CN104220097A - 促甲状腺激素组合物 - Google Patents

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Abstract

本文中描述了促甲状腺激素(TSH)的组合物，其中至少一种聚亚烷基二醇聚合物附接于TSH的糖位点。还描述了突变的促甲状腺激素(TSH)和至少一种聚亚烷基二醇聚合物的组合物，其中所述突变TSH包括其中一个或多个氨基酸残基已被半胱氨酸残基取代的TSH，且所述聚亚烷基二醇聚合物在取代的半胱氨酸残基的位点处附接于突变TSH。还描述了包含这些TSH组合物的药物组合物和在有此需要的患者中治疗甲状腺病况的方法，其通过对患者施用有效量的药物组合物。

Description

促甲状腺激素组合物
发明背景
甲状腺癌是其中源自甲状腺的细胞有不受控生长的疾病的集合。甲状腺癌通常已被归为分化的甲状腺癌，包括乳突(papillary)、卵泡(follicular)和Hurthle细胞癌，和其他甲状腺癌，包括髓样癌和退行发育性癌(anaplasticcancer)。一些分化的甲状腺癌随时间变得不那么高度分化，且可以归类为去分化性或较差分化性癌症。对患者施用促甲状腺激素(TSH)能在包括甲状腺肿和甲状腺癌在内的多种甲状腺疾病的诊断或治疗办法中起作用。对于这些疾病，施用的TSH的药动学概貌对于诊断或治疗规程的最佳成功可能是重要的。
重组人TSH(rhTSH)，作为促甲状腺激素(Genzyme Corp.,NDA 2-898)上市销售，以在连续日的多次注射给药，继之以RAI给药，并在第3天和第5天抽血用于肿瘤诊断。这一严格的给药方案通过相对较短的TSH的持续作用时间成为必要，其还导致降低的功效和副作用。具有延长的作用时间的TSH组合物将很可能改进多种甲状腺疾病的治疗和检测并减少副作用。
如此，存在对改善的含TSH组合物的需要，其优化TSH释放的药动学并减少多次注射的需要。
发明概述
本发明涉及与(一种或多种)聚亚烷基二醇聚合物如聚乙二醇(PEG)缀合的促甲状腺激素(TSH)的组合物，其延长体内TSH作用时间。另外，本发明涉及突变的TSH的组合物，其中所述TSH已经突变以引入可与聚亚烷基二醇聚合物缀合的另外位点。本文中描述的本发明TSH组合物可用于制备药物组合物且可用于治疗患有甲状腺病况的有此需要的患者。
依照一个实施方案，本发明涉及包含TSH的组合物，其中至少一种聚亚烷基二醇聚合物附接于TSH的糖位点。在某些方面，组合物的TSH自哺乳动物例如人分离，或者TSH是重组的哺乳动物TSH，例如重组的人TSH(rhTSH)。
在某些实施方案中，TSH的糖位点是氨基酸上的唾液酸，所述氨基酸例如天冬酰胺残基rhTSHα亚基的ASN52、rhTSHα亚基的ASN78、或rhTSHβ亚基的ASN23、及其组合。
在其他实施方案中，TSH上的糖位点是氨基酸例如天冬酰胺上的半乳糖。在具体的实施方案中，所述半乳糖基团位于TSH上的位点，例如rhTSHα亚基的氨基酸ASN52、rhTSHα亚基的氨基酸ASN78、rhTSHβ亚基的氨基酸ASN23、及其组合处。
在本发明的相关方面，本发明的组合物相比于对照展现增强的T4应答。
在本发明的其他相关方面，附接于TSH的糖位点的聚亚烷基二醇聚合物是聚乙二醇(PEG)。在具体的实施方案中，PEG具有约3,000至约100,000道尔顿的平均分子量。在其他实施方案中，一个或超过一个线性或分支的PEG分子附接于TSH。
在本发明的又一个相关的实施方案中，描述了包含突变的促甲状腺激素(TSH)和至少一种聚亚烷基二醇聚合物的组合物，其中所述突变的TSH包括其中一个或多个氨基酸残基已被半胱氨酸残基取代的TSH，其中所述聚亚烷基二醇聚合物在所述半胱氨酸残基处附接于所述突变的TSH，且所述突变的TSH是生物学活性的。
在某些实施方案中，所述已被半胱氨酸取代的氨基酸残基位于TSH的α亚基上。在一个具体的实施方案中，所述已被半胱氨酸取代的氨基酸残基位于选自下组的重组人TSH的氨基酸位置处：ASN52、ASN78、MET71、ASN66、THR69、和GLY22、及其组合。
仍在其他实施方案中，所述已被半胱氨酸取代的氨基酸残基位于TSH的β亚基上。在一个具体的实施方案中，所述已被半胱氨酸取代的氨基酸残基位于选自下组的重组人TSH的氨基酸位置处：ASN23、VAL118、THR21、GLU63、和ASP56、及其组合。在某些方面，具有半胱氨酸修饰的突变TSH附接有作为聚亚烷基二醇聚合物的聚乙二醇(PEG)。在具体的实施方案中，PEG具有约3,000至约100,000道尔顿的平均分子量。在其他实施方案中，一个或超过一个线性或分支或组合的PEG分子附接于TSH。
依照本发明的其他实施方案，描述了包含治疗有效量的本发明组合物连同药学可接受载体的药物组合物。
这些药物组合物用于治疗有此需要的患者中的甲状腺病况的方法，其通过对该患者施用有效量的本发明的药物组合物。在具体的实施方案中，所述甲状腺病况是甲状腺癌。在其他实施方案中，所述组合物经由肌内注射递送。
本发明还涉及产生PEG化、生物学活性的促甲状腺激素(TSH)的方法，包括将至少一种聚亚烷基二醇聚合物附接于TSH的糖位点。
在另一个相关方面，本发明涉及一种产生PEG化、生物学活性的突变的促甲状腺激素(TSH)的方法，包括a)将一个或多个另外的半胱氨酸残基引入TSH的氨基酸序列，由此产生突变的TSH；b)将一个或多个聚亚烷基二醇聚合物附接于在步骤a)中引入的一个或多个半胱氨酸残基，由此产生PEG化、生物学活性的突变的TSH。在具体的实施方案中，所述半胱氨酸残基代替TSH中的内源性氨基酸残基。
本发明还涉及一种治疗有此需要的受试者中的甲状腺病况的方法，包括施用有效量的PEG化、生物学活性的促甲状腺激素(TSH)。
附图简述
前述内容从本发明的示例实施方案的以下更具体描述将是明显的，如伴随附图中例示的，其中类似的指代符号遍及不同的示图指相同的部分。附图不一定是按比例尺的，重点因而放在例示本发明的实施方案上。
图1A-图1B是线性(图1A)和三维(图1B)示图，其显示在N端、赖氨酸氨基酸残基和天然糖位点处具有PEG化靶物的TSH亚基的结构建模。
图2A-图2D是赖氨酸和N端PEG化反应。具有不同PEG:蛋白质比率的赖氨酸PEG化的PEG化反应混合物的SDS-PAGE分析显示于图2A(考马斯蓝染色)和图2B(PEG染色)。具有1:1PEG:蛋白质比率的反应混合物用框高亮，其进一步在SEC-HPLC上分析(图2C)。图2D是2:1PEG:蛋白质比率的N端PEG化反应的SEC-HPLC概貌(profile)。
图3是显示3种不同的糖PEG化途径的示图。
图4是显示选定突变体的β-碳位置的结构模型。
图5是银染色的非还原性SDS-PAGE，其评估突变体的表达水平和寡聚化。
图6是显示3种半胱氨酸定点突变体的PEG化的凝胶。
图7是突变体TSH的几种PEG化反应的SEC-HPLC概貌的一系列层析图。
图8A-图8B是αG22C TSH PEG化条件的优化。
图9A-图9B是对G22C TSH的亚基-和位点-特异性缀合的确认。
图10A-图10D是糖PEG化反应混合物和纯化的糖PEG化rhTSH缀合物的SDS-PAGE分析。具有不同的(PEG:蛋白质)摩尔比的GAM(+)和GAM(-)反应混合物分别显示于图10A和图10B。纯化的糖PEG化rhTSH缀合物显示于图10C(PEG染色)和图10D(考马斯蓝染色)。
图11A-图11B是40kD SAM反应混合物(图11A)和纯化的糖PEG化rhTSH缀合物(图11B)的SEC-HPLC概貌。
图12是纯化的MonoPEG化40kD SAM缀合物的胰蛋白酶肽图谱，和收集的PEG化胰蛋白酶片段的N端测序结果，如实施例10中解释的。
图13A-图13C是在纯化的糖PEG化rhTSH缀合物的每个亚基上的PEG化相对量的测定，如实施例11中解释的。
图14A-图14C是显示具有不同大小PEG的PEG化SAM、GAM(+)、GAM(-)的受体结合测定的结果的图。
图15是多种PEG化TSH的药效学数据的图，其显示相对于rhTSH对照、随时间对T4水平(pg/dL)的影响，如实施例13中解释的。
图16是显示与对照相比，多种PEG化TSH在血清中随时间的浓度的图，如实施例13中解释的。
图17是显示与对照相比，多种PEG化TSH在血清中随时间的浓度的图，如实施例14中解释的。
图18A-图18D是显示与对照相比，对于多种PEG化TSH在血清中随时间的T4浓度的图，如实施例16中解释的。
图19A-图19C是显示与对照相比，对于不同剂量的40kD SAM在血清中随时间的T4浓度的图，如实施例17中解释的。
图20A-图20B是显示与对照相比，对于多种PEG化TSH在血清中随时间的T4浓度的图，如实施例18中解释的。
图21A-图21F是显示与对照相比，对于多种PEG化TSH在血清中随时间的T4浓度的图，如实施例19中解释的。
图22是显示与对照相比，对于多种PEG化TSH在血清中随时间的T4浓度的图，如实施例19中解释的。
图23是对于10kD MultiSAM和40kD SAM在血清中随时间的T4浓度的图，如实施例20中解释的。
