KR102045980B1

KR102045980B1 - 균류의 수명을 증가시키기 위해 변형된 분위기에서 균류 포자를 포장하는 방법

Info

Publication number: KR102045980B1
Application number: KR1020137005428A
Authority: KR
Inventors: 마르코스 로드리게스 데 파리아
Original assignee: 엠프레사 브라질레이라 데 페스퀴사 아그로페쿠아리아-엠브라파
Priority date: 2010-07-30
Filing date: 2011-08-01
Publication date: 2019-11-18
Also published as: US20130203154A1; JP2013534135A; AU2016203062A1; JP6641253B2; EP2599857A4; CR20130083A; BRPI1002615B8; JP2019154451A; JP2016195611A; EP2599857A1; AU2011284816A1; AU2018202274B2; BRPI1002615A2; EP2599857B1; AU2018202274A1; WO2012012858A1; AR083245A1; BRPI1002615B1; MX2013001230A; MX357404B

Abstract

본 발명은 균류 포자의 수명을 증가시키는 포장 방법 및 그러한 포자를 포함한 포장에 관한 것이다. 상기 포장 방법은 관심 있는 균류에 대해 생존성인 수분 활성도 범위가 되도록 포자를 미리 건조시키는 단계; 봉지를 사용함으로써 기체- 및 수증기- 불투과성인 포장으로 포자를 포장하여 낮은 상대 습도 및 낮은 산소 함량의 분위기를 제공하는 단계; 포자를 높은 온도에 노출시키기 전에 포자에 적합한 온도에서 일정 시간 동안 포장 내에서 포자를 유지시키는 단계를 포함한다.

Description

균류의 수명을 증가시키기 위해 변형된 분위기에서 균류 포자를 포장하는 방법{METHOD FOR PACKAGING FUNGAL SPORES IN A MODIFIED ATMOSPHERE WITH A VIEW TO INCREASING THE SHELF LIFE OF THE FUNGI}

본 발명은 뷰베리아 속(Beauveria ), 이사리아 속(Isaria ), 레카니실리움 속(Lecanicillium ), 노뮤레아 속(Nomuraea ), 메타리지움 속(Metarhizium ) 및 트리코더마 속(Trichoderma)과 같은 곤충 병원성(entomopathogenic) 균류 포자의 수명(shelf-life)을 증가시키기 위해 포자를 포장하는 방법에 관한 것이다.

생물학적 살생물제(pesticide)들은 인간에 대해 비독성이기 때문에 합성되어 얻어진 것에 대한 대안이다. 그 중에서 곤충 병원성 균류로부터 생산된 것이 있는데, 그 포자들은 연장된 기간 동안 생존성을 유지시키기 위해 탈수된다(Moore et al. Effects of moisture content and temperature on storage of Metarhizium flavoride conidia. Biocontrol Science and Technology, v.6, p. 51-61). 탈수는 또한 포자가 건조한 열, 냉동 및 해동, 산성 배지와 같은 극한의 환경에서 생존할 수 있도록 한다.

한 세기 이상 동안 진행된 연구를 통해 균류와 농업적 유해생물(pest)들 간의 상호작용을 알게 되었다. 그러한 상호작용은 병원균, 해충 및 잡초 제거를 통해 작물의 개발을 촉진한다. 그러한 발견을 통해 농업적 유해생물을 조절하기 위해 항진균제(mycopesticide)를 사용하도록 자극되었다. 생물학적 살생물제(biopesticide)의 생산이 증가되어 왔는데, 그 원인들로는, 더 건강한 음식에 대한 소비자들의 수요, 덜 독성인 폐기물을 갖는 음식, 농업적 살생물제 사용에 대한 산업 전문가들의 더 많은 인지, 화학적 살생물제에 대한 증가하는 규제 법령 제정 및 화학물질에 대한 내성을 관리하기 위한 프로그램에서 대안적 제품의 사용의 요구를 들 수 있다.

유해생물의 생물학적 조절에 사용되고 살생물제로서 사용되는 균류들은 수송 또는 저장 동안 50℃ 이상에 달하는 고온에 노출된다. 이러한 환경적 요소는 온도 상승에 민감한 메타리지움 속(Metarhizium ), 뷰베리아 속(Beauveria ), 레카니실리움 속(Lecanicillium ) 및 트리코더마 속(Trichoderma)과 같은 균류 포자의 생존력(viability)에 영향을 미친다. 상기 연구들은 특히 냉장 조건 또는 약 30℃ 미만의 주위 온도 조건 하에서 상기 균류를 저장하는 것에 관한 것이다. 살진균제는 냉장 없이는 저장 동안 생존력에 있어 빠른 감소를 나타내며, 이는 시장에서 제품 허가에 문제를 가져오며 이는 타겟 유해생물의 조절에 바람직하지 않은 결과를 초래한다.

Marques 및 Alves에 의한 연구(Marques, E J., Alves, S.R. "Optimizacao de formulacoes na preservacao de esporos de Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. e Metarhizium anisopliae (Metschn.) Sorok em diferentes condicoes de armazenamento. [Optimization of formulations in the preservation of spores of Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. and Metarhizium anisopliae (Metschn.) Sorok at different storage conditions] Arquivos de Biologia e Tecnologia, v. 39, p. 861- 877, 1996)를 통해 30℃에서 저장된 15.5%의 수분 함량을 갖는 포자의 생존력이 30일 이내에 현저히 감소될 수 있음이 입증되었다.

Sandhu 등의 연구(Sandhu, S.S., Rajak, R.C., Agarwal, G.P. Studies on prolonged storage of Beauveria bassiana conidia: effects of temperature and relative humidity on conidial viability and virulence against chikpea borer. Helicoverpa armigera . Biocontrol Science and Technology, v. 3, p.47-53, 1993)를 통해, 저장 동안 적용된 평형상태의 상대 온도 및 습도가 낮을수록, 뷰베리아 바시아리아(Beauveria bassiaria) 포자의 생존력이 더 길게 보존된다는 것이 알려졌다.

저온 또는 중간 정도의 온도의 환경, 또는 내부 및 외부 분위기(atmosphere) 사이의 교환을 가능케 하는 포장 내에 곤충 병원성 균류 및 다른 종들을 저장하는 것이 중요함이 매우 강조되어 왔으나, 이는 25℃ 이상의 온도에서 저장하기 위한 적합한 방법을 구성하지는 않는다.

US 5,989,898은 불투과성 포장 및 습도 및 산소 흡수제를 이용하여 10% 미만의 상대 습도 및 5% 미만의 산소를 갖는 분위기를 만드는 것을 개시한다. 상기 문헌은 또한 진공 포장 또는 포자를 포함한 포장에 질소를 가함으로써 산소를 제거하는 것을 제안한다.

25℃ 및 37℃에서 저장하기 위해 사용된 미생물은 뷰베리아 바시아나 (Beauveria bassiana ) 및 메타리지움 아니소플리애 (Metarhizium anisopliae)이었다. US5989898은 포자를 재활성화시키기 위해 계면활성제를 사용하며, 이것이 본 발명과 다른데, 이는 산소 대신 다른 비독성 기체(CO₂, H₂, 및 He)를 사용하여 37℃ 가 넘는 온도에서 저장을 할 수 있도록 하며, 포장된 제품의 전-인큐베이션 (pre-incubation) 기간의 준수를 채택한다. 산소 및 습도의 수준을 적합한 수준으로 감소시키기 위해, 적절히 포장된 살진균제가 극한의 조건에 노출되기 전에 적절한 온도 조건에 노출되는 것이 중요하다. WO 9,718,294는 습도 감소 방법과 연관되거나 연관되지 않으면서, 산소 함량을 감소시킴으로써 균류 포자 또는 세균의 수명을 두배 내지 여섯배 연장시키는 것을 개시하고 있다. 그러나, 최고 저장 온도는 30℃로 평가되었고, O₂ 흡수제 봉지를 이용하는 처리 또는 질소를 사용하는 처리에서 저장 70일만 지나면 초기 생존력이 85% 이상까지 감소되었다. 본 발명은 3 내지 6개월의 기간 이상 예컨대 40℃와 같은 고온에서 저장된 균류 포자의 생존력을 유지하는 것을 가능하게 한다.

