 맵과 N 말단 시퀀싱 결과를 나타낸다. 3개의 트립신 분해 당펩티드(AT9, AT6, BT3)만이 검출되어, 탄수화물 페길화의 부위 특이성을 나타내었다. 밑줄 친 N은 N 연결된 당화 부위에 해당한다.
실시예 11. 각 서브유닛 상에서의 상대적인 페길화 양 결정
2회의 연속적인 역상 HPLC 전개를 이용하여, 페길화된 서브유닛으로부터 분리시킨 후의 상대적인 비 페길화 α와 β 서브유닛을 측정함으로써 서브유닛 특이적인 페길화를 계산하였다. 페길화된 α와 β 서브유닛을 분리하는 크로마토그래피 조건을 확인할 수 없었기 때문에 이러한 추론 방법을 이용하였다. 원심성 한외여과에 의해 시료(100㎍)을 20㎕로 농축시킨 다음, 6M 구아니딘 하이드로클로라이드, 10mM 인산 나트륨, 100mM 염화나트륨, pH 7.0 내에서 변성시켰다. 25˚C에서 밤새 항온배양한 후, 시료를 75% 용매 A(10mM 인산 나트륨, pH 6.5)와 25% 용매 B(40% 10mM 인산 나트륨, pH 6.5, 60% 아세토니트릴)로 사전에 평형을 유지시킨 포로셸 300SB-C8 컬럼(2.1 x 75 mm, 5㎛ 입자, 애질런트 테크놀로지, 미국 캘리포니아 주)에 로딩하였다. 컬럼을 5분에 걸쳐 25~50%B로, 뒤이어 20분에 걸쳐 50~75%B로, 25˚C에서 분당 0.4ml로 용리시켰다. 비 페길화 TSH 서브유닛에 해당하는 피크 분획(약 9.5~12.5분)을 전체로서 수집하고(도 13b), 원심성 한외여과로 50㎕ 미만으로 농축시켰다. 시료를 물로 50㎕까지 조정한 다음, 2M 디티오트레이톨 4.7㎕와 6M 구아니딘 하이드로클로라이드, 0.1M 트리스, pH 8.5 150㎕를 첨가하여 환원시키고, 질소를 덧씌워 25℃에서 밤새 항온배양하였다. 그런 다음, 2M 요오드아세트아미드 9.3㎕를 첨가하여 유리 티올을 알킬화하고, 질소를 덧씌워, 25℃에서 2시간 동안 항온배양하였다. 0.25% 트리플루오로아세트산 150㎕를 첨가하여 알킬화 반응을 종료시켰다. 환원 및 알킬화된 비 페길화 TSH 서브유닛을 제2의 역상 HPLC 전개로 분석하였다. HPLC 컬럼 설정은 용매 A가 물 내의 0.1% 트리플루오로아세트산으로 이루어졌고, 용매 B가 아세토니트릴 내의 0.08% 트리플루오로아세트산으로 이루어졌다는 점, 그리고 컬럼이 50℃로 유지되었다는 점을 제외하고는 위에 지시된 바와 동일하였다. 컬럼은 0.3ml/분으로 15분간 2~75%B의 선형 기울기로 용리시켰다. 결과로 얻어진 시료당 3회 주입으로부터의 A214nm 크로마토그램(도 13c)의 적분으로 비 페길화 α 대 β 서브유닛의 상대적인 퍼센트를 결정하였다. 그런 다음, 페길화 α 대 β 서브유닛의 퍼센트를 이들 값의 역수로 간주하였다. 이러한 분석 결과는 40kD 모노페길화 GAM-, GAM+ 및 SAM 콘쥬게이트에서 변경된 α 서브유닛의 분획이 각각 77%, 66%, 및 58%임을 보여주었으며, 이는 SDS-PAGE로 얻어진 결과(도 13a)와 일치하였다.
실시예 12. 시험관 내 수용체 결합 분석법
RSR 리미티드(Kronus, Star, ID)의 TSH 수용체 자기 항체 2세대 ELISA 키트를 이용하여 시험관 내 돼지 TSH 수용체 결합 분석법으로 정제된 페길화 콘쥬게이트를 분석하였다. 키트가 제공하는 TSH 수용체에 대해 비오틴이 부착된 인간 단일 클론성 자기 항체를 이용하는 대신, 본 발명자들은 TSH 수용체에 대한 결합의 경쟁적 억제를 위해 타이로젠(Thyrogen®)(rhTSH)을 비오틴화하여 사용하였다. 고정화된 돼지 TSH 수용체에 대한 비오틴이 부착된 rhTSH의 결합은 rhTSH 대조군 또는 페길화된 rhTSH 콘쥬게이트에 의해 억제되었고, IC50 값을 측정하였다.
제조사의 프로토콜(QED 바이오사이언스(QED Bioscience Inc.), 미국 캘리포니아 주 샌디에고)에 따라 크로마링크(ChromaLink™)비오틴 라벨링 시약을 이용하여 단백질당 1.7 내지 1.8개의 비오틴으로 타이로젠(Thyrogen®)을 비오틴화하였고, 제바(Zeba™) 탈염 스핀 컬럼(Desalt Spin Column)(서모 사이언티픽, 미국 일리노이 주 록포드)으로 50mM 인산 나트륨, 150mM 염화나트륨, pH 7.0 내로 완충액 교환하였다. RSR 리미티드(Kronus, Star, ID)의 TSH 수용체 자기 항체 2세대 ELISA 키트와 함께 공급된 96웰 플레이트 상에 고정시킨 돼지 TSH 수용체에 대한 결합에 대한 비오틴이 부착된 타이로젠과 PEG-rhTSH 콘쥬게이트의 경쟁에 의해 시험관 내 수용체 결합 측정을 수행하였다. PEG-rhTSH 콘쥬게이트를 분석 완충액(100mM HEPES pH 7.5, 20mM EDTA, 1% BSA, 0.5% Triton X-100)에 1:5로 16μM내지 41pM로 단계별로 희석하고, 분석 완충액에 1000배 희석한 비오틴이 부착된 타이로젠과 1:1로 혼합하였다. 혼합물을 각 수용체가 코팅된 웰에 첨가하고, 25˚C에서 25분 동안 항온배양하였다. 플레이트에 결합된 비오틴이 부착된 타이로젠의 양을 결정하기 위하여, 결합되지 않은 rhTSH를 씻어내고, RSR 리미티드 ELISA 프로토콜에 따라 스트렙트아비딘 페록시다아제를 25℃에서 20분 동안 첨가하였다. 그런 다음, 과량의 비 결합 스트렙트아비딘 페록시다아제를 제거하기 위하여 플레이트를 3회 세척한 다음, 각 웰에 테트라메틸벤지딘(TMB)을 첨가하고 25℃의 암소에서 30분 동안 항온배양하였다. 0.5M 황산 정지 완충액으로 반응을 종료시키고, 스펙트라맥스(SpectraMax®)340pc 플레이트 판독기(몰레큘러 디바이스(Molecular Devices), 미국 캘리포니아 주 서니베일)을 이용하여 450nm에서 각 웰의 흡광도를 판독하였다. 그래프패드(GraphPad) 프리즘 소프트웨어로 S자형 용량 반응식을 이용하여 데이터를 적합하게 하여, IC50 값을 생성하였다.