图24是显示与对照相比，对于40kD SAM和40kD G22C在血清中随时间的T4浓度的图，如实施例21中解释的。
发明详述
促甲状腺激素(Genzyme Corp.,NDA 2-898)是重组人TSH(rhTSH)，目前在市场上销售用于诊断和/或治疗甲状腺癌。它作为冻干的粉末销售，用于在肌内施用前用水重建。
这类现有的TSH制剂具有严格的给药方案，需要多次注射，具有有限的药动学概貌并产生副作用如恶心。本发明的TSH组合物和突变的TSH组合物解决了这些缺点。本文中描述了更长作用的促甲状腺激素(TSH)组合物，其降低注射频率、提供灵活的施用方案、改进治疗指标且具有更好的刺激甲状腺组织的功效。另外，其他效力参数受到本发明的更长作用的TSH组合物的正向影响，包括延长的TSH半衰期和增加的T4释放持续时间。
如本文中显示的，将聚亚烷基二醇聚合物例如聚乙二醇缀合于TSH有益地改变TSH的药动学概貌和药效学概貌。如下文中更详细描述的，研究了TSH的N端PEG化、赖氨酸PEG化和糖聚合物附接。预期TSH的N端PEG化将产生具有延长的作用时间的TSH，而TSH的赖氨酸PEG化和糖PEG化将导致TSH效力的严重降低。本文中描述的研究结果显示，TSH的糖PEG化对于TSH的效力具有正向效果，而TSH的N端PEG化和赖氨酸PEG化均极大地降低了TSH的效力。
因此，在一个方面，本发明针对包含促甲状腺激素(TSH)的组合物，其中至少一种聚亚烷基二醇聚合物附接于TSH的糖位点。本文中还显示经突变以引入靶向PEG化的半胱氨酸残基的TSH的位点特异性PEG化对TSH的效力产生正向效果。如此，在另一个方面，本发明针对包含突变的促甲状腺激素(TSH)和至少一种聚亚烷基二醇聚合物的组合物，其中所述突变的TSH包括其中一个或多个氨基酸残基已被半胱氨酸残基取代的TSH，其中所述聚亚烷基二醇聚合物在所述半胱氨酸残基处附接于所述突变的TSH，且所述突变的TSH是生物学活性的。本文中提供的PEG化TSH组合物相对于未缀合于聚乙二醇聚合物的具有一个或多个以下改进的治疗治标效果：增强的溶解性、降低的蛋白水解、降低的免疫原性、降低的肾清除速率、延长的血液循环寿命、增加的作用持续时间、和改变的分布和吸收。
TSH是具有两个亚基α和β亚基的糖蛋白。α(alpha)亚基(即绒毛膜促性腺激素α)等同于人绒毛膜促性腺激素、黄体生成素和促卵泡激素(FSH)的。β(beta)亚基是TSH独有的，且决定其功能。
rhTSH指重组合成的TSH。本文中描述的重组DNA方法一般是那些列于Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Cold String HarborLaboratory Press,1989，和/或Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等编,Green Publishers Inc.，和Wiley and Sons 1994，有附录(supplement))的。术语“重组”指合成或者另外体外操作的多核苷酸(例如“重组的多核苷酸”)，和使用重组多核苷酸来在细胞或其他生物系统中产生基因产物的方法，以及由重组多核苷酸编码的多肽(“重组蛋白质”)。
所述方法中使用的TSH和本文中描述的组合物可自天然存在的哺乳动物来源如牛、猪、灵长类或人分离，或从非天然存在的来源以重组形式分离，其使用本领域中已知的方法，如记载于美国专利No.5,840,566和6,365,127的。
已知大分子到聚合物(例如多糖、唾液酸聚合物、羟乙基淀粉和聚亚烷基二醇(例如聚丙二醇、聚丁二醇、聚乙二醇)和其他类似模块)的缀合可用于有效改变药物的体内功效，即，改变其药效学和药动学特性之间的平衡。然而，这类缀合经常导致药物结合亲和力的丧失，且在效果上导致效力的丧失。在有限的情况中，效力的降低由经聚合物修饰的药物的更长的循环半衰期弥补，使得所得药动学(PK)和药效学(PD)概貌可用于治疗。
尽管聚乙二醇(PEG)到特定大分子的缀合(称为PEG化)保留大部分活性，但PEG化的激素和细胞因子(其活性一般需要与细胞表面受体的较高亲和力相互作用)显示活性中的显著降低。激素的PEG化经常不利地影响该激素的PD概貌和PK概貌。
聚乙二醇(PEG)是一种非抗原性惰性聚合物，已显示其延长蛋白质在体内循环的时间长度。典型地，这些常见的PEG试剂一般在赖氨酸残基和/或N端氨基酸处附接于蛋白质上的伯胺和仲胺。有商品化的不同大小的PEG，且一旦附接，可通过利用大小变化和对单药分子的多种附接定制用于个体指征。已显示PEG改进注射的PEG化蛋白质的血浆半衰期，但如上文陈述的，效力可能由于PEG的空间阻碍而受损(Fishburn,C.S.,J Pharm Sci 97:4167(2008))。为了避免效力问题并生成期望的PD和PK概貌，对要PEG化的靶蛋白的结构-功能关系的详细了解有助于生成保留最大功能活性的PEG化产物。
最近，在确定生长激素超家族成员的结构中取得了进展，这导致潜在的治疗学。理解这些蛋白质如何与其靶物相互作用，与结构信息结合，通过使用结构信息来设计用于将该蛋白质在其相应靶物上的治疗益处最大化的聚合物缀合物已生成了有效的药物。遗憾的是，没有TSH与其受体的复合物结构的结构信息；然而，已解析了与FSH受体(FSHR)复合的相关蛋白质促卵泡激素(FSH)的晶体结构(Fan和Hendrickson,Nature 433:269(2004))。TSH与FSH具有高度同源性，其共享相同的α亚基和相似的β亚基。同样地，TSH受体和FSH受体是高度同源的。如此，FSH-FSH受体复合物可充当TSH与其受体相互作用的初始模型。
如本文中显示的，当将TSH序列叠加到FSH-FSHR复合物(PDB索引1XWD)的3D结构模型上时，N端似乎离受体相互作用区最远，如此很可能是在PEG化时最小化受体结合的损失的PEG附接理想位点(见图1B)。由于在TSH中有许多赖氨酸，且其中一些接近受体结合位点，因此将与其PEG在赖氨酸处的附接会干扰受体结合。
TSH是一种糖基化蛋白质。糖链构成其重量的15-25％且包括3条天冬酰胺连接的糖链。这些链中的2条可见于TSH的α亚基，分别连接于天冬酰胺52(ASN 52)和天冬酰胺78(ASN 78)，而第3条在TSH的β亚基上，连接于天冬酰胺23(ASN 23)。天冬酰胺连接的糖链是潜在的PEG缀合位点，然而，在TSH蛋白上其与受体相互作用区特别是ASN 52的相应的接近，表明在这类位点处的PEG缀合将很可能对于受体结合具有负面影响。如此，选择潜在位点用于聚合物对TSH的缀合呈现了很大的不确定性。
此外，长时间以来已知TSH的去糖基化导致在受体结合时有效信号转导的损失(Szkudlinski等,Physiol Rev.82:473(2002))。尽管从TSH的糖除去末端唾液酸改进了体外活性，但在体内观察到极大降低的循环时间，推测是由于通过肝唾液酸糖蛋白受体的清除。Thotakura,N.R.,Szkudlinski,M.W.和Weintraub,B.D.,Glycobiology 4,525-533(1994)。去除个体糖位点还增强了体外功能活性，尤其是对于α链氨基酸位置52，这再次表明糖可能足够接近受体以达到唾液酸的负电荷与受体上的负电荷之间的静电排斥。总之，对TSH的该结构功能分析指示为了最小化对功能效力的影响，N端PEG化是远比糖PEG化更优选的。如本文中描述的，研究了N端PEG化、赖氨酸PEG化和糖聚合物附接。
因此，产生缀合聚合物的TSH的糖聚合物方法学是本发明的一个方面。在一个实施方案中，所述聚合物是聚亚烷基二醇。如本文中使用的，“聚亚烷基二醇(PAG)”包括聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、聚丁二醇等。聚合物可以是线性或分支的。PAG共价附接于分子。如本语境中使用的，术语“附接”或“附接的”指TSH蛋白的位点或模块与聚合物如聚亚烷基二醇的偶联或缀合，例如直接共价地彼此连接的，或者经由介入模块间接共价彼此连接的，所述介入模块如桥、间隔物、或连接模块。附接或缀合于TSH的聚合物不同于与TSH混合、掺混(commingle)或一起在溶液中的聚合物。
“糖位点”指见于TSH上的糖侧链。所述位点可以是天然糖基化的位点，或者是酶法提供的位点。在某些实施方案中，特定地选择糖位点以满足实现TSH与受体最佳相互作用的期望标准或其他功能要求，如蛋白质的折叠或移动性。所述糖位点可用于附接聚合物模块如PEG。蛋白质上的典型糖位点是天冬酰胺、丝氨酸或苏氨酸。TSH具有3条天冬酰胺连接的糖链。
在某些实施方案中，将单一聚合物附接于TSH。在其他实施方案中，将多个聚合物附接于TSH。所述多个附接的聚合物可以是一个种类或者多个种类的。例如，在其中单个PEG分子附接于蛋白质的情况中，该蛋白质被称为“MonoPEG化的”，而在其中超过一个PEG分子附接于蛋白质的情况中，该蛋白质被称为“MultiPEG化的”。当蛋白质是MultiPEG化时，附接于蛋白质(相对于其他附接的PEG)的个体PEG可具有相同或不同的分子量，而且可为线性或分支结构的。PEG分子的分子量范围是3,000-100,000道尔顿。在某些实施方案中，附接的PEG的分子量是5kD、10kD、20kD、30kD、40kD或60kD或其组合。
