JP2886984B2 - 無定形基体上のカビの増殖の測定 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 1.本発明の分野 本発明はカビの増殖を測定するための方法および装置
に関する。

2.関連技術の説明 食糧のマイコトキシン（真菌毒素）の汚染は穀物、飼
料および動物産業に影響を与える共通の問題である。少
なくとも300の異なるマイコトキシンが穀粒および脂肪
種子を汚染しうるということが知られている。これらの
食糧の汚染によって多量の穀物が破棄される結果とな
る。さらに、これらの物資は一般に動物の飼料の主な成
分を示しているので、マイコトキシン汚染からの動物の
健康への脅威は著しいものである。マイコトキシンに関
する潜在的な健康への危険性に対して増大する警戒、お
よびマイコトキシンの存在に関する食糧試験における近
年の進歩のため、これらの化合物による穀物および飼料
の汚染は穀物および動物飼育産業が直面する主要な問題
の一つとして考えられている。食糧のマイコトキシン汚
染は、特定の毒を生ずるカビの増殖が制御されないため
に生じている。マイコトキシンはこれらのカビが増殖す
るにつれて直ちに環境中に放出される高い毒性の代謝副
生物である。時間が進むにつれて、マイコトキシン生成
の原因であるカビは生存能力がなくなってくるかもしれ
ない。しかしながら、ほとんどの場合、マイコトキシン
はその高い化学的安定性のため残る。

食糧におけるマイコトキシンの汚染を最小にする論理
的な試みはカビの増殖を最小にすることである。穀物、
飼料および動物飼育産業では食糧中のカビの増殖を最小
にする多数の試みが使用されてきた：（１）殺虫剤、肥
料および潅漑技術の適切な使用は、収穫前の穀物におい
てカビの増殖およびマイコトキシンの形成の可能性を大
きく低減する。（２）カビの増殖は穀物の成長サイクル
の最後近くで収穫前の穀物中に起こるので、穀物を早く
収穫すると通常最小のカビ増殖および最小のマイコトキ
シン汚染となる。（３）収穫された穀物を直ちに迅速に
および完全に乾燥すると、収穫後の穀物におけるカビの
増殖を遅らせる。しかしながら、乾燥法は収穫後できる
だけすぐに開始しなければならず、穀物の最終的な水分
はカビの増殖を妨げるため十分低くなければならない。
（４）乾燥した、水密性のおよびかびて固まった物質を
含まない貯蔵設備中で穀物および生産された飼料を貯蔵
することは、これらの貯蔵容器中に貯蔵された穀物およ
び飼料におけるカビの増殖およびマイコトキシン汚染を
回避するのを助ける。（５）生産された飼料を素早く使
用すると飼料製造と飼料消費の期間内でカビ増殖の機会
が減少される。（６）化学保存料を使用すると穀物およ
び飼料中のカビ増殖が最小となるので、これらの物資で
はマイコトキシン汚染の変化が最小となる。食糧のマイ
コトキシン汚染とカビ増殖との関連性および重要性があ
るとすれば、培養条件が模擬的な実施またはフィールド
に近い条件の物資中のカビ増殖を測定する正確な方法が
避けられないことは明らかである。これは化学保存料の
効果を研究しようとする場合には特に重要である。飼料
のカビ増殖を遅らせると考えられている化学薬品は、化
学薬品が使用された場合の飼料のカビ増殖が使用されな
かった場合よりも少ないという証拠によって支持されな
ければならない。

不都合なことに、飼鳥類飼料のような無定形基体上で
のカビ増殖の正確な測定は飼料における他のもの（例え
ばバクテリア）の測定よりもはるかに困難である。ほと
んどのバクテリア及び酵母は単一細胞または単一細胞か
らなる集塊として産生する。従って、適切な希釈剤を分
析する試料と混合すると希釈剤中に細胞の懸濁液が生成
すると考えられる。次いで、希釈剤をさらに希釈するこ
とができ、希釈剤を適切な培地上に置き、生成するバク
テリアコロニーを数えることによって生存能力のあるバ
クテリアおよび酵母の数（微生物の増殖の度合いを示
す）を測定することができる。ほとんどの農作物におい
てこのやり方ではカビは産生も増殖もしない。カビの増
殖はまず菌糸体の増殖によって特徴付けられる。カビ増
殖の初期の段階は肉眼では見えない。カビが増殖しつづ
けるにつれて、この菌糸体が増殖し、飼料を通じて連続
的な繊維状のネットワークを形成する。これに伴って、
塊は飼料粒子表面より上に生殖胞子を放出するよう働く
空気中の菌糸体の増殖したものでもある。この菌糸体の
塊はしばしば分析される物資の個々の粒子の不可欠な部
分となる。このため、バクテリアまたは酵母の増殖の評
価に使用される技術はカビ増殖の評価には適切ではな
い。

多分、カビ増殖の評価のためのほとんどの伝統的な方
法は「カビの胞子を数えること」である。この技術の前
提は「物資中のカビの胞子が多ければ多いほど予想され
るカビ増殖が大きい」ということである。カビの胞子は
一個または集塊として発生するため、バクテリアまたは
酵母を数えるのに使用したのと類似の方法で数えること
ができる。カビの胞子濃度がカビ増殖を示しているとい
う技術の単純さおよび「仮定条件」は飼料におけるカビ
増殖を評価するためにこの技術を使用する主な理由であ
る。カビ増殖の評価にカビの胞子を数えることを使用す
ることにおける誤信はカビによる胞子形成とカビの増殖
は独立した生物学的事象：所定のカビは飼料中で豊かに
増殖しうるが、胞子形成は乏しいという事実による。こ
の場合、カビの胞子を数えることは、基体上で乏しいカ
ビの増殖しか起こっていないという結論に達するが、事
実は逆である。他のカビは増殖が乏しいが豊富な胞子を
生成することが知られている。この状況でも、カビの胞
子を数えることは誤った結果を導く。

