JPH08500006A

JPH08500006A - 無定形基体上のカビの増殖の測定

Info

Publication number: JPH08500006A
Application number: JP6500856A
Authority: JP
Inventors: キング，ブルース・デクスター
Original assignee: デユコーア・エル・ピー
Priority date: 1992-05-29
Filing date: 1993-05-27
Publication date: 1996-01-09
Anticipated expiration: 2014-04-26
Also published as: DE69316982T2; AU4402993A; US5648231A; CN1048756C; MX9303177A; EP0642663A1; JP2886984B2; EP0642663B1; CA2136414C; CN1084892A; WO1993024835A1; DE69316982D1

Abstract

(57)【要約】急速なカビ増殖を支える制御された一定の環境に維持された容器中に試料を置くこと；試料上のカビ増殖を開始する一定の水分含量に試料を維持すること；および試料上のカビ増殖の変化の測定として容器中のO₂および／またCO₂の変化を測定すること；によって試料上のカビ増殖を測定する。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称無定形基体上のカビの増殖の測定１．本発明の分野本発明はカビの増殖を測定するための方法および装置に関する。２．関連技術の説明食糧のマイコトキシン（真菌毒素）の汚染は穀物、飼料および動物産業に影響を与える共通の問題である。少なくとも300の異なるマイコトキシンが穀粒および脂肪種子を汚染しうるということが知られている。これらの食糧の汚染によって多量の穀物が破棄される結果となる。さらに、これらの物資は一般に動物の飼料の主な成分を示しているので、マイコトキシン汚染からの動物の健康への脅威は著しいものである。マイコトキシンに関する潜在的な健康への危険性に対して増大する警戒、およびマイコトキシンの存在に関する食糧試験における近年の進歩のため、これらの化合物による穀物および飼料の汚染は穀物および動物飼育産業が直面する主要な問題の一つとして考えられている。食糧のマイコトキシン汚染は、特定の毒を生ずるカビの増殖が制御されないために生じている。マイコトキシンはこれらのカビが増殖するにつれて直ちに環境中に放出される高い毒性の代謝副生物である。時間が進むにつれて、マイコトキシン生成の原因であるカビは生存能力がなくなってくるかもしれない。しかしながら、ほとんどの場合、マイコトキシンはその高い化学的安定性のため残る。食糧におけるマイコトキシンの汚染を最小にする論理的な試みはカビの増殖を最小にすることである。穀物、飼料および動物飼育産業では食糧中のカビの増殖を最小にする多数の試みが使用されてきた：（１）殺虫剤、肥料および潅漑技術の適切な使用は、収穫前の穀物においてカビの増殖およびマイコトキシンの形成の可能性を大きく低減する。（２）カビの増殖は穀物の成長サイクルの最後近くで収穫前の穀物中に起こるので、穀物を早く収穫すると通常最小のカビ増殖および最小のマイコトキシン汚染となる。（３）収穫された穀物を直ちに迅速におよび完全に乾燥すると、収穫後の穀物におけるカビの増殖を遅らせる。しかしながら、乾燥法は収穫後できるだけすぐに開始しなければならず、穀物の最終的な水分はカビの増殖を妨げるため十分低くなければならない。（４）乾燥した、水密性のおよびかびて固まった物質を含まない貯蔵設備中で穀物および生産された飼料を貯蔵することは、これらの貯蔵容器中に貯蔵された穀物および飼料におけるカビの増殖およびマイコトキシン汚染を回避するのを助ける。（５）生産された飼料を素早く使用すると飼料製造と飼料消費の期間内でカビ増殖の機会が減少される。（６）化学保存料を使用すると穀物および飼料中のカビ増殖が最小となるので、これらの物資ではマイコトキシン汚染の変化が最小となる。食糧のマイコトキシン汚染とカビ増殖との関連性および重要性があるとすれば、培養条件が模擬的な実施またはフィールドに近い条件の物資中のカビ増殖を測定する正確な方法が避けられないことは明らかである。これは化学保存料の効果を研究しようとする場合には特に重要である。飼料のカビ増殖を遅らせると考えられている化学薬品は、化学薬品が使用された場合の飼料のカビ増殖が使用されなかった場合よりも少ないという証拠によって支持されなければならない。不都合なことに、飼鳥類飼料のような無定形基体上でのカビ増殖の正確な測定は飼料における他のもの（例えばバクテリア）の測定よりもはるかに困難である。ほとんどのバクテリア及び酵母は単一細胞または単一細胞からなる集塊として産生する。従って、適切な希釈剤を分析する試料と混合すると希釈剤中に細胞の懸濁液が生成すると考えられる。次いで、希釈剤をさらに希釈することができ、希釈剤を適切な培地上に置き、生成するバクテリアコロニーを数えることによって生存能力のあるバクテリアおよび酵母の数（微生物の増殖の度合いを示す）を測定することができる。ほとんどの農作物においてこのやり方ではカビは産生も増殖もしない。カビの増殖はまず菌糸体の増殖によって特徴付けられる。カビ増殖の初期の段階は肉眼では見えない。カビが増殖しつづけるにつれて、この菌糸体が増殖し、飼料を通じて連続的な繊維状のネットワークを形成する。これに伴って、塊は飼料粒子表面より上に生殖胞子を放出するよう働く空気中の菌糸体の増殖したものでもある。この菌糸体の塊はしばしば分析される物資の個々の粒子の不可欠な部分となる。このため、バクテリアまたは酵母の増殖の評価に使用される技術はカビ増殖の評価には適切ではない。