本文中提供用于TSH的糖PEG化的3种备选方案：(i)唾液酸介导的PEG化(称为"SAM")，(ii)半乳糖介导的PEG化(称为"GAM(-)")，和(iii)唾液酸消除与半乳糖介导的PEG化偶联(称为"GAM(+)")。简言之，如图3中显示的，在唾液酸介导的SAM PEG化中，将唾液酸氧化，接着化学附接PEG。在GAM(-)PEG化中，将半乳糖模块氧化，接着化学附接PEG。而在GAM(+)中，将唾液酸模块酶法消除，然后氧化暴露的半乳糖模块，接着化学附接PEG。
本发明中还包括对TSH的PEG化的位点特异性方法。一种这类方法使用半胱氨酸反应性PEG将PEG附接于半胱氨酸残基。许多具有不同反应基团(例如马来酰亚胺、乙烯基砜)和不同大小PEG(2-40kDa)的高度特异性的、半胱氨酸反应性PEG是商品化的。在中性pH，这些PEG试剂选择性地附接于“游离”的半胱氨酸残基，即不牵涉靶蛋白中的二硫键的半胱氨酸残基。或者，可将牵涉天然二硫键的两个半胱氨酸之一除去或用另一氨基酸取代，留下天然的半胱氨酸(蛋白质中的正常将与除去或被取代的半胱氨酸残基形成二硫键的半胱氨酸残基)游离且可用于化学修饰。优选地，取代半胱氨酸的氨基酸将是中性氨基酸如丝氨酸或丙氨酸。
经过试用重组DNA技术的体外诱变，可在蛋白质上的任何可用位置引入另外的半胱氨酸残基。然后，新添加的“游离”半胱氨酸可充当使用半胱氨酸反应性PEG特异性附接PEG分子的位点。添加的半胱氨酸残基是蛋白质中已有氨基酸的取代物。半胱氨酸残基可添加到蛋白质的氨基端之前、蛋白质的羧基端之后、或插入蛋白质中的两个氨基酸之间。术语“突变体TSH”，用于本文指其中野生型TSH的一个或多个氨基酸已被允许在TSH分子上形成一个或多个糖基化位点的另一氨基酸取代的TSH。因此，TSH的氨基酸取代使得能进行至少一种聚合物如聚亚烷基二醇的位点特异性偶联。例如，PEG分子对突变体TSH的位点特异性偶联允许生成一种TSH，其拥有聚乙烯-糖基化TSH的药效学和药动学益处。
在具体的实施方案中，使用半胱氨酸的氨基酸取代可在对于表1和2中突变体显示的位置。
在一个优选的实施方案中，取代不实质上改变天然TSH的结构属性。在某些实施方案中，已被半胱氨酸取代的氨基酸残基位于TSH的α亚基或β亚基上。在具体的实施方案中，已被半胱氨酸取代的氨基酸残基位于选自下组的重组人TSHα亚基的氨基酸位置处：ASN52、ASN78、MET71、ASN66、THR69、和GLY22、及其组合，或位于选自下组的重组人TSHβ亚基的氨基酸位置处：ASN23、VAL118、THR21、GLU63、和ASP56、及其组合。
本文中描述的TSH组合物是生物学活性的。“生物学活性”意指本发明的TSH组合物具有一种或多种的以下效果：更长的作用持续时间、延长的半衰期、增加的T4释放持续时间、更高的AUEC、Tmax的正向迁移、和更低的峰-到-槽暴露(peak-to-trough exposure)，其可减少副作用。在某些实施方案中，将组合物与对照比较且效果是基本上相似的，稍微更小或稍微更大或实质性更大。可使用本领域技术人员已知的多种技术来评估依照本发明产生的TSH组合物的生物学活性。
在评估本发明TSH组合物的生物学活性时，可将生物学活性与对照比较。如本领域技术人员理解的，可使用多种适宜对照。在一个实施方案中，如本文中使用的“对照”指天然(野生型)TSH或rhTSH。
本发明的组合物在对有此需要的患者(例如有近乎全部或全部甲状腺切除的甲状腺癌患者)施用时将提供已定制用于指定用途的TSH血清浓度。在某个实施方案中，本文中描述的组合物的作用持续时间比rhTSH增加为至少2倍。在另一个实施方案中，TSH组合物的作用持续时间比rhTSH增加为至少3倍。具有增加的作用持续时间的这类实施方案有效地减少了施用频率，同时维持与目前的rhTSH制剂可比的功效。
在一个实施方案中，所述组合物提供相比于rhTSH更长的半衰期(t1/2)。在具体的实施方案中，所述t1/2在大鼠中为rhTSH的多至23倍长。
在另一个实施方案中，显示T4水平比rhTSH具有更大的持续效果。在大鼠中，rhTSH组中的T4水平在给药后48小时时回到媒介物水平，而在一个实施方案中，T4维持到给药后168小时时。
如本文中使用的“有效Tmax”指“峰高浓度时间”，其为所述的组合物特征性的。如本文中使用的“有效Cmax”指“峰高浓度”，其为所述的组合物特征性的。在许多情况下，有效的Tmax和Cmax提供其中药物浓度在治疗范围内的血液(或血清或血浆)浓度时间曲线。“t1/2”指药物的作用持续时间已知且药物在体内的浓度或量降低一半所需的时间。
人TSHα亚基的核酸序列为：
gctcctgatgtgcaggattgcccagaatgcacgctacaggaaaacccattcttctcccagccgggtgcccca
atacttcagtgcatgggctgctgcttctctagagcatatcccactccactaaggtccaagaagacgatgttggt
ccaaaagaacgtcacctcagagtccacttgctgtgtagctaaatcatataacagggtcacagtaatggggg
gtttcaaagtggagaaccacacggcgtgccactgcagtacttgttattatcacaaatct(SEQ.ID NO:1)
人TSHα亚基的氨基酸序列为：
APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQKNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKS
(SEQ ID NO:2)
人TSHβ亚基的核酸序列为：
ttttgtattccaactgagtatacaatgcacatcgaaaggagagagtgtgcttattgcctaaccatcaacaccac
catctgtgctggatattgtatgacacgggatatcaatggcaaactgtttcttcccaaatatgctctgtcccaggat
gtttgcacatatagagacttcatctacaggactgtagaaataccaggatgcccactccatgttgctccctattttt
cctatcctgttgctttaagctgtaagtgtggcaagtgcaatactgactatagtgactgcatacatgaagccatca
agacaaactactgtaccaaacctcagaagtcttatctggtaggattttctgtc(SEQ ID NO:3)
人TSHβ亚基的氨基酸序列为：
FCIPTEYTMHIERRECAYCLTINTTICAGYCMTRDINGKLFLPKYALSQDVCTYRDFIYRTVEIPGCPLHVAPYFSYPVALSCKCGKCNTDYSDCIHEAIKTNYCTKPQKSYLVGFSV(SEQ ID NO:4)
如本文中使用的，术语“对应于TSH亚基的氨基酸残基的氨基酸残基”在比对序列时意图指示对应于野生型TSH亚基序列(SEQ ID NO:2和4)的氨基酸残基。使用适宜的用于序列比对的计算机程序，如例如ClustalW程序，版本1.8,1999(Thompson等,1994,Nucleic Acid Research,22:4673-4680)，从比对的序列方便地确定氨基酸序列同源性/同一性。
实施例
实施例1.rhTSH的唾液酸介导的(SAM)PEG化
高碘酸钠氧化：将100mM乙酸钠，pH 5.6中的25mM高碘酸钠(Sigma,311448)添加到100mM乙酸钠，pH 5.6中的4.5mg/ml TSH中至终浓度范围为0.2mM至2mM，于包裹在铝箔中的玻璃管形瓶中。将混合物在冰上在黑暗中温和地摇动30分钟。30分钟后，将50％甘油添加至3％的反应体积，然后摇动15分钟。然后将混合物缓冲液交换为100mM乙酸钠，pH 5.6，并浓缩为至少4.3mg/ml的TSH浓度以实施PEG化。
PEG化：将适宜大小的氨氧基PEG(dH2O中100mg/ml)添加到氧化的TSH至不同的(PEG:蛋白质)摩尔比。将反应体积用100mM乙酸钠，pH 5.6调整至最终TSH浓度为4mg/ml。然后将混合物在25℃温育16小时，或在8℃温育16小时，伴随温和摇动。温育后，添加50摩尔过量的0.05M羟胺以淬灭反应混合物并在25℃温育6小时，伴随温和摇动。
实施例2.去唾液酸化rhTSH的半乳糖介导的(GAM(+))PEG化
神经氨酸酶处理：添加20mU神经氨酸酶(His6-梭菌属神经氨酸酶(520mU/ul))每mg TSH并在37℃温育6小时。
过氧化氢酶/半乳糖氧化酶处理：将2U过氧化氢酶(Sigma 442U/μΙ)每mgTSH添加到神经氨酸酶处理的TSH。将4μg半乳糖氧化酶(Worthington GAO,1.2mg/ml)每mg TSH添加到该混合物，然后在37℃温育16小时。温育后，将混合物缓冲液交换并浓缩到100mM乙酸钠，pH 5.6中至至少5.5mg/ml的浓度以实施PEG化。