微生物学の基本的なコンセプトは微生物の増殖（カビ
を含む）が生物体の増殖の結果として基体の消失または
副生物の生成により間接的に測定することができるとい
うことである。呼吸測定法は通常酸素の消費を測定する
ことにより密閉系の微生物の増殖を測定するのに長く使
用されてきた。Warburg呼吸測定器はこの目的のため以
前使用されていたが、いくつかの制限のため常に十分で
あるわけではない。（１）酸素消費は二酸化炭素が増殖
室中の水酸化カリウムの存在により吸収されるにつれ、
系内の圧力の小さな変化を検出することにより測定され
る。（２）酸素消費（微生物増殖に伴なう基体の消失）
の測定のみはWarburg呼吸測定器で測定することができ
る。（３）さらに酸素消費は系内の僅かな圧力の変化に
よって測定できるので、極めて安定な温度が必要であ
る。（４）活動的に増殖する生物体が熱を発生する多く
の場合、Warburg呼吸測定器の使用は適切でない。
（５）Warburg呼吸測定器は文字通り「密閉系」である
ので、微生物体によって消費された酸素を補給すること
はできない。従って、酸素が呼吸測定器内の空気中から
消耗するにつれて、好気性生物体（例えば、カビ）は二
酸化炭素の濃度が上昇し、酸素の濃度が減少するため自
由に適切な増殖を維持することができない。（６）さら
にWarburg呼吸測定器は密閉系内の圧力変化の手動の記
録が必要である；頻繁な継続的測定はしばしば実際的で
ない。

最近では、独特の呼吸測定器（“MICRO−OXYMAX"20,C
olumbus Instruments社製）が、「密閉系」中で酸素消
費と二酸化炭素の生成を同時に測定することができるよ
うに改良された（米国特許4,947,339号および図１参
照）。20までの室中の空気を高感度酸素および二酸化炭
素センサーを通して定期的に循環させてから室に戻す。
呼吸測定器の測定は、時間に関して室中のガス濃度を変
化させる。室の体積および測定の間に経過した時間と合
わせた酸素および二酸化炭素濃度における変化は酸素が
消費された速度および二酸化炭素が生成した速度の計算
を可能にする。さらに、酸素の累積消費および二酸化炭
素の累積生成も測定することができる。累積測定値は基
体上のカビの増殖を示している。速度測定値はカビ増殖
の速度を決定するのに使用することができる。この特別
の呼吸測定器の一つの有用な特徴は各室中の空気を室の
空気と置き換えるまたは「新しくする（refresh）」こ
とをプログラムする能力である。長い実験の間には、酸
素および／または二酸化炭素の濃度は初期の濃度から、
室中の生物体の増殖速度が悪影響を及ぼすかもしれない
範囲まで著しく変化するかもしれない。このような場
合、使用者は各室を定期的に「新しくする」ように呼吸
測定器を配列するよう選ぶことができる。これによっ
て、酸素および二酸化炭素の最適なレベルが実験の開始
時のものと等しく維持される。

バルブとスイッチを組み合わせて使用して、センサー
はユーザーの所定の間隔で反復的にそして連続的に20の
培養室のそれぞれに接続されている。特別に設計された
ソフトウエアを有するマイクロコンピューターを、酸素
および二酸化炭素濃度の制御、結果の計算並びに印刷ま
たは結果をフロッピーもしくはハードディスクに保存す
ることを含む系全体を制御するのに使用する。また、系
はセンサーの較正並びに培養室の体積および気圧の自動
測定を助ける設備を組み込まれる。

“MICRO−OXYMAX"20は呼吸測定器は０〜１％二酸化炭
素の範囲で作動する、非常に安定な単一ビームの非分散
性赤外線二酸化炭素センサーを使用している。酸素セン
サーは電気化学的（燃料電池）であり、室空気中の酸素
のパーセンテージを直接測定することができる。

この装置は試料の水分含量が重要な場合には完全に適
切なわけではない。この装置では室の回りの環境の温度
を制御するための準備がなされていない。さらに各室内
に使用されている基体の水分レベルを制御するための準
備がなされていない。湿った飼鳥類飼料の場合は、実験
が進み各室内の空気を採取するにつれ、特定のガス濃度
の分析の前に乾燥カラム（図１中の系の左に示されてい
るのがポンプである）により、空気から水分が除去され
る。時間中、各室内の空気を繰り返し採取している間、
試料は脱水する傾向がある。この脱水はカビの通常の増
殖の妨害をし、しばしば誤った結果を導く。

発明の概要 急速なカビ増殖を支える制御された一定の環境を維持
する容器中に試料を置き；試料を一定の水分含量に維持
し；試料上でカビ増殖を開始させ；そして試験片上のカ
ビ増殖の測定値として容器中のO₂および／またはCO₂の
変化を測定することによって試料上のカビ増殖を測定す
る。

図面の簡単な説明 図１はホースの接続を示している“MICRO−OXYMAX"の
正面図である。

図２および３は本発明で使用される“MICRO−OXYMAX"
20装置を示している。

図２は微生物学的培養器および拡張モジュールを示し
ている。

図３は培養器の内側およびチューブの接続を示してい
る。

発明の詳述 本発明はカビ増殖の測定においてこれまで直面してい
る前記問題を克服する方法および装置である。

この方法は、 a.試料上のカビの急速な増殖を支える所定の固定された
水分含量を有しているカビの胞子を含む有機物質の試料
を密閉容器中に置き； b.前記容器中の環境を、急速なカビの増殖を支える暗く
実質的に一定の温度および相対湿度に維持し； c.試料の一部の水分含量を変化させる、前記容器中の水
蒸気の凝縮を回避し； d.前記容器中において、カビの増殖を妨げる酸素および
／または二酸化炭素の濃度における著しい変化を回避
し； e.前記容器から空気を定期的に回収し、前記空気中の少
なくとも一つの代謝ガスの濃度を測定し； f.前記容器中の前記代謝ガスの濃度変化を継続的な測定
により決定し；そして g.前記代謝ガスの濃度変化をカビ増殖の変化と相関させ
る ことからなる。