多分、カビ増殖の評価のためのほとんどの伝統的な方法は「カビの胞子を数えること」である。この技術の前提は「物資中のカビの胞子が多ければ多いほど予想されるカビ増殖が大きい」ということである。カビの胞子は一個または集塊として発生するため、バクテリアまたは酵母を数えるのに使用したのと類似の方法で数えることができる。カビの胞子濃度がカビ増殖を示しているという技術の単純さおよび「仮定条件」は飼料におけるカビ増殖を評価するためにこの技術を使用する主な理由である。カビ増殖の評価にカビの胞子を数えることを使用することにおける誤信はカビによる胞子形成とカビの増殖は独立した生物学的事象：所定のカビは飼料中で豊かに増殖しうるが、胞子形成は乏しいという事実による。この場合、カビの胞子を数えることは、基体上で乏しいカビの増殖しか起こっていないという結論に達するが、事実は逆である。他のカビは増殖が乏しいが豊富な胞子を生成することが知られている。この状況でも、カビの胞子を数えることは誤った結果を導く。微生物学の基本的なコンセプトは微生物の増殖（カビを含む）が生物体の増殖の結果として基体の消失または副生物の生成により間接的に測定することができるということである。呼吸測定法は通常酸素の消費を測定することにより密閉系の微生物の増殖を測定するのに長く使用されてきた。Warburg呼吸測定器はこの目的のため以前使用されていたが、いくつかの制限のため常に十分であるわけではない。（１）酸素消費は二酸化炭素が増殖室中の水酸化カリウムの存在により吸収されるにつれ、系内の圧力の小さな変化を検出することにより測定される。（２）酸素消費（微生物増殖に伴なう基体の消失）の測定のみはWarburg呼吸測定器で測定することができる。（３）さらに酸素消費は系内の僅かな圧力の変化によって測定できるので、極めて安定な温度が必要である。（４）活動的に増殖する生物体が熱を発生する多くの場合、Warburg呼吸測定器の使用は適切でない。（５）Warburg呼吸測定器は文字通り「密閉系」であるので、微生物体によって消費された酸素を補給することはできない。従って、酸素が呼吸測定器内の空気中から消耗するにつれて、好気性生物体（例えば、カビ）は二酸化炭素の濃度が上昇し、酸素の濃度が減少するため自由に適切な増殖を維持することができない。（６）さらにWa rburg呼吸測定器は密閉系内の圧力変化の手動の記録が必要である；頻繁な継続的測定はしばしば実際的でない。最近では、独特の呼吸測定器（“MICRO-OXYMAX”20, ColumbusInstruments社製）が、「密閉系」中で酸素消費と二酸化炭素の生成を同時に測定することができるように改良された（米国特許4,947,339号および図１参照）。20までの室中の空気を高感度酸素および二酸化炭素センサーを通して定期的に循環させてから室に戻す。呼吸測定器の測定は、時間に関して室中のガス濃度を変化させる。室の体積および測定の間に経過した時間と合わせた酸素および二酸化炭素濃度における変化は酸素が消費された速度および二酸化炭素が生成した速度の計算を可能にする。さらに、酸素の累積消費および二酸化炭素の累積生成も測定することができる。累積測定値は基体上のカビの増殖を示している。速度測定値はカビ増殖の速度を決定するのに使用することができる。この特別の呼吸測定器の一つの有用な特徴は各室中の空気を室の空気と置き換えるまたは「新しくする(refresh) 」ことをプログラムする能力である。長い実験の間には、酸素および／または二酸化炭素の濃度は初期の濃度から、室中の生物体の増殖速度が悪影響を及ぼすかもしれない範囲まで著しく変化するかもしれない。このような場合、使用者は各室を定期的に「新しくする」ように呼吸測定器を配列するよう選ぶことができる。これによって、酸素および二酸化炭素の最適なレベルが実験の開始時のものと等しく維持される。バルブとスイッチを組み合わせて使用して、センサーはユーザーの所定の間隔で反復的にそして連続的に20の培養室のそれぞれに接続されている。特別に設計されたソフトウエアを有するマイクロコンピューターを、酸素および二酸化炭素濃度の制御、結果の計算並びに印刷または結果をフロッピーもしくはハードディスクに保存することを含む系全体を制御するのに使用する。また、系はセンサーの較正並びに培養室の体積および気圧の自動測定を助ける設備を組み込まれる。 “MICRO-OXYMAX”20は呼吸測定器は０〜１％二酸化炭素の範囲で作動する、非常に安定な単一ビームの非分散性赤外線二酸化炭素センサーを使用している。酸素センサーは電気化学的（燃料電池）であり、室空気中の酸素のパーセンテージを直接測定することができる。この装置は試料の水分含量が重要な場合には完全に適切なわけではない。この装置では室の回りの環境の温度を制御するための準備がなされていない。さらに各室内に使用されている基体の水分レベルを制御するための準備がなされていない。湿った飼鳥類飼料の場合は、実験が進み各室内の空気を採取するにつれ、特定のガス濃度の分析の前に乾燥カラム（図１中の系の左に示されているのがポンプである）により、空気から水分が除去される。時間中、各室内の空気を繰り返し採取している間、試料は脱水する傾向がある。この脱水はカビの通常の増殖の妨害をし、しばしば誤った結果を導く。発明の概要急速なカビ増殖を支える制御された一定の環境を維持する容器中に試料を置き；試料を一定の水分含量に維持し：試料上でカビ増殖を開始させ；そして試験片上のカビ増殖の測定値として容器中のO₂および／またはCO₂の変化を測定することによって試料上のカビ増殖を測定する。図面の簡単な説明図１はホースの接続を示している“MICRO-OXYMAX”の正面図である。図２および３は本発明で使用される“MICRO-OXYMAX”20装置を示している。