N 말단 및 리신 페길화는 탄수화물 콘쥬게이션보다 더 낮은 TSH 수용체 친화도를 나타내는 콘쥬게이트를 생산하였다. 40kD PEG를 이용한 N 말단 모노 페길화는 TSH 대조군에 비해 10.8배 더 낮은 수용체 결합 친화도를 초래했다. 40kD PEG를 이용한 리신 페길화는 TSH 대조군에 비해 31.2배 더 낮은 수용체 결합 친화도를 초래했다. 대조적으로, GAM+ 모노 페길화는 20kD PEG 콘쥬게이션에 대해 2.2배 더 낮은 수용체 결합 친화도와 40kD PEG 콘쥬게이션에 대해 3.6배 더 낮은 수용체 결합 친화도를 초래했다. 또한, SAM 모노 페길화는 N 말단 페길화에 비해 시험관 내 TSH 수용체 결합 친화도의 적당한 감소를 가져왔는데, 콘쥬게이트된 PEG의 크기에 따라 2.1배 내지 5.3배 감소 범위를 나타냈다. GAM(-) 모노 페길화는 모든 탄수화물 페길화 전략 가운데 최대의 손실을 유발하였는데, 20kD PEG 콘쥬게이션은 시험관 내 TSH 수용체 결합 친화도의 2.7배의 감소를, 40kD PEG 콘쥬게이션은 8.0배의 감소를 유발하였다(표 3a와 표 3b 및 도 14 참조).
<표 3a>
Figure 112014066304211-pct00001
<표 3b>
Figure 112014066304211-pct00002
실시예 13. 단일 근육 내( IM ) 주사 후 수컷과 암컷 스프래그 다우리 랫트에서의 페길화 rhTSH 의 약동학 및 약력학 분석
단일 근육 내(IM) 주사 후 수컷과 암컷 랫트에서 rhTSH와 페길화 rhTSH(20kD SAM, 20kD GAM(-), 20kD GAM(+), 40kD GAM(+))의 약동학을 평가하였다.
단일 용량의 rhTSH 또는 페길화 rhTSH(20kD SAM, 20kD GAM(-), 20kD GAM(+), 40kD GAM(+))를 0.5mg/kg의 용량으로 금식시킨 수컷과 암컷의 경정맥 삽관 랫트에 IM 투여하였다. 용량 부피 제한 때문에, 동물들은 사두근으로 2회 또는 3회의 근육 내 주사 형태로 시험 품목을 투여받았다. 다리를 번갈아 가며 투여하였다. 용량 투여 전과 용량 투여 후 시점:0.5, 1, 2, 4, 8, 24, 및 48시간에 동물로부터 혈액 시료를 채취하였다. 시험 품목 투여 전날 저녁, 동물 케이지로부터 음식물을 치웠다. 이 기간 동안 동물들은 물에는 접근할 수 있었다. 용량 투여 전 시료 채취 및 시험 품목 투여 후에 음식물을 케이지에 다시 넣어주었다. 그 날을 마칠 때 다시금 음식물을 치워서 24시간의 용량 투여 후 시료 채취를 하는 동안 동물들을 금식시켰다. 시료 채취 후 음식물을 다시 케이지에 넣어주고, 그 날을 마칠 때 다시 치워서, 48시간의 용량 투여 후 시료 채취를 하는 동안 동물들을 금식시켰다. 단일 포트의 경정맥 캐뉼라로부터 혈액을 채취하였다. 대략 400㎕의 전혈을 혈청 분리기 튜브에 수집하여 혈청에 대해 처리하였다. 혈청을 두 개의 튜브(각각 대략 100㎕)로 분리하였다. TSH ELISA로 rhTSH 또는 페길화 rhTSH 농도를 분석할 때까지 모든 시료들을 -80℃에 보관하였다. 최종 시료 채취 후, 동물을 CO2로 안락사시켰다.
군 동물 번호 시험 품목 용량
(mg/kg)		 투여 경로 시점
1 1~6 rhTSH 0.5 IM 투여 전, 투여 후 0.5, 1, 2, 4, 8, 24 및 48시간
2 7~12 PEG rhTSH
(20KD SAM)		 0.5 IM 투여 전, 투여 후 6, 24, 48 및 72시간
3 13~18 PEG rhTSH
(20KD GAM-)		 0.5 IM 투여 전, 투여 후 6, 24, 48 및 72시간
4 19~24 PEG rhTSH
(20KD GAM+)		 0.5 IM 투여 전, 투여 후 6, 24, 48 및 72시간
5 25~30 PEG rhTSH
(40KD GAM+)		 0.5 IM 투여 전, 투여 후 6, 24, 48 및 72시간
rhTSH
(n=5)		 20KD SAM
(n=6)		 20KD GAM(-)
(n=6)		 20KD GAM(+)
(n=6)		 40KD GAM(+)
(n=6)
t1 /2 (hr) 5.68±2.33 30.1±6.47 27.0±3.91 12.6±3.45 38.6±19.6
CI (ml/hr/kg) 131±27.7 4.74±0.54 3.31±0.41 156±25.5 12.2±1.88
Vz (ml/kg) 1051±386 203±38.8 128±22.7 2818±843 650±233
Cmax (ug/ml) 0.42±0.14 2.09±0.56 3.85±0.79 0.23±0.06 0.81±0.18
Tmax (hr) 2.00±0.00 16.0±8.76 5.33±3.01 1.50±0.55 7.00±8.65
AUCINF
(ug*hr/ml)		 3.94±0.73 107±11.2 153±21.3 3.30±0.65 41.6±6.00
PK 데이터는 20kD SAM과 20kD GAM(-)이 rhTSH 대조군에 비해 > 5배의 오래 계속되는 t1/2, 오래 계속되는 Tmax 및 증가된 노출(곡선 아래 면적, AUC)을 나타냄을 보여주었다. 20 kD GAM(+)의 PK 프로파일은 20kD SAM과 20kD GAM(-)에 비해 덜 향상되었음을 보여주었고, 40kD GAM(+)은 중간 정도의 향상만을 나타내었다. Vz(겉보기 분포 부피)의 증가된 값은 GAM(+) 콘쥬게이트가 수용체 매개 제거를 겪을 수 있음을 나타내었다(도 16 및 표 5 참조). 제조사의 프로토콜에 따라, ACE 임상 화학 시스템(Alfa Wassermann Diagnostic Technologies, LLC)을 이용하여 약력학 데이터(도 15 참조)를 수집하고자 혈청 T4 농도를 측정하였다.
실시예 14. 단일 IM 주사 후 수컷과 암컷 스프래그 다우리 랫트에서의 페길화 rhTSH 의 약동학 분석
단일 근육 내(IM) 주사 후 수컷과 암컷 랫트에서 페길화 rhTSH(10kD 멀티SAM, 10kD SAM, 40kD SAM, 40kD GAM(-))의 약동학을 평가하였다.