場合により、試料は１種またはそれ以上の特定のカビ
および／またはカビ抑制剤と一緒に接種する。

本発明の装置はさらに十分この後で説明されるが、カ
ビ増殖を測定するこの方法を達成するための手段からな
る。

本発明の好ましい実施態様では、基本的な“MICRO−O
XYMAX"系の能力を有する呼吸測定器を使用し、本発明の
工程および制御を達成するために改良されている。図１
に示すように、製造会社から調達した基本的な系は、適
切なソフトウエアーを用いた駆動コンピューター11、二
酸化炭素センサー12、酸素センサー13、システムポンプ
14および二つの拡張モジュール15からなる。試料室また
は容器16は拡張モジュールに接続されており、このモジ
ュールは多くの試料室に収容することができる。詳細
は、米国特許第4,947,388号にあるが、ここではその全
部を組み込んでいる。

本発明の装置では“MICRO−OXYMAX"は図２および３に
示したように改良されている。強制空気微生物培養器17
を加え、この中で試料容器16を試験期間中保持する。培
養器は、試料容器16を拡張モジュールに接続する、試料
容器あたり二つのチューブを有する。

図３に見られるように、これらのチューブ18の一セッ
トが拡張モジュールから個々の加湿室19へ導かれてお
り、チューブ23によって試料室（または容器）に接続さ
れており、これは順番に試料チューブ20によって拡張モ
ジュール22に接続されており、これを通じてO₂および／
またはCO₂測定のための空気試料は取り出される。従っ
て、飼鳥類飼料のような試料を含む室はライン中で試料
室と拡張モジュール間にある加湿器に接続されている。
加湿器は試料が脱水するのを回避し、これは試料に向か
うガスを飽和近くまで湿らせる。各加湿器は、バーミキ
ュライトおよび脱イオン水または比較的滅菌され脱イオ
ンされた加湿剤を含む。すべての室および加湿器はチュ
ーブを除いて、気密シールされている。試料容器は高め
られた棚21すなわち格子上に置かれ、各容器のまわりの
空気を自由に循環させるので、これにより試料容器の回
りは一定の均一な温度に維持される。培養器は強制空気
培養器中および試料室中の実質的に一定の温度をモニタ
ーするのに使用する温度探針を含む。

密閉された微生物培養器は幾つかの重要な機能を持っ
ている：（１）カビ増殖試験している間の温度の正確な
制御、（２）水の蒸発および次に試料中に局部的に高い
水分レベルの蓄積を生じる試料室中のそれらの凝縮を避
けること、および（３）光の影響の最小化、光はできる
だけ避けるべきであるが、これは光が試験される試料と
共に、含まれうる基体（試料）の栄養分およびすべての
抗菌剤を光分解させるかもしれないからである。

加湿器は試料および各試料室内の空気の湿気を比較的
一定に維持する。多くの加湿系を使用しうるが、この代
表的なものは園芸用のパーミキュライト（W.R.Grace ＆
Co.製）および脱イオン水である。水は湿ったバーミキ
ュライト中に微生物の増殖を妨げる化合物、例えば第四
アンモニウム化合物を含むことができる。操作では特定
のガスのために採取された空気をすべてまず最初に無水
硫酸カルシウム（８メッシュ、W.A.Hammond Drierite C
o.製）のような乾燥剤を通過させて乾燥させる。採取を
繰り返すと増殖速度試験中に試料の脱水が起こる。加湿
器は、試験全体の継続時間中、各試料室中の基体のすぐ
上の空気中の相対湿度を実質的に高度に一定に維持する
ことによって、カビの制限されない増殖を保証しなが
ら、この脱水の進行を効果的に回避する。

本発明は、カビの増殖を支える任意の物質または形状
の試料、例えば食物、一般的な有機物などの上の、カビ
の増殖、特定のカビまたはカビの混合物のいずれかを測
定するための幅広い適用性を有している。本発明は穀
粒、脂肪種子、堅果およびサイレージ上でもカビの増殖
を測定するのに特に有用である。試料はその自然な状態
で試験されうる、すなわちそれは一つまたはそれ以上の
特定のカビの胞子と共に接種される。またカビ抑制剤を
一般にまたは特別にカビに対するその効果を測定するた
めに接種することができる。

本発明の方法および装置は飼鳥類飼料上のカビ増殖試
験に優れた適用性があるので、飼鳥類飼料に関して詳し
く記述されるが、原理はカビ増殖を支える物質に広く適
用される。

試料、この場合、各試料容器中の飼鳥類飼料の量は重
要である。飼料が多すぎると、カビ増殖が、生成された
二酸化炭素および消費された酸素のレベルが呼吸測定器
で正確に測定できないほど高くなるという結果となる。
実際には、各250ml培養フラスコ中10〜50gの飼料が適切
であることがわかっている。もちろん、他の装置、特定
のカビおよび試験試料については他の量が適切となる。
適切な量の範囲は単純な実験により容易に決定すること
ができる。

粒径もまた重要である。一般に試験基体の均一な粒径
が好ましく、これは均一な方が代謝ガス（これはカビの
増殖に対応している）における変化が多くの試料室の間
で、不均一な粒径で得られるよりもより一貫しているか
らである。同じ効果は粒子が比較的小さい場合も生じ
る。従って、粉にした飼料粒子では粉にしていない飼料
よりもより均一な結果が得られる、特に、試料室中に使
用される飼料を1.0mm孔径のふるいを通過させてすりつ
ぶした場合、最適な結果が得られることがわかった。も
ちろん、小さい粒子は試験される飼料中のすべての栄養
分へカビの接近を容易にするので、自由なカビの増殖が
保証される。