図２は微生物学的培養器および拡張モジュールを示している。図３は培養器の内側およびチューブの接続を示している。発明の詳述本発明はカビ増殖の測定においてこれまで直面している前記問題を克服する方法および装置である。この方法は、ａ．試料上でカビの急速な増殖を支える所定の固定された水分含量を有しているカビの胞子を含む有機物質の試料を密閉容器中に置き；ｂ．前記容器中の環境を、急速なカビの増殖を支える暗く実質的に一定温度および相対湿度に維持し；ｃ．試料の一部の水分含量を変化させる、前記容器中の水蒸気の凝縮を回避し；ｄ．前記容器中において、カビの増殖を妨げる酸素および／または二酸化炭素の濃度における著しい変化を回避し；ｅ．前記容器から空気を定期的に回収し、前記空気中の少なくとも一つの代謝ガスの濃度を測定し；ｆ．前記容器中の前記代謝ガスの濃度変化を継続的な測定により決定し；そしてｇ．前記代謝ガスの濃度変化をカビ増殖の変化と相関させることからなる。場合により、試料は１種またはそれ以上の特定のカビおよび／またはカビ抑制剤と一緒に接種する。本発明の装置はさらに十分この後で説明されるが、カビ増殖を測定するこの方法を達成するための手段からなる。本発明の好ましい実施態様では、基本的な“MICRO-OXYMAX”系の能力を有する呼吸測定器を使用し、本発明の工程および制御を達成するために改良されている。図１に示すように、製造会社から調達した基本的な系は、適切なソフトウエアーを用いた駆動コンピューター11、二酸化炭素センサー12、酸素センサー13、システムポンプ14および二つの拡張モジュール15からなる。試料室または容器16は拡張モジュールに接続されており、このモジュールは多くの試料室に収容することができる。詳細は、米国特許第4,947,388号にあるが、ここではその全部を組み込んでいる。本発明の装置では“MICRO-OXYMAX”は図２および３に示したように改良されている。強制空気微生物培養器17を加え、この中で試料容器16を試験期間中保持する。培養器は、試料容器16を拡張モジュールに接続する、試料容器あたり二つのチューブを有する。図３に見られるように、これらのチューブ18の一セットが拡張モジュールから個々の加湿室19へ導かれており、チューブ23によって試料室（または容器）に接続されており、これは順番に試料チューブ20によって拡張モジュール22に接続されており、これを通じてO₂および／またはCO₂測定のための空気試料は取り出される。従って、飼鳥類飼料のような試料を含む室はライン中で試料室と拡張モジュール間にある加湿器に接続されている。加湿器は試料が脱水するのを回避し、これは試料に向かうガスを飽和近くまで湿らせる。各加湿器は、バーミキュライトおよび脱イオン水または比較的滅菌され脱イオンされた加湿剤を含む。すべての室および加湿器はチューブを除いて、気密シールされている。試料容器は高められた棚21すなわち格子上に置かれ、各容器のまわりの空気を自由に循環させるので、これにより試料容器の回りは一定の均一な温度に維持される。培養器は強制空気培養器中および試料室中の実質的に一定の温度をモニターするのに使用する温度探針を含む。密閉された微生物培養器は幾つかの重要な機能を持っている：（１）カビ増殖試験している間の温度の正確な制御、（２）水の蒸発および次に試料中に局部的に高い水分レベルの蓄積を生じる試料室中のそれらの凝縮を避けること、および（３）光の影響の最小化、光はできるだけ避けるべきであるが、これは光が試験される試料と共に、含まれうる基体（試料）の栄養分およびすべての抗菌剤を光分解させるかもしれないからである。加湿器は試料および各試料室内の空気の湿気を比較的一定に維持する。多くの加湿系を使用しうるが、この代表的なものは園芸用のバーミキュライト（W.R.Gr ace & Co.製）および脱イオン水である。水は湿ったバーミキュライト中に微生物の増殖を妨げる化合物、例えば第四アンモニウム化合物を含むことができる。操作では特定のガスのために採取された空気をすべてまず最初に無水硫酸カルシウム（８メッシュ、W.A.Hammond Drierite Co.製）のような乾燥剤を通過させて乾燥させる。採取を繰り返すと増殖速度試験中に試料の脱水が起こる。加湿器は、試験全体の継続時間中、各試料室中の基体のすぐ上の空気中の相対湿度を実質的に高度に一定に維持することによって、カビの制限されない増殖を保証しながら、この脱水の進行を効果的に回避する。本発明は、カビの増殖を支える任意の物質または形状の試料、例えば食物、一般的な有機物などの上の、カビの増殖、特定のカビまたはカビの混合物のいずれかを測定するための幅広い適用性を有している。本発明は穀粒、脂肪種子、堅果およびサイレージ上でもカビの増殖を測定するのに特に有用である。試料はその自然な状態で試験されうる、すなわちそれは一つまたはそれ以上の特定のカビの胞子と共に接種される。またカビ抑制剤を一般にまたは特別にカビに対するその効果を測定するために接種することができる。本発明の方法および装置は飼鳥類飼料上のカビ増殖試験に優れた適用性があるので、飼鳥類飼料に関して詳しく記述されるが、原理はカビ増殖を支える物質に広く適用される。試料、この場合、各試料容器中の飼鳥類飼料の量は重要である。飼料が多すぎると、カビ増殖が、生成された二酸化炭素および消費された酸素のレベルが呼吸測定器で正確に測定できないほど高くなるという結果となる。実際には、各250m l培養フラスコ中10〜50gの飼料が適切であることがわかっている。もちろん、他の装置、特定のカビおよび試験試料については他の量が適切となる。適切な量の範囲は単純な実験により容易に決定することができる。粒径もまた重要である。一般に試験基体の均一な粒径が好ましく、これは均一な方が代謝ガス（これはカビの増殖に対応している）における変化が多くの試料室の間で、不均一な粒径で得られるよりもより一貫しているからである。