CN1048756C - 无定形培养基上霉菌生长的测量 - Google Patents
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Abstract
通过将样品放入一个可控的恒定环境条件的容器中，以有利于霉菌的快速生长，来测量样品上霉菌的生长；使该样品保持在恒定的湿度下；使霉菌在样品上开始生长，并通过测量该容器中的O2和/或CO2的变化，来测量样品上霉菌生长的变化。
Description
本发明涉及一种测量霉菌生长的方法和装置。
粮食、饲料的真菌霉素污染是影响谷物、饲料和畜牧业的一个普遍的问题。众所周知，至少300种不同的真菌素，能够污染谷物和油籽。这些食料的污染能够导致大量谷物的毁坏。此外，由真菌毒素污染对动物健康的威助是很明显的。由于真菌毒素对健康的潜在危害的警告不断增强，和对于真菌毒素存在的情况下，饲料测试方面的最新进展，由于这些复合物对谷物和饲料的污染，被认为是谷物和畜牧业所面临的主要问题之一。食料的真菌毒素污染是某些产生毒素的霉菌不可控的生长的结果。真菌毒素是高毒的新陈代谢的副产物，当这些霉菌生长时，它直接逸入周围环境中。随着时间的推移，引起真菌毒产生的霉菌可能变成无生命的。但是在大多数的情况下，由于其高度的化学稳定性，这样真菌毒素会保留下来。
为了降低在食料中的真菌毒素的污染，一个合乎逻辑的方法，是要降低霉菌的生长。为了在食料中降低霉菌生长，已经在谷物、饲料和畜牧业中，应用了很多的方法：(1)适当使用杀虫剂、肥料和灌溉技术，这样很大程度上在收获的谷物中减少了霉菌的生长和真菌毒素生成的概率；(2)通常较早地收获谷物，会使霉菌生长最少并且真菌毒素污染最少，因为霉菌在接近谷物生长周期的末期，才在收获的谷物中生成；(3)立即、快速和完全地干燥已收获的谷物、阻滞在收后谷物中霉菌的生长。然而，干燥步骤在收获之后必须尽快开始，并且谷物的最终湿度必须低至足以防止霉菌生长的程度；(4)在存储设备中存储谷物和已制作的饲料的该存储设备，是干燥的、不透水的并设有霉菌和结块的物质。这有利于防止在这些存储容器中，所储存的谷物或饲料中霉菌的生长和真菌毒素污染；(5)较快使用已制作的饲料，以便在饲料制作和饲料消费之间减少霉菌生长的机会；(6)使用化学防腐剂降低在谷物和饲料中霉菌的生长，以此减少在这些农作物中真菌毒素污染的相关性和重要性，很明显在农产品中，测量霉菌生长的精确方法，不可避免地需要一种场所，其培殖条件模拟接近实际的，或“现场的”条件。当研究化学防腐剂的效力时，这一点特别重要，一种化学制品被确认能阻滞饲料中霉菌的生长，必须有证据的支持，即在该化学制品使用时，比没有使用时在饲料中霉菌的生长较少。
遗憾的是，在一种无定形的培养基中，例如在家畜饲料中，精确测量霉菌的生长，比在饲料中测量其它细菌要困难得多。大多数细菌和酵母菌作为单个细胞再生，或作为包含单个细胞的积聚体而再生。然而，将一种适当的稀释剂和所要分析的样品相混合，会导致在稀释剂中细胞的悬浮。然后，稀释剂能够进一步被稀释并且可存活的细菌或酵母菌的数量(指示微生物生长程度的)，能够通过稀释剂涂复在适当的介质上并计算最终细菌群体的数目而确定。在大多数农作物采用这种方式时，霉菌不会再生或生长。霉菌生长的特征在于，最初要借助菌丝的形成。霉菌生长的这一早期阶段，单独用肉眼是看不到的。当霉菌连续的丝状网络。与这种物质相关的还有架空的菌丝的生成发展，这种菌丝用以保护在饲料颗粒表面以上的再生孢子。这种菌丝物质经常变成被分析的农作物单个颗粒的主要部分，因此，评定细菌或酵母菌生长所用的技术，不适于评定霉菌的生长。