特定のカビおよび／またはカビ遅延剤を評価する場合
は、接種する前に試料を滅菌することが重要である。も
ちろん、その自然な状態での試料のカビ増殖が測定され
る場合、滅菌は必要ない。試験前に試料を微粉状にする
場合、粒子が小さくなった後滅菌を行うべきである。滅
菌の主な理由は接種する前に飼料中の生存能力のあるす
べての生物体を除去することである。予備実験はすべて
の好気性微生物の増殖は酸素消費および二酸化炭素の生
成における変化に寄与していることを示している。微生
物（すなわち、バクテリアおよびカビ）の混合された個
体群が飼料中に存在する場合、およびカビ阻害剤が特別
にカビの個体群を抑制する場合、その場合はカビという
競合者が除去されるのでバクテリアは急速に増殖すると
考えられる。競合する微生物（すなわちカビ）がない場
合のバクテリアの増殖は、実際にカビの個体群が全体的
に抑制された時、抑制が起こらなかったことを示す特定
ガス濃度における変化という結果になると考えられる。
さらに二つまたはそれ以上のカビの種類が飼料中に同時
に存在する場合、与えられたカビ抑制剤は一方と比較し
てもう一方に対してより効くかもしれない。特定ガス濃
度の測定に基づいて、その種がカビ抑制剤によって影響
されない種から阻害されていると識別することはできな
い。

飼料の水分レベルも自然のままの基体におけるカビ増
殖の決定子である。飼鳥類飼料は通常11.5〜13.5％の水
分含量である。この水分レベルでは、一般に飼料は貯蔵
中にカビ増殖を支持しないと認められている。最近の情
報はカビ増殖は約14.0％の水分レベルで起こることがで
きると示している。しかしながら、この水分レベルで
は、水分の有効性が低いためカビ増殖は制限され、非常
にゆっくり進行する。水分の「閾値」を超えたときに飼
料中の急速なカビ増殖の開始が起こる。飼料中のこの相
対的に高い水分レベルは幾つかの状況の結果として起こ
りうる。（１）高水分の成分から製造された飼料はカビ
増殖を支持するのに十分な水分含量を有することができ
る。（２）ペレットにするのに使用された水分が貯蔵前
に飼料から適切に除去されていないまま製造された飼料
は、急速にカビ増殖させるのに十分な水分も含む可能性
がある。（３）飼料中の高水分レベルは「水分移動（mo
isture migration）」として知られる現象から生じるこ
とが知られている。水分移動は、周囲の温度が高い場合
（例えば日中時間）の、飼料貯蔵容器内の水の蒸発であ
る。周囲温度が下がった場合（例えば暗くなっている時
間）、先に蒸発した水の蒸気は凝縮し、水滴が飼料貯蔵
容器中の局部的な領域に蓄積される。これらの高水分含
量の領域は、通常飼料容器の周辺に沿っておよび貯蔵さ
れた飼料の上部表面付近にある。これらの特定部位にお
ける水分レベルは通常15％より上、20％またはそれより
上のレベルに達することもある。これらの「微小環境」
ではカビ増殖およびマイコトキシン形成は最も速い速度
で進行する。これは、本発明の実施にあたっては排除し
なければならない試料室中の水蒸気凝縮の主な源であ
る。

実施例の方法により、上述の呼吸測定装置を用いて1
3.06％の低い水分レベルでAspergillus parasitiusと共
に接種した飼鳥類飼料上のカビ増殖を検出することがで
き、顕著に高い水分レベルではカビ増殖速度は加速され
ることを示した。水分レベルが高いほど、カビ増殖の抑
制のために飼料に添加された任意の物質に対する要求は
より高くなる。この実験では、カビ抑制剤としてナタマ
イシンの評価をするのに、少なくとも17.0％の開始水分
含量を選んだ。この水分レベルでのカビ増殖の抑制にお
けるナタマイシンの成功は、低い水分レベルでもそして
ひょっとしたらより高い水分レベルでさえ抑制が起こっ
ていることを示している。

培養の長さもまた重要な因子である。飼鳥類産業では
飼料製造から鶏による消費までの時間の経過は約７〜14
日である。飼料の貯蔵が長ければ長いほど、カビ増殖お
よびマイコトキシン形成を含む飼料の微生物分解の可能
性が大きくなる。ナタマイシンを用いたすべての実験で
は、全培養時間は14日を使用した。基本的にカビ増殖試
験では、長い十分な培養時間によって意義のある評価が
得られるということは重要である。

もう一つの重要な因子は接種レベルである。比較的低
い濃度の胞子を用いた基体（例えば飼料の試料）の接種
は培地の長めの「遅滞期」を生じることが知られてい
る。カビの増殖も高レベルの接種と比べると少ないかも
しれない。ナタマイシンの接種レベル（例えば、胞子の
数／飼料のｇ）に関しては、5000胞子/g程度の胞子数が
適切であることがわかった。このレベルの接種物は14日
の培養期間にわたって最大のカビ増殖が保証されてい
る。

前述のように、“MICRO−OXYMAX"装置は定期的に試料
室からの空気を取り込み酸素および／または二酸化炭素
（代謝ガス）の濃度を測定するよう設定することができ
る。

各室中の特定ガス濃度を測定する時間の間隔も重要で
ある。採取間隔が短すぎると、各室内ではっきりと感知
できる変化が起こらないかもしれない。採取間隔が長す
ぎると、特定ガス濃度の変化は各ガスの濃度を正確に測
定する呼吸測定器の能力を超えるに違いない。特定の試
料およびカビについての適切な時間間隔は実験によって
容易に決定することができる。例えば、4.0時間の採取
間隔が、20.0飼料のg/室を使用する場合に適切であると
決定された。比較的大きな数の間隔／日（約６）のた
め、この採取間隔では各室中のカビ増殖の初期の開始に
ついての情報が４時間以内の正確さで得られる。

一つまたはそれ以上の代謝ガスの個々の採取によって
上記の試料以来の濃度変化、濃度増分（delta concentr
ation）が示される。この変化は対照標準試料のような
基準と比較してカビ増殖の速度が経験的に関連付けられ
る。長期間にわたる一連の採取によって少ない測定値し
かないものよりより信頼できる増分（delta）およびカ
ビ増殖、測定値が得られる。また、試料の数が大きい
と、実際の使用状況に応じて選ばれた時間、例えば貯蔵
時間における平均増殖が得られる。