본 발명의 목적은 수명을 증가시키기 위해 균류 포자를 포장하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

상기 방법은 (i) 포자의 초기 습도량을 유기체에 생존력 있는 수분 활성도 범위로 감소시키는 단계; (ii) 포자를 하나 이상의 산소 흡수제 및 습도 흡수제를 포함한 기체- 및 수증기 불투과성 포장 내로 위치시키는 단계; 및 (iii) 상기 포장 내에서 고온 노출 전에 포자를 15 내지 25℃의 온도, 바람직하게는 25℃ 또는 유기체에 적합한 다른 온도에서 2일 이상동안 유지시키는 단계를 포함한다.

본 발명의 두번째 구체예는 증가된 수명을 갖는 뷰베리아 속(Beauveria ), 이사리아 속(Isaria ), 레카니실리움 속(Lecanicillium ), 노뮤레아 속(Nomuraea ), 메타리지움 속(Metarhizium ) 및 트리코더마 속(Trichoderma)의 포자를 제공하는 것이다.

또 다른 구체예에서, 밀봉된 포장은 그 내부에 (i) 생존성 균류 포자; (ii) 기체- 및 수증기 불투과성 포장 내에서 적절한 온도에서의 인큐베이션 기간을 갖고 봉지 사용에 의해 감소된 수분 함량 및 산소를 갖는 환경을 포함하는 포장이다.

도 1: 50℃에서 60일간 저장한 후에 뷰베리아 바시아나 (Beauveria bassiana) 분생자(conidial) 생존력에 미치는 다양한 기체들의 영향. 생존력은 발아를 위한 두 종의 프로토콜을 이용하여 평가하였다. (고속 재수화(rehydration) 대 저속 재수화).
도 2는 20% CO₂ (+80% N₂)의 주입 및 25, 40, 또는 50℃에서의 저장 후의 뷰베리아 바시아나 (Beauveria bassiana ) 분생자(conidia)의 생존력.

본 발명은 비-냉장 조건, 특히 37℃ 이상의 온도에서 균류의 수명을 증가시키는 저장 방법에 관한 것이다. 본 방법에 의해 포자는 고온의 주위 온도에 있을 때에도 생존력을 유지할 수 있다.

본 명세서에서, 특정 용어들은 광범위하게 사용된다. 그런 다음 하기 정의들이 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공된다.

"변형된 분위기 포장"이라는 용어는 상기 포장 내부의 포장 재료들이 대기와는 다른 조성의 기체에 노출되는 과정을 의미하며, 이는 포장 내부의 특정 기체 또는 기체들의 혼합물의 주입 또는 포장의 구성성분과 반응하는 구성성분을 갖는 요소의 사용과 같은 테크닉을 포함할 수 있다. 상기 요소들은 흡수 봉지제, 기체 방출제 또는 수증기 흡수제를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.

"생존력(viability)"이라는 용어는 살진균제의 분생자 품질을 평가하기 위한 더 적합한 프로토콜로 간주되기 때문에, 고속 재수화(rehydration)를 이용하는 절차에 의해 측정된 포자의 발아 퍼센트를 의미한다.

"유기체에 생존성인 온도"는 특정 종의 분생자의 사망 또는 약화를 초래하지 않는 온도를 의미한다. 본 발명에서 생존성 온도는 바람직하게는 25℃에 가깝다.

"수분 활성도(water activity)(a_w)"는 동일 온도에서 어떤 재료의 수증기압과 순수의 증기압의 비율을 의미한다. 이는 화학적 및 생물학적 반응에 이용가능한 재료에 포함된 물의 측정이며 따라서 미생물을 이용한 연구에서 중요한 파라미터이다.

본 발명의 목적을 위해, "전-인큐베이션(pre-incubation) 기간" 또는 "평형화(equilibration) 기간"이라 함은 포자가 고온에 노출되기 전에 불투과성 포장 내에서 유지되는 시간을 의미하며, 이 시간은 수분 활성도가 0.1 미만, 바람직하게는 0.02 내지 0.03의 값으로 감소되기 위해 필요하다.

"수명(shelf-life)"은 항진균제가 그 효능에 관련된 속성들의 상당한 손실 없이 특정 온도 조건에서 저장될 수 있는 기간을 의미한다. 비-밀폐된 포장 내에 포장된 항진균제는 저장 상대 습도가 또한 고려되어야 한다. 본 발명의 목적을 위해, 2 내지 6개월의 기간이, 40℃에 가까운 온도에서 저장된 생물학적 살충제에 대한 최소한의 바람직한 수명으로 간주된다. 생존력은 분생자 품질을 언급하기 위해 병리학자들에 의해 가장 보편적으로 사용되는 속성이며, 이는 바람직하게는 80%를 넘어야 한다. 따라서, 항진균제에 대한 수명은 소정 온도에서 생존력이 80%까지 감소되는 데에 필요한 시간으로 정의된다.

곤충 병원성 균류 포자의 수명을 연장하는 방법은 하기 단계들을 포함한다:

(i) 포자의 초기 습도량을 유기체에 생존성인 매우 낮은 수준의 수분 활성도(water activity)로 감소시키는 단계;

(ii) 포자를 산소 흡수제 및 습도 흡수제를 포함한 기체- 및 수증기 불투과성 포장 내로 위치시키는 단계로서 상기 흡수제는 바람직하게는 봉지의 형태이며, 선택적으로 산소 및 습도 둘 다 흡수할 수 있는 단일의 봉지가 사용될 수도 있는 단계; 및

(iii) 상기 포장 내에서 포자를 고온에 노출시키기 전에 온화된 온도에서 2일 이상동안 유지시키는 단계.

수화된 포자의 초기 습도량의 감소는 포자 수확 단계 동안 건조에 의해 달성될 수 있다. 균류의 생산은 통상 쌀죽(boiled rice) 등과 같은 고상 기질에서 일어날 수 있다. 균류 생산 공정 직후에 콜로니가 형성된 기질은 낮은 상대 습도를 갖는 방에서 조건화될 수 있고 그 결과 분생자 건조가 가능해질 수 있거나, 수분 활성도가 낮은 값까지 감소될 때까지 건조제를 함유한 챔버를 사용할 수도 있다.

필링(filling) 전에 그와 같은 낮은 수분 활성도 값은 바람직하게는 0.1 미만이다. 이 재료는 칼슘 설페이트 및 실리카겔로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 챔버 건조시 습도량의 감소가 일어나기 위해서는 저온, 바람직하게는 15 내지 25℃의 온도, 더 바람직하게는 약 25℃, 또는 포자 생존력에 영향을 미치지 않는 다른 온도에서 2일 이상의 기간동안 기다리는 것이 필요하며, 여기서 균류 구조를 약화시키지 않으면서 균류의 탈수가 일어날 수 있다.

유기체의 수분 활성도는 필링 후에 현저히 감소되며 따라서 이는 기체- 및 수증기-불투과성 포장의 사용을 통해 유지될 수 있다.