단일 용량의 rhTSH 또는 페길화 rhTSH(10kD 멀티SAM, 10kD SAM, 40kD SAM, 40kD GAM(-))를 0.5mg/kg의 용량으로 금식시킨 수컷과 암컷의 경정맥 삽관 랫트에 IM 투여하였다. 용량 부피 제한 때문에, 동물들은 사두근으로 2회 또는 3회의 근육 내 주사 형태로 시험 품목을 투여받았다. 다리를 번갈아 가며 투여하였다. 용량 투여 전과 용량 투여 후 시점:0.5, 1, 3, 6, 24, 48, 72 및 96시간에 동물로부터 혈액 시료를 채취하였다. 시험 품목 투여 전날 저녁, 동물 케이지로부터 음식물을 치웠다. 이 기간 동안 동물들은 물에는 접근할 수 있었다. 용량 투여 전 시료 채취 및 시험 품목 투여 후에 음식물을 케이지에 다시 넣어주었다. 각각의 날을 마칠 때 다시금 음식물을 치워서 다음날 아침에 용량 투여 후 시료 채취를 위해 금식시켰다. 각각의 용량 투여 후 시료 채취 후 음식물을 다시 케이지에 넣어주었다. 단일 포트의 경정맥 캐뉼라로부터 혈액을 채취하였다. 대략 400㎕의 전혈을 혈청 분리기 튜브에 수집하여 혈청에 대해 처리하였다. 혈청을 두 개의 튜브(각각 대략 100㎕)로 분리하였다. TSH ELISA로 rhTSH 또는 페길화 rhTSH 농도를 분석할 때까지 모든 시료들을 -80℃에 보관하였다. 최종 시료 채취 후, 동물을 CO2로 안락사시켰다.
군 동물 번호 시험 품목 용량
(mg/kg)		 투여 경로 시점
1 1~6 rhTSH 0.5 IM 투여 전, 투여 후 0.5, 1, 3, 6, 24, 48, 72, 및 96시간
2 7~12 PEG rhTSH
(10KD 멀티SAM)		 0.5 IM 투여 전, 투여 후 0.5, 1, 3, 6, 24, 48, 72, 및 96시간
3 13~18 PEG rhTSH
(10KD SAM)		 0.5 IM 투여 전, 투여 후 0.5, 1, 3, 6, 24, 48, 72, 및 96시간
4 19~24 PEG rhTSH
(40KD SAM)		 0.5 IM 투여 전, 투여 후 0.5, 1, 3, 6, 24, 48, 72, 및 96시간
5 25~30 PEG rhTSH
(40KD GAM-)		 0.5 IM 투여 전, 투여 후 0.5, 1, 3, 6, 24, 48, 72, 및 96시간
rhTSH
(n=6)		 10KD SAM
(n=5)		 10KD 멀티 SAM
(n=6)		 40KD SAM
(n=4)		 40KD GAM(-)
(n=6)
t1 /2 (hr) 3.42±0.61 15.8±1.23 46.8±10.4 77.9±16.9 80.1±16.1
CI (ml/hr/kg) 167±31.3 15.8±1.38 2.35±0.77 1.04±0.16 1.27±0.15
Vz (ml/kg) 810±129 358±18.9 159±60.4 114±9.24 146±25.3
Cmax (ug/ml) 0.44±0.11 1.0±0.11 3.11±1.02 3.81±0.31 3.19±0.55
Tmax (hr) 1.50±1.18 5.40±1.34 14.5±18.33 30.0±12.0 28.0±9.8
AUCINF
(ug*hr/ml)		 3.07±0.53 31.8±2.71 228±59.3 492±82.5 397±46.9
PK 데이터는 10kD 멀티 SAM, 40kD SAM, 및 40kD GAM(-)이 rhTSH 대조군에 비해 14~23배의 오래 계속되는 t1/2, 오래 계속되는 Tmax 및 증가된 노출(곡선 아래 면적, AUC)을 나타냄을 보여주었다(도 17 및 표 7 참조). 40kD SAM과 40kD GAM(-)의 PK 프로파일에서 관찰된 향상은 실시예 13의 20kD SAM과 20kD GAM(-)보다 더 크다.
PEG 콘쥬게이트의 생체 내 랫트 약동학 연구( 실시예 13 및 실시예 14): 전반적으로, 혈장 반감기는 예상했던 대로 rhTSH에 콘쥬게이트된 PEG의 크기에 비례하여 증가되었다. 동일한 PEG 크기의 SAM 및 GAM(-) 콘쥬게이트의 경우, 수용체 결합 친화도와는 달리, PK 특질의 향상을 위한 두 개의 페길화 전략 사이에 뚜렷한 차이가 없어, PK에 미치는 영향은 단지 PEG 크기에 의존적일 뿐, 페길화 부위에 의존적이지 않다는 점을 시사한다. 예를 들어, 40kD SAM과 40kD GAM(-)은 rhTSH 대조군(3.42 ± 0.61시간)에 비해 각각 77.9 ± 16.9시간과 80.1 ± 16.1시간으로 혈장 반감기의 23배 증가를 나타냈다. 멀티 페길화(10kD 멀티SAM)는 동일한 크기의 PEG의 모노 페길화(10kD SAM)에 비해 혈장 반감기의 더 큰 증가를 나타냈다. 10kD 멀티SAM은 rhTSH 대조군에 비해 46.8 ± 10.4시간으로 13.7배 증가했지만, 10kD SAM은 15.8 ± 1.23시간으로 겨우 4.6배 증가하였다(표 7 참조). 농도 피크 시간(Tmax)의 PEG 크기 의존적 지연 또한 관찰되었다. 예를 들어, 10kD, 20kD 및 40kD SAM은 2.00 ± 0.00시간 또는 1.50 ± 1.18시간의 rhTSH 대조군에 비해, 각각 5.40 ± 1.34시간, 16.0 ± 8.76시간 및 30.0 ± 12.0시간의 Tmax를 나타냈다(표 5 및 표 7 참조).
실시예 15. 약동학 분석법: rhTSH 또는 페길화 rhTSH ELISA
혈청 시료 내 단백질 농도 측정
높은 결합의 96웰 ELISA 플레이트를 pH 9.2의, 0.1M 중탄산 나트륨 완충액에 희석시킨 1.33㎍/ml의 쥐 항-hCG 포획 항체로 코팅하고, 웰당 100㎕로 첨가하였다. 정제된 단백질로부터 표준 rhTSH 또는 페길화 rhTSH 곡선을 작성하고, 1X 플레이트 세척제 내의 1.0% w/v BSA로 이루어지는 시료 희석 완충액(SDB)에 희석하였다. 분석당 rhTSH 또는 페길화 rhTSH 종의 검정을 거친 선형 범위에 따라, 2:3 계열 희석 계획을 이용하여, 표준물질을 25-1.463ng/mL로부터, 8.334-0.488ng/mL 또는 5.556 내지 0.325ng/mL로 희석하였다. 시료를 1:10 이상의 희석비율로 SDB에 희석하였다. 정상 랫트 혈청에 제조한 500ng/mL, 및 25ng/mL rhTSH 대조군을 각각 SDB에 1:100 및 1:10으로 희석하였다. SDB에 제조한 0.5ng/mL rhTSH 대조군을 희석하지 않은 채로 첨가하였다. 코팅된 플레이트를 세척하고, 시료, 표준물질 및 대조군 100㎕를 플레이트에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 항온배양하였다.
비오틴이 부착된 항-rhTSH 단일 클론성 검출 항체(클론 TS8)를 각 로트에 특이적인 적당한 희석도에 따라 SDB에 희석하였다. 플레이트를 세척하고, 희석된 비오틴 부착 검출 항체 100㎕를 웰에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 항온배양하였다.
스트렙트아비딘-호스래디시 페록시다아제 콘쥬게이트(SA-HRP)를 각 로트에 특이적인 적당한 희석도에 따라 SDB에 희석하였다. 플레이트를 세척하고, 희석된 SA-HRP 100㎕를 웰에 첨가하고, 25℃에서 15분 동안 항온배양하였다.