同じ効果は粒子が比較的小さい場合も生じる。従って、粉にした飼料粒子では粉にしていない飼料よりもより均一な結果が得られる、特に、試料室中に使用される飼料を1.0mmの孔径のふるいを通過させてすりつぶした場合、最適な結果が得られることがわかった。もちろん、小さい粒子は試験される飼料中のすべての栄養分へカビの接近を容易にするので、自由なカビの増殖が保証される。特定のカビおよび／またはカビ遅延剤を評価する場合は、接種する前に試料を滅菌することが重要である。もちろん、その自然な状態での試料のカビ増殖が測定される場合、滅菌は必要ない。試験前に試料を微粉状にする場合、粒子が小さくなった後滅菌を行うべきである。滅菌の主な理由は接種する前に飼料中の生存能力のあるすべての生物体を除去することである。予備実験はすべての好気性微生物の増殖は酸素消費および二酸化炭素の生成における変化に寄与していることを示している。微生物（すなわち、バクテリアおよびカビ）の混合された個体群が飼料中に存在する場合、およびカビ阻害剤が特別にカビの個体群を抑制する場合、その場合はカビという競合者が除去されるのでバクテリアは急速に増殖すると考えられる。競合する微生物（すなわちカビ）がない場合のバクテリアの増殖は、実際にカビの個体群が全体的に抑制された時、抑制が起こらなかったことを示す特定ガス濃度における変化という結果になると考えられる。さらに二つまたはそれ以上のカビの種類が飼料中に同時に存在する場合、与えられたカビ抑制剤は一方と比較してもう一方に対してより効くかもしれない。特定ガス濃度の測定に基づいて、その種がカビ抑制剤によって影響されない種から阻害されていると識別することはできない。飼料の水分レベルも自然のままの基体におけるカビ増殖の決定子である。飼鳥類飼料は通常11.5〜13.5％の水分含量である。この水分レベルでは、一般に飼料は貯蔵中にカビ増殖を支持しないと認められている。最近の情報はカビ増殖は約 14.0％の水分レベルで起こることができると示している。しかしながら、この水分レベルでは、水分の有効性が低いためカビ増殖は制限され、非常にゆっくり進行する。水分の「閾値」を超えたときに飼料中の急速なカビ増殖の開始が起こる。飼料中のこの相対的に高い水分レベルは幾つかの状況の結果として起こりうる。（１）高水分の成分から製造された飼料はカビ増殖を支持するのに十分な水分含量を有することができる。（２）ペレットにするのに使用された水分が貯蔵前に飼料から適切に除去されていないまま製造された飼料は、急速にカビ増殖させるのに十分な水分も含む可能性がある。（３）飼料中の高水分レベルは「水分移動（moisture migration）」として知られる現象から生じることが知られている。水分移動は、周囲の温度が高い場合（例えば日中時間）の、飼料貯蔵容器内の水の蒸発である。周囲温度が下がった場合（例えば暗くなっている時間）、先に蒸発した水の蒸気は凝縮し、水滴が飼料貯蔵容器中の局部的な領域に蓄積される。これらの高水分含量の領域は、通常飼料容器の周辺に沿っておよび貯蔵された飼料の上部表面付近にある。これらの特定部位における水分レベルは通常15％より上、20％またはそれより上のレベルに達することもある。これらの「微小環境」ではカビ増殖およびマイコトキシン形成は最も速い速度で進行する。これは、本発明の実施にあたっては排除しなければならない試料室中の水蒸気凝縮の主な源である。実施例の方法により、上述の呼吸測定装置を用いて13.06％の低い水分レベルでAspergillus parasitiusと共に接種した飼鳥類飼料上のカビ増殖を検出することができ、顕著に高い水分レベルではカビ増殖速度は加速されることを示した。水分レベルが高いほど、カビ増殖の抑制のために飼料に添加された任意の物質に対する要求はより高くなる。この実験では、カビ抑制剤としてナタマイシンの評価をするのに、少なくとも17.0％の開始水分含量を選んだ。この水分レベルでのカビ増殖の抑制におけるナタマイシンの成功は、低い水分レベルでもそしてひょっとしたらより高い水分レベルでさえ抑制が起こっていることを示している。培養の長さもまた重要な因子である。飼鳥類産業では飼料製造から鶏による消費までの時間の経過は約７〜14日である。飼料の貯蔵が長ければ長いほど、カビ増殖およびマイコトキシン形成を含む飼料の微生物分解の可能性が大きくなる。ナタマイシンを用いたすべての実験では、全培養時間は14日を使用した。基本的にカビ増殖試験では、長い十分な培養時間によって意義のある評価が得られるということは重要である。もう一つの重要な因子は接種レベルである。比較的低い濃度の胞子を用いた基体（例えば飼料の試料）の接種は培地の長めの「遅滞期」を生じることが知られている。カビの増殖も高レベルの接種と比べると少ないかもしれない。ナタマイシンの接種レベル（例えば、胞子の数／飼料のｇ）に関しては、5000胞子／ｇ程度の胞子数が適切であることがわかった。このレベルの接種物は14日の培養期間にわたって最大のカビ増殖が保証されている。前述のように、“MICRO-OXYMAX”装置は定期的に試料室からの空気を取り込み酸素および／または二酸化炭素（代謝ガス）の濃度を測定するよう設定することができる。各室中の特定ガス濃度を測定する時間の間隔も重要である。採取間隔が短すぎると、各室内ではっきりと感知できる変化が起こらないかもしれない。採取間隔が長すぎると、特定ガス濃度の変化は各ガスの濃度を正確に測定する呼吸測定器の能力を超えるに違いない。特定の試料およびカビについての適切な時間間隔は実験によって容易に決定することができる。例えば、4.0時間の採取間隔が、20. 0飼料のｇ／室を使用する場合に適切であると決定された。