포자의 보존을 위해 적절한 분위기를 제공하는 수단으로서 포자를 포장하는 과정에서, 바람직하게는, 습도 및 산소 흡수제를 포함하는 봉지가 사용된다. 이러한 봉지는 단지 한가지 기능, 즉 이들이 개별적으로 산소 흡수제 또는 습도 흡수제일 수도 있고, 아니면 산소 및 습도 흡수제로서 기능하는 단일의 봉지가 사용될 때 이중 기능을 가질 수도 있다. 상기 봉지들은 포자에 비독성인 분위기를 생성해야 한다. 습도 흡수제로서 칼슘 설페이트 또는 실리카겔이 사용될 수 있다. 본 발명을 위한 유용한 봉지는 RP-3A (산소 및 습도 흡수제), Ageless® ZPT 1000 (산소 흡수제), OxyFree^TM 504A (산소 및 이산화탄소 흡수제), OxyFree^TM 504E (산소 흡수제 및 이산화탄소 생성제) 또는 무수 칼슘 설페이트 (습도 흡수제)로부터 선택될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 방법에서 사용되는 불투과성 포장은 알루미늄화된 포장 및 유리일 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

포장을 위한 봉지를 사용한 결과는 포자의 초기 수분 활성도에 따라 다르다. 산소 흡수제 봉지만을 사용할 때에는 포자의 높은 습도가 포자의 보존에 영향을 미쳐 고온 조건에 노출된 후에 생존력이 감소된다. 고온에 노출될 때 수증기를 방출하지 않는 무수 칼슘 설페이트 화합물인 Drierite™과 같은 습도 흡수제를 사용해야 한다. 상기 흡수제는 177℃가 넘는 온도에 노출된 후에만 수증기를 방출한다.

포장 내부의 최종 항진균제 및 분위기 조성의 수분 활성도는, 사용까지의 포자의 생존력을 유지하기 위한 필수적인 인자이다. 포자가 고온에 노출되기 전에 불투과성 포장에 유지되는 시간을 "전-인큐베이션" 또는 "평형화" 기간으로 언급되는데, 이 기간은 수분 활성도를 0.1 미만, 바람직하게는 0.02 내지 0.03으로 감소시키는 데에 필요하다. 예를 들어, 뷰베리아 바시아나 (Beauveria bassiana ) 균류는, 평형화 기간이, 소량의 포자에 대해서는 통상 2일 이상인데, 이는 사용되는 포장의 크기, 제형의 유형, 살진균제의 양, 및 흡수제 봉지의 양 및 효율에 따라 달라진다.

본 발명에 따라 포장되고 재활성화되는 균류는 뷰베리아 속(Beauveria ), 이사리아 속(Isaria ), 레카니실리움 속(Lecanicillium ), 노뮤레아 속(Nomuraea ), 메타리지움 속(Metarhizium ) 및 트리코더마 속(Trichoderma)을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 균류 포자가 포장되는 불투과성 포장은 유리, 알루미늄 함유 라미네이트 재료 또는 세라믹 또는 다른 기체- 및 수증기-불투과성 재료일 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명을 예를 들어 설명하고 더욱 명확히 하기 위한 목적으로 하기에 실시예가 제공되지만 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다.

유리 포장에 서로 다른 기체의 주입

뷰베리아 바시아나(Beauveria bassiana) 포자 샘플(0.6g)을 고무셉타(rubber septa)를 갖는 금속 캡으로 밀봉된 125ml의 밀폐 유리 바이알(glass vials)(Ball ®, Jarden Corp., Muncie, IN, USA)에 보관하였다. 각각의 유리 바이알에는 40분 동안 40mL.min^-1의 속도로 N₂와 평형상태를 유지하는 100% 또는 21%의 산소뿐 아니라 순수한 이산화탄소, 질소, 헬륨 또는 수소를 주입하였다(Airgas East, lnc., Salem, NH, USA). O₂가 주입되지 않았던 바이알에는, 그 환경이 검출할 수 없는 농도의 O₂를 가지고 있지 않았음을 보장하기 위해 이러한 기체의 농도를 주입 이후에 측정하였다. 기체 샘플(500 μL)을 각 바이알에서부터 밀폐 주사기(hermetic syringe, model 1750, Hamilton Company, Reno, NV, USA)를 이용해 수집했고, 열전도성 검출기(thermal conductivity detector)를 갖춘 기체 크로마토그래피(Varian Aerograph, Walnut Creek, CA, USA )에 주입하였다. 그 피크의 높이를 N₂와 평형상태를 유지하는 6.96%의 O₂ 및 4.91%의 CO₂를 갖는 일반적인 상업적 제품과 비교하였다. 기체 노출(gas exposure)로 구성된 각 처리를 3번 또는 4번씩 반복하였다. 저장 중 기체 교환(O₂)을 최소화하기 위해, 125 mL의 유리 바이알을 같은 기체 혼합물을 갖는 더 큰 Ball® 병 밀폐 용기(0.95 L)에 보관하였다. 이러한 설계에 사용하기 위해, 유리병(glass bottle)을 50°C에서 60일 동안 인큐베이션 시켰다. 온도를 각 인큐베이터당 두 개의 디지털 데이터 로거(data Iogger , Hobo®, Onset Computer Corp., Bourne, MA, USA)로 계속적으로 모니터하였다. 이러한 저장 후에, 각 바이알 안의 O₂ 농도를 시스템 밀폐성(system hermeticity)을 나타내는 것으로 다시 측정하였다. 포자의 수분활성도를 수분 활성도 미터(LabMaster-a_w, Novasina, Pfaffikon, Switzerland)로 25°C에서 측정하였고, 발아(germination)를 측정하였다. 생존력(viability)을 물-계면활성제 용액에 파우더 분생자(powder conidia)를 현탁하고 이스트(yeast) 추출물 아가-베노밀 배지 추출물(agar-benomyl medium extract, yeast extract Agar/benomyl medium - YEA)에 이 물질을 증착(disposing)하는 것에 의해 직접적으로 측정하였다. 용액(물-계면활성제)을 주위 온도(ambient temperature)와 평형상태를 유지하게 했다. 각 재수화 프로토콜(rehydration protocol)을 수행한 후에, 접종된 아가 블록(agar block)(유리 슬라이드 위의)을 파라핀화된(paraffinized) 페트리 디쉬에 25°C의 암중에서 접종하였고, 발아수 측정(germination count)을 접종 24 후에 수행하였다(p.i.). 어떤 크기의 발아관(germ tube)이 위상차 조명(phase contrast illumination)의 400X 배율에서 보였을 때 분생자가 발아한 것으로 간주되었다. 적어도 200 분생자를 각 실험적 처리의 각 현탁 복제물(suspension replicate)에 대해 몇몇 현미경 가시영역(microscopic field)에서 실험하였다.

본 실험을 21% O₂의 처리 없이 서로 다른 날에 반복하였다. O₂를 제외한 기체가 주입된 바이알에서 상당한 기체 교환이 일어난 것은(O₂의 최종 함량 f>3.5%) 폐기하였다. 본 데이터를 아크 사인의 제곱근으로 변환하였고, 분산(variance)의 일-변인 분석법(one-factor analysis)을 사용하여 분석하였다. 평균값을 Tukey-Kramer HSD 또는 t-test에 의해 비교하였고, 5%의 유의수준에서 통계학적으로 서로 다르게 고려하였다. 데이터를 JMP 통계적 소프트웨어 패키지(SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)를 사용하여 분석하였다.

도 1은 첫 번째 분석에서 포자의 최종 수분활성도는 기체 처리(P= 0,4150, F_5,13=1,1)에 따라 변하지 않았음을 보여주며; 전체적 평균 수분활성도는 0.099±0.0248 이었다. 50°C(P <0.0001, F_5,13 = 122.0)에서 60일 후에는 상당하나 차이를 관찰한 발아에서 N₂, CO₂, H₂ 및 He에의 노출은 40-51%의 범위와 동등한 생존력을 제공였고, 각각 21% 및 100%의 O₂에서 발아율이 매우 낮았고 또한 심지어 생존성 포자가 없다고 기록되었다.