플레이트를 세척하고, 테트라메틸 벤지딘(TMB) 기질 100㎕를 모든 웰에 첨가하고, 25℃에서 20분 동안 항온배양하였다.
TMB 정지 완충액 100㎕를 모든 웰에 첨가하고, 플레이트를 450nm에서 판독하였다.
실시예 16. 페길화 rhTSH 약력학의 마우스 T4 생물 검정 평가
단일 IP 주사, T3 펠릿 이식 3일 후, 페길화 rhTSH의 약력학을 수컷 마우스에서 평가하였다. 이러한 마우스 PD 모델에서, 투여 3일 전 완효성 T3 펠릿 이식에 의한 연구 기간 동안 내인성 마우스 T4를 억제시켰다(도 18a 내지 도 18d의 용제 군 참조). 따라서, rhTSH 대조군 또는 페길화 rhTSH 콘쥬게이트에 의해 방출된 T4의 양만 측정되었다. 마우스의 제한된 혈액 부피 때문에, 용량 투여 후 6, 24, 48 및 72시간의 4회의 시점을 수집하였다.
이소플루란으로 동물을 마취시키고, 투관침을 이용하여 0.1mg T3 펠릿(T-261, Innovative Research of America)을 피하로 이식하였다. 펠릿 이식 후 3일째에 수컷 마우스(ICR 계통, 6주령, Taconic Farms)에 단일 용량의 rhTSH(0.4 또는 4.0mg/kg) 또는 페길화 rhTSH(4mg/kg)을 IP 투여하였다. 이소플루란으로 동물을 마취시키고, 안구뒤 신경얼기로부터 혈액 시료를 채취하였다. 1군의 혈액 시료를 용량 투여 전(동물 1~4), 시험 품목 투여 후 6시간(동물 5~8), 24, 48, 및 72시간에 채취하였다. 모든 다른 군으로부터의 혈액 시료는 시험 품목 투여 후 6, 24, 48, 및 72시간째에 채취하였다. 대략 60㎕의 전혈을 마이크로헤마토크릿 모세관으로 채취하여, 혈청에 대해 처리하였다. 마지막 시료 채취 후, CO2로 동물을 안락사시켰다. 모든 혈청 시료는 ACE® 임상 화학 T4 분석법으로 T4 농도를 분석할 때까지 -80˚C 에 보관하였다. 혈청 T4 농도를 제조사의 프로토콜에 따라 ACE 임상 화학 시스템(Alfa Wassermann Diagnostic Technologies, LLC)으로 측정하였다.
군 동물
번호		 펠릿 투여
경로		 시험
품목		 용량
(mg/kg)		 투여
경로		 시점
1 1~8 T3, 0.1mg SC 용제
(PBS 내 0.2% BSA)		 0.0 IP 용량 투여 전(1~4), 투여 후 6(5~8), 24, 48, 및 72시간
2 9~16 T3, 0.1mg SC rhTSH 0.4 IP 용량 투여 후 6, 24, 48, 및 72시간
3 17~24 T3, 0.1mg SC rhTSH 4 IP 용량 투여 후 6, 24, 48, 및 72시간
4 25~32 T3, 0.1mg SC PEG rhTSH
40KD SAM		 4 IP 용량 투여 후 6, 24, 48, 및 72시간
5 33~40 T3, 0.1mg SC PEG rhTSH
10KD
멀티SAM		 4 IP 용량 투여 후 6, 24, 48, 및 72시간
6 41~48 T3, 0.1mg SC PEG rhTSH
10KD
멀티GAM(+)		 4 IP 용량 투여 후 6, 24, 48, 및 72시간
용제 처리 동물로부터의 데이터는 피하 T3 펠릿을 통한 연구 지속기간 동안 T4 억제로 인한 모델의 타당성을 보여주었다. 6시간째에, 모든 처리는 용제에 비해 유의미하게(p<0.001) T4를 증가시켰다(도 18a). 24시간째에, 0.4mg/kg rhTSH는 용제와 유사한 T4 수준으로 되돌아가기 시작했으나, 처리한 나머지는 용제에 비해 유의미하게(p<0.001) 상승시켰다(도 18b). 48시간에는 두 가지(0.4mg/kg 및 4mg/kg) rhTSH 처리가 T4의 용제와 비슷한 T4 수준으로 되돌아갔고, 세 가지 PEG 콘쥬게이트는 약간 감소되었으나, 4mg/kg의 rhTSH와 비교할 때 유의미하게(p<0.001) 상승되었다(도 18c). 72시간에는 40KD SAM과 10KD 멀티 SAM이 (48시간 시점과 비슷한) 상승된 채로 남아있었으나, 10KD 멀티 GAM(+)은 약간 떨어졌다(도 18d). 모든 콘쥬게이트는 rhTSH 4mg/kg과 비교할 때 상승된 채로 유지되었고, 추가적으로 40KD SAM과 10KD 멀티 SAM은 10KD 멀티 GAM(+)과 비교할 때 상승되었다(p<0.001).
10KD 멀티 SAM 및 40KD SAM은 PK(실시예 14) 및 PD(실시예 16) 데이터를 기초로 할 때, 전도유망한 후보인 것으로 나타났다. 10KD 멀티 GAM(+)도 마찬가지로 전도유망한 것으로 나타났으나, 두 가지의 더 전도유망한 후보에 비해 그만큼 향상된 작용시간을 나타내지는 않았다.
실시예 17. 페길화 rhTSH 약력학(40kD SAM)의 용량 반응 곡선 연구 평가
단일 IP 주사, T3 펠릿 이식 3일 후, 페길화 rhTSH(40kD SAM)의 약력학을 수컷 마우스에서 세 가지 상이한 용량 수준으로 평가하였다.
이소플루란으로 동물을 마취시키고, 투관침을 이용하여 0.1mg T3 펠릿(T-261, Innovative Research of America)을 피하로 이식하였다. 펠릿 이식 후 3일째에 수컷 마우스(ICR 계통, 6주령, Taconic Farms)에 단일 용량의 rhTSH 또는 페길화 rhTSH(40kD SAM)을 0.04mg/kg(도 19a), 0.4mg/kg(도 19b), 또는 4mg/kg (도 19c)의 용량으로 IP 투여하였다. 이소플루란으로 동물을 마취시키고, 안구뒤 신경얼기로부터 혈액 시료를 채취하였다. 1군의 혈액 시료를 시험 품목 투여 후 6시간(동물 1~4), 24, 48, 72, 및 96시간(동물 5~8)에 채취하였다. 모든 다른 군으로부터의 혈액 시료는 시험 품목 투여 후 6, 24, 48, 및 72시간째에 채취하였다. 대략 60㎕의 전혈을 마이크로헤마토크릿 모세관으로 채취하여, 혈청에 대해 처리하였다. 마지막 시료 채취 후, CO2로 동물을 안락사시켰다. 모든 혈청 시료는 ACE® 임상 화학 T4 분석법으로 T4 농도를 분석할 때까지 -80˚C에 보관하였다. 혈청 T4 농도를 제조사의 프로토콜에 따라 ACE 임상 화학 시스템(Alfa Wassermann Diagnostic Technologies, LLC)으로 측정하였다.