本発明の呼吸測定装置の独特な特徴の一つは、各室内
の空気を周囲の空気で「リフレッシュする」または交換
する能力である。各室内の空気は培養時間に応じて酸素
レベルが徐々に減少し、二酸化炭素レベルが徐々に増加
するので、室のリフレッシュは必須である。酸素が減少
し、二酸化炭素が増加するにつれて、カビは必須ガス
（酸素）が不足となり、毒性ガス（二酸化炭素）が蓄積
するので抑制される。定期的に空気を新しくすることは
実験のすべての段階でカビを同じレベルの酸素に接触さ
せることになる。さらに、二酸化炭素濃度は実験の終わ
り近くでは、培養の初期の相の間にあるよりもより毒性
が少ない。従って、カビはこの時間中ずっと最適な速度
で増殖すると考えられる。

いずれか一つの室が室内で初期ガス濃度から酸素また
は二酸化炭素の濃度のいずれかが0.08％の変化をしたこ
とを検出した時に、すべての室で室のリフレッシュが自
動的に起こるようプログラムした場合、飼鳥類飼料上の
ナタマイシンの増殖速度の試験において優れた結果が得
られる。

これらの方法の工程では、本発明の装置は、 a.少なくとも一つの密閉可能な試料容器； b.試験期間中、容器の内側を実質的に一定の選ばれた温
度および相対湿度で暗い環境に前記試料容器を維持する
ための手段； c.測定している間、前記容器中で水の凝縮を回避するた
めの手段； d.試験中に密閉されて前記容器内での代謝ガスの変化が
限定されている場合、前記容器中の空気を新たにするた
めの手段； e.試験中に密閉されている場合、前記容器から定期的に
試料中の空気を回収する手段； f.前記空気の試料中の少なくとも一つの代謝ガスの濃度
を測定するための手段 からなる。

以下の実施例では、本発明の好ましい装置は上記のよ
うに改良された“MICRO−OXYMAX"装置からなる。

実施例１ 本実施例は、ナタマイシンカビ増殖遅延剤で処理され
た飼鳥類飼料上のアフラトキシンを生成するAspergillu
s parasiticusの増殖の測定を示している。

薬物（表１）を全く含まない市販のブロイラー用の最
初の飼料（starter ration）の一定量が市販飼鳥類飼料
ミルから得られた。この飼料を実験室の粉砕機で約1mm³
の粒径に細かく粉砕した。次いで飼料を滅菌した（121
℃で15分）。試料を135℃の強制通風炉中で２時間乾燥
して水分含量を測定した（AOAC法、930.15）。1.0kgの
飼料に十分な量の滅菌脱イオン水を加え、17.0％の理論
水分含量が得られるよう完全に混合した。それから実際
の最終的な水分含量を測定した（AOAC法930.15）。湿ら
せた飼料の五つの200gアリコートをそれぞれ2800ml Fer
nbachフラスコに移した。

計算された組成 代謝エネルギー（kcal/kg） 3100 タンパク質（％） 23.00 カルシウム（％） 1.00 燐（総％） 0.72 燐（有効％） 0.48 メチオニン＋シスチン（％） 0.93 リジン（％） 1.25 ナトリウム（％） 0.20 1.ビタミンプレミックスが含有するもの（kg/食餌あた
り）：ビタミンＡ、5500IU;ビタミンD3、1100ICU;ビタ
ミンＥ、11IU;リボフラビン4.4mg;パントテン酸カルシ
ウム、12mg;ニコチン酸、44mg;塩化コリン、220mg;ビタ
ミンB12、6.6mcg;ビタミンB6、2.2mg;メナジオン、1.1m
g（MSBCとして）；葉酸、0.55mg;D−ビオチン、0.11mg;
チアミン、2.2mg（チアミン一水化物として）；エトキ
シキン、125mg;セレン、0.3mg（亜セレン酸ナトリウム
として）。

2.微量の無機物の混合物が含有するもの（食餌のpp
m）：マンガン、60;亜鉛、50;鉄、30;銅、5;ヨウ素、1.
5。

カビの熟成した傾斜培養物に滅菌希釈液（水中の0.00
5％“Triton"X−100）9.0mlを添加してAsperigillus pa
rasiticus、NRRL 2999の胞子懸濁液を調製した。傾斜表
面を滅菌された微生物ループで穏やかにこすり、菌糸か
ら胞子が離れるのを促進する。標準的な希釈および培養
培地としてSaboraudsブドウ糖寒天を使用する混釈平板
方法論（pour−plate methodology）によって、懸濁液
中の生存能力のある胞子の濃度を測定した。適切な体積
の懸濁液を各飼料のアリコートに５〜８×103胞子/gと
なるよう添加した。完全に混合した後、秤量したナタマ
イシンプレミックスを各200グラムのアリコートに０
（対照標準）、５、10、15および20ナタマイシンのg/飼
料のトンの濃度となるよう添加した。飼料を再び混合
し、処理した飼料のそれぞれ20gの試料を、呼吸測定器
中の培養のための室として働く250mlの広口エルレンマ
イヤーフラスコ中に置いた。四つ反復試験フラスコを各
レベルのナタマイシン用に調製した。

すべてのフラスコをゴム栓で密閉し、30℃で48時間、
予備培養した。この最初の予備培養期間の後、すべての
フラスコを30℃で微生物培養器中に置き、呼吸測定器
（“MICRO−OXYMAX"20、Columbus Instruments社製）に
接続した。実験の間を通じて安定した飼料の水分含量が
保証されるよう各フラスコの室に加湿器を取り付けた。
酸素消費および二酸化炭素生成の測定を288時間（12
日）の間、４時間毎に測定した。すべてのデータは累積
酸素消費および累積二酸化炭素生成として計算された。

水分の効用は多分、特定の基体上のカビ増殖に関する
最も重要な因子である。使用される飼料の初期水分含量
は17.00％であると測定された。この水分レベルが、適
切な基体の存在下でのA.parasiticusの増殖用の最適な
温度（30℃）と組み合わせられ、豊富なカビの増殖が保
証される。