첫 번째 실험에서와 같이, 본 처리는 처리 간에 포자의 최종 수분활성도(P = 0.29, F = _3,11=1,4) 및 0.119 ± 0.0021의 평균 수분활성도에서 상당한 차이를 제공하지 않았다. 100% O₂의 주입은 생존자가 없는 결과를 다시 야기했다(21% O₂는 실험하지 않았다). 다른 모든 기체의 저장은 O₂로 처리한 것보다 우수한 생존력을 야기했으나 낮고, 동등(10-13%의 범위)하다(도 1B). 이러한 발아율은 첫 번째 실험보다 낮은 포자의 수분활성도 때문에, 첫 번째 실험에서 관찰된 49-51%의 범위보다 현저하게 낮았다. O₂가 주입된 바이알을 제외한 것에서, O₂의 잔여 농도(1.6% -1.9%)는 기체가 주입된 바이알들 간에 차이가 없었다(P=0.73, F_2,8= 0.3).

서로 다른 온도에서 포자의 저장을 위한 N₂ 및 CO₂ 주입

상기 실시예에서 설명된 것과 동일한 설계를 사용하여, 포자의 샘플을 20% CO₂ 및 80% N₂와 함께 주입하였다. 4개의 샘플을 45, 91, 180 및 240일 동안 40°C에서 저장 후 최종 수분활성도 및 잔여 O₂에 관한 각 처리에 대해 실험하였다. 본 실험을 서로 다른 날에 반복하였다. 게다가, 25°C (46, 120, 180, 365 및 400일 보관 후 평가) 및 50°C (15, 30, 47, 75 및 90일 저장 후 평가)에서 저장의 효과를 조사하기 위해 실험을 수행하였다. 모든 케이스에서, 또한 생존력을 서로 다른 온도에서 인큐베이터에 저장하기 바로 직전인 “데이 제로(day zero)”에서 측정하였다. 평가의 단일 날짜에서 서로 다른 병들을 표본 조사하였고, 그 때문에 본 연구는 반복 측정 설계(repeated measures design)를 사용하지 않았다.

본 데이터를 아크 사인의 제곱근으로 변환하였고, 분산의 일-변인 분석법을 사용하여 분석하였다. 평균값을 Tukey-Kramer HSD 또는 t-test에 의해 비교하였고, 5%의 유의수준에서 통계학적으로 서로 다르게 고려하였다. 데이터를 JMP 통계적 소프트웨어 패키지(SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)를 이용하여 분석하였다.

25°C에서의 저장 실험에서 생존력의 상당한 감소를 관찰하였으나(P=0.0002, F_5,18 = 8.8) 감소는 점진적이고 작았으며, 생존력은 도 2에서 보여지는 바와 같이, 저장 후 480일째의 87% 및 365일째의 90%보다 높았다. 포자의 수분활성도는 저장 후 46일의 0.104부터 실험의 끝(P <0.0001, F _[4,15] = 36.3)의 0.204까지 증가하였으며 잔여 O₂의 평균 농도는 0.5%에서 12.4%까지 증가하였다(P <0.0001, F_4,15 = 38.0).

40°C에서의 실험에서, 저장의 처음 3개월 동안 통계학적으로 상당한 생존력의 감소가 있었으나, 그 감소는 오직 6 퍼센트 포인트(93에서 87%로)였다. 그 이후에 저장 후 240일째에서 4% 생존력으로의 가파른 감소가 일어났다(ANOVA P <0.0001, F _4,34= 361.7). 45일째 내지 240일째의 간격 동안, 잔여 O₂의 평균 농도는 1.2%에서 6.6%까지 증가하였고(P = 0.0002, F_3,28 = 9.4), 수분활성도는 0.104에서 0.145로 증가하였다(P <0.0001, F_3,27 = 35.4).

50°C에서 초기 생존력은 처음 15일 동안 96에서 81%로 가파르게 감소하였으며, 저장 후 90일째에는 약 10% 까지 감소했다(P <0.0001, F_6,21 = 129.1). 잔여 O₂는 저장 후 15일째의 0.8%에서 90일째의 3.2%까지 증가하였으나(P = 0.0074, F_5,18 = 4.5), 반면 포자의 수분활성도는 이 기간 동안 상당한 정도로 변화하지는 않았다(15일째의 0.104에서 90일째의 0.098: P = 0.3448, F_5,18 = 1.2).

활성 포장(active packaging, AP)의 사용 및 기체 주입

뷰베리아 바시아나(Beauveria bassiana) 포자를 125mL의 유리 바이알에서 NaOH로 1일 동안 25°C 에서 탈수하였고, 그 결과 0.083 ± 0.001의 수분활성도를 야기했다. 몇몇 임의의 샘플을 유리 바이알에 옮기고 N₂를 주입하였다. O₂의 손실을 유리 용기를 가진 듀얼 필링 시스템(dual filling system)을 사용하여 감소시켰다. 남은 샘플(0.6g)을: i) O₂ 및 수분 RP-3A 흡수 봉지제를 갖는 알루미늄 백(bag); ii) O₂ 흡수 필름(code M-0034, lot 19208A, 88.9x63.5x0.3 mm CSP Technologies, Auburn, AL, USA) 플러스(plus) 습도 흡수 필름(CSP Technologies, code M-0026, lot 02208A, 63.5x38.1x0.6 mm) 또는; iii) O₂ 및 습도 흡수에 대해 이중 작용(dual action)을 갖는 필름(CSP Technologies, code M-0033, lot 10808A, 76,2x76.2x0.6 mm) 포함하는 3가지 AP 처리 중 하나를 거치게 하였다. 대조군으로, 포자들을 RP-3A 봉지제를 가진 30 mm 두께의 폴리에틸렌 백(code P827-2.1.2; Empac Agroindustrial Ltda Plastics, Brasilia, Brazil)에 유지하였다.

제조 후에, 포자가 담긴 모든 포장들을 25°C에서 5일 동안 사전-인큐베이션하였고 그 다음에 50°C로 옮겼다. N₂가 주입된 유리 바이알의 잔여 O₂를 승온(elevated emperature)에서 인큐베이션 직전에 확인하였다. 모든 처리에서, 50°C로 옮기기 직전 포자의 수분활성도 및 생존력의 파괴 분석(destructive determination)에 3개의 용기를 사용하였다. 포자들을 50°C에서 56 또는 120일 동안 인큐베이션하였다. 저장 이후에, 수분활성도를 측정하였고 분생자의 생존력을 평가(assessed)하였다. 각 처리 및 날짜에, 독립적으로 준비된 4개의 포장을 파괴적으로 평가하였으며, 그래서 반복 측정 설계는 채택되지 않았다.

변형된 분위기를 위한 봉지(SACHET)

뷰베리아 바시아나 포자의 샘플을 25°C에서 2일 동안 황산 칼슘 건조제(Drierite^TM 8-mesh indicator, W.A. Hammond Drierite Co., Xenia, OH, USA) 와 함께 125mL의 유리 바이알에서 저장하였다. 필링(filling) 전 포자의 수분활성도는 0.019±0.0005 였다. 다른 처리에서는 필링 전 0.738±0.0007의 수분활성도를 야기하는 포화된 NaCl 용액에서 포자를 25°C에서 2일 동안 유지하였다. 그런 뒤 샘플을 분위기 변형을 위한 하기의 봉지 중 하나를 가지는 라미네이트(laminate) 백(10x12 cm)으로 옮겼다: O₂ 및 습도 흡수제 RP-SA, O₂ 흡수제 Ageless ® ZPT 1000 (Mitsubishi Gas Chemical Co., Japan), O₂ 및 CO₂ 흡수제 OxyFree^TM 504A (Tianhua Tech, China), O2 흡수제 및 CO₂ 생성제 OxyFree^TM 생성제 504E (Tianhua Tech, China), 또는 Drierite^TM (56.7 g)에 기반을 둔 습도 흡수제. 대조군으로, 봉지가 없는 라미네이트된 백을 사용했다. 이 백을 사전-인큐베이션 기간 없이 50°C에서 인큐베이션하였고, 45일 뒤에 발아 수를 측정하고 포자의 수분활성도를 정량화 하였다. 각 처리를(봉지의 유형 대 초기 수분활성도) 4번 반복하였다.