군 동물 번호 펠릿 투여 경로 시험 품목 용량
(mg/kg)		 투여
경로
1 1~8 T3, 0.1mg SC 용제
(PBS 내 0.2% BSA)		 0.0 IP
2 9~16 T3, 0.1mg SC rhTSH 0.04 IP
3 17~24 T3, 0.1mg SC rhTSH 0.4 IP
4 25~32 T3, 0.1mg SC rhTSH 4 IP
5 33~40 T3, 0.1mg SC PEG rhTSH 40KD SAM 0.04 IP
6 41~48 T3, 0.1mg SC PEG rhTSH 40KD SAM 0.4 IP
7 49~56 T3, 0.1mg SC PEG rhTSH 40KD SAM 4 IP
AUEC ( 유효곡선 아래 면적) 계산에 의한 연장 평가
rhTSH
0.04mg/kg 		40KD SAM
0.04mg/kg 		rhTSH
0.4mg/kg 		40KD SAM
0.4mg/kg 		rhTSH
4.0mg/kg 		40KD SAM
4mg/kg
153±48.2 해석 불가능 153±17.1 179±36.3 158±22.2 637±189***
* rhTSH와 비교시 p<0.001
용제 처리 동물로부터의 데이터는 피하 T3 펠릿을 통한 연구 지속기간 동안 T4 억제로 인한 모델의 타당성을 보여주었다. 모든 용량의 rhTSH는 동등한 AUEC를 나타냈으며, 용량 반응 곡선의 정상에서 겉보기의 최대 효과를 나타냈다. 40KD SAM은 효과 없음으로부터, 약간의 효과, 겉보기의 최대 효과까지의, 완전한 용량 반응 곡선을 나타내는 AUEC를 보여주었다. rhTSH 처리는 6시간째에 모든 용량에서 T4 수준을 증가시킨 다음, 24시간째에 용제와 유사한 T4 수준으로 감소되었으나, 용량 투여 후 48시간째에 용제 수준으로 되돌아가는 T4 수준을 나타낸 최대 용량인 4mg/kg은 예외였다. 40KD SAM을 이용한 연장 효과는 본 마우스 PD 모델에서 용량에 의존적이었고, 4mg/kg 용량 수준에서 가장 의미가 있었다. 0.4mg/kg 수준에서는 약간의 효과 증진만이 보였다.
실시예 18. 단일 IM 주사, T3 펠릿 이식 후 3일 후의 수컷과 암컷 스프래그 다우리 랫트에서 페길화 rhTSH 의 약력학적 분석
단일 근육 내(IM) 주사, T3 펠릿 이식 3일 후, 페길화 rhTSH의 약력학을 수컷과 암컷 랫트에서 평가하였다.
이소플루란으로 동물을 마취시키고, 투관침을 이용하여 1.5mg T3 펠릿(T-261, Innovative Research of America)을 피하로 이식하였다. 펠릿 이식 후 3일째에 단일 용량의 rhTSH 또는 페길화 rhTSH를 0.0mg/kg(용제), 0.04mg/kg, 0.4mg/kg, 또는 0.65mg/kg의 용량으로 수컷과 암컷의 경정맥 삽관 랫트에 IM 투여하였다. 40kD 멀티 SAM 및 50kD 멀티 SAM의 경우, 모노 페길화 종의 함량을 기초로 하여 0.65mg/kg 용량을 결정하였다. 용량 부피 제한 때문에, 동물들은 사두근으로 2회의 근육 내 주사 형태로 시험 품목을 투여받았다. 다리를 번갈아 가며 투여하였다. 용량 투여 전과 용량 투여 후 시점: 1, 3, 6, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 및 168시간에 동물로부터 혈액 시료를 채취하였다. 단일 포트의 경정맥 캐뉼라로부터 혈액을 채취하였다. 대략 250㎕의 전혈을 혈청 분리기 튜브에 수집하고, 최소 30분 동안 혈액이 응고되도록 하였다. 튜브를 5분 동안 10,000rpm의 원심분리기에 회전시키고, 혈청을 두 개의 튜브(각각 약 50㎕)로 분리하였다. 모든 시료들을 ACE® 임상 화학 T4 분석법으로 T4 농도를 분석할 때까지 -80˚C에 보관하였다. 최종 시료 채취 후, 동물을 CO2로 안락사시켰다. 제조사의 프로토콜에 따라 ACE 임상 화학 시스템(Alfa Wassermann Diagnostic Technologies, LLC)으로 혈청 T4 농도를 측정하였다.
군 동물 번호
수컷		 동물 번호
암컷		 펠릿 투여 경로 시험 품목 용량(mg/kg)
/경로
1 1~2 3~4 T3, 1.5mg SC 용제
(PBS 내 0.2% BSA)		 0.0/IM
2 5~6 7~8 T3, 1.5mg SC rhTSH 0.04/IM
3 9~10 11~12 T3, 1.5mg SC rhTSH 0.4/IM
4 13~15 16~18 T3, 1.5mg SC PEG rhTSH
10KD 멀티SAM		 0.04/IM
5 19~21 22~24 T3, 1.5mg SC PEG rhTSH
10KD 멀티SAM		 0.4/IM
6 25~27 29~30 T3, 1.5mg SC PEG rhTSH
40KD SAM		 0.4/IM
7 31~33 33~36 T3, 1.5mg SC PEG rhTSH
40KD 멀티SAM		 0.65/IM
8 37~39 40~42 T3, 1.5mg SC PEG rhTSH
40KD 멀티SAM		 0.65/IM
AUEC ( 유효곡선 아래 면적) 계산에 의한 연장 평가
AUEC
계산 		rhTSH
0.04mg/kg 		rhTSH
0.4mg/kg 		10KD 멀티
0.04mg/kg 		10KD 멀티
0.4mg/kg 		40KD SAM 0.4mg/kg 40KD 멀티 0.65mg/kg 50KD 멀티 0.65mg/kg
0~96시간 113±39.1 151±34.7 62.2±33.2 200±77.6 227±72.0 261±49.6 294±86.9*
0~120시간 119±44.5 151±34.7 62.2±33.2 201±75.9 237±78.2 271±54.1 319±102*
0~144시간 129±49.8 151±34.7 62.2±33.2 201±75.9 240±79.3 272±55.1 327±110*
0~168시간 143.8±64.4 152±32.0 64.6±32.6 203±76.7 243±79.8 275±56.1 333±110*
* rhTSH와 비교시 p<0.05
용제 처리 동물로부터의 데이터는 피하 T3 펠릿을 통한 연구 지속기간 동안 T4 억제로 인한 모델의 타당성을 보여주었다. rhTSH의 Tmax는 용량 투여 후 6시간째에 일어났고, 용량 투여 후 72시간까지 바탕선(즉, 용제군 수준)으로 되돌아갔다. 10KD 멀티 SAM Tmax는 용량 투여 후 24시간째에 일어났고, 0.04mg/kg 용량의 경우 용량 투여 후 72시간에, 0.4mg/kg 용량의 경우 용량 투여 후 96시간에 바탕선으로 돌아갔다. 저용량 데이터는 본 모델에서 rhTSH에 대한 10KD 멀티 SAM의 감소된 효능을 보여주었는데, 이는 감소된 TSH 수용체 결합 친화도를 반영할 수 있다. 고용량 데이터는 용량 투여 후 48시간 및 72시간에 10KD 멀티 SAM을 이용한 증진된 약력학적 효과를 확인시켜주었다. 40kD 멀티SAM 및 50kD 멀티SAM을 포함하는 모든 후보는 0.4mg/kg에서 rhTSH에 비해 증진된 T4 반응을 보였고, 이는 부분적으로는 용량 투여 후 24시간까지 Tmax의 이동에 의해 매개되었을 것이다. 연장된 약력학적 활성은 용량 투여 후 96~120시간에 걸쳐 관찰되었다. (40kD 멀티 SAM 및 50kD 멀티 SAM의 경우, 0.65mg/kg 용량은 이들 콘쥬게이트 내에서 모노 페길화 종의 퍼센트 함량을 기초로 할 때, 0.4mg/kg과 동등하다.) 모든 시험 품목에 대해, 대략 95%의 약력학적 효과가 근육 내 투여 후의 용량 투여 후 96시간 이내에 관찰되었다.