比較的大きな数の間隔／日（約６）のため、この採取間隔では各室中のカビ増殖の初期の開始についての情報が４時間以内の正確さで得られる。一つまたはそれ以上の代謝ガスの個々の採取によって上記の試料以来の濃度変化、濃度増分（delta concentration）が示される。この変化は対照標準試料のような基準と比較してカビ増殖の速度が経験的に関連付けられる。長期間にわたる一連の採取によって少ない測定値しかないものよりより信頼できる増分（delt a）およびカビ増殖、測定値が得られる。また、試料の数が大きいと、実際の使用状況に応じて選ばれた時間、例えば貯蔵時間における平均増殖が得られる。本発明の呼吸測定装置の独特な特徴の一つは、各室内の空気を周囲の空気で「リフレッシュする」または交換する能力である。各室内の空気は培養時間に応じて酸素レベルが徐々に減少し、二酸化炭素レベルが徐々に増加するので、室のリフレッシュは必須である。酸素が減少し、二酸化炭素が増加するにつれて、カビは必須ガス（酸素）が不足となり、毒性ガス（二酸化炭素）が蓄積するので抑制される。定期的に空気を新しくすることは実験のすべての段階でカビを同じレベルの酸素に接触させることになる。さらに、二酸化炭素濃度は実験の終わり近くでは、培養の初期の相の間にあるよりもより毒性が少ない。従って、カビはこの時間中ずっと最適な速度で増殖すると考えられる。いずれか一つの室が室内で初期ガス濃度から酸素または二酸化炭素の濃度のいずれかが0.08％の変化をしたことを検出した時に、すべての室で室のリフレッシュが自動的に起こるようプログラムした場合、飼鳥類飼料上のナタマイシンの増殖速度の試験において優れた結果が得られる。これらの方法の工程では、本発明の装置は、ａ．少なくとも一つの密閉可能な試料容器；ｂ．試験期間中、容器の内側を実質的に一定の選ばれた温度および相対湿度で暗い環境に前記試料容器を維持するための手段；ｃ．測定している間、前記容器中で水の凝縮を回避するための手段；ｄ．試験中に密閉されて前記容器内での代謝ガスの変化が限定されている場合、前記容器中の空気を新たにするための手段；ｅ．試験中に密閉されている場合、前記容器から定期的に試料中の空気を回収する手段；ｆ．前記空気の試料中の少なくとも一つの代謝ガスの濃度を測定するための手段からなる。以下の実施例では、本発明の好ましい装置は上記のように改良された“MICRO- OXYMAX”装置からなる。実施例１本実施例は、ナタマイシンカビ増殖遅延剤で処理された飼鳥類飼料上のアフラトキシンを生成するAspergillus parasiticusの増殖の測定を示している。薬物（表１）を全く含まない市販のブロイラー用の最初の飼料（starter rati on）の一定量が市販飼鳥類飼料ミルから得られた。この飼料を実験室の粉砕機で約１mm³の粒径に細かく粉砕した。次いで飼料を滅菌した（121℃で15分）。試料を135℃の強制通風炉中で２時間乾燥して水分含量を測定した（AOAC法、930.15 ）。1.0kgの飼料に十分な量の滅菌脱イオン水を加え、17.0％の理論水分含量が得られるよう完全に混合した。それから実際の最終的な水分含量を測定した（AO AC法930.15）。湿らせた飼料の五つの200gアリコートをそれぞれ2800ml Fernbac hフラスコに移した。カビの熟成した傾斜培養物に滅菌希釈液（水中の0.005％“Triton”X-100）9. 0mlを添加してAspergillus parasiticus、NRRL 2999の胞子懸濁液を調製した。傾斜表面を滅菌された微生物ループで穏やかにこすり、菌糸から胞子が離れるのを促進する。標準的な希釈および培養培地としてSaboraudsブドウ糖寒天を使用する混釈平板方法論（pour-plate methodology）によって、懸濁液中の生存能力のある胞子の濃度を測定した。適切な体積の懸濁液を各飼料のアリコートに５〜８×103胞子／ｇとなるよう添加した。完全に混合した後、秤量したナタマイシンプレミックスを各200グラムのアリコートに０（対照標準）、５、10、15および20ナタマイシンのｇ／飼料のトンの濃度となるよう添加した。飼料を再び混合し、処理した飼料のそれぞれ20ｇの試料を、呼吸測定器中の培養のための室として働く250mlの広口エルレンマイヤーフラスコ中に置いた。四つ反復試験フラスコを各レベルのナタマイシン用に調製した。すべてのフラスコをゴム栓で密閉し、30℃で48時間、予備培養した。この最初の予備培養期間の後、すべてのフラスコを30℃で微生物培養器中に置き、呼吸測定器（“MICRO-OXYMAX”20、ColumbusInstruments社製）に接続した。実験の間を通じて安定した飼料の水分含量が保証されるよう各フラスコの室に加湿器を取り付けた。酸素消費および二酸化炭素生成の測定を288時間（12日）の間、４時間毎に測定した。すべてのデータは累積酸素消費および累積二酸化炭素生成として計算された。水分の効用は多分、特定の基体上のカビ増殖に関する最も重要な因子である。使用される飼料の初期水分含量は17.00％であると測定された。この水分レベルが、適切な基体の存在下での A.parasiticusの増殖用の最適な温度（30℃）と組み合わせられ、豊富なカビの増殖が保証される。すべての培地を呼吸測定法を開始する前に約２日培養した。したがって、初期の呼吸測定の測定値（接種後146時間）はカビ増殖開始後の培地の状態を反映している。接種後146時間では、対照標準と５ｇ／トン培地間の累積二酸化炭素生成に大きな差はない。しかしながら、二酸化炭素生成の著しく低いレベルが、対照標準培地と10ｇ／トン、15ｇ／トンおよび20ｇ／トンの培地との間で注目された。これは培地の６日の「予備培養」の間に示されたナタマイシンの抗カビ活性の影響である。接種後163.5時間では、対照標準培地と四つのレベルのすべてのナタマイシンを含む培地との間で著しい相違が観察された。