或许，用于估价霉菌生长的最常规的方法是“霉菌孢子计数法”。上述这种技术是指“在农作物中的霉菌孢子越多，预期的霉菌生长越大”。霉菌孢子单个或作为积聚物生成，因此，能够采用对细菌和酵母菌计数相类似的方式进行计数。技术的简易和霉菌孢子浓度指示霉菌生长的“设想”是使用该技术评价饲料中霉菌生长的主要原因。使用霉菌孢子计数法，来评价霉菌生长的错误在于：这样一个事实，利用霉菌“生成孢子”和霉菌的“生长”可能是独立的生物过程：一个给定的霉菌可以在饲料中大量生长，但是生成孢子很少。在这种情况下，对霉菌孢子计数将导致这样一个结论，在培养基中产生的霉菌稀少。然而，相反的结论才是正确的。此外，已知霉菌生长稀少但是产生大量的孢了，在这种情况下，对霉菌孢子计数，也会得出错误的结论。
微生物学的一个基本概念，是微生物的生长(包括霉菌)能够间接地通过由于有机物生长的结果，使培养基消失或副产品的产生来测量。呼吸测量法很长时间以来，一直被用于在一密闭的装置中，通过测量氧的消耗，来测量微生物的生长。瓦勃格(Warburg)呼吸测量器，以前一直用于此目的，但是，因为几个限制条件而并不是总是满足要求的。(1)氧的消耗量是通过检测装置内部压力的微小变化来测量，而二氧化碳被吸收是利用在生长室中氢氧化钾的存在；(2)只能用瓦勃格Warburg呼吸测量器测量氧的消耗量(培养空的消失与微生物的生长有关)；(3)此外，因这氧的消耗量由装置内部压力的轻微变化来确定，所以要求保持极大的稳定的温度；(4)在很多情况下，主动生长的有机物会产生热量，使用瓦勃格呼吸测量器是不合适的；(5)因为瓦勃格呼吸测量器是一个真正的“密闭装置”，不能保证对被微生物消耗氧的再补充。因此，当在呼吸测量器内部空气中的氧消耗贫化时，需氧的有机物(即霉菌)由于二氧化碳浓度的增加，以及氧的浓度降低，可能不能在一种无限制的状态下维持最佳生长；(6)还有，瓦勃格呼吸测量器需要由人工操作读出在密封装置内部的压力变化，而频繁和周期性测量、通常是不实际的。
最近，一种独特的呼吸测量器(“MICRO-OXYMAX”20，哥伦布仪器公司，俄亥俄州、哥伦布)，已经开发出来，它能同时在一个“密封装置”中，测量氧的消耗和二氧化碳的生成(参阅美国专利US4947339及图1)。在高达20个腔室中的空气，经过高度灵敏的氧和二氧化碳传感器周期性地循环，然后再返回到腔室中。呼吸测量器测量在腔室中的气体深度相对于时间的变化，氧和二氧化碳浓度的变化，与腔室的体积以及各次测量之间持续时间有关，这就使之能够进行计算氧的消耗速率和二氧化碳生成速率。此外，氧的累积消耗量以及二氧化碳的累积生成量也就能够确定。这种累积测量反映了在培养基上霉菌的生长。速率测量能用于确定霉菌生长的速率。该特定呼吸测量器的一个很有用的特征是，能够按程序用房间的空气替换或“更新”每一个腔室中的空气。在长时间的实验过程中，氧和/或二氧化碳的浓度可能产生明显的变化，从开始的浓度变化到在腔室中有机物的生长速率可能受到不利影响的程度。在这种情况下，使用者选择配置呼吸测量器，以便周期“更新”每一个腔室中的空气。维持氧和二氧化碳的最佳水准，使之等于实验开始阶段具有的水准。
使用阀门、开关组合，各传感器重复按顺序地按使用者确定的间隔，连接到20个培育室中的每一个之上。具有特定设计软件的微机，用来控制整个系统，包括控制氧和二氧化碳浓度的测量，计算结果打印或将其存入软盘或硬盘。该系统正装有某些设备，以便于传感器检验和自动测量培育室体积和气压。
“MICRO-OXYMAX”20呼吸测量后器，采用一种非常稳定的单束的非色散的红外二氧化碳传感器，其工作范围可检测0-1％二氧化碳含量。氧传感器是电化学式的(燃料电池)，能够直接测量腔室中气体的氧百分含量。