PEG化：将适宜大小的氨氧基PEG(dH2O中100mg/ml)添加到氧化的和缓冲液交换的TSH至1:1(PEG:蛋白质)摩尔比。将反应体积用100mM乙酸钠，pH 5.6调整，从而反应中的最终TSH浓度为5mg/ml。然后将混合物在25℃温育16小时，伴随温和摇动。接着向反应混合物添加50摩尔过量的0.05M羟胺(m.w.69.49)并在25℃温育6小时，伴随温和摇动。
实施例3.rhTSH的半乳糖介导的(GAM(-))PEG化
过氧化氢酶/半乳糖氧化酶处理：将2U过氧化氢酶(Sigma 442U/μΙ)每mg和4μg半乳糖氧化酶(Worthington GAO,1.2mg/ml)每mg添加到TSH。然后将混合物在37℃温育16小时。温育后，将混合物缓冲液交换并浓缩到100mM乙酸钠，pH 5.6中至至少5.5mg/ml的终浓度以实施PEG化。
PEG化：将适宜大小的氨氧基PEG(dH2O中100mg/ml)添加到氧化的和缓冲液交换的TSH至1:2(PEG:蛋白质)摩尔比。将反应体积用100mM乙酸钠，pH 5.6调整，从而反应中的最终TSH浓度为5mg/ml。然后将混合物在25℃温育16小时，伴随温和摇动。接着向反应混合物添加50摩尔过量的0.05M羟胺(m.w.69.49)并在25℃温育6小时，伴随温和摇动。
实施例4.rhTSH的N端PEG化
将适宜大小的醛PEG(反应缓冲液中100mg/ml)以不同(PEG:蛋白质)比率添加到终浓度为5mg/ml的rhTSH中，其在100mM乙酸钠，pH 5或pH 5.6中，含20mM氰基硼氢化钠。在25℃达16小时或在8℃达长达2天完成温育，接着用0.1体积的1M Tris，pH 7.5在25℃达3小时来淬灭反应。
在N端的PEG化得到比糖缀合失去更多TSH受体结合亲和力的缀合物。使用40kD PEG的N端MonoPEG化相比于rhTSH对照产生体外TSH受体结合亲和力的11.1倍降低(降低为1/11.1)。
实施例5.rhTSH的赖氨酸PEG化
将适宜大小的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)PEG(dH2O中50mg/ml)以不同(PEG:蛋白质)比率(例如(0.5:1)、(1；1)、(2:1)、(4:1)、(8:1))添加到PBS(磷酸盐缓冲盐水)缓冲液，pH 7.2中终浓度为0.8mg/ml的rhTSH中。在25℃达1.5小时完成温育。
探索用N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)PEG的赖氨酸缀合。对于40kDaPEG，在PBS(磷酸盐缓冲盐水)缓冲液，pH 7.2中测试不同的(PEG:蛋白质)比率和不同的温育时间。最终TSH浓度为0.8mg每ml。在25℃或37℃达1.5小时或19.5小时完成PEG化。测试的短温育时间(1.5小时)显示与长温育时间(19.5小时)相同的结果。推测起来这是由于NHS PEG在水溶液中的快速水解。PEG化程度依赖于(PEG:蛋白质)摩尔比，更高的PEG摩尔过量产生更多MultiPEG化的缀合物。
收集MonoPEG化种类的大小排阻层析(SEC)级分并递交用于体外TSH受体结合测定法。体外TSH受体结合测定法结果显示Mono-40kDa NHS PEG-TSH(赖氨酸PEG化)比对照TSH(起始材料)具有低31.2倍(1/31.2)的亲和力，而Mono-40kDa氨氧基PEG-TSH(SAM PEG化)具有低5.3倍(1/5.3)的亲和力。
实施例6.产生半胱氨酸突变体用于位点特异性缀合
设计和制备TSH单突变体以引入用于位点特异性PEG化的半胱氨酸。这些突变体设计为使得其对蛋白质折叠、受体结合的影响最小化并针对其有效缀合的潜力。
在基于TSH/TSH受体的结构模型设计引入半胱氨酸突变体的位点时采用以下考虑：1)突变位点不应位于或临近于受体结合位点；2)突变位点不应位于或临近于α/β亚基二聚化接口；3)突变位点不应位于或临近于二硫键；4)基于报道的文献，避免在突变时导致比活性急剧丧失的位点；5)突变位点应溶剂暴露以用于后续PEG化；6)选择将均匀覆盖与受体结合位点相反的大部分TSH表面的位点以全面评估在每个区域的PEG化可行性。其中一些考虑汇总在表1中。选择的突变体的β-碳位置在我们的结构模型中暴露于溶剂，如图4中显示的。这预示这些位置在突变为半胱氨酸时很可能是PEG化试剂可到达的。在表1中选择的头3个位点是TSH中的天然糖基化位点。
表1
突变体ID 突变体 亚基 先前报道的诱变数据
1 N52C(a) α 在变为Gln时比活性中6x↑
2 N78C(a) α 在变为Gln时比活性中2-3x↑
3 N23C(b) β 在变为Gln时比活性中2-3x↑
4 V118C(b) β
5 M71C(a) α 氧化时比活性中<2x↓
6 N66C(a) α 在变为Lys时比活性中稍微升高
7 T69C(a) α
8 G22C(a) α
9 T21C(b) β
10 E63C(b) β
11 D56C(b) β 突变时比活性稍微变化
合成编码rhTSH基因(包含其信号肽)的DNA并克隆到Gateway进入载体(例如pDONOR221)中。利用基于寡核苷酸的定点诱变来在两个TSH亚基上的多个位点引入Cys突变。将所得野生型和突变体载体经由Gateway克隆改组到表达载体(例如pCEP4.DEST)中。从瞬时转染的HEK293细胞培养基制备蛋白质并通过生化和基于细胞的测定法，例如凝胶电泳、Western印迹、SEC-HPLC层析、PEG修饰产量和细胞报告测定法来表征。
评估结果并比较其表达水平、聚集(二聚化)倾向、PEG化功效和对TSH功能的扰动。例如，对纯化的突变体TSH的银染色分析揭示，突变体TSHN66C(α),TSH G22C(α),TSH M71C(α),TSH T69C(α)、和TSH V118C(β)具有最佳表达水平(见图5)。PEG化实验表明TSH G22C(α),TSH N66C(α),TSHT69C(α)、和TSH V118C(β)被有效地PEG化(见图6中的代表性PEG化结果)。M71C(α)似乎在PEG化温育中形成聚集物。(数据未显示)。决定推动选定的突变体(例如G22C)进入大规模生产和体内研究(见表2)。
表2
# 突变体 亚基 表达 单体 PEG化 离开TSHR 选择的领先者
1 野生型 *** ***
2 N52C(a) α ND
3 N78C(a) α ND
4 N23C(b) β ND
5 V118C(b) β * *** *
6 M71C(a) α ** *
7 N66C(a) α ** ** ** **
8 T69C(a) α ** ** *** ** #2
9 G22C(a) α ** *** *** *** #1
10 T21C(b) β ND
11 E63C(b) β ND
12 D56C(b) β ND
从CHO汇集物(pool)制备更大规模Cys突变体。密码子优化并合成编码野生型(WT)和突变rhTSH基因的DNA。将这些基因克隆到CHO表达载体(例如pGEN600,pGEN620)中用于瞬时转染到CHO细胞中。用甲氨蝶呤(MTX)选择扩增转染的CHO细胞。将所得CHO汇集物用于放大的蛋白质生产。
发现在表达和纯化后半胱氨酸TSH突变体在引入的半胱氨酸处加帽，如此需要另外的还原方法学来创建PEG化的突变体TSH。突变体TSH首先需要用温和的还原剂还原以从引入的半胱氨酸释放帽，而未不可逆地打断天然二硫键(这将使蛋白质失活)。
因此，采用多种方法以努力减少加帽的半胱氨酸。例如，将各种浓度的TCEP(三(2-羧基乙基)膦HCl)溶液与rhTSH突变体温育以还原。尽管使用该方法对于除去半胱氨酸帽是有效的，但还似乎有其他二硫键的一些还原，其导致后面的非特异性PEG化。另一种使用固定化的珠与TCEP的还原方法似乎在还原rhTSH中更温和，然而该方法还导致二硫键还原的一些低水平。我们发现1-10mM的半胱氨酸(作为还原剂)对于减少加帽的Cys而不打断已有的rhTSH中的二硫键尤为有效。
将半胱氨酸还原剂与帽一起除去以允许重新形成二硫键。然后，“脱帽的”引入的半胱氨酸选择性地缀合半胱氨酸反应性PEG试剂。尽管该方法已在其他蛋白质如FVIII(Mei等,Blood 116:270-9(2010))和抗体片段(Yang等,Protein Engineering 16:761-770(2003))中示例，然而，没有试图将其用于含半胱氨酸结(knot)蛋白质的已知报道。先前报道的示例仅具有1-2％的半胱氨酸含量，而TSH具有11％的半胱氨酸含量(23/210的氨基酸)，这使得将第24个半胱氨酸引入TSH而不扰乱天然二硫键(如此急剧降低受体结合亲和力)尤其困难。因此，我们不得不筛选多个位置以引入半胱氨酸突变，其中仅一些能成功地与PEG缀合。
位点特异性Cys PEG化：从CHO细胞产生G22C rhTSH用于位点特异性PEG化。在图8中显示的优化实验后将半胱氨酸添加到G22C rhTSH(1-2mg/ml)至终浓度为2mM。将蛋白质在4℃过夜温育以除去Cys22上的帽。将混合物透析过滤(dialfilter)到PEG化缓冲液中(10mM磷酸钠，2mM EDTA,pH7.0)。将PEG添加到蛋白质以得到5x摩尔过量并在25℃温育2小时。所述PEG化用2x半胱氨酸停止，并通过SEC-HPLC检查产量。将反应混合物的pH降低至pH5.0，然后加载到monoS柱上用于纯化。