すべての培地を呼吸測定法を開始する前に約２日培養
した。したがって、初期の呼吸測定の測定値（接種後14
6時間）はカビ増殖開始後の培地の状態を反映してい
る。

接種後146時間では、対照標準と5g/トン培地間の累積
二酸化炭素生成に大きな差はない。しかしながら、二酸
化炭素生成の著しく低いレベルが、対照標準培地と10g/
トン、15g/トンおよび20g/トンの培地との間で注目され
た。これは培地の６日の「予備培養」の間に示されたナ
タマイシンの抗カビ活性の影響である。接種後163.5時
間では、対照標準培地と四つのレベルのすべてのナタマ
イシンを含む培地との間で著しい相違が観察された。こ
の相違は実施例の残りを通じて著しいまま続いた。

同じ間隔での酸素消費に関して、接種後146時間でい
ずれの処理の間にも著しい違いは見られなかった。接種
後163.5時間では対照標準培地とナタマイシンを含むす
べての培地の間で酸素消費量において著しい相違があっ
た。すべてのナタマイシン培地では接種後238.5時間の
間ずっと対照標準培地と比較して著しく低い酸素消費レ
ベルを示した。この実施例の残りの間では、対照標準と
5g/トン培地ではあまり違わなかった。しかしながら、
ナタマイシンの10、15および20g/トン濃度では対照標準
培地と比較して著しく酸素消費が減少した。

Aspergillus parasiticusを接種した、湿った飼鳥類
飼料培地において累積二酸化炭素生成および累積酸素消
費が著しく低いという結果に基づいて、ナタマイシンは
毒素を生じるカビの増殖を遅らせると結論できる。さら
に、このカビ遅延活性は接種後146時間程度で明白であ
る。さらに二酸化炭素生成のデータは、5g/トンまたは
それ以上のナタマイシンは16日間カビ増殖を著しく遅延
させるのに十分であることを示している。酸素消費量の
データは、同じ長さの期間のこのカビの増殖を著しく低
下させるには10g/トン以上のナタマイシンが必要である
ことを示している。

実施例２ 本実施例は以下：（１）飼料の初期水分含量は17.38
％であった、（２）初期接種は5000胞子/gであった、お
よび（３）培養期間は約24時間に減らした：を除いて実
施例１と同じやり方で行った。他の実験条件はすべて実
施例１と同じであった。また、湿った飼鳥類飼料をA.pa
rasiticusで接種してから呼吸測定を開始するまでの期
間は実施例２では実施例１よりも少ない。従って、累積
二酸化炭素生成の初期測定値は種々の処理間で大きく異
なる。ナタマイシンのカビ遅延活性は最初に接種後98.5
時間で明らかである。このとき、ナタマイシンで処理さ
れたすべての培地は対照標準培地と比較して著しく低い
二酸化炭素生成レベルを示した。ナタマイシンのこの効
果は接種後313時間を通じて持続した。接種後340.5時間
で、ナタマイシン濃度15および20g/トンを含む培地のみ
が対照標準培地と著しく異なっていた。

同様の結果が累積酸素消費の測定値から得られた。接
種後46.5および72時間の両方で種々の処理間に著しい違
いは見られなかった。しかしながら、接種後98.5時間で
はすべてのナタマイシン培地での酸素消費量は対照標準
培地のものより著しく低かった。これらの相違は接種後
291時間を通して持続した。接種後313および340.5時間
１では、10g/トン以上含む培地は対照標準培地よりも著
しく低いレベルの酸素を消費した。

A.parasiticusを接種された、湿った飼鳥類飼料中の
累積二酸化炭素生成および累積酸素消費に基づいて、再
び、ナタマイシンはこの毒素を生じるカビの増殖を遅延
すると結論づけることができる。カビ増殖の遅延は、本
実験では接種後98.5時間あたりで明白である。呼吸測定
の最初の３日間で二酸化炭素生成または酸素消費のいず
れかにおけるナタマイシンの著しい効果に注目するとい
う失敗は、カビの胞子の水和、続く胞子の発芽および菌
糸の増殖に必要な時間の影響によるもので、もっともあ
りがちである。これらの最初の相の間では、最初の３日
間に二酸化炭素生成と酸素消費に反映されるように胞子
は呼吸する；しかしながら、最初の３日後までは菌糸の
著しい増殖は起こらない。この菌糸の増殖が起こるまで
は、ナタマイシンはそのカビ遅延活性を働かせない。こ
れはナタマイシンの作用の知られている機構によるもの
である：ナタマイシンは菌糸の細胞壁のステロールとの
相互作用により菌糸の増殖を妨げる。二酸化炭素生成に
基づいて、14日間のカビ増殖を著しく低下させるにはナ
タマイシン15g/トンまたはそれ以上が必要である。酸素
消費に基付くと、同じ期間カビ増殖を遅らせるにはナタ
マイシン10g/トンが必要である。

実施例１と２の比較では、湿った飼鳥類飼料中のA.pa
rasiticusの増殖が５〜15g/トンのナタマイシン濃度に
よって遅延されることを示している。両実施例では、10
g/トンで累積酸素消費量の著しい低下が生じた。二酸化
炭素生成に基づくと、カビ増殖を遅延させるのに必要な
最小のナタマイシン濃度は実施例１では5g/トンであ
り、実施例２では15g/トンであった。湿った飼鳥類飼料
のカビ増殖を著しく低減するには10g/トンの濃度が適当
であると結論付けられる。

実施例はカビ遅延剤の効果を主に取り扱っているが、
自然なままのカビ増殖の測定は、パンおよび他の食物、
革、並びに湿ったセルロースでできた物質を含む有機基
体上で同じやり方で行われる。ナイスタチン、プロピオ
ン酸およびその塩を含む他のカビ遅延剤を使用するカビ
増殖測定も同様に行うことができる。またFusarium sps
またはPennicillum spsを含む他のカビの増殖用の未処
理およびカビ遅延剤処理された有機基体上でも同じやり
方で測定が行われる。