这种装置对样品的湿度是很重要的场合，并不是完全可以胜任的。在这种装置中不能保证，对环境腔室的周围环境温度的控制。此外，不能保证每个腔室内部，使用的培养基湿度水准的控制。在湿润的家畜饲料的情况下，在实验进行的过程中，以及对每一个腔室内部气体取样时，对特定气体浓度进行分析之前，利用干燥柱管(在图1所示系统的左部表示的是一个抽气机)将水分从气体中排出。在对每一个腔室内部的气体，进行重复取样的过程中，势必使样品脱水。这种脱水干扰霉菌的正常生长，并经常导致得出错误的结论。
对在某一样品上的霉菌生长进行测量，是将样品放置在维持一种可控的恒定环境的，有助于霉菌快速生长的容器中，将样品维持在恒定的湿度下，促使样品霉菌的生长，通过测量该容器中氧和/或二氧化碳变化，来测量该样品上霉菌生长。
图1表示有软管连接的“MICRO-OXYMAX”20的前视图。
图2表示一个微生物培育器和扩展组件。
图3表示培育器的内侧以及管线的连接。
本发明涉及一个方法和装置，旨在克服在测量霉菌生长的过程中前此遇到的上述各种问题。本方法包括：
a将一个含有霉菌孢子的有机物质的样品放入一个密闭的容器中，该样品具有的予定的固定湿度，有利于霉菌在所述样品上迅速生长；
b将所述容器中的环境维持在暗的状态，以及在基本上恒定的温度和相对湿度下，使之有利于霉菌迅速生长；
c避免在所述容器中水蒸汽的凝结，凝结会改变在所述样品的任何部分的湿度；
d避免在所述容器中氧和/或二氧化碳浓度的明显变化，这种明显变化会阻碍霉菌的生长；
e周期性地从所述容器中抽出空气并测定在所述空气中的至少一种新陈代谢的气体浓度；
f从依次测定中，测定所述容器中所述新陈代谢的气体浓度变化，以及
g确定所述新陈代谢的气体浓度变化，与霉菌生长变化之间的相互关系。
可选择地，用一种或多种特定霉菌和/或霉菌抑制剂给样品接种。
下文将更完整介绍本发明的装置，包括实施测量霉菌生长的本方法的装置。
在本发明的最佳实施例中，使用具有基本的“MICRO-OXYMAX”系统能力和呼吸测量器，并予以调整以实现本发明的步骤和控制。如图1所示，从制造商购买的基本系统，包括采用适当软件的控制计算机11，二氧化碳传感器12，氧传感器13，系统抽风机14和两个扩展组件15，样品室或容器16，与各扩展组件相连接，该扩展组件能适应很多的样品室。更详细的情况，请参阅美国专利US4947388，在此该文件结合本文，作为一个整体一并给出供参考。
在本发明的装置中“MICRO-OXYMAX”被改进，如图2和图3中所示。附加一个强迫通风的微生物培养器17，在检测周期由样品容器16保持在该培养器中。培养器对每个样品容器都有两个管，以便将样品容器16连接到扩展组件上。
如图3所示，许多管18中的一套从扩展组件通向各个增湿器腔室19，并用管23连接到样品室(或容器)，该样品室又依次利用采样管20连接到扩展组件22，空气样品经采样管被采取，用于测量O2和/或CO2。因此，含有样品的各个室(容器)，例如家畜饲料样品，排成一行连到各个增湿器，而增湿器介于样品室和扩展组件之间。增湿器用于防止样品脱水，用以对气体增湿使样品近于饱和。每一个增湿器装有蛭石和去离导水，或类似的灭菌的去离子的增湿剂。所有的腔室和增湿器，除去管道以外都是密闭不透气的。样品容器放在升降的架21或格栅上，以便使空气能围绕每个容器自由循环。借此，环绕样品容器维持恒定的均匀的温度。细菌培养器包括一个温度探头，用以监视在强迫通风的细菌培养器中，亦即在样品室中的基本恒定的温度。
密闭的微生物细菌培养器，具有几个重要的功能：(1)在霉菌生长测试的过程中，精确地控制温度；(2)防止在样品室中的水蒸发，以及其后的凝结，这种凝结会导致在样品中，产生局部的高水准湿度，以及(3)减少光的影响，使其影响减到某一切实可行的程度，因为光能引起培养基(样品)的营养基和一些抗真菌剂的光降解，该抗真菌剂由于和要测量的样品在一起，而包含在培养基之中。