この相違は実施例の残りを通じて著しいまま続いた。同じ間隔での酸素消費に関して、接種後146時間でいずれの処理の間にも著しい違いは見られなかった。接種後163.5時間では対照標準培地とナタマイシンを含むすべての培地の間で酸素消費量において著しい相違があった。すべてのナタマイシン培地では接種後238.5時間の間ずっと対照標準培地と比較して著しく低い酸素消費レベルを示した。この実施例の残りの間では、対照標準と５ｇ／トン培地ではあまり違わなかった。しかしながら、ナタマイシンの10、15および20ｇ／トン濃度では対照標準培地と比較して著しく酸素消費が減少した。 Aspergillus parasiticusを接種した、湿った飼鳥類飼料培地において累積一酸化炭素生成および累積酸素消費が著しく低いという結果に基づいて、ナタマイシンは毒素を生じるカビの増殖を遅らせると結論できる。さらに、このカビ遅延活性は接種後146時間程度で明白である。さらに二酸化炭素生成のデータは、５ｇ／トンまたはそれ以上のナタマイシンは16日間カビ増殖を著しく遅延させるのに十分であることを示している。酸素消費量のデータは、同じ長さの期間このカビの増殖を著しく低下させるには10ｇ／トン以上のナタマイシンが必要であることを示している。実施例２本実施例は以下：（１）飼料の初期水分含量は17.38％であった、（２）初期接種は5000胞子／ｇであった、および（３）培養期間は約24時間に減らした：を除いて実施例１と同じやり方で行った。他の実験条件はすべて実施例１と同じであった。また、湿った飼鳥類飼料をA.parasiticusで接種してから呼吸測定を開始するまでの期間は実施例２では実施例１よりも少ない。従って、累積二酸化炭素生成の初期測定値は種々の処理間で大きく異なる。ナタマイシンのカビ遅延活性は最初に接種後98.5時間で明らかである。このとき、ナタマイシンで処理されたすべての培地は対照標準培地と比較して著しく低い二酸化炭素生成レベルを示した。ナタマイシンのこの効果は接種後313時間を通じて持続した。接種後340.5 時間で、ナタマイシン濃度15および20ｇ／トンを含む培地のみが対照標準培地と著しく異なっていた。同様の結果が累積酸素消費の測定値から得られた。接種後46.5および72時間の両方で種々の処理間に著しい違いは見られなかった。しかしながら、接種後98.5 時間ではすべてのナタマイシン培地での酸素消費量は対照標準培地のものより著しく低かった。これらの相違は接種後291時間を通して持続した。接種後313および340.5時間では、10ｇ／トン以上含む培地は対照標準培地よりも著しく低いレベルの酸素を消費した。 A.parasiticusを接種された、湿った飼鳥類飼料中の累積二酸化炭素生成および累積酸素消費に基づいて、再び、ナタマイシンはこの毒素を生じるカビの増殖を遅延すると結論づけることができる。カビ増殖の遅延は、本実験では接種後98 .5時間あたりで明白である。呼吸測定の最初の３日間で二酸化炭素生成または酸素消費のいずれかにおけるナタマイシンの著しい効果に注目するという失敗は、カビの胞子の水和、続く胞子の発芽および菌糸の増殖に必要な時間の影響によるもので、もっともありがちである。これらの最初の相の間では、最初の３日間に二酸化炭素生成と酸素消費に反映されるように胞子は呼吸する；しかしながら、最初の３日後までは菌糸の著しい増殖は起こらない。この菌糸の増殖が起こるまでは、ナタマイシンはそのカビ遅延活性を働かせない。これはナタマイシンの作用の知られている機構によるものである：ナタマイシンは菌糸の細胞壁のステロールとの相互作用により菌糸の増殖を妨げる。二酸化炭素生成に基づいて、１４日間のカビ増殖を著しく低下させるにはナタマイシン15ｇ／トンまたはそれ以上が必要である。酸素消費に基付くと、同じ期間カビ増殖を遅らせるにはナタマイシン10ｇ／トンが必要である。実施例１と２の比較では、湿った飼鳥類飼料中のA.parasiticusの増殖が５〜1 5ｇ／トンのナタマイシン濃度によって遅延されることを示している。両実施例では、10ｇ／トンで累積酸素消費量の著しい低下が生じた。二酸化炭素生成に基づくと、カビ増殖を遅延させるのに必要な最小のナタマイシン濃度は実施例１では５ｇ／トンであり、実施例２では15ｇ／トンであった。湿った飼鳥類飼料のカビ増殖を著しく低減するには10ｇ／トンの濃度が適当であると結論付けられる。実施例はカビ遅延剤の効果を主に取り扱っているが、自然なままのカビ増殖の測定は、パンおよび他の食物、革、並びに湿ったセルロースでできた物質を含む有機基体上で同じやり方で行われる。ナイスタチン、プロピオン酸およびその塩を含む他のカビ遅延剤を使用するカビ増殖測定も同様に行うことができる。また Fusarium spsまたはPennicillum spsを含む他のカビの増殖用の未処理およびカビ遅延剤処理された有機基体上でも同じやり方で測定が行われる。実施例３近年では、Fusarium moniliformeは食糧汚染に関して重要になった。過去20年にわたって飼鳥類飼料の調査の中で、F.moniliformeは飼鳥類飼料において発見された最も有力な種である。F.moniliformeは毒素の群を生成することがわかっており、まとめてフモニシン（fumonisins）として参照される。フモニシンは発癌性の可能性を含む幅広い毒性を有している。F.moniliformeの発生が広く、その代謝産物が毒性でありおよび飼鳥類におけるこれらの代謝産物が疾患を引き起こす可能性があるため、この特定のカビはカビ遅延活性できるナタマイシンのこの評価に含まれることになった。薬物（表１）を全く含まない市販のブロイラー用の最初の飼料の一定量が、市販飼鳥類飼料ミルから得られた。