実施例３ 近年では、Fusarium moniliformeは食糧汚染に関して
重要になった。過去20年にわたって飼鳥類飼料の調査の
中で、F.moniliformeは飼鳥類飼料において発見された
最も有力な種である。F.moniliformeは毒素の群を生成
することがわかっており、まとめてフモニシン（fumoni
sins）として参照される。フモニシンは発癌性の可能性
を含む幅広い毒性を有している。F.moniliformeの発生
が広く、その代謝産物が毒性でありおよび飼鳥類におけ
るこれらの代謝産物が疾患を引き起こす可能性があるた
め、この特定のカビはカビ遅延活性できるナタマイシン
のこの評価に含まれることになった。

薬物（表１）を全く含まない市販のブロイラー用の最
初の飼料の一定量が、市販飼鳥類飼料ミルから得られ
た。この飼料を実験室の粉砕機で約1mm³の粒径に細かく
粉砕した。次いで飼料を滅菌した（121℃で15分）。試
料を135℃の強制通風炉中で２時間乾燥して水分含量を
測定した（AOAC法、930.15）。1.0kgの飼料に十分な量
の滅菌脱イオン水を加え、17.0％の理論水分含量が得ら
れるよう完全に混合した。それから実際の最終的な水分
含量を測定した（AOAC法930.15）。湿らせた飼料の五つ
の200gアリコートをそれぞれ2800ml Frenbachフラスコ
に移した。

カビの熟成した傾斜培養物に滅菌希釈液（水中の0.00
5％“Triton"X−100）9.0mlを添加してFusarium monili
forme、NRRL 5806の胞子懸濁液を調製した。傾斜表面を
滅菌された微生物ループで穏やかにこすり、菌糸から胞
子が離れるのを促進する。標準的な希釈度および培養培
地としてSaboraudsブドウ糖寒天を使用する混釈平板方
法論（pour−plate methodology）によって、懸濁液中
の生存能力のある胞子の濃度を測定した。適切な体積の
懸濁液を各飼料のアリコートに5.0×10³胞子/gとなるよ
う添加した。完全に混合した後、秤量したナタマイシン
プレミックスを各200グラムのアリコートに０（対照標
準）、５、10、15および20ナタマイシンのg/飼料のトン
の濃度となるよう添加した。飼料を再び混合し、処理し
た飼料のそれぞれ20gの試料を、呼吸測定器中の培養の
ための室として働く250mlの広口エルレンマイヤーフラ
スコ中に置いた。四つの反復試験フラスコを各レベルの
ナタマイシン用に調製した。

すべてのフラスコをゴム栓で密閉し、30℃で40時間、
予備培養した。この最初の予備培養期間の後、すべての
フラスコを30℃で微生物培養器中に置き、呼吸測定器
（“MICRO−OXYMAX"20、Columbus Instruments社製）に
接続した。実験の間を通じて安定した飼料の水分含量が
保証されるよう各フラスコ（室）に加湿器を取り付け
た。酸素消費および二酸化炭素生成の測定を364時間（1
5日）の間、４時間毎に測定した。すべてのデータは累
積酸素消費および累積二酸化炭素生成として計算され
た。

水分の効用は多分、特定の基体上のカビ増殖に関する
最も重要な因子である。本実験で使用される飼料の初期
水分含量は17.70％であると測定された。基体でのF.mon
iliformeの増殖に適した温度（30℃）と組み合わせられ
たこの水分レベルにより豊富なカビの増殖が保証され
る。

接種後46および71.5時間では、いずれの培地間でも累
積二酸化炭素生成に大きな差はない。接種後93時間で
は、ナタマイシンを含むすべての培地は対照標準培地よ
りも著しく低い二酸化炭素レベルを生成した。この関係
は接種後314時間を通じて持続された。

同じ間隔での酸素消費に関して、接種後46および71.5
時間でのいずれでも著しい違いは見られなかった。しか
しながら、接種後93時間では、10g/トンまたはそれ以上
の濃度のナタマイシンを含む培地では対照標準培地より
も著しく低いレベルの酸素が消費された。接種後117.5
時間ではすべてのナタマイシン培地で対照標準培地と著
しく異なった。この関係は接種後286.5時間を通して持
続した。

F.moniliformeを接種した、湿った飼鳥類飼料培地に
おいて累積二酸化炭素生成および累積酸素消費が著しく
低いという結果に基づいて、ナタマイシンは毒素を生じ
るカビの増殖を遅らせると結論できる。さらに、このカ
ビ遅延活性は接種後93時間程度で明白である。さらに二
酸化炭素生成のデータは、5g/トンまたはそれ以上のナ
タマイシンでこの種のFusariumの増殖を著しく遅延させ
るのに十分であることを示している。

実施例４ ブロイラーチキン飼料中Pennicillium rubrum NRLL 3
290による酸素消費および二酸化炭素生成におけるナタ
マイシンの結果を、本発明によるカビ増殖の速度測定の
この実施例によって示す。

Pennicillum rubrumは例えばトウモロコシ、小麦のよ
うな食糧および完全な飼料における一般的な汚染物質と
して知られている。P.rubrumによって生成される主な毒
物はrubratoxin Bである。rubratoxin Bは飼鳥類に致命
的な出血性症候群を引き起こすことが知られており、こ
れは内臓器官の鬱血により特徴付けられる。鶏における
rubratoxinのためのLD50は4.0mg/kgと確立されている。
P.rubrumが飼鳥類飼育産業で使用されている食糧を汚染
する高い可能性がありそしてrubratoxinの形成から中毒
症が生じる可能性があるので、P.rubrumが、湿った飼鳥
類飼料におけるナタマイシンのカビ遅延活性を査定する
ためこの評価に含まれることになった。

薬物（表１）を全く含まない市販のブロイラー用の最
初の飼料の一定量を使用した。この飼料を実験室の粉砕
機で約1mm³の粒径に細かく粉砕した。次いで飼料を滅菌
した（121℃で15分）。試料を135℃の強制通風炉中で２
時間乾燥して水分含量を測定した（AOAC法、930.15）。
1.0kgの飼料に十分な量の滅菌脱イオン水を加え、17.0
％の理論水分含量が得られるよう完全に混合した。それ
から実際の最終的な水分含量を測定した（AOAC法930.1
5）。湿らせた飼料の五つの200gアリコートをそれぞれ2
800ml Fernbachフラスコに移した。