增湿器维持在每一个样品室内部的样品中和环境气体中的相对恒定湿度。可以使用许多种加湿系统，常用的类型是园艺类别的蛭石(W.R.Gracc & CO.Cambridge.MA)和去离子水。水可以含有一种防止在湿润的蛭石中，微生物生长的化合物，例如四价的铵化合物。在测量过程中，用于特定气体取样的所有空气，首先通过一种干燥剂，例如无水硫酸钙(8目W.A.Hammond Dvieritc CO，Xenia.OH)进行干燥。在生长速率测试的过程中，重复取样会引起样品的脱水。增湿器有效地防止这种脱水过程，在整个测量过程中，通过直接位于在每一个样品室中的培养基上方的气体环境中，保持高的基本上恒定的相对湿度，保证霉菌不受限制的生长。
本发明在测量霉菌的生长方面具有广泛的适用性，而所测量的霉菌，可在任何有利于霉菌生长的材料或任何形式的样品上，例如食物，一般的有机物，以及其它类似物，或者是一种特定的霉菌，或者是各种霉菌的混合物都可以。本发明特别适用于谷物、油籽、坚果甚至青饲料方面的霉菌生长测量。样品可以在其自然状态下测量，或者可以用一种或多种特定的霉菌孢子进行接种。还有可以包含一种霉菌抑制剂以便确定在一般情况下或特定情况下其抑制霉菌的效力。
由于本发胆的方法和装置在家畜饲料的霉菌生长测量方面，具有优异的适应性，尽管该原理广泛适用于各种有利于霉菌生长的材料，下文将详细介绍有关家畜饲料的测量。
在本案例中，在每一个样品容器中的家畜谷物饲料样品的数量是重要的。对利用呼吸测量器进行精确测量来说，过多的饲料将使得霉菌生长所产生的二氧化碳和所消耗的氧太多。在实践中，人们发现在每250毫升的培育烧瓶中，放入10-50克的饲料是适宜的。当然，对其它设备，某些霉菌和测量样品而言，另外的数量关系可能是适宜的。通过简单的实验，就很容易地确定数量范围。
颗粒的大小也是很重要的。在一般的情况下，要优选测量培养基，作到颗粒大小均匀，因为颗粒均匀会使在各重复的样品室中，新陈代谢气体(其与霉菌生长相关)所产生的变化，要比颗粒不均匀所得到的变化更加一致。当颗粒相对较小时，会产生相同的效果。因此，磨细的饲料颗粒要比未磨细的饲料，得到更均匀的效果。特别是人们发现，当在样品室中所使用的饲料磨细到能通过1.0毫米细孔尺寸的筛子时，所得到效果最佳。当然小的颗粒尺寸还易于使霉菌接近被测量饲料中的所有培养基，以此保证霉菌不受限制地生长。
当一种特定的霉菌和/或真菌阻滞剂要进行测定时，在接种之前将样品杀菌是很重要的。当然，假如要测定在样品的自然状态下霉菌生长，那么就不需要杀菌。假如样品在测量前要磨细，应在颗粒磨细后再进行杀菌。进行杀菌的主要作用是在接种之前，降低在饲料之中存活的所有有机物。最初的实验表明，所有需氧的微生物的生长都会促使氧的消耗以及二氧化碳生成方面产生变化。假如在饲料中存在混合的微生物族群(即细菌和霉菌)，并且假如一种霉菌抑制剂专门抑制霉菌族群，那么，由于霉菌这一竞争者受到限制，细菌将迅速生长。在设有竞争的微生物(即霉菌)的情况下，细菌的生长将导致某些特定气体浓度变化，它表明没有发生抑制作用，实际上霉菌族群可能全部被抑制了。此外，假如在饲料中同时存在两种或多种霉菌种属，某一特定的抑制剂可能对一种种属比对另外一种种属更有效。根据对特定气体浓度的测量，人们不可能将受到抑制的种属与不受霉菌抑制影响的种属鉴别出来。