흡수제 봉지 및/또는 기체 및 수증기 생성제를 갖는 백안에서 45일 동안 50°C에서 저장한 후에 측정한 뷰베리아 바시아나 포자의 발아(%).

봉지	낮은 초기 a_w (0.019)		높은 초기 a_w (0.738)
봉지	최종 a_w	%	최종 a_w	%
Ageless (O₂ 흡수제)	0.807± 0.0012 a	0,0% c	0.819±: 0.0015 a	0.0% c
Drierite^TM (습도 흡수제)	0.022± 0.0003 e	5.2±0.7% b	0.23± 0.0007 e	7.3%±1.3% b
RP-3A (O₂/습도 흡수제)	0.794± 0.0003 c	79.0±1.3% a	0.022± 0.0003 e	72.8%±3.2% a
504 A (O₂ 및CO₂ 흡수제)	0.704± 0.0003 c	0.0% c	0.729± 0.0009 c	0.0% c
504 E (O₂ 흡수제 및 CO₂ 생성제)	0.761± 0.0035 b	0.0% c	0.798± 0.0024 b	0.0% c
봉지 없음(대조군)	0.027±: 0.0003 d	3.8±0.4% b	0.709± 0.0012 d	0.0% c

¹각 컬럼에서, 같은 글자(letter)뒤에 따르는 평균(± SE)은 통계학적으로 다르지 않다(Tukey HSD, α = 0.05). 발아를 고속 재수화 프로토콜을 통해서 측정하였다.

몇몇 변형된 분위기 봉지의 사용은 낮고(P <0.0001, F _[5.12] = 1631.4) 높은(P <0.0001, F _[5.12] = 522.4) 초기 수분활성도 둘 다에서의 포자 생존력에서 매우 상당한 차이를 야기한다(표 1). 예상한대로, 서로 다른 봉지의 흡수 용량(absorption capacity)을 고려하면, 낮은 또는 높은 초기 수분활성도를 갖는 처리에서 포자의 최종 수분활성도는 또한 현저하게 달랐다. 저장 중에 습도를 방출하거나(Ageless, 504A 및 504E) 또는 습도는 흡수하되 O₂는 흡수하지 않는(Drierite^TM) 봉지의 사용은 O₂ 및 습도를 흡수하는, 이중 작용 흡수제(RP-3A )를 사용한 것과 비교했을 때보다 낮은 생존력을 야기했다.

수명의 연장을 위한 변형된 분위기 봉지의 조합

뷰베리아 바시아나 포자의 샘플을 Drierite^TM와 함께 25°C에서 2일 동안 건조하였고(0.020 ± 0.0008의 수분활성도를 야기함) 그런 뒤 하기의 다른 봉지를 갖는 16x20 cm의 라미네이트화 백으로 옮겼다: O₂ 및 습도를 흡수하는 RP-5A(RP-3A와 같은 조성이나 더 큰 포장에 적합한) 및 O₂를 흡수하고 CO₂ _-를 발생시키는 504E 또는 504E에 Drierite^TM 봉지(56.7 g)를 더한 봉지. 각 처리를 3번 반복하였고 40°C에서 저장 후 148 및 180일 후의 발아뿐만 아니라 포자의 수분활성도를 측정하였다.

O₂를 흡수하나 습도를 방출하는 봉지(504E)는 건조제와 함께 실험했을 때 효과적이었으나, 504E 봉지만의 사용은 생존력의 완전한 손실을 야기했다(표 2). 봉지들의 사용을 조합하는 전략은 40°C에서 저장 후 148일 후(P< 0.0001, F_2,6= 309,0) 및 178일 후(P< 0,0001, F_2,6= 2,035) 둘 다에서, 이중 작용 봉지(RP-5A)의 사용만큼 좋았다.

40°C에서 5 내지 6개월 동안 저장한 뷰베리아 바시아나 포자의 생존력 및 수분활성도에 대한 건조제 봉지를 갖거나 또는 갖지 않는 O₂ 흡수제 및 CO₂ 생성제의 영향.

봉지	148 일		178 일
봉지	최종 a_w ¹	%	최종 aw¹	%
504 E (O₂ 흡수제 및 CO_{2 --}생성제)	0.793± 0.0038 a	0.0% b	0.809± 0.0168 a	0.0% b
504E + Drierite^TM (습도 흡수제)	0.030± 0.0003 b	81.0±4.5% a	0.030± 0.0003 b	79.3±1.9% a
RP-5A (O₂/습도 흡수제)	0.026± 0.0000 b	83.5±2.2% a	0.028± 0.0003 b	81.8±0.4% a

¹초기 A_w는 0.020±0.0008 였으며 포자들은 40°C에 노출되기 전인 적당한 온도에서 사전-인큐베이션되지 않았다.

²각 컬럼에서 같은 글자(letter)뒤에 따르는 평균(± EP)은 통계학적으로 다르지 않다(Tukey HSD, α = 0.05). 발아를 고속 재수화 프로토콜을 통해서 측정하였다.

수명에서 평형화 기간(EQUILIBRIUM PERIOD)의 효과

뷰베리아 바시아나의 순수한 포자는 높은 온도 방식(high temperature regimen)에 노출되어지기 전에 포장 안에서 평형상태를 유지하는 그들의 수분활성도를 가졌다. 뷰베리아 바시아나의 샘플을 25°C의 Drierite^TM 또는 NaCl에서 2일 동안 보관하였고, 각각 0.020±0.0008 및 0.740±0.0018의 수분활성도를 야기했다. 그런 뒤, 포자들을 각각 봉지 RP-3A (O₂ 및 습도 흡수제)를 갖는 라미네이트화된 백으로 옮겼고, 표적 온도(25, 40 및 50°C)에서 저장되어지기 전에 25°C에서 5일 동안의 추가기간으로 사전-인큐베이션하였다. 다르게는, 샘플들을 25°C의 Drierite^TM _-또는 NaCl에서 7일 동안 보관하였고, RP-3A 봉지를 갖는 라미네이트화된 백으로 옮겼고, 25°C에서 5일의 평형화 기간 없이 표적 온도에서 즉각적으로 저장했다. 각 처리를 4번 반복하였고, 생존력 및 수분활성도의 측정을 50°C에서 60일 후 및 25 또는 40°C에서 180일 후에 수행하였다.

포자의 최종 수분활성도는 각 저장 온도에서 처리간에 변화하지 않았다(표 3). 25°C에서 180일 후 발아 퍼센트는 생존력이 68%로 감소했던 높은 초기 수분활성도 및 평형화 기간을 갖는 처리를 제외한 모든 처리에서 높았다(91-94%). 40°C에서 180일 후에, 생존력은 대부분의 처리에서 87-80%였으나, 높은 초기 수분활성도를 갖고 평형화 기간(P 0.0068, F_3.8= 8.7)이 없는 처리에서는 상당히 낮았다(75%). 최종적으로, 50°C에서 60일 후에, 대부분의 모든 처리들에서 생존력이 83-86%의 범위에 있는 경향을 관찰하였으나, 생존력이 60%로 상당히 감소했던 높은 초기 수분활성도를 갖고 평형화 기간이 없는 처리를 제외한다(P< 0.0001, F_3,8= 37.8).