カビの熟成した傾斜培養物に滅菌希釈液（水中の0.00
5％“Triton"X−100）9.0mlを添加してPennicillium ru
brum NRRL 3209の胞子懸濁液を調製した。傾斜表面を滅
菌された微生物ループで穏やかにこすり、菌糸から胞子
が離れるのを促進する。標準的な希釈度および培養培地
としてSaboraudsブドウ糖寒天を使用する混釈平板方法
論（pour−plate methodology）によって、懸濁液中に
生存能力のある胞子の濃度を測定した。適切な体積の懸
濁液を各飼料のアリコートに５×103胞子/gとなるよう
添加した。完全に混合した後、秤量したナタマイシンプ
レミックスを各200グラムのアリコートに０（対照標
準）、５、10、15および20ナタマイシンのg/飼料のトン
の濃度となるよう添加した。飼料を再び混合し、処理し
た飼料のそれぞれ20gの試料を、呼吸測定器中の培養の
ための室として働く250mlの広口エルレンマイヤーフラ
スコ中に置いた。四つの反復試験フラスコを各レベルの
ナタマイシン用に調製した。

すべてのフラスコをゴム栓で密閉し、30℃で115時
間、予備培養した。この最初の予備培養期間の後、すべ
てのフラスコを30℃で微生物培養器中に置き、呼吸測定
器（“MICRO−OXYMAX"20、Columbus Instruments社製）
に接続した。実験の期間を通じて安定した飼料の水分含
量が保証されるよう各フラスコの室に加湿器を取り付け
た。酸素消費および二酸化炭素生成の測定を340時間（1
4日）の間、４時間毎に測定した。すべてのデータは累
積酸素消費および累積二酸化炭素生成として計算され
た。

水分の効用は多分、特定の基体上のカビ増殖に関する
最も重要な因子である。本実験で使用される飼料の初期
水分含量は17.20％であると測定された。基体上でPenic
illium rubrumの増殖に適した温度（30℃）と組み合わ
せて、この水分レベルではこのカビの増殖は保証され
る。属としてのPenicilliumは他の毒を生ずる属、例え
ばAspergillusおよびFusariumと比較して、幾分高い水
分レベルおよび水活性が必要であることが知られてい
る。AspergillusおよびFusariumは約17％の水分レベル
で急速な増殖を示すことができるが、この同じ水分レベ
ルで、ほとんどのPenicillium種は等しい速度では増殖
しない。

この種のPenicilliumについては、すべての培地で接
種後219時間まで、累積二酸化炭素生成における著しい
相違はなかった。この後のすべての時間のインターバル
でも累積二酸化炭素における著しい相違は見られなかっ
た。累積二酸化炭素生成において一貫した著しい減少を
示すということは、この特定のカビの低い増殖速度によ
るもので、飼料中のナタマイシンの存在は失敗であった
かもしれない。例えば、Asupergillus parasiticusによ
り生成された二酸化炭素は全部で76.3mlであるがこれと
比較して同じ期間のP.rubrumによる全二酸化炭素はたっ
た16.4mlである。先に説明したように、Penicilliumの
種は同じ水分レベルを含む同じ基体でAsupergillusおよ
びFusariumのものほど急速には増殖しない。

この実験における二酸化炭素生成と酸素消費の相違
は、ナタマイシンおよび類似の目的で使用される他の任
意の化合物のカビ遅延活性の正確な評価のためにはこれ
らのガスの両方を同時に測定する必要性を指摘してい
る。さらに、このような化合物の評価は異なる属及び種
のカビ増殖に必要な最適な水分レベルにおける違いを考
慮に入れなければならない。

上記実施例は主に菌遅延の効力を取り扱っているが、
自然なままのカビの増殖の測定はパンおよび他の食物、
革、並びに湿ったセルロース物質などを含む有機基体上
で同じやり方で行うことができる。ナスタチンなどを含
む他のカビ遅延剤を用いたカビ増殖測定も同様に行われ
る。また、他のカビの増殖についても未処理のおよびカ
ビ遅延剤で処理された有機基体上で同じやり方で行われ
る。

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（ａ）試料上のカビの急速な増殖を支える
   所定の固定された水分含量を有しているカビの胞子を含
   む有機物質の試料を密閉容器中に置き； （ｂ）前記容器中の環境を、急速なカビの増殖を支える
   暗く実質的に一定の温度および相対湿度に維持し； （ｃ）前記容器中において、カビの増殖を妨げる酸素お
   よび／または二酸化炭素の濃度における著しい変化を回
   避し； （ｄ）前記容器から空気を定期的に回収し、前記空気中
   の少なくとも一つの代謝ガスの濃度を測定し； （ｅ）前記容器中の前記代謝ガスの濃度変化を継続的な
   測定値により決定し；そして （ｆ）前記代謝ガスの濃度変化をカビ増殖の速度と対応
   させる ことからなる有機物質上のカビ増殖の測定法。
2. 【請求項２】前記試料を前記室中に置く前に前記試料を
   真菌抑制剤で処理する請求項１の方法。
3. 【請求項３】前記真菌抑制剤がナタマイシン、ナイスタ
   チン、プロピオン酸およびその殺菌性の塩からなる群よ
   り選ばれる請求項２の方法。
4. 【請求項４】a.少なくとも一つの密閉可能な試料容器； b.試験期間中、前記試料容器の内側を実質的に一定の選
   ばれた温度および相対湿度で暗い環境に維持するための
   手段； c.試験中に密閉されて前記容器内での代謝ガスの変化が
   限定されている場合、前記容器中の空気を新たにするた
   めの手段； d.試験中に密閉されている場合、前記容器から定期的に
   空気の試料を回収する手段； e.前記空気の試料中の少なくとも一つの代謝ガスの濃度
   を測定するための手段 からなるカビ増殖の測定装置。