饲料的湿度水准，对在自然培养基中的霉菌生长也是有决定作用的。家畜饲料一般湿度为11.5～13.5％。在这种湿度下，一般认为饲料在储存过程中不利于霉菌生长。最近的情报指出：湿度大约为14.0％时，能使霉菌生长。然而，在该湿度下由于水分的可利用性较低，霉菌生长受到限制，并且过程非常缓慢。当湿度的“阀值”被超过时，饲料中就会产生霉菌开始迅速生长的现象。由于几种情况作用的结果，在饲料中可能产生这样相对高的湿度。(1)由于高湿度的配料制作的饲料具有的湿度足以支持霉菌的生长；(2)在一个用于制粒的设备中，潮气没有从饲料中充分排出，在存储之前所制作的饲料也可能包含足够水分，使得霉菌迅速生长；(3)由于所谓的“水分转移”现象，人们都知道会产生在饲料中的高湿度水准。水分转移是在饲料存储容器内部水分蒸发的结果，发生在周围环境温度升高的时候(例如在日照时)。当环境温度降低时(即在黑暗时)，先前蒸发的水蒸汽凝结并且水滴积聚在饲料存储容器内部的局部区域内。这些具有高水分含量的区域，一般沿着饲料储藏室的外围，和靠近所存储饲料的上表面。在这些特定部位的湿度常常超过15.0％，并且能达到20％或其以上的水准。正是在这些微环境中，霉菌生长和真菌毒素的形成是以最快的速率发生的。这是在样品室中水蒸汽凝结最主要的来源，在实施本发明时必须加以避免。
作为实例，上述呼吸测量器设备能够探测在接种曲霉属寄生物的家畜饲料上，在湿度低至13.06％的条件下的霉菌生长，并显示在增加湿度的情况下，霉菌生成的速率加剧。较高的湿度对附加到饲料上的，以抑制霉菌生长的物质有较高的需求量。在我们的实验中，选择湿度最少17.0％用以鉴定和作为霉菌抑制剂使用的游霉素。在该湿度条件下、在抑制霉菌生长方面、游霉素所取得的成功将表明，抑制作用也可以在较低的湿度下发生，甚至在较高的湿度下也可能发生。
培育的时间长短也是一个重要因素。在家畜业中，从饲料制作到为鸡消耗所持续的时间大约7-14天。饲料储存越长，饲料的微生物破坏作用，包括霉菌生长和真菌毒素的形成概率就越大。在使用游霉素的所有实验中，所用总的培育时间为14天。在测量霉菌生长的过程中，足够长的培育时间，才能得到有意义的鉴定结果，这一点在实践中是很重要的。
另外一个重要因素是接种的水准，众所周知，使用相对较低浓度的孢子接种某一培养基(即饲料样品)，将导致相当长的培育的“停滞期”。霉菌的生长，也可能比高的接种水准的情况要少。对于游霉素，已经发现接种水准(例如每克饲料的孢子数)，孢子的数量低于5000孢子/克是适宜的。这种接种水准，保证在14天的培育期内，使霉菌得到最大限度的生长。
如上所述，“MICRO-OXYMAX”设备，能够进行调整，以便周期性地从样品室中抽取空气，并测定氧和/或二氧化碳(新陈代谢的气体)的浓度。
在测定每一个腔室中特定的气体浓度之间的时间间隔，也是很重要的。假如取样的时间间隔太短，在每一个腔室内部可能并没有发生明显的变化。假如取样的时间间隔太长，特定气体浓度的变化可能超过呼吸测量器对精确测量各种气体浓度的能力。对某一种特定的样品和霉菌的合适的时间间隔，通过实验可以容易地确定。例如，当每腔室使用20.0克饲料时，4小时的取样时间间隔，确认是合适的。由于每天有相对大的时间间隔(大约6)，这种取样间隔提供在每个腔室中，关于霉菌生长的初始阶段，精确到4小时内的情报。
一种或多种新陈代谢的气体的各次样，反映自上次取样以来的浓度变化，即浓度变化量。这种变化能够以实验方式，相对某一标准，例如一个检查标准用的样品，与霉菌生长的速率联系起来。在延长的时间阶段内的一系列取样，比仅进行少量的测量能提供更可靠的变化量，亦即霉菌生长的测量结果。较大量的采样能提供。相对于实际使用情况，例如存储时间所选择的时间阶段内，平均生长情况。