この飼料を実験室の粉砕機で約１mm³の粒径に細かく粉砕した。次いで飼料を滅菌した（121℃で15分）。試料を135℃の強制通風炉中で２時間乾燥して水分含量を測定した（AOAC法、930.15）。1.0kgの飼料に十分な量の滅菌脱イオン水を加え、17.0％の理論水分含量が得られるよう完全に混合した。それから実際の最終的な水分含量を測定した（AOAC法930.15）。湿らせた飼料の五つの200ｇアリコートをそれぞれ2800ml Fernbachフラスコに移した。カビの熟成した傾斜培養物に滅菌希釈液（水中の0.005％“Triton”X-100）9. 0mlを添加してFusarium moniliforme、 NRRL5806の胞子懸濁液を調製した。傾斜表面を滅菌された微生物ループで穏やかにこすり、菌糸から胞子が離れるのを促進する。標準的な希釈度および培養培地としてSaboraudsブドウ糖寒天を使用する混釈平板方法論（pour-plate methodology）によって、懸濁液中の生存能力のある胞子の濃度を測定した。適切な体積の懸濁液を各飼料のアリコートに5.0×1 0³胞子／ｇとなるよう添加した。完全に混合した後、秤量したナタマイシンプレミックスを各200グラムのアリコートに０（対照標準）、５、10、15および20ナタマイシンのｇ／飼料のトンの濃度となるよう添加した。飼料を再び混合し、処理した飼料のそれぞれ20ｇの試料を、呼吸測定器中の培養のための室として働く 250mlの広口エルレンマイヤーフラスコ中に置いた。四つの反復試験フラスコを各レベルのナタマイシン用に調製した。すべてのフラスコをゴム栓で密閉し、30℃で40時間、予備培養した。この最初の予備培養期間の後、すべてのフラスコを30℃で微生物培養器中に置き、呼吸測定器（“MICRO-OXYMAX”20、ColumbusInstruments社製）に接続した。実験の間を通じて安定した飼料の水分含量が保証されるよう各フラスコ（室）に加湿器を取り付けた。酸素消費および二酸化炭素生成の測定を364時間（15日）の間、４時間毎に測定した。すべてのデータは累積酸素消費および累積二酸化炭素生成として計算された。水分の効用は多分、特定の基体上のカビ増殖に関する最も重要な因子である。本実験で使用される飼料の初期水分含量は17.70％であると測定された。基体でのF.moniliformeの増殖に適した温度（30℃）と組み合わせられたこの水分レベルにより豊富なカビの増殖が保証される。接種後46および71.5時間では、いずれの培地間でも累積二酸化炭素生成に大きな差はない。接種後93時間では、ナタマイシンを含むすべての培地は対照標準培地よりも著しく低い二酸化炭素レベルを生成した。この関係は接種後314時間を通じて持続された。同じ間隔での酸素消費に関して、接種後46および71.5時間でのいずれでも著しい違いは見られなかった。しかしながら、接種後93時間では、10ｇ／トンまたはそれ以上の濃度のナタマイシンを含む培地では対照標準培地よりも著しく低いレベルの酸素が消費された。接種後117.5時間ではすべてのナタマイシン培地で対照標準培地と著しく異なった。この関係は接種後286.5時間を通して持続した。 F.moniliformeを接種した、湿った飼鳥類飼料培地において累積二酸化炭素生成および累積酸素消費が著しく低いという結果に基づいて、ナタマイシンは毒素を生じるカビの増殖を遅らせると結論できる。さらに、このカビ遅延活性は接種後93時間程度で明白である。さらに二酸化炭素生成のデータは、５ｇ／トンまたはそれ以上のナタマイシンでこの種のFusariumの増殖を著しく遅延させるのに十分であることを示している。実施例４ブロイラーチキン飼料中Pennicillium rubrum NRLL 3290による酸素消費および二酸化炭素生成におけるナタマイシンの効果を、本発明によるカビ増殖の速度測定のこの実施例によって示す。 Pennicillium rubrumは例えばトウモロコシ、小麦のような食糧および完全な飼料における一般的な汚染物質として知られている。P.rubrumによって生成される主な毒物はrubratoxin Ｂである。rubratoxin Ｂは飼鳥類に致命的な出血性症候群を引き起こすことが知られており、これは内臓器官の鬱血により特徴付けられる。鶏におけるrubratoxinのためのLD50は4.0mg／kgと確立されている。P.r ubrumが飼鳥類飼育産業で使用されている食糧を汚染する高い可能性がありそしてrubratoxinの形成から中毒症が生じる可能性があるので、P.rubrumが、湿った飼鳥類飼料におけるナタマイシンのカビ遅延活性を査定するためのこの評価に含まれることになった。薬物（表１）を全く含まない市販のブロイラー用の最初の飼料の一定量を使用した。この飼料を実験室の粉砕機で約１mm³の粒径に細かく粉砕した。次いで飼料を滅菌した（121℃で15分）。試料を135℃の強制通風炉中で２時間乾燥して水分含量を測定した（AOAC法、930.15）。1.0kgの飼料に十分な量の滅菌脱イオン水を加え、17.0％の理論水分含量が得られるよう完全に混合した。それから実際の最終的な水分含量を測定した（AOAC法930.15）。湿らせた飼料の五つの200ｇアリコートをそれぞれ2800ml Fernbachフラスコに移した。カビの熟成した傾斜培養物に滅菌希釈液（水中の0.005％“Triton”X-100）9. 0mlを添加してPennicillium rubrum NRRL 3209の胞子懸濁液を調製した。傾斜表面を滅菌された微生物ループで穏やかにこすり、菌糸から胞子が離れるのを促進する。標準的な希釈度および培養培地としてSaboraudsブドウ糖寒天を使用する混釈平板方法論（pou r-plate methodology）によって、懸濁液中の生存能力のある胞子の濃度を測定した。