본 연구에서 관찰되는 수명은 이전에 얻어진 그것들보다 상당히 길다. O₂를 제외한(CO₂, N₂, H₂ 및 He) 기체의 주입 후에 분위기 변형은 50°C에서 2개월 저장 후 비교할만한 생존력을 야기한다. 바이알에서 20% CO₂ (+ 80% N₂)의 분위기에서 실험할 때, 포자 생존력이 80%로 떨어지는 시간은 40 내지 50°C의 온도에서 91 및 15일보다 우수하다. Hong et al. (2001) (Hong, TD, et al. The effect of storage environment on the longevity of conidia of Beauveria bassiana. Mycological Research v. 105, p. 597-602, 2001)에 의해 공개된 데이터로부터 얻은 추정치와 비슷한데 이는 5% 습도 이하로 탈수되고 밀봉한 용기에 대기와 함께 저장된 포자는 각각 40 내지 50°C에서 80 및 17일 동안 80%의 생존력을 보유하는는 것을 제시한다. 이러한 것은, 그 때까지, 높은 온도에서 균류의 해당 종에서 기록된 최장 수명이었다. 그러나, 활성 포장 (밀폐된 포장에서 O₂ 및 습도를 흡수하는 봉지가 있는)을 사용할 때 및 평형화 기간이 도입되었을 때, 생존력은 40°C에서 6개월 후 또는 50°C에서 2개월 후에 80 내지 90% 범위의 전례 없는 값에 도달하였다.

습도 및 O₂ 흡수제 봉지를 갖는 라미네이트 백에서 저장된 뷰베리아 바시아나 포자의 발아에 대한 초기 수분활성도 및 평형화 기간(사전-인큐베이션)의 영향.

상태	25°C에서 180일		40°C에서 180일		50°C에서 60일
상태	최종a_w ²	%	최종a_w ²	%	최종a_w ²	%
낮은 초기a_w/사전-인큐베이션	0.029± 0.0000 a	93.2± 0.4 % ab	0.028± 0.0003 a	87.8± 0.9 % a	0,022± 0,0000	84.8± 3.5 % a
낮은 초기 a_w/사전-인큐베이션 없음	0.029± 0.0003 a	94.0± 1.1 % a	0.028± 0.0003 a	88.8± 0.8 % a	0,022± 0,0000	86.3± 3.8 % a
높은 초기 a_w/사전-인큐베이션	0.029± 0.0000 a	91.0± 1.3 % ab	0.028± 0.0000 a	88.0± 2.6 % a	0,021± 0,0000	82.5± 1.0 % a
높은 초기 a_w/사전-인큐베이션 없음	0.029± 0.0003 a	88.3± 0.4 % b	0.028± 0.0003 a	75.3±2.2 % b	0,021± 0,0000	60.0±3.0 % b

¹각 컬럼에서 같은 글자(letter)뒤에 따르는 평균(± EP)은 통계학적으로 다르지 않다(Tukey HSD, α = 0.05). 발아를 고속 재수화 프로토콜을 통해서 측정하였다.

²낮고 높은 초기 a_w는 각각 0.020±0.0008 및 0.740±0.0018 이었다.

수명에 대한 탈수 단계(포장 이전)의 효과

25°C에서 7일의 평형화 기간이 모든 처리에 대해 채택되었다는 것은 표 4로부터 확인 될 수 있다. 그러나, 한 실험에서, 단지 봉지 RP-3A(포장 안에서 수증기와 산소를 흡수하는)의 사용만으로는 높은 수준의 발아를 확보하기에 부족하다는 것을 발견하였다. “수화 + RP-3A” 처리에서 포장 전에 샘플을 사전-건조의 단계는 채택되지 않았으며, 심지어 평형화 기간의 끝에서 0.050(그리고 저장 16개월의 끝에서 0.020)으로 수분활성도가 감소하였고, 최종 결과는 40°C의 평형화 기간의 끝에서 또는 저장 기간 동안 내내 0.1 밑을 유지하였고, 0.02 내지 0.03의 이상적 범위 이내였던 이전의 처리보다 낮았다. 실험 2에서, 두 가지 처리는 권장된 단계(사전-건조, 습도 및 산소의 흡수를 위한 봉지(들)의 채택, 산소의 제거를 위한 평형화 기간의 관찰 및 높은 온도로 노출되기 전에 0.03에 가까운 수준으로 수분활성도의 감소)에 뒤따르고, 따라서 결과가 만족스러웠다. 처리 2의 첫 번째 실험에서 이중 기능 봉지를 사용하였고(습도 및 산소를 흡수하는), 반면 두 번째에서는 각 기능을 위한 봉지를 채택하였다. 당업계에서 알려진 과정과 방법은 절대 40°C에서 분생자 보관의 16개월 후 대략 70%의 균류 뷰베리아 바시아나의 생존력(발아 퍼센트)를 제공할 수 없다는 것을 강조하는 것은 중요하다.

40°C에서 18개월 동안 저장한 뷰베리아 바시아나 분생자의 생존력에 대한 수분활성도(a_w)의 영향.

	0^b일			16개월
처리	초기a_w	발아의 퍼센트	최종 a_w	발아의 퍼센트
실험1
사전 탈수+ RP-3A (O₂/H₂O흡수제)^a	0.026± 0.000	92.5± 1.76 a	0.020± 0.000	71.0±1.51 a
사전 수화 + RP-3A	0.050± 0.001	89.3± 1.59 a	0.020± 0.000	52.7±5.02 b
실험2
사전 탈수 + RP-3A^a	0.025± 0.000	95.5± 1.09 a	0.020± 0.000	71.4±0.92 a
	0.032± 0.001	95.2± 0.14 a	0.024± 0.000	70.6±1.16 a

^a 본 발명에서 권장된 단계를 갖는 처리. “수화 + RP-3A” 처리에서, 첫 번째 단계(포장 전에 포자 수분활성도의 0.3밑의 수준으로 탈수)는 평형화 기간의 끝에서의 수분활성도가 최적 한계(0.02 내지 0.03)보다 높게 되는 것을 야기하고, 이는 본 특허에서 권장된 모든 단계가 관찰되는 이전의 처리에서 보다 낮은 발아의 퍼센트로 이어진다.

^b데이터는 25°C에서 7일의 초기 평형화 기간에 뒤이은 높은 온도에서의 저장 전에 즉각적으로 수집된다.

40°C에서 균류 메타리지움 아니소플리애(Metarhizium anisopliae)의 수명에서 활성 포장의 영향

메타리지움 아니소플리애의 포자에 대한 평형화 기간(25°C에서 8일)을 관찰했던 실험에서(표 5), 봉지 RP-3K(산소 흡수제 단 수증기를 방출하는)의 사용은 만족스러운 결과를 제공하기엔 충분하지 않았다. 혼자 사용되면, 수증기의 방출이 포자의 수분활성도를 매우 높은 값으로 증가하게 하고, 그 결과, 수명이 극적으로 감소한다. 반면, 포장안에서 산소를 흡수하는 것뿐 아니라 또한 수증기를 흡수하는 봉지 RP-3A의 처리는 포자의 수분활성도를 최적의 값 이내로 유지시켰고, 따라서 40°C에서 2주 저장 후 높아진 발아의 퍼센트에 기여하였다.