几个PEG化反应的SEC-HPLC概貌显示于图8。获得约75％的MonoPEG化G22C TSH，这是非常有效的缀合。对G22C的亚基和位点特异性缀合的确认显示于图9A-图9B。
实施例7.PEG化rhTSH的MonoS AKTA纯化
将样品在monoS柱(GE Healthcare)上纯化并使用10mM乙酸钠pH5和10mM乙酸钠，1M氯化钠pH5的梯度以4ml/min的流速洗脱。梯度以0％流动相B(10mM乙酸钠，1M氯化钠pH5)开始，然后在25个柱体积内增加到50％流动相B，接着是100％流动相B，从而清洗柱。
实施例8.SDS-PAGE分析和染色
将预倾注的梯度凝胶(4-12％Bis Tris,Invitrogen)加载上4-5g TSH。制备MOPS(3-(N-吗啉代)丙磺酸)运行缓冲液(Invitrogen)。将电泳装置置于具有冰的冰桶(bucket)中。将凝胶在200V运行约50分钟，然后用蒸馏水漂洗3次，每次5分钟。将50ml 5％氯化钡添加到凝胶并摇动10分钟。通过将凝胶用蒸馏水漂洗5分钟来除去氯化钡。然后除去蒸馏水，并将凝胶首先针对PEG用1x碘化钾/碘溶液染色，直至条带可见。然后，将凝胶用蒸馏水脱色，并立即扫描。对于蛋白质染色，使用考马斯脱色(10％乙酸，20％甲醇)来除去PEG染色的所有痕迹，然后将凝胶用考马斯蓝染料染色。纯化的糖PEG化rhTSH缀合物的SDS-PAGE分析结果显示于图10C(PEG染色)和图10D(考马斯染色)。
实施例9.PEG化rhTSH的SEC-HPLC分析
将样品在Superdex 20010/300GL柱(GE Healthcare)上运行，然后以0.4ml每分钟的流速在50mM磷酸钠，150mM氯化钠缓冲液pH7中洗脱。40kD SAM反应和纯化的PEG化rhTSH缀合物的代表性SEC-HPLC概貌分别显示于图11A和图11B。
实施例10.PEG化rhTSH的肽图谱和N端测序
将每份样品20微克稀释到含有6M盐酸胍和38mM二硫苏糖醇的0.1MTris，pH 8.5中，用氮气覆盖并在25℃过夜温育。温育后，以50mM添加碘乙酰胺。然后将样品用氮气覆盖并在25℃温育2小时。烷基化反应通过添加1/1(v/v)0.25％三氟乙酸淬灭，并使用3,500MWCO Slide-A-Lyzer mini透析单元(Thermo Scientific)将样品透析到0.1M Tris，pH 8.5中。将样品以1:25(酶:样品)比率在37℃过夜消化。消化反应用1/1(v/v)0.25％三氟乙酸淬灭。使用装备有自动化注射器和级分收集器、二元溶剂泵(binary solvent pump)、恒温柱区室(thermostatted column compartment)、和可变波长检测器的Agilent 1200HPLC，将经胰蛋白酶消化的样品分级(fractionated)。将样品加载到Poroshell300SB-C8柱(2.1x 75mm,5μm颗粒,Agilent Technologies,CA)上，其保持在50℃，并在98％溶剂A(水中0.1％三氟乙酸)和2％溶剂B(乙腈中0.08％三氟乙酸)中预平衡。使用从2％至60％的溶剂B的线性梯度在25min内以0.4ml/min的流速洗脱胰蛋白酶的肽。收集在比未PEG化片段更大的％B处洗脱的PEG化片段，并在离心浓缩器(Thermo Scientific,MA)中干燥。使用Procise蛋白质测序器(Applied Biosystems,CA)实施自动化的N端序列分析。使用预先编程的脉冲液体(pulsed liquid)方法对200pmol样品和对照进行18个周期的自动化Edman降解。图12显示40kD SAM缀合物的肽图谱和N端测序结果。仅检测到3种胰蛋白酶糖肽(AT9、AT6、BT3)，指示糖PEG化的位点特异性。带下划线的N对应于N-连接的糖基化位点。
实施例11.测定每个亚基上的相对PEG化的量
通过测量未PEG化α和β亚基(在将其与PEG化的亚基分离后)的相对量来计算亚基特异性的PEG化，其使用两次连续的反相HPLC运行。使用这种推论方法，是因为不能鉴定解析PEG化α和β亚基的层析条件。通过离心超滤将样品(100μg)浓缩为20μL，然后在6M盐酸胍，10mM磷酸钠，100mM氯化钠，pH 7.0中变性。在25℃过夜温育后，将样品加载到用75％溶剂A(10mM磷酸钠，pH 6.5)和25％溶剂B(40％10mM磷酸钠，pH 6.5，60％乙腈)预平衡的Poroshell 300SB-C8柱(2.1x 75mm,5μm颗粒,Agilent Technologies,CA)上。将柱在5min内用25-50％B，继之以在20min内用50-75％B在25℃以0.4ml/min洗脱。收集对应于未PEG化TSH亚基(～9.5-12.5min)的全部峰级分(图13B)并通过离心超滤浓缩至低于50μL。将样品用水调整为50μL，然后通过添加4.7μL的2M二硫苏糖醇和150μL的6M盐酸胍，0.1M Tris，pH 8.5，用氮气覆盖并在25℃过夜温育来还原。游离硫醇然后通过添加9.3μL的2M碘乙酰胺，用氮气覆盖，并在25℃温育2小时来烷基化。该烷基化反应通过添加150μL的0.25％三氟乙酸来淬灭。通过第二次反相HPLC运行来概貌分析还原的和烷基化的未PEG化TSH亚基。HPLC柱设置与上文所示的相同，只是溶剂A组成为水中0.1％的三氟乙酸，溶剂B组成为乙腈中0.08％的三氟乙酸，并将柱保持在50℃。将柱用2-75％B的线性梯度在15min内以0.3ml/min洗脱。未PEG化α对β亚基的相对百分比通过从每种样品三次注射所得的A214nm层析图(图13C)积分来确定。然后，将PEG化α对β亚基的相对百分比取作这些值的倒数(inverse)。该分析显示40kD MonoPEG化GAM-、GAM+和SAM缀合物中修饰的α亚基的分数分别为77％、66％和58％，与通过SDS-PAGE获得的结果相一致(图13A)。
实施例12.体外受体结合测定法
通过体外猪TSH受体结合测定法来分析纯化的PEG化缀合物，其使用来自RSR Limited(Kronus,Star,ID)的TSH Receptor Autoantibody 2nd GenerationELISA试剂盒。代替使用由试剂盒提供的针对TSH受体的生物素化的人单克隆自身抗体，我们将(rhTSH)生物素化以用于对TSH受体结合的竞争性抑制。生物素化的rhTSH到固定化的猪TSH受体的结合受到rhTSH对照或PEG化rhTSH缀合物的抑制，并测量IC50值。
使用ChromaLinkTM Biotin Labeling Reagent依照制造商方案(QEDBioscience Inc.,San Diego,CA)将以1.7至1.8个生物素每蛋白生物素化，并使用ZebaTM Desalt Spin Column(Thermo Scientific,Rockford,IL)缓冲液交换到50mM磷酸钠，150mM氯化钠pH 7.0中。对受体结合的体外测量通过生物素化的与PEG-rhTSH缀合物对猪TSH受体结合的竞争来进行，所述猪TSH受体固定化于96孔板上，由来自RSR Limited(Kronus,Star,ID)的TSHReceptor Autoantibody 2nd Generation ELISA试剂盒供应。将PEG-rhTSH缀合物在测定缓冲液(100mM HEPES pH 7.5,20mM EDTA,1％BSA,0.5％TritonX-100)中以1:5系列稀释为从16μΜ至41pM，并以1:1与在测定缓冲液中稀释1000倍的生物素化的混合。将混合物添加到每个用受体涂覆的孔并在25℃温育25分钟。清洗掉未结合的rhTSH，并依照RSR Limited ELISA方案添加链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶在25℃达20分钟以确定结合于板的生物素化的量。然后将板清洗3次以除去过量的未结合的链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶，接着向每个孔添加四甲基联苯胺(TMB)并在黑暗中在25℃温育30分钟。将反应用0.5M硫酸终止缓冲液淬灭，并使用340pc板阅读器(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)读出每个孔在450nm处的吸光度。使用S形(sigmoidal)剂量应答方程和GraphPad Prism软件拟合数据以生成IC50值。
N端和赖氨酸PEG化得到具有比糖缀合低的TSH受体亲和力的缀合物。使用40kD PEG的N端MonoPEG化得到比TSH对照低10.8倍(为对照1/10.8)的受体结合亲和力。使用40kD PEG的赖氨酸PEG化得到比TSH对照低31.2倍(为对照1/31.2)的受体结合亲和力。相比之下，GAM+MonoPEG化对于20kD PEG缀合得到低2.2倍(为1/2.2)的受体结合亲和力，对于40kD PEG缀合得到低3.6倍(为1/3.6)的受体结合亲和力。SAM MonoPEG化还导致相比于N端PEG化在体外TSH受体结合亲和力方面的中等降低，根据缀合的PEG的大小，范围为从2.1至5.3倍的降低(为1/2.1至1/5.3)。GAM(-)MonoPEG化在所有糖PEG化策略中导致最大的损失，其中20kD PEG缀合导致体外TSH受体结合亲和力降低2.7倍(为1/2.7)，而40kD PEG缀合导致降低8.0倍(为1/8.0)。(见表3a和3b和图14)。