本发明的呼吸测量器装置的独特特征之一是，能利用周围环境空气“更新”或替换在一个腔室内部的气体。腔室气体的更新是不可缺少的，因为在每个腔室中，气体在培育时间内，可能经历氧含量逐渐降低，而二氧化碳含量逐渐增加的过程。当氧降低而二氧化碳增加时，由于缺少必不可少的气体(氧)的供应，和有害气体(二氧化碳)的积累，霉菌将受到抑制。周期性更新气体还使得霉菌在实验的所有阶段，得到相近的含氧量。再者，邻近实验结束时，二氧化碳浓度并不比在培育的初期阶段中更有害。因此，整个生长期间霉菌将以最佳速率生长。
当在所有腔室中的腔室空气更新，按程序自动进行时，在氧或二氧化碳的浓度变化偏离腔室内部初始气体浓度达0.08％，而检测任何一个腔室时，在测量家畜饲料的游离素的生长速率方面得到优异的结果。
从本方法的步骤看出，本发明的装置包括：
a至少一个密封的样品容器；
b一个装置，用以在测量期间将所述样品容器，保持在黑暗的环境中，在容器的内部保持所选择的基本上恒定的温度和相对湿度；
c用以在测量的过程中，在所说的容器中避免水蒸汽凝结的装置；
d用以更新在容器中的空气装置，当容器密封时在测量过程中用以限制容器内部的新陈代谢的气体变化；
e一个装置，当容器密封时在测量过程中，用以周期性地从所述样品室中抽出空气样品；以及
f一个装置，用以测量在所述空气样品中的至少一种新陈代谢的气体。
在如下实例中，包含“MICRO-OXYMAX”装置的本发明的最佳装置，按照上述所描述的要求作了改进。
实例1
本实例表示在用游离素真菌生长抑制剂，处理的家畜饲料上产生曲霉属寄生物的黄曲霉毒素的生长测量情况。
一种商业的不含任何药物的鸡用催肥食料(表1)，由商业家畜饲料厂得到。这种饲料在实验室研磨机上，仔细研磨直到颗粒大小接近1毫米3。然后，饲料被杀菌(121℃持续15分钟)。通过将样品在一个强制通风加热器中，在135℃下持续2小时进行干燥测定湿度(AOAC Method 930.15)。足量的无菌去离子水加到1.0千克的饲料中，并彻底混合以达到17.0％的理想湿度。最终的实际湿度，然后，进行测定(AOAC Method 930.15)。五个200克加湿饲料的等分试样，转移到五个2800毫升的费氏烧瓶(Fernbachflasks)的每一个之中。
表1。烤鸡用饲料的成分及计算分析，该饲料用作培养基，利用游霉素进行抑制真菌生长的研究
| 成 分 | ％ | 磅/吨 |
| 磨碎的黄色谷粒除壳的大豆粉粒(49.0％蛋白质)家畜脂肪家畜副产品细粒脱氟的磷酸盐石灰石维生素予制混合物1盐D.L蛋氨酸(98％)痕量无机混合物2计算的成分可新陈代谢的能量 卡路里/4克蛋白质， ％钙 ％磷， 总量％磷，可利用％蛋氨酸+胱氨酸％赖氨酸 ％钠 ％ | 57.3133.483.153.001.540.790.280.210.190.05 | 1146.2669.663.060.030.815.85.64.23.81.0310023.001.000.720.480.931.250.20 |
1、维生素予制混合物(每千克/饲料)提供：维生素A5500国际单位；维生素D31100国际单位；维生素E11国际单位；维生素B24.4毫克；泛酸钙12毫克；烟酸44毫克；氯化钽碱220毫克；维生素Bn6.6毫克；维生素B6，2.2毫克；维生素K1.1毫克(MSBC)；叶酸0.55毫克，D-维生素H0.11毫克；维生素B1，2.2毫克(一水合硫胺)；乙氧喹125毫克；硒0.3毫克(亚硒酸钠)。
2、痕量无机混合物提供(饲料的百万分数含量)锰60；锌50；铁30；铜5；碘1.5。