페길화 콘쥬게이트에서 관찰된 더 높은 AUEC는 용량 투여 후 24~96시간 사이의 더 높은 T4 수준에 의해 유발된다. 0~96시간의 기간 동안, 10KD 멀티 SAM은 rhTSH AUEC의 1.3배, 40KD SAM은 1.5배, 40KD 멀티 SAM은 1.7배, 및 50KD 멀티 SAM은 1.9배를 나타냈다(표 12, 도 20).
실시예 19. 단일 IM 주사, T3 펠릿 이식 후 3일 후의 수컷과 암컷 스프래그 다우리 랫트에서 페길화 rhTSH 의 약력학적 분석
단일 근육 내(IM) 주사, T3 펠릿 이식 3일 후, 페길화 rhTSH의 약력학을 수컷과 암컷 랫트에서 평가하였다.
이소플루란으로 동물을 마취시키고, 투관침을 이용하여 1.5mg T3 펠릿(T-261, Innovative Research of America)을 피하로 이식하였다. 펠릿 이식 후 3일째에 단일 용량의 rhTSH 또는 페길화 rhTSH를 0.0mg/kg(용제), 0.4mg/kg, 또는 0.65mg/kg의 용량으로 수컷과 암컷의 경정맥 삽관 랫트에 IM 투여하였다. 50kD 멀티 SAM의 경우, 모노 페길화 종의 함량을 기초로 하여 0.65mg/kg 용량을 결정하였다. 용량 부피 제한 때문에, 동물들은 사두근으로 2회의 근육 내 주사 형태로 시험 품목을 투여받았다. 다리를 번갈아 가며 투여하였다. 용량 투여 전과 다음과 같은 용량 투여 후 시점에 동물로부터 혈액 시료를 채취하였다: 6(도 21a), 24(도 21b), 48(도 21c), 72(도 21d), 96(도 21e), 및 168시간(도 21f). 단일 포트의 경정맥 캐뉼라로부터 혈액을 채취하였다. 대략 250㎕의 전혈을 혈청 분리기 튜브에 수집하고, 최소 30분 동안 혈액이 응고되도록 하였다. 튜브를 5분 동안 10,000rpm의 원심분리기에 회전시키고, 혈청을 두 개의 튜브(각각 약 50㎕)로 분리하였다. 모든 시료들을 ACE® 임상 화학 T4 분석법으로 T4 농도를 분석할 때까지 -80˚C에 보관하였다. 최종 시료 채취 후, 동물을 CO2로 안락사시켰다. 제조사의 프로토콜에 따라 ACE 임상 화학 시스템(Alfa Wassermann Diagnostic Technologies, LLC)으로 혈청 T4 농도를 측정하였다.
군 동물 번호
수컷		 동물 번호
암컷		 펠릿 투여 경로 시험 품목 용량(mg/kg)
/경로
1 1~3 4~6 T3, 1.5mg SC 용제
(PBS 내 0.2% BSA)		 0.0/IM
2 7~9 10~12 T3, 1.5mg SC rhTSH 0.4/IM
3 13~16 17~20 T3, 1.5mg SC PEG rhTSH
10KD 멀티SAM		 0.4/IM
4 21~24 25~28 T3, 1.5mg SC PEG rhTSH
40KD 멀티SAM		 0.4/IM
5 29~32 33~36 T3, 1.5mg SC PEG rhTSH
50KD 멀티SAM		 0.65/IM
AUEC ( 유효곡선 아래 면적) 계산에 의한 연장 평가
AUCE 계산 rhTSH
0.4mg/kg 		10KD 멀티
0.4mg/kg 		40KD SAM
0.4mg/kg 		50KD 멀티
0.4mg/kg
0~96시간 176±82 203.7±62.8 277±68 337±111
0~168시간 190±87.7 245±82.6 429±82.0 506±231
용제 처리 동물로부터의 데이터는 피하 T3 펠릿을 통한 연구 지속기간 동안 T4 억제로 인한 모델의 타당성을 보여주었다(도 22 참조). 연장된 약력학적 효과는 각각의 시험 품목에 대해 군 내에서 일관되었다. 작용 지속기간과 AUEC 모두는 실시예 18과 일관되게, rhTSH < 10KD 멀티 SAM < 40KD SAM < 50KD 멀티SAM 순위를 차지했다.
실시예 20. 페길화 rhTSH (10KD 멀티 SAM 및 40KD SAM)의 약력학적 평가
단일 근육 내(IM) 주사, T3 펠릿 이식 3일 후, 페길화 rhTSH(10KD 멀티 SAM 및40KD SAM)의 약력학을 수컷과 암컷 랫트에서 평가하였다.
이소플루란으로 동물을 마취시키고, 투관침을 이용하여 1.5mg T3 펠릿(T-261, Innovative Research of America)을 피하로 이식하였다. 펠릿 이식 후 3일째에 단일 용량의 용제 또는 페길화 rhTSH(10KD 멀티 SAM 또는 40KD SAM)를 표 15에 명시된 바와 같이 0.0mg/kg(용제), 0.1, 0.2, 0.4, 또는 1.0mg/kg의 용량으로 수컷과 암컷의 경정맥 삽관 랫트에 IM 투여하였다. 용량 부피 제한 때문에, 동물들은 사두근으로 2회의 근육 내 주사 형태로 시험 품목을 투여받았다. 다리를 번갈아 가며 투여하였다. 용량 투여 전과 다음과 같은 용량 투여 후 시점에 동물로부터 혈액 시료를 채취하였다: 6, 24, 48, 72, 96, 및 168시간. 단일 포트의 경정맥 캐뉼라로부터 혈액을 채취하였다. 대략 250㎕의 전혈을 혈청 분리기 튜브에 수집하고, 최소 30분 동안 혈액이 응고되도록 하였다. 튜브를 5분 동안 10,000rpm의 원심분리기에 회전시키고, 혈청을 두 개의 튜브(각각 약 50㎕)로 분리하였다. 모든 시료들을 ACE 임상 화학 T4 분석법으로 T4 농도를 분석할 때까지 -80˚C에 보관하였다. 최종 시료 채취 후, 동물을 CO2로 안락사시켰다. 제조사의 프로토콜에 따라 ACE 임상 화학 시스템(Alfa Wassermann Diagnostic Technologies, LLC)으로 혈청 T4 농도를 측정하였다.