適切な体積の懸濁液を各飼料のアリコートに５×103胞子／ｇとなるよう添加した。完全に混合した後、秤量したナタマイシンプレミックスを各200グラムのアリコートに０（対照標準）、５、10、15および20ナタマイシンのｇ／飼料のトンの濃度となるよう添加した。飼料を再び混合し、処理した飼料のそれぞれ 20ｇの試料を、呼吸測定器中の培養のための室として働く250mlの広口エルレンマイヤーフラスコ中に置いた。四つの反復試験フラスコを各レベルのナタマイシン用に調製した。すべてのフラスコをゴム栓で密閉し、30℃で115時間、予備培養した。この最初の予備培養期間の後、すべてのフラスコを30℃で微生物培養器中に置き、呼吸測定器（“MICRO-OXYMAX”20、ColumbusInstruments社製）に接続した。実験の期間を通じて安定した飼料の水分含量が保証されるよう各フラスコの室に加湿器を取り付けた。酸素消費および二酸化炭素生成の測定を340時間（14日）の間、４時間毎に測定した。すべてのデータは累積酸素消費および累積二酸化炭素生成として計算された。水分の効用は多分、特定の基体上のカビ増殖に関する最も重要な因子である。本実験で使用される飼料の初期水分含量は17.20％であると測定された。基体上でPenicillium rubrumの増殖に適した温度（30℃）と組み合わせて、この水分レベルではこのカビの増殖は保証される。属としてのPenicilliumは他の毒を生ずる属、例えばAspergillusおよびFusariumと比較して、幾分高い水分レベルおよび水活性が必要であることが知られている。Aspergillusおよび Fusariumは約17％の水分レベルで急速な増殖を示すことができるが、この同じ水分レベルで、ほとんどのPenicillium種は等しい速度では増殖しない。この種のPenicilliumについては、すべての培地で接種後219時間まで、累積二酸化炭素生成における著しい相違はなかった。この後のすべての時間のインターバルでも累積二酸化炭素における著しい相違は見られなかった。累積二酸化炭素生成において一貫した著しい減少を示すということは、この特定のカビの低い増殖速度によるもので、飼料中のナタマイシンの存在は失敗であったかもしれない。例えば、Asupergillus parasiticusにより生成された二酸化炭素は全部で76.3 mlであるがこれと比較して同じ期間のP.rubrumによる全二酸化炭素はたった16.4 mlである。先に説明したように、Penicilliumの種は同じ水分レベルを含む同じ基体でAsupergillusおよびFusariumのものほど急速には増殖しない。この実験における二酸化炭素生成と酸素消費の相違は、ナタマイシンおよび類似の目的で使用される他の任意の化合物のカビ遅延活性の正確な評価のためにはこれらのガスの両方を同時に測定する必要性を指摘している。さらに、このような化合物の評価は異なる属及び種のカビ増殖に必要な最適な水分レベルにおける違いを考慮に入れなければならない。上記実施例は主に菌遅延の効力を取り扱っているが、自然なままのカビの増殖の測定はパンおよび他の食物、革、並びに湿ったセルロース物質などを含む有機基体上で同じやり方で行うことができる。ナスタチンなどを含む他のカビ遅延剤を用いたカビ増殖測定も同様に行われる。また、他のカビの増殖についても未処理のおよびカビ遅延剤で処理された有機基体上で同じやり方で行われる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＫ，ＵＡ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．（a）試料上のカビの急速な増殖を支える所定の固定された水分含量を有しているカビの胞子を含む有機物質の試料を密閉容器中に置き；（b）前記容器中の環境を、急速なカビの増殖を支える暗く実質的に一定の温度および相対湿度に維持し；（c）試料の一部の水分含量を変化させる、前記容器中の水蒸気の凝縮を回避し；（d）前記容器中において、カビの増殖を妨げる酸素および／または二酸化炭素の濃度における著しい変化を回避し：（e）前記容器から空気を定期的に回収し、前記空気中の少なくとも一つの代謝ガスの濃度を測定し；（f）前記容器中の前記代謝ガスの濃度変化を継続的な測定値により決定し；そして（g）前記代謝ガスの濃度変化をカビ増殖の速度と対応させることからなる有機物質上のカビ増殖の測定法。２．前記試料を前記室中に置く前に前記試料に少なくとも一つのカビを接種する請求項１の方法。３．前記試料を前記室中に置く前に前記試料をカビ遅延剤で処理する請求項１の方法。４．前記試料を前記室中に置く前に前記試料を滅菌して少なくとも一つのカビを接種し、カビ遅延剤で処理する請求項１の方法。５．前記カビ剤がナタマイシン、ナイスタチン、プロピオン酸およびその殺菌性の塩からなる群より選ばれる請求項３の方法。６．前記有機物質が穀粒、脂肪種子及び堅果からなる群より選ばれる請求項１の方法。７．前記有機物質が粉砕された飼鳥類の飼料である請求項１の方法。８．前記飼料を前記室中に置く前にナタマイシンで処理する請求項７の方法。９.a. 少なくとも一つの密閉可能な試料容器； b. 試験期間中、容器の内側を実質的に一定の選ばれた温度および相対湿度で暗い環境に前記試料容器を維持するための手段； c. 測定している間、前記容器中での水の凝縮を回避するための手段； d. 試験中に密閉されて前記容器内での代謝ガスの変化が限定されている場合、前記容器中の空気を新たにするための手段； e. 試験中に密閉されている場合、前記容器から定期的に空気の試料を回収する手段； f. 前記空気の試料中の少なくとも一つの代謝ガスの濃度を測定するための手段からなるカビ増殖の測定装置。