曲霉属寄生物的孢子悬浮物NRRL 2999的准备，是通过将9.0毫升的无菌稀释剂(0.005％“三硝基甲苯”X-100溶在水中)，加到霉菌的成熟斜面培养基上。斜面的表面用无菌微生物环状物轻度地刮，以利于孢子从菌丝中释出。在悬浮物中活性孢子的浓度，借助标准稀释剂和倾注一平板法，利用萨布罗式葡萄糖琼脂培养基作为覆层介质来测定。适当体积的悬浮物，加到饲料的等分试样上，以便得到每克5.8×103个孢子。接着进行彻底混合，经过称重的一定数量的游霉素予制混合物，加到每一个200克的等分试样中，以便得到0(实验对照物)，5、10和20克(游霉素/吨饲料)的浓度。饲料进行再混合、将每种20克已处理的样品，放入250毫升的宽嘴锥形烧瓶中(依氏烧瓶)，该烧瓶在呼吸测量中作为培养室。对每一种等级的游霉素准备4个同样的烧瓶。
用橡胶塞密封所有的烧瓶，在30℃下进行持续48小时的予培育。在此初始予培阶段之后，所有的烧瓶放在30℃下的微生物培育器中，并且连接到一个呼吸测量器(“MICRO-OXYMAX”20哥伦布仪器公司、俄亥俄州哥伦布)。每一个烧瓶装备一个增湿器，以保证在实验过程的始终稳定的饲料湿度。氧的消耗和二氧化碳生成的测量，确定为每4小时一次，持续288小时(12天)。累积氧的消耗和累积二氧化碳生成的所有数据进行计算。
水分的可利用性或许对在某一特定培养基上的霉菌生长，是最为关键的因素。确定所使用饲料的初始湿度，为17.00％。结合以最佳温度(30℃)，这种湿度水准对于在适当的培养基中A曲霉属寄生物的生长，保证了丰富的霉菌的生长。
在开始进行呼吸测量法测量之前，所有培养基培育大约都持续2天。因此，初期的呼吸测量(在接种以后146小时)，反映了霉菌生长开始之后的培育状态。
接种之后的146小时内，在实验对照物和5克/吨壤育物之间，在累积的二氧化碳生成量方面并没有明显的差别。然而，应该指出：在实验对照培育物和10克/吨，15克/吨以及20克/吨的培育物之间二氧化碳的生长明显处于较低的水准。这反映了在6天的培育物的“预增育”期间所表现的游霉素抗真菌的能力。接种后的163.5小时，在实验对照培育物和包含所有4种水准的游霉素之间所累积的二氧化碳生成量方面观察到有明显的差别，这种差别持续贯穿于本实例的剩余部分都是明显的。
要指出在接种后的146小时在任何不同的处理方法之间，在同样的时间间隔下关于氧的消耗并没有明显的差别。在接种后的163.5小时，在实验对照培育物和包含游离素的所有培育物之间，氧的消耗有明显的差别。在接种之后一直到238.5小时。相对于实验对照培育物，所有的游霉培育物，显出氧的消耗水准明显的低。对本实例的剩余部分，该实验对照物和5克/吨的培育物是明显不同的。然而，相对该实验对照培育物，10.15和20克/吨时的游霉素的浓度下氧的消耗明显减少。
根据在用曲霉属寄生物，接种的潮湿家畜饲料培育物中所累积二氧化碳生成量和累积氧的消耗量明显降低，就能断定游霉素抑制了这种有害霉菌的生长。进而，早在接种后的146小时这种抑制霉菌的能力就得到验证。此外，二氧化碳生成数据表明5克/吨或更多的游霉素，在16天的过程中对明显抑制霉菌生长来说是足够的。氧的消耗数据表明，在同样长的时间内，为了明显减少这种霉菌的生长，不小于10克/吨的游霉素的浓度是需要的。
实例2
本实例的进行与实例1相似，除去如下部分：(1)在饲料中的初始湿度为17.38％；(2)起始接种物为5000孢子/克；(3)接种时间减少到大约24小时。所有其它实验条件与实例1均相同。再有在用A(曲霉属)寄生物接种到潮湿的家畜饲料，与开始进行呼吸测量法的开始之间的时间间隔，在实例2中比实例1中要短。因而，累积的二氧化碳生成量的初始测量、在各种不同的处理方法之间没有明显的差别。在接种后的98.5小时游霉素的抑制霉菌的能力，首先得到验证。在这时，所有用游霉素处理的培育物与该实验对照培育物相比，二氧化碳生成量的水准呈现明显的降低。游霉素这种效力持续到接种后的313小时。接种后340.5小时，那时含有15和20克/吨浓度的游霉素的培育物，明显地不同于该实验对照培育物。