군 동물 번호
수컷		 동물 번호
암컷		 펠릿 투여 경로 시험 품목 용량(mg/kg)
/경로
1 1~2 3~4 T3, 1.5mg SC 용제
(PBS 내 0.2% BSA)		 0.0/IM
2 5~6 7~9 T3, 1.5mg SC PES rhTSH
10KD 멀티 SAM		 0.2/IM
3 10~11 12~14 T3, 1.5mg SC PES rhTSH
10KD 멀티 SAM		 0.4/IM
4 15~16 17~19 T3, 1.5mg SC PEG rhTSH
10KD 멀티SAM		 1.0/IM
5 20~22 23~24 T3, 1.5mg SC PES rhTSH
40KD SAM		 0.1/IM
6 25~27 28~29 T3, 1.5mg SC PEG rhTSH
40KD SAM		 0.2/IM
7 30~32 33~34 T3, 1.5mg SC PEG rhTSH
40KD SAM		 0.4/IM
AUEC ( 유효곡선 아래 면적) 계산에 의한 연장 평가
AUEC 계산 10KD 멀티
0.2mg/kg 		10KD 멀티
0.4mg/kg 		10KD 멀티
1mg/kg 		40KD SAM
0.1mg/kg 		40KD SAM
0.2mg/kg 		40KD SAM
0.4mg/kg
0~168시간 177±33.8 213±81.8 340±117 75.6±3.41 174±115 397±68.1
용제 처리 동물로부터의 데이터는 피하 T3 펠릿을 통한 연구 지속기간 동안 T4 억제로 인한 모델의 타당성을 보여주었다(도 23 참조). 10KD 멀티 SAM은 0.4mg/kg에서 최대의 PD 반응을 나타내지 않았고, 1mg/kg은 (정도 및 지속시간에서) 더욱 확연한 T4 반응을 초래했다. 40KD SAM 0.2mg/kg은 중간 정도의 PD 반응을 나타냈으나, 0.1mg/kg은 거의 또는 전혀 효과가 없었다. 흥미롭게도, 10KD 멀티 SAM과 40KD SAM은 0.2mg/kg에서 거의 동일한 PD를 나타냈다. 그러나 0.4mg/kg에서 40kD SAM은 10kD 멀티 SAM보다 더 강력한 약력학적 효과를 이끌어냈다. 전반적으로, 세 가지 별도의 연구(실시예 18, 19 및 20)로부터의 데이터는 10kD 멀티 SAM과 40kD SAM에 대해 일관성이 있다.
실시예 21. 단일 IM 주사, T3 펠릿 이식 후 3일 후의 수컷과 암컷 스프래그 다우리 랫트에서 페길화 rhTSH (40KD SAM)의 두 가지 용량 수준과 비교한 페길화 Cys 돌연변이 TSH (40KD G22C )의 약력학적 (PD) 평가
페길화 Cys 돌연변이 TSH(40KD G22C)의 약력학을 평가하고, T3 펠릿이 이식된 스프래그 다우리 랫트에서 rhTSH와 40kD SAM 페길화 rhTSH의 약력학과 비교하였다.
이소플루란으로 동물을 마취시키고, 투관침을 이용하여 1.5mg T3 펠릿(T-261, Innovative Research of America)을 피하로 이식하였다. 펠릿 이식 후 3일째에 단일 용량의 용제, rhTSH, 페길화 rhTSH(40KD SAM), 또는 페길화 Cys 돌연변이 TSH(40KD G22C)를 0.0mg/kg(용제), 0.2, 또는 0.4mg/kg의 용량으로 수컷과 암컷의 경정맥 삽관 랫트에 IM 투여하였다. 용량 부피 제한 때문에, 동물들은 사두근으로 2회의 근육 내 주사 형태로 시험 품목을 투여받았다. 다리를 번갈아 가며 투여하였다. 용량 투여 전과 다음과 같은 용량 투여 후 시점에 동물로부터 혈액 시료를 채취하였다: 6, 24, 48, 72, 96, 및 168시간. 단일 포트의 경정맥 캐뉼라로부터 혈액을 채취하였다. 대략 250㎕의 전혈을 혈청 분리기 튜브에 수집하고, 최소 30분 동안 혈액이 응고되도록 하였다. 튜브를 5분 동안 10,000rpm의 원심분리기에 회전시키고, 혈청을 두 개의 튜브(각각 약 50㎕)로 분리하였다. 모든 시료들을 ACE 임상 화학 T4 분석법으로 T4 농도를 분석할 때까지 -80℃에 보관하였다. 최종 시료 채취 후, 동물을 CO2로 안락사시켰다. 제조사의 프로토콜에 따라 ACE 임상 화학 시스템(Alfa Wassermann Diagnostic Technologies, LLC)으로 혈청 T4 농도를 측정하였다.
군 동물 번호
수컷		 동물 번호
암컷		 펠릿 투여 경로 시험 품목 용량(mg/kg)
/경로
1 1~2 3 T3, 1.5mg SC 용제
(PBS 내 0.2% BSA)		 0.0/IM
2 4 5~6 T3, 1.5mg SC rhTSH 0.4/IM
3 7~9 10~12 T3, 1.5mg SC 페길화 rhTSH
(40KD SAM)		 0.2/IM
4 13~15 16~18 T3, 1.5mg SC 페길화 rhTSH
(40KD SAM)		 0.4/IM
5 19~21 22~24 T3, 1.5mg SC 페길화 Cys 돌연변이 TSH(40KD G22C) 0.4/IM
AUEC ( 유효곡선 아래 면적) 계산에 의한 연장 평가
AUEC 계산
(hr*㎍/ dL ) 		rhTSH
0.4mg/kg 		40KD SAM
0.2mg/kg 		40KD SAM
0.4mg/kg 		Cys 돌연변이
40kD G22C
0.4mg/kg
0~168시간 221±90.0 276±115 319±133 212±101
용제 처리 동물로부터의 데이터는 피하 T3 펠릿을 통한 연구 지속기간 동안 T4 억제로 인한 모델의 타당성을 보여주었다(도 24 참조). 약력학적 관점으로부터, 40kD G22C Cys 돌연변이는 40kD SAM보다 우수한 것으로는 보이지 않았다. 40kD SAM은 40kD G22C Cys 돌연변이와 비교할 때 증가된 작용 지속시간을 보이는 것으로 나타났다.
본 출원에 인용된 모든 특허, 공개된 출원 및 참고문헌의 교시 내용은 전체로서 참조로 통합된다.