표 6의 데이터는 본 발명의 방법이 40°C에서 5개월 이상 저장한 후에 종래에 알려진 방법에 의해서는 이 종에 대해 절대 가능하지 않아왔던 메타리지움 아니소플리애에 대한 대략 70%의 생존력의 달성을 가능하게 한다는 것을 증명한다. 일반적으로, 상업적 제품(항진균제)에서 최소 허용 생존력은 대략 80%이다. 위에서 얻어진 데이터의 외삽법(extrapolation)에 기반을 두면, 이 퍼센트는 40°C에서 4개월 저장 후에 본 발명의 방법을 통해 도달 되었을 것이다. 이러한 값들은 예를 들어 37°C에서 2개월 저장 후 대략 80%의 생존력이 관찰되었던 Jin et aI. (1999)에 의한 U.S 특허 5,989,893에서 보고된 것 보다 상당히 높다.

40°C에서 2주 동안 저장된 메타리지움 아니소플리애 포자의 생존력 중 평형화 기간의 끝에서 수분활성도(a_w)의 영향.

	0^b일			2 주째
처리	초기a_w	발아의 퍼센트	처리	초기a_w
건조 + RP-3A (O₂/H₂O 흡습제)^a	0.028± 0.001	80.0± 4.00 a	0.027± 0.001	78.9± 2.21 a
건조 + RP-3K (O₂ 흡습제)	0.246± 0.005	79.3± 5.13 a	0.286± 0.006	26.9± 10.45 b

^a본 발명에서 권고되는 단계를 갖는 처리

^b데이터는 25°C에서 8일의 초기 평형화 기간에 뒤이은 높은 온도에서의 저장 전에 즉각적으로 수집된다.

40°C에서 5,4개월 동안의 메타리지움 아니소플리애의 저장 이후 포자 발아의 퍼센트.

	0^b일			16 개월
처리	초기a_w	발아의 퍼센트	처리	초기a_w
RP-3A (O₂/H₂O 흡습제)^a	0.037± 0.001	94.5± 1.73	0.021± 0.001	68.3± 3.32

^a본 발명에서 권고되는 단계를 갖는 처리

^b데이터는 25°C에서 5일의 초기 평형화 기간에 뒤이은 높은 온도에서의 저장 전에 즉각적으로 수집된다.

공기가 CO₂ 및 N₂로 대체됐던 분위기가 뷰베리아 바시아나 포자의 수명(longevity)을 증가시키는 것이 본원에 보고된 선행 기술의 연구에서 관찰되었다. 비록 메타리지움 아니소플리애의 단기 수명 동안 O₂ 제거의 유익한 효과(또는 CO₂ 농도를 증가시키는)는 클라크 및 마델린에 의해서 수 십년간 증명되어 왔음에도 불구하고(19A5)(Clerk, CG; Madelin, M.F. The longevity of conidia of three insect-parasitizing hyphomycetes. Transactions of the British Mycological Society 48, 193-209, 1965), 이 종의 수명을 연장하려는 이전의 시도들은 공기의 존재 안에서 수행되었다. 미국 특허 5,989,898는 Drierite^TM와 함께 탈수되고 추정상 습도 및 기체에 대해 불투과성인 백에 삽입된 Ageless 봉지의 사용으로 얻어진 O₂가 없는 분위기에서 저장된 메타리지움의 포자가 37°C에서 2달 후에 74% 생존력을 보였고, O₂ 흡수제가 없거나 또는 40내지 100% 범위의 높은 상대 습도를 가진 백에서 유지되면 생존력을 보이지 않았다는 것을 개시하였다. Leite 등은. (2002) (Leite, L.G., et al. Preservacao de micelio de Batkoa sp. e Furia sp. (Entomophthorales) em combinacao com dessecantes e redutores de oxigenio [Preservation of mycelium of Batkoa sp. and Furia sp. (Entomophthorales) in combination with desiccant and oxygen reducers]. Arquivos do Instituto Biologico 69, 117-122, 2002) 3달 동안 23℃에서 Ageless 및 실리카겔을 사용하여 밧코아 종(Batkoa sp .) 및 푸리아 종(Furia sp )의 건조 균사체(mycelia)를 보존하였다. 그러나 변형된 분위기에서 곤충병원성 균류 포장에 관한 이후의 연구들은 알려지지 않았다.

비-밀폐된 포장에서 포자들에 대한 공기의 유용성은 중요하고(Hong, T.O., et al. Saturated salt solutions for humidity control and the survival of dry powder formulations and or of Beauveria bassiana conidia. Journal of Invertebrate Pathology. v.89, p. 136-143, 2005) 그래서 포자들의 수명에 대해 관찰된 결과가 실망스럽다. 본 발명은 O₂ 및 습도에 대해 높은 투과성을 갖는 플라스틱 폴리머의 채택이 비록 활성 포장에 효율적인 봉지와 조합되었다 할지라도 항진균제 포장에 전적으로 바람직하지 않다는 것을 보여준다. 유리 용기에의 기체 주입(40분 동안)은 비-밀폐된 포장의 사용보다 훨씬 더 효율적이나, 포장에 존재하는 O₂ 의 많은 제거를 가능하게 하곤 했었던 기체 주입 프로토콜의 불능 및 공기가 외부 환경과 교환되고 기체의 주입 후에 바랐던 것 보다 큰 수분활성도의 존재 때문에 현재의 기술수준에서 뷰베리아 바시아나 포자의 수명을 연장하기 위한 라미네이트의 사용(+ 활성포장의 봉지)보다는 덜 효과적이라는 것을 증명했다. 테쉴러 등의 연구(2007) (Teshler, M.P. et al. Increased shelf life of the bioherbicide through combining modified atmosphere packaging and low temperatures. Biocontrol Science and Technology 17, 387-400, 2007)는 잔여 O₂ 농도가 라미네이트화된 포장에서 기체 주입 후에 0.26% 였다는 것을 개시했다. 수분활성도는 효율적인 O₂ 및 습도 흡수제의 사용 및 알루미늄으로 밀폐하여 채워진 후에 낮고 일정한 수준이었다. 분리된 무수생명의 유기체(anhydrobiotic organism)에서, 자유 라디칼(free radical)의 생산에 이르는 효소적 반응이 일어날 수 할 수 있고, 비-효소적 반응은 이러한 자유 라디칼에 의해 매개되었다. 예를 들어, 인지질의 분해 반응은 막(membrane)에서 부산물(지방산)의 축적과 함께 일어날 수 있다(McKersie, B.D. et aI. Senaratna, T., Walker, M.A., Kendall, E.J., Hetherington, P.R. Deterioration of membranes during aging in plants: Evidence for free radical mediation. In: L.D. Nooden, L.D., Leopold, A.C. (Eds.), Senescence and Aging in Plants. San Diego: Academic Press, p. 442-464, 1088). 그러나 극도로 건조하고 O₂가 없는, 분위기의 조건에서 에이징(aging)은 비-밀폐된 상태에서보다 느리다.

테스트된 식품 산업에서 사용되는 대부분의 활성 포장 봉지는 포자의 수분활성도 수준이 바람직하지 않은 수준까지 증가하는 것 때문이든 O₂가 낮은 수준으로 감소하지 않았기 때문이든 간에, 뷰베리아 바시아나 포자의 생존력을 연장하는데 효과적이지 않았다. O₂ 및 습도를 흡수할 수 있는 이중 작용을 갖는 봉지는 오직 단일 속성(attribute)만 갖는 봉지보다 더 효율적이었다. 비록 CO₂가 어떤 균의 생장에서 균발육 저지 활성(fungistatic activity)을 갖는 것으로 알려져있다 하여도(Tabak and Cooke, 1968; Abellana et aI. 2000), 저장된 곤충병원성 포자에서 해로운 효과가 관찰되지 않았으며, 이는 O₂ 흡수제 및 CO₂ 방출제 봉지의 사용에 의한 활성포장을 사용하는 것의 가능성을 제시한다.