表3a
表3b
实施例13.在雄性和雌性Sprague Dawley大鼠中单次肌内(IM)注射后对PEG化rhTSH的药动学和药效学分析
在雄性和雌性大鼠中在单次肌内(IM)注射后评估rhTSH和PEG化rhTSH(20kD SAM,20kD GAM(-),20kD GAM(+),40kD GAM(+))的药动学。
将单剂量的rhTSH或PEG化rhTSH(20kD SAM,20kD GAM(-),20kDGAM(+),40kD GAM(+))以0.5mg/kg的剂量IM施用给禁食的颈静脉插入导管的(jugular vein cannulated)雄性和雌性大鼠。由于剂量容积限制，动物以两次或三次肌内注射的形式接受测试物进入四头肌中。将腿轮换来给药。在给药前和在给药后的以下时间点：0.5,1,2,4,8,24和48小时从动物收集血液样品。在测试物施用前的晚上从动物笼移除食物。动物在该时间期间能获得水。在给药前样品收集和测试物施用后将食物添加回笼。在当天结束时再次移除食物，从而使动物对于24小时给药后样品收集空腹。在样品收集后将食物添加回笼，并在当天结束时再次移除，从而使动物对于48小时给药后样品收集空腹。从单端口颈静脉插管收集血液。约400μL的全血液被收集到血清分离管中并处理以获得血清。将血清分离到两个管中(各～100μL)。将所有样品存储于-80℃直至通过TSH ELISA分析其rhTSH或PEG化rhTSH浓度。在最后一次样品收集后将动物用CO2安乐死。
表4
表5
PK数据显示20kD SAM和20kD GAM(-)相比于rhTSH对照具有>5倍延长的t1/2、延长的Tmax和增加的暴露(曲线下面积，AUC)。20kD GAM(+)的PK概貌相比于20kD SAM显示较少的改进，而20kD GAM(-)和40kD GAM(+)仅显示中等改进。Vz(表观分布容积)的增加值指示GAM(+)缀合物可能经历受体介导的清除。(见图16和表5)。测量血清T4浓度以收集药效学数据(见图15)，其依照制造商方案使用ACE临床化学系统(Alfa Wassermann DiagnosticTechnologies,LLC)进行。
实施例14.在雄性和雌性Sprague Dawley大鼠中单次IM注射后对PEG化rhTSH的药动学分析
在雄性和雌性大鼠中在单次肌内(IM)注射后评估PEG化rhTSH(10kDMultiSAM,10kD SAM,40kD SAM,40kD GAM(-))的药动学。
将单剂量的rhTSH或PEG化rhTSH(10kD MultiSAM,10kD SAM,40kDSAM,40kD GAM(-))以0.5mg/kg的剂量IM施用给禁食的颈静脉插入导管的雄性和雌性大鼠。由于剂量容积限制，动物以两次或三次肌内注射的形式接受测试物进入四头肌中。将腿轮换来给药。在给药前和在给药后的以下时间点：0.5,1,3,6,24,48,72和96小时从动物收集血液样品。在测试物施用前的晚上从动物笼移除食物。动物在该时间期间能获得水。在给药前样品收集和测试物施用后将食物添加回笼。在每天结束时再次移除食物，从而使动物对于其后早上的给药后样品收集空腹。在每次给药后样品收集后将食物添加回笼。从单端口颈静脉插管收集血液。约400μL的全血液被收集到血清分离管中并处理以获得血清。将血清分离到两个管中(各～100μL)。将所有样品存储于-80℃直至通过TSH ELISA分析其rhTSH或PEG化rhTSH浓度。在最后一次样品收集后将动物用CO2安乐死。
表6
表7
PK数据显示10kDMultiSAM,40kD SAM和40kD GAM(-)相比于rhTSH对照具有14～23倍延长的t1/2，延长的Tmax和增加的暴露(曲线下面积，AUC)。(见图17和表7)。在40kD SAM和40kD GAM(-)的PK概貌中观察到的改进大于实施例13中20kD SAM和20kD GAM(-)的改进。
PEG缀合物的体内大鼠药动学研究(实施例13和14)：总之，血浆半衰期如预期的与缀合至rhTSH的PEG大小成比例增加。对于相同PEG大小的SAM和GAM(-)缀合物，不同于受体结合亲和力，在两种PEG化策略之间对于PK参数的改进没有明显差异，表明对PK的影响是仅PEG大小依赖性的而不是PEG化位点依赖性的。例如，40kD SAM和40kD GAM(-)两者均相比于rhTSH对照(3.42±0.61小时)显示血浆半衰期的23倍增加，分别达到77.9±16.9小时和80.1±16.1小时。MultiPEG化(10kD MultiSAM)相比于相同大小PEG的MonoPEG化(10kD SAM)具有更大的血浆半衰期增加。10kD MultiSAM相比于rhTSH对照具有13.7倍增加，达到46.8±10.4小时，而10kD SAM仅具有4.6倍增加，达到15.8±1.23小时。(见表7)。还观察到浓度峰时间(Tmax)的PEG大小依赖性延迟。例如，10kD、20kD和40kD SAM分别在5.40±1.34小时、16.0±8.76小时和30.0±12.0小时显示Tmax，相比于rhTSH对照在2.00±0.00小时或1.50±1.18小时。(见表5和表7)。
实施例15.药动学测定法：rhTSH或PEG化rhTSH ELISA测量血清样品中的蛋白质浓度
将高结合96孔ELISA板用在0.1M碳酸氢钠缓冲液pH 9.2中以1.33pg/m稀释的鼠抗hCG捕捉抗体涂覆，并以每孔100μL添加。从纯化的蛋白质制备标准rhTSH或PEG化rhTSH曲线并在由1X板清洗液中1.0％w/v BSA组成的样品稀释缓冲液(SDB)中稀释。使用2:3系列稀释方案从25-1.463ng/mL,8.334-0.488ng/mL或5.556至0.325ng/mL稀释标准物，其依赖于rhTSH或PEG化rhTSH种类每测定法的合格的线性范围。将样品以不低于1:10稀释在SDB中稀释。将在正常大鼠血清中制备的500ng/mL和25ng/mL rhTSH对照在SDB中分别以1:100和1:10稀释。添加未稀释的在SDB中制备的0.5ng/mL rhTSH对照。清洗经涂覆的板，将100μL样品、标准物和对照添加到板，并在37℃温育1小时。
将生物素化的抗rhTSH单克隆检测抗体(克隆TS8)依照特异于每个批次的适宜稀释度在SDB中稀释。清洗板，将100μL稀释的生物素化检测抗体添加到孔，并在37℃温育1小时。
将链霉菌抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶缀合物(SA-HRP)依照特异于每个批次的适宜稀释度在SDB在稀释。清洗板，将100μL稀释的SA-HRP添加到孔，并在25℃温育15分钟。
清洗板，将100μL四甲基联苯胺(TMB)底物添加到所有孔，并在25℃温育20分钟。
向所有孔添加100μL的TMB终止缓冲液，并在450nm处读板。
实施例16.对PEG化rhTSH药效学的小鼠T4生物测定法评估
在T3团粒植入后3天的单IP注射后，评估雄性小鼠中PEG化rhTSH的药效学。在该小鼠PD模型中，通过在给药前3天植入缓慢释放的T3团粒在该研究时段期间抑制内源性小鼠T4(见图18A-图18D中的媒介物组)。因此，仅测量通过rhTSH对照或PEG化rhTSH缀合物释放的T4的量。由于小鼠的有限血液容积，收集给药后6,24,48和72小时的4个时间点。
将动物用异氟烷麻醉，并使用套针皮下植入0.1mg T3团粒(T-261,Innovative Research of America)。在团粒植入后3天，对雄性小鼠(ICR种系，6周龄，Taconic Farms)IP施用单剂量的rhTSH(0.4或4.0mg/kg)或PEG化rhTSH(4mg/kg)。将动物用异氟烷麻醉，并从眶后丛(retro-orbital plexus)收集血液样品。在给药前(动物1-4)、测试物施用后6(动物5-8)、24、48和72小时收集组1血液样品。在测试物施用后6、24、48和72小时从所有其他组收集血液样品。将约60μL的全血收集入微红细胞压积毛细管并处理以获得血清。在最后一次样品收集后，将动物用CO2安乐死。将所有血清样品存储于-80℃直至通过临床化学T4测定法对其分析T4浓度。通过ACE临床化学系统(Alfa WassermannDiagnostic Technologies,LLC)依照制造商方案来测量血清T4浓度。
表8