본 발명은 이의 예시적인 실시예를 참조하여 특별히 나타내어지고 기술되었지만, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 첨부된 특허청구범위에 포함되는 본 발명의 범위를 벗어나지 않고도 형태 및 세부 사항에서 다양한 변경이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> GENZYME CORPORATION <120> THYROID STIMULATING HORMONE COMPOSITIONS <130> 5614WO PCT <140> PCT/US12/67705 <141> 2012-12-04 <150> US 61/577,412 <151> 2011-12-19 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 276 <212> DNA <213> Human <400> 1 gctcctgatg tgcaggattg cccagaatgc acgctacagg aaaacccatt cttctcccag 60 ccgggtgccc caatacttca gtgcatgggc tgctgcttct ctagagcata tcccactcca 120 ctaaggtcca agaagacgat gttggtccaa aagaacgtca cctcagagtc cacttgctgt 180 gtagctaaat catataacag ggtcacagta atggggggtt tcaaagtgga gaaccacacg 240 gcgtgccact gcagtacttg ttattatcac aaatct 276 <210> 2 <211> 92 <212> PRT <213> Human <400> 2 Ala Pro Asp Val Gln Asp Cys Pro Glu Cys Thr Leu Gln Glu Asn Pro 1 5 10 15 Phe Phe Ser Gln Pro Gly Ala Pro Ile Leu Gln Cys Met Gly Cys Cys 20 25 30 Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu 35 40 45 Val Gln Lys Asn Val Thr Ser Glu Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys Ser 50 55 60 Tyr Asn Arg Val Thr Val Met Gly Gly Phe Lys Val Glu Asn His Thr 65 70 75 80 Ala Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser 85 90 <210> 3 <211> 354 <212> DNA <213> Human <400> 3 ttttgtattc caactgagta tacaatgcac atcgaaagga gagagtgtgc ttattgccta 60 accatcaaca ccaccatctg tgctggatat tgtatgacac gggatatcaa tggcaaactg 120 tttcttccca aatatgctct gtcccaggat gtttgcacat atagagactt catctacagg 180 actgtagaaa taccaggatg cccactccat gttgctccct atttttccta tcctgttgct 240 ttaagctgta agtgtggcaa gtgcaatact gactatagtg actgcataca tgaagccatc 300 aagacaaact actgtaccaa acctcagaag tcttatctgg taggattttc tgtc 354 <210> 4 <211> 118 <212> PRT <213> Human <400> 4 Phe Cys Ile Pro Thr Glu Tyr Thr Met His Ile Glu Arg Arg Glu Cys 1 5 10 15 Ala Tyr Cys Leu Thr Ile Asn Thr Thr Ile Cys Ala Gly Tyr Cys Met 20 25 30 Thr Arg Asp Ile Asn Gly Lys Leu Phe Leu Pro Lys Tyr Ala Leu Ser 35 40 45 Gln Asp Val Cys Thr Tyr Arg Asp Phe Ile Tyr Arg Thr Val Glu Ile 50 55 60 Pro Gly Cys Pro Leu His Val Ala Pro Tyr Phe Ser Tyr Pro Val Ala 65 70 75 80 Leu Ser Cys Lys Cys Gly Lys Cys Asn Thr Asp Tyr Ser Asp Cys Ile 85 90 95 His Glu Ala Ile Lys Thr Asn Tyr Cys Thr Lys Pro Gln Lys Ser Tyr 100 105 110 Leu Val Gly Phe Ser Val 115

Claims (53)

  1. 재조합 인간 갑상선 자극 호르몬(rhTSH)으로서, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이
    a) rhTSH α 서브유닛의 ASN52, rhTSH α 서브유닛의 ASN78, 및 rhTSH β 서브유닛의 ASN23 또는 이의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 시알산기;
    b) rhTSH α 서브유닛의 ASN52, rhTSH α 서브유닛의 ASN78, rhTSH β 서브유닛의 ASN23 또는 이의 조합에 위치한 갈락토오스; 또는
    c) a) 및 b) 모두
    에서 재조합 인간 갑상선 자극 호르몬(rhTSH)에 부착된, 재조합 인간 갑상선 자극 호르몬(rhTSH).
  2. 제1항에 있어서, PEG는 3,000 내지 100,000kDa의 평균 분자량을 나타내는 재조합 인간 갑상선 자극 호르몬(rhTSH).
  3. 제1항에 있어서, 하나의 PEG가 부착된 재조합 인간 갑상선 자극 호르몬(rhTSH).
  4. 제1항에 있어서, 야생형 rhTSH에 비해 연장된 T4 반응을 나타내는 재조합 인간 갑상선 자극 호르몬(rhTSH).
  5. 돌연변이된 재조합 인간 갑상선 자극 호르몬(rhTSH)으로서, 알파 서브유닛의 ASN66, THR69, 및 GLY22 또는 베타 서브유닛의 VAL118로부터 선택된 아미노산 잔기가 시스테인 잔기로 치환되고, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이 상기 시스테인 잔기에서 돌연변이된 재조합 인간 갑상선 자극 호르몬(rhTSH)에 부착된, 돌연변이된 재조합 인간 갑상선 자극 호르몬(rhTSH).
  6. 제5항에 있어서, PEG는 3,000 내지 100,000kDa의 평균 분자량을 나타내는 돌연변이된 재조합 인간 갑상선 자극 호르몬(rhTSH).
  7. 제5항에 있어서, 하나의 PEG가 부착된 돌연변이된 재조합 인간 갑상선 자극 호르몬(rhTSH).
  8. 제5항에 있어서, 야생형 rhTSH에 비해 연장된 T4 반응을 나타내는 돌연변이된 재조합 인간 갑상선 자극 호르몬(rhTSH).
  9. 페길화된 재조합 인간 갑상선 자극 호르몬(rhTSH)의 생산방법으로서,
    a) rhTSH α 서브유닛의 ASN52, rhTSH α 서브유닛의 ASN78, 및 rhTSH β 서브유닛의 ASN23 또는 이의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 시알산기;
    b) rhTSH α 서브유닛의 ASN52, rhTSH α 서브유닛의 ASN78, rhTSH β 서브유닛의 ASN23 또는 이의 조합에 위치한 갈락토오스; 또는
    c) a) 및 b) 모두
    에 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 부착하는 단계를 포함하는, 페길화된 재조합 인간 갑상선 자극 호르몬(rhTSH)의 생산방법.
  10. 페길화된 돌연변이된 재조합 인간 갑상선 자극 호르몬(rhTSH)의 생산방법으로서,
    a) 알파 서브유닛의 ASN66, THR69, 및 GLY22 또는 베타 서브유닛의 VAL118로부터 선택된 아미노산 잔기를 대신하여 시스테인 잔기를 rhTSH에 도입하여, 돌연변이된 rhTSH를 생성하는 단계; 및
    b) 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 a) 단계에서 도입된 시스테인 잔기에 부착하여, 페길화된 돌연변이된 재조합 인간 갑상선 자극 호르몬(rhTSH)을 생성하는 단계를 포함하는,
    페길화된 돌연변이된 재조합 인간 갑상선 자극 호르몬(rhTSH)의 생산방법.
  11. 제9항에 있어서, PEG는 3,000 내지 100,000kDa의 평균 분자량을 나타내는 페길화된 재조합 인간 갑상선 자극 호르몬(rhTSH)의 생산방법.
  12. 제9항에 있어서, 하나의 PEG가 재조합 인간 갑상선 자극 호르몬(rhTSH)에 부착되는 페길화된 재조합 인간 갑상선 자극 호르몬(rhTSH)의 생산방법.
  13. 제10항에 있어서, PEG는 3,000 내지 100,000kDa의 평균 분자량을 나타내는 페길화된 돌연변이된 재조합 인간 갑상선 자극 호르몬(rhTSH)의 생산방법.
  14. 제10항에 있어서, 하나의 PEG가 돌연변이된 재조합 인간 갑상선 자극 호르몬(rhTSH)에 부착되는 페길화된 돌연변이된 재조합 인간 갑상선 자극 호르몬(rhTSH)의 생산방법.
  15. 유효량의 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 재조합 인간 갑상선 자극 호르몬(rhTSH) 또는 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 돌연변이된 재조합 인간 갑상선 자극 호르몬(rhTSH); 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는,
    갑상선 암의 치료를 필요로 하는 대상자의 갑상선 암을 치료하기 위한 약학적 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 근육 내 주사를 통해 전달되는 약학적 조성물.
  17. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 재조합 인간 갑상선 자극 호르몬(rhTSH) 또는 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 돌연변이된 재조합 인간 갑상선 자극 호르몬(rhTSH)을 포함하는,
    갑상선 암의 치료를 필요로 하는 환자의 갑상선 암 치료용 의약 제조를 위한 약학적 조성물.
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  19. 삭제
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