약 1년의 수명이 25℃에서 뷰베리아 바시아나의 오일 제형(oil formulation)(Wraight et al, 2001)뿐 아니라 진공상태에서 저장되고(Hong et al, 1999) 27-32℃에서 6.2%의 습도를 갖는 상대적으로 내열성(thermotolerant)인 M. acridum 에 대해 기록되었다(그러나 7.0% 수분 함량을 갖는 포자에서는 같은 것이 달성되지 않는다). 본 발명은 2.1 내지 2.4% 습도를 갖는 활성 포장으로 포장된 포자에 대해 8개월의 수명을 달성했으며, 이는 40℃ 근처의 평균 온도를 갖는 지역(region)에 분배(distribution)되기에 충분한 시간이다. 실험을 또한 50℃에서 수행하였다. 비슷하거나 높은 온도는 특정 지역(Hong, T.D., Ellis, R.H., Moore, D. Development of a model to predict the effect of temperature and moisture on fungal spore longevity. Annals of Botany, v. 79, p. 121-128, 1997) 또는 수송 중에(Ostrem and Godshall, 1979) 달성될 수 있다.

저장과 본질적으로 관련된 인자들 외에, 균류 번식체(propagule)의 원래 품질 -이는 교대로 인큐베이션 조건에 의해 영향을 받음- [Agosin, E. et al .. Effect of culture conditions on spore shelf life of the biocontrol agent Trichoderma harzianum. World Journal of Microbioiogy and Biotechnology v. 13, p. 225-232, 1997; Frey, S., Magan, N. Production of the fungal biocontrol agent Ulocladium atrum by submerged fermentation: accumulation of endogenous reserves and shelf-life studies. Applied Microbiology and Biotechnology, v. 56, p. 372-377, 2001; Tarocco et al. Optimization of erythritol and glycerol accumulation in conidia of Beauveria bassiana by solid-state fermentation, using response surface methodology. Applied Microbiology and Biotechnology v.68, p. 481-488, 2005], 건조 및 수거 과정[Sandoval-Coronado, C.F. et al. Drying and formulation of blastospores of PaeciIomyces fumosoroseus (Hyphomycetes) produced in two different liquid media. World Journal of Microbiology and Biotechnology v. 17, p. 423-428, 2001; Bateman, R. Constraints and enabling technologies for mycopesticide development. Outlooks on Pest Management April, p. 64-69. 2004; Jackson, M.A., Payne A.R.,. Evaluation of the desiccation tolerance of blastospores of Paecilomyces fumosoroseus (Deuteromycotina: Hyphomycetes) using a Iabscale, air-drying chamber with controlled relative humidity. Biocontrol Science and Technology, v. 17, p. 709-719, 2007.)] 및 제형(formulation) [Sandoval Coronado. C.F.. Luna-Olvera, H.A., Arevalo-Nino, K, Jackson, M.A., Poprawski, T.J., Galan-Wong, L.J.,. Drying and formulation of blastospores of Paecilomyces fumosoroseus (Hyphomycetes) produced in two different liquid media. World Journal of Microbiology and Biotechnology v, 17, p. 423-428, 2001: Batta, Y.A. Production and testing of novel formulations of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae (Metschinkoff) Sorokin (Deuteromycotina:Hyphomycetes). Crop Protection, v. 22, p. 415-422, 2003; Friesen, T. J. et al. Effect of conditions and protectants on the survival of Penicillium bilaiae during storae. Biocontrol Science and Technology, v. 16, p. 80-08, 2006]과 같은 전-저장 (pre-storage) 인자들 역시 수명에 엄청난 영향을 미친다. 본 발명은 고온에 노출되기 전에 포장되고 온화한 조건에 놓여지는 포자를 건조시킴으로써 높은 초기 수분 활성도를 원하는 수준에 도달시키고 이로써 포자의 미성숙 사망 또는 약화를 피하게 된다. 발아 프로토콜과 같은 후-저장(post-storage) 인자들은 -비록 수명에 직접 관련되지는 않지만- 적절히 수행되지 않는다면 잘못된 생존력으로 귀결된다. 본 실시예에서 나타난 수명은 고속 재수화 프로토콜을 강조하면서 어림되었다(24시간 동안 습한 챔버 내부에서 저속 재수화 방법에 포자를 사전 노출시키지 않고).

Drierite^TM 또는 O₂ 및 습도 흡수제를 갖는 밀폐된 백 내에 유지된 미리-탈수된 포자의 수분 활성도는 0.010 내지 0.030의 범위 내에서 일정하였다(평형상태 상대 습도 1.9-3.0%). 이러한 작은 변이는 겨울(실험실의 에어컨 및 건조기) 및 더 높은 온도 및 상대 습도를 갖는 계절들 사이에 관찰되었다. 공기 중에 떠 있는 균류 포자들을 탈수하여 수명을 연장하는 것이 중요하다는 것은 이미 알려져 있다(Clerk, C.G.; Madelin, M.F. The longevity of conidia of three insectparasitizing hyphomycetes. Transactions of the British Mycological Society 48, 193-209, 1965; Feng, M.G., Poprawski, T.J., Khachatourians, G.G. Production, formulation and application of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana for insect control: current status. Biocontrol Science and Technology v.4, p 3-34, 1994; Shimizu, S; Mitani, T. Effects of temperature on viability of conidia from Beauveria bassiana in oil formulations. Japanese Journal of Applied Entomology and Zoology v. 44, p.51-53, 2000). 포장으로부터 공기가 제거되지 않은 밀폐된 저장에 대한 연구(Hong, T.D., et al Gunn, J The effect of storage environment on the longevity of conidia of Beauveria bassiana. Mycological Research 105, 597- 602, 2001)를 통해 뷰베리아 바시아나 (Beauveria bassiana ) 의 두 분리체(isolate)의 수명은, 저장시 습도량이 4.6 내지 5.2%의 범위 미만의 값으로 감소되고 20℃의 평형상태에서 상대습도가 11-14%이었을 때 현저히 증가하지 않았음이 보고되었다. 이 연구에서 포자의 가장 좋은 수분 활성도는 일관되게 Drierite^TM 과 관련되었는데, 이는 5% 보다 상당히 낮은 수분 함량을 가진다. 본 발명에서 얻어진 결과들은 실질적으로 무산소성인 조건 (0.03% 미만의 산소) 하에서 저장을 위한 최적의 수분 활성도는 산소성 대기 하에서보다 낮음을 제시한다.

Claims

균류 포자를 포장하는 방법으로서,
상기 방법은
(i) 포자의 초기 수분 활성도(water activity)를 0.3 미만으로 감소시키는 단계;
(ii) 포자를 산소 흡수제 및 습도 흡수제를 포함한, 기체 및 수증기 불투과성 포장 내로 위치시키는 단계; 및
(iii) 상기 포장 내에서 포자를 15 내지 25℃의 온도에서 2일 이상동안 유지시키는 단계를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 습도 흡수제는 칼슘 설페이트 또는 실리카겔로부터 선택된 하나 이상인 것인 방법.
제1항에 있어서, 흡수제들은 포자에 대해 비독성인 하나 이상의 봉지의 형태인 방법.
제1항에 있어서, 기체 및 수증기 불투과성 포장은 유리, 알루미늄 함유 라미네이트 재료 및 세라믹으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 것인 방법.
제1항에 있어서, (ii) 단계 후에 최종 수분 활성도 값이 0.1 미만인 방법.
제5항에 있어서, (ii) 단계 후에 최종 수분 활성도 값이 0.02 내지 0.03인 방법.
제1항에 있어서, 포자는 뷰베리아 속(Beauveria), 이사리아 속(Isaria), 레카니실리움 속(Lecanicillium), 노뮤레아 속(Nomuraea), 메타리지움 속(Metarhizium) 및 트리코더마 속(Trichoderma)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 것인 방법.
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