来自经媒介物处理的动物的数据指示由于经由皮下T3团粒的研究持续时间的T4抑制的模型有效性。在6小时时，所有治疗相比于媒介物显著地(p<0.001)增加T4(图18A)。在24小时时，0.4mg/kg rhTSH开始返回T4的媒介物样水平，而剩余处理相比于媒介物保持显著(p<0.001)升高(图18B)。在48小时时，两种(0.4mg/kg和4mg/kg)rhTSH处理已回到T4的媒介物样水平，且3种PEG缀合物适度降低但相比于4mg/kg rhTSH显著(p<0.001)升高(图18C)。在72小时时，40KD SAM和10KD MultiSAM保持升高(类似于48小时时间点)，而10KD MultiGAM(+)适度下降(图18D)。所有缀合物相比于rhTSH 4mg/kg均保持升高，另外，40KD SAM和10KD MultiSAM相比于10KD MultiGAM(+)升高(p<0.001)。
基于PK(实施例14)和PD(实施例16)数据，10KD MultiSAM和40KDSAM似乎是有前景的候选物。10KD MultiGAM(+)似乎也有前景，但没有像所述两种更有前景的候选物改进得那么多的作用持续时间。
实施例17.PEG化rhTSH药效学(40kD SAM)的剂量应答曲线研究评估
在T3团粒植入后3天的单腹膜内(IP)注射后，评估雄性小鼠中3种不同剂量水平的PEG化rhTSH(40kD SAM)的药效学。
将动物用异氟烷麻醉，并使用套针皮下植入0.1mg T3团粒(T-261,Innovative Research of America)。在团粒植入后3天，对雄性小鼠(ICR种系，6周龄，Taconic Farms)以0.04mg/kg(图19A)、0.4mg/kg(图19B)、或4mg/kg(图19C)的剂量IP施用单剂量的rhTSH或PEG化rhTSH(40kD SAM)。将动物用异氟烷麻醉，并从眶后丛收集血液样品。在测试物施用后6(动物1-4)、24、48、72和96(动物5-8)小时收集组1血液样品。在测试物施用后6、24、48和72小时从所有其他组收集血液样品。将约60μL的全血收集到微红细胞压积毛细管并处理以获得血清。在最后一次样品收集后，将动物用CO2安乐死。将所有血清样品存储于-80℃直至通过临床化学T4测定法对其分析T4浓度。通过ACE临床化学系统(Alfa Wassermann Diagnostic Technologies,LLC)依照制造商方案来测量血清T4浓度。
表9
表10
通过AUEC(有效曲线下面积)计算评估延长
*p<0.001相比于rhTSH
来自经媒介物处理的动物的数据指示由于经由皮下T3团粒的研究持续时间的T4抑制的模型有效性。所有rhTSH剂量均显示等同的AUEC，且在剂量应答曲线的顶部引发表观最大效果。40KD SAM展现代表全剂量应答曲线的AUEC，从无影响到适度影响到明显最大影响。rhTSH处理在6小时时在所有剂量增加T4水平，然后在24小时时降低至T4的媒介物样水平，但最高剂量4mg/kg除外，其显示在给药后48小时时返回媒介物水平的T4水平。使用40KD SAM的效果的延长依赖于该小鼠PD模型中的剂量，在4mg/kg剂量水平最显著。在0.4mg/kg水平仅看到温和的效果增强。
实施例18.在雄性和雌性Sprague Dawley大鼠中在T3团粒植入后3天的单次IM注射后对PEG化rhTSH的药效学分析
在T3团粒植入后3天的单肌内(IM)注射后，评估雄性和雌性大鼠中PEG化rhTSH的药效学。
将动物用异氟烷麻醉，并使用套针皮下植入1.5mg T3团粒(T-261,Innovative Research of America)。在团粒植入后3天，对颈静脉插入导管的雄性和雌性大鼠以0.0mg/kg(媒介物)、0.04mg/kg、0.4mg/kg、或0.65mg/kg的剂量IM施用单剂量的rhTSH或PEG化rhTSH。对于40kD MultiSAM和50kDMultiSAM，基于单PEG化种类的含量来确定0.65mg/kg剂量。由于剂量容积限制，动物以两次肌内注射的形式接受测试物进入四头肌中。将腿轮换来给药。在给药前和在给药后的以下时间点：1,3,6,24,48,72,96,120,144和168小时从动物收集血液样品。从单端口颈静脉插管收集血液。将约250μL的全血液收集到血清分离管中并允许血液凝结最少30分钟。将管在离心机中以10,000rpm旋转5分钟并将血清分离到两个管中(各～50μL)。将所有样品存储于-80℃直至通过临床化学T4测定法对其分析T4浓度。在最后一次样品收集后，将动物用CO2安乐死。通过ACE临床化学系统(Alfa WassermannDiagnostic Technologies,LLC)依照制造商方案来测量血清T4浓度。
表11
表12
通过AUEC(有效曲线下面积)计算评估延长
*p<0.05相比于rhTSH
来自经媒介物处理的动物的数据指示由于经由皮下T3团粒的研究持续时间的T4抑制的模型有效性。rhTSH的Tmax在给药后6小时时出现并在给药后72小时时返回至基线(即媒介物组水平)。10KD MultiSAM Tmax在给药后24小时时出现，且对于0.04mg/kg剂量在给药后72小时时返回至基线，对于0.4mg/kg剂量在给药后96小时时返回至基线。低剂量数据显示该模型中10KD MultiSAM相对于rhTSH的降低的效力，这可能反映降低的TSH受体结合亲和力。高剂量数据确认了使用10KD MultiSAM在给药后48和72小时时的增强的药效学效果。包括40kD MultiSAM和50kD MultiSAM在内的所有候选物相比于rhTSH在0.4mg/kg显示增强的T4应答，这可能部分是由Tmax到给药后24小时的迁移所介导的。在给药后至96-120小时时观察到延长的药效学活性。(对于40kD MultiSAM和50kD MultiSAM，0.65mg/kg剂量等同于0.4mg/kg，基于这些缀合物中MonoPEG化种类的百分比含量)。对于所有测试物，在肌内施用后的给药后96小时内观察到约95％的药效学效果。使用PEG化缀合物观察到的更高的AUEC由给药后24-96小时之间更高的T4水平驱动。对于0-96小时时段，10KD MultiSAM展现1.3倍的rhTSH AUEC；40KD SAM，1.5倍；40KD MultiSAM，1.7倍；和50KD MultiSAM，1.9倍。(表12，图20)。
实施例19.在雄性和雌性Sprague Dawley大鼠中在T3团粒植入后3天的单次IM注射后对PEG化rhTSH的药效学分析
在T3团粒植入后3天的单肌内(IM)注射后，评估雄性和雌性大鼠中PEG化rhTSH的药效学。
将动物用异氟烷麻醉，并使用套针皮下植入1.5mg T3团粒(T-261,Innovative Research of America)。在团粒植入后3天，对颈静脉插入导管的雄性和雌性大鼠以0.0mg/kg(媒介物)、0.4mg/kg、或0.65mg/kg的剂量IM施用单剂量的rhTSH或PEG化rhTSH。对于50kD MultiSAM，基于MonoPEG化种类的含量确定0.65mg/kg剂量。由于剂量容积限制，动物以两次肌内注射的形式接受测试物进入四头肌中。将腿轮换来给药。在给药前和在给药后的以下时间点：6(图21A)、24(图21B)、48(图21C)、72(图21D)、96(图21E)、和168(图21F)小时从动物收集血液样品。从单端口颈静脉插管收集血液。将约250μL的全血收集到血清分离管中并允许血液凝结最少30分钟。将管在离心机中以10,000rpm旋转5分钟并将血清分离到两个管中(各～50μL)。将所有样品存储于-80℃直至通过临床化学T4测定法对其分析T4浓度。在最后一次样品收集后，将动物用CO2安乐死。通过ACE临床化学系统(Alfa Wassermann DiagnosticTechnologies,LLC)依照制造商方案来测量血清T4浓度。
表13
表14
通过AUEC(有效曲线下面积)计算评估延长
来自经媒介物处理的动物的数据指示由于经由皮下T3团粒的研究持续时间的T4抑制的模型有效性。(见图22)。对于每种测试物，延长的药效学效果在组内一致。作用持续时间和AUEC均排序为rhTSH<10KD MultiSAM<40KD SAM<50KD MultiSAM，与实施例18一致。
实施例20.PEG化rhTSH(10KD MultiSAM和40KD SAM)的药效学评估
在T3团粒植入后3天的单肌内(IM)注射后，评估雄性和雌性大鼠中PEG化rhTSH(10KD MultiSAM和40KD SAM)的药效学。
将动物用异氟烷麻醉，并使用套针皮下植入1.5mg T3团粒(T-261,Innovative Research of America)。在团粒植入后3天，对颈静脉插入导管的雄性和雌性大鼠以如表15中指定的0.0mg/kg(媒介物)、0.1、0.2、0.4、或1.0mg/kg的剂量IM施用单剂量的媒介物或PEG化rhTSH(10KD MultiSAM或40KDSAM)。由于剂量容积限制，动物以两次肌内注射的形式接受测试物进入四头肌中。将腿轮换来给药。在给药前和在给药后的以下时间点：6,24,48,72,96和168小时从动物收集血液样品。从单端口颈静脉插管收集血液。将约250μL的全血收集到血清分离管中并允许血液凝结最少30分钟。将管在离心机中以10,000rpm旋转5分钟并将血清分离到两个管中(各～50μL)。将所有样品存储于-80℃直至通过临床化学T4测定法对其分析T4浓度。在最后一次样品收集后，将动物用CO2安乐死。通过ACE临床化学系统(Alfa WassermannDiagnostic Technologies,LLC)依照制造商方案来测量血清T4浓度。
表15
表16
通过AUEC(有效曲线下面积)计算评估延长
来自经媒介物处理的动物的数据指示由于经由皮下T3团粒的研究持续时间的T4抑制的模型有效性。(见图23)。10KD MultiSAM在0.4mg/kg未产生最大PD应答，且1mg/kg产生更突出的T4应答(在程度和持续时间上)。40KDSAM 0.2mg/kg展现出中等的PD应答，而0.1mg/kg具有很小或无效果。有意思的是，10KD MultiSAM和40KD SAM在0.2mg/kg展现近乎相等的PD。然而，在0.4mg/kg，40kD SAM比10kD MultiSAM引发更强的药效学效果。总之，来自3项分别研究的数据(实施例18、19和20)对于10kD MultiSAM和40kDSAM是一致的。
实施例21.在雄性和雌性Sprague Dawley大鼠中在T3团粒植入后3天的单次IM注射后PEG化Cys-突变体TSH(40KD G22C)相比于两剂量水平的PEG化rhTSH(40KD SAM)的药效学(PD)评估
在植入T3团粒的Sprague Dawley大鼠中评估PEG化Cys-突变体TSH(40KD G22C)的药效学并与rhTSH和40kD SAM PEG化rhTSH的药效学比较。
将动物用异氟烷麻醉，并使用套针皮下植入1.5mg T3团粒(T-261,Innovative Research of America)。在团粒植入后3天，对颈静脉插入导管的雄性和雌性大鼠以0.0mg/kg(媒介物)、0.2或0.4mg/kg的剂量IM施用单剂量的媒介物,rhTSH,PEG化rhTSH(40KD SAM)、或PEG化Cys-突变体TSH(40KDG22C)。由于剂量容积限制，动物以两次肌内注射的形式接受测试物进入四头肌中。将腿轮换来给药。在给药前和在给药后的以下时间点：6,24,48,72,96和168小时从动物收集血液样品。从单端口颈静脉插管收集血液。将约250μL的全血收集到血清分离管中并允许血液凝结最少30分钟。将管在离心机中以10,000rpm旋转5分钟并将血清分离到两个管中(各～50μL)。将所有样品存储于-80℃直至通过临床化学T4测定法对其分析T4浓度。在最后一次样品收集后，将动物用CO2安乐死。通过ACE临床化学系统(Alfa WassermannDiagnostic Technologies,LLC)依照制造商方案来测量血清T4浓度。
表17
表18
通过AUEC(有效曲线下面积)计算评估延长
来自经媒介物处理的动物的数据指示由于经由皮下T3团粒的研究持续时间的T4抑制的模型有效性。(见图24)。从药效学角度来看，40kD G22C Cys-突变体不表现为优于40kD SAM。40kD SAM表现为显示比40kD G22C Cys-突变体增加的作用持续时间。
本文中引用的所有专利、公开的申请和参考文献的教导均通过提述以其整体并入本文。
尽管已参照其示例实施方案具体显示并描述了本发明，但本领域技术人员可理解的是可在其中进行多种形式上和细节上的变化，而不背离由所附权利要求涵盖的本发明的范围。

Claims (52)

1.一种包含促甲状腺激素(TSH)的组合物，其中至少一种聚亚烷基二醇聚合物附接于所述TSH的糖位点。
2.权利要求1的组合物，其中自哺乳动物分离所述TSH。
3.权利要求2的组合物，其中所述哺乳动物是人。
4.权利要求1的组合物，其中所述TSH是重组的哺乳动物TSH。
5.权利要求4的组合物，其中所述TSH是重组的人TSH(rhTSH)。
6.权利要求5的组合物，其中所述糖位点是唾液酸。
7.权利要求6的组合物，其中所述唾液酸基团位于选自下组的TSH上的位点处：rhTSHα亚基的ASN52、rhTSHα亚基的ASN78、和rhTSHβ亚基的ASN23、或其组合。
8.权利要求5的组合物，其中所述糖位点是半乳糖。
9.权利要求8的组合物，其中所述半乳糖位于rhTSHα亚基的ASN52、rhTSHα亚基的ASN78、rhTSHβ亚基的ASN23、或其组合处。
10.权利要求1的组合物，其中所述聚亚烷基二醇聚合物是聚乙二醇(PEG)。
11.权利要求10的组合物，其中所述PEG具有约3,000至约100,000kDa的平均分子量。
12.权利要求11的组合物，其中一个PEG附接于所述TSH。
13.权利要求11的组合物，其中超过一个PEG附接于所述TSH。
14.权利要求1的组合物，其中所述TSH相比于对照展现延长的T4应答。
15.一种包含突变的促甲状腺激素(TSH)和至少一个聚亚烷基二醇聚合物的组合物，其中所述突变的TSH包括其中一个或多个氨基酸残基已被半胱氨酸残基取代的TSH，其中所述聚亚烷基二醇聚合物在所述半胱氨酸残基处附接于所述突变的TSH，且所述突变的TSH是生物学活性的。
16.权利要求15的组合物，其中所述已被半胱氨酸取代的氨基酸残基位于TSH的α亚基上。
17.权利要求16的组合物，其中所述已被半胱氨酸取代的氨基酸残基位于选自下组的重组人TSH的氨基酸位置处：ASN52、ASN78、MET71、ASN66、THR69、和GLY22、及其组合。
18.权利要求15的组合物，其中所述已被半胱氨酸取代的氨基酸残基位于TSH的β亚基上。
19.权利要求18的组合物，其中所述已被半胱氨酸取代的氨基酸残基位于选自下组的重组人TSH的氨基酸位置处：ASN23、VAL118、THR21、GLU63、和ASP56、及其组合。
20.权利要求15的组合物，其中所述聚亚烷基二醇聚合物是聚乙二醇(PEG)。
21.权利要求20的组合物，其中所述PEG具有约3,000至约100,000kDa的平均分子量。
22.权利要求20的组合物，其中一个PEG附接于所述TSH。
23.权利要求20的组合物，其中超过一个PEG附接于所述TSH。
24.一种产生PEG化、生物学活性的促甲状腺激素(TSH)的方法，包括将至少一种聚亚烷基二醇聚合物附接于TSH的糖位点。
25.一种产生PEG化、生物学活性的突变的促甲状腺激素(TSH)的方法，包括a)将一个或多个另外的半胱氨酸残基引入TSH，由此产生突变的TSH；b)将一个或多个聚亚烷基二醇聚合物附接于在步骤a)中引入的一个或多个半胱氨酸残基，由此产生PEG化、生物学活性的突变的TSH。
26.权利要求25的方法，其中所述半胱氨酸残基代替TSH中的内源性氨基酸残基。
27.权利要求25的方法，其中自哺乳动物分离所述TSH。
28.权利要求27的方法，其中所述哺乳动物是人。
29.权利要求25的方法，其中所述TSH是重组的哺乳动物TSH。
30.权利要求29的方法，其中所述TSH是重组的人TSH(rhTSH)。
31.权利要求25的方法，其中所述聚亚烷基二醇聚合物是聚乙二醇(PEG)。
32.权利要求31的方法，其中所述PEG具有约3,000至约100,000kDa的平均分子量。
33.权利要求31的方法，其中一个PEG附接于所述TSH。
34.权利要求31的方法，其中超过一个PEG附接于所述TSH。
35.权利要求25的方法，其中所述半胱氨酸位于TSH的α亚基上。
36.权利要求35的方法，其中所述半胱氨酸位于选自下组的重组人TSH的氨基酸位置处：ASN52、ASN78、MET71、ASN66、THR69、和GLY22、及其组合。
37.权利要求25的方法，其中所述半胱氨酸位于TSH的β亚基上。
38.权利要求37的方法，其中所述半胱氨酸位于选自下组的重组人TSH的氨基酸位置处：ASN23、VAL118、THR21、GLU63、和ASP56、及其组合。
39.一种治疗有此需要的受试者中的甲状腺病况的方法，包括施用有效量的PEG化、生物学活性的促甲状腺激素(TSH)。
40.权利要求39的方法，其中自哺乳动物分离所述TSH。
41.权利要求40的方法，其中所述哺乳动物是人。
42.权利要求39的方法，其中所述TSH是重组的哺乳动物TSH。
43.权利要求42的方法，其中所述TSH是重组的人TSH(rhTSH)。
44.权利要求39的方法，其中所述聚亚烷基二醇聚合物是聚乙二醇(PEG)。
45.权利要求44的方法，其中所述PEG具有约3,000至约100,000kDa的平均分子量。
46.权利要求44的方法，其中一个PEG附接于所述TSH。
47.权利要求44的方法，其中超过一个PEG附接于所述TSH。
49.一种药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求1-23中任一项的组合物和药学可接受的载体。
50.一种治疗有此需要的患者中的甲状腺病况的方法，包括对所述患者施用有效量的权利要求49的药物组合物。
51.权利要求50的方法，其中所述药物组合物相比于对照展现出增强的T4应答。
52.权利要求50的方法，其中所述甲状腺病况选自下组：甲状腺癌。
53.权利要求50的方法，其中所述药物组合物经由肌内注射递送。
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