由测量累积的氧的消耗量，得到类似的结果。在接种后的46.5和72小时，要指出在各种不同的处理方法之间设有明显的差别。然而，在接种后的98.5小时，在所有的游霉素培育物中，累积氧的消耗量比该实验对照培育物中累积的氧的消耗量明显降低。这些差别持续到接种后的291小时。在接种后的313和2340.5小时处，包含10克/吨或更大浓度的培育物所有消耗的氧，比该实验对照培育物明显要低。
根据在利用A(曲霉属)寄生物接种的潮湿家畜饲料中，累积二氧化碳生成量和累积氧消耗量，能再次断定游霉素抑制了这种有害霉菌的生长。在本实验中，早在接种后的98.5小时，对霉菌生长抑制就得到验证。在呼吸测量的头3天的过程中，没有显出游霉素对二氧化碳生成量或氧的消耗量有明显影响，很可能反映了对霉菌孢子的水合、其后的孢子生长以及菌丝的发展各方面都需要时间。在该初始阶段，头3天通过二氧化碳的生成和氧的消耗，反映了孢子呼吸，然而，在3天以后，还没有明显的菌丝发展。一直到产生菌丝发展，游霉素才发挥抑制霉菌素的能力。这是由于已知的游霉素的作用机理：游霉素通过与丝菌细胞壁固醇相互作用，而干扰妨碍菌丝的生长。根据二氧化碳的生成量、在14天的过程中为了明显降低霉菌生长，需要15克/吨或更多的游霉素。根据氧的消耗量，在相同的时间内，为了抑制霉菌的生长，需要不少于10克/吨的游霉素。
比较实例1和实例2，表明在潮湿的家畜饲料中A(曲霉属)寄生物的生长，受到5-15克/吨浓度的游霉素的抑制。在两个实例中，10克/吨浓度导致累积氧的消耗量明显减少，为了抑制霉菌生长所需的最低游霉素浓度，根据二氧化碳的生成量，在实例1中为5克/吨，在实例2中为15克/吨。为了保证在潮湿的家畜饲料中，明显降低霉菌的生长生长可以判定10克/吨的浓度将是适宜的。
尽管这些实例基本上都是真菌抑制剂的效力，而对自然的霉菌生长的测量，都是以同样的方式，在各种有机的培养基上进行的，其中包括面包和其它食物。皮革和潮湿的纤维材料。利用其它的真菌抑制剂，包括制真菌丝、丙酸及其盐类，也以相似方式进行霉菌生长测量。还以同样的方式，在未经处理的和真菌抑制剂处理的有机培养基上进行测量，用于测量其它霉菌，包括新用菌属物种或青霉属物种。
实例3
近些年来，新月菌属(Fusarium)念珠菌(moriliforme)，由于污染食料而受到重视。在过去20年，对家畜饲料的调查研究，已经揭示F(新月菌属)念珠菌是在家畜饲料中所发现的最普遍的新月菌属的种属。已经发现F念珠菌产生一组总起来称为 费忙尼森(fumonisins)的毒素。该毒素具有范围很广的毒性，其中包括致癌的潜在危险。由于发生F(新月菌属)念珠菌的广泛传播，它的新陈代谢产生的毒性，以及在家畜中这种新陈代谢所引起的疾病的潜在危险，这种特殊的霉菌，已被包括在游霉素的可能抑制霉菌能力的鉴定之中。
一种商业的不含任何药物的鸡用催肥食料(表1)，由商业家畜饲料厂得到。这种饲料在实验室研磨机上，仔细研磨直到颗粒大小接近1立方毫米。然后，该饲料被进行杀菌(121℃持续15分钟)。通过将样品在一个强制通风加热器中，在135℃下持续2小时进行干燥，以测定其湿度(AOAC Method930.15)。是量的无菌去离子水加到1.0克的饲料中，并进行彻底的混合，以达到理想的17.0％的湿度。然后测定最终的实际湿度(AOAC Method 930.15)。5个200克的加湿饲料的等分试样，转移到5个2800毫升的费氏烧瓶中的每一个之中。
新月菌属念珠菌的孢子悬浮物NRRL 5806的准备，是通过将9.0毫升的无菌稀释剂(0.005％“三硝基甲苯”X-100溶在水中)，加到霉菌的成熟斜面培养基上。斜面的表面用一种无菌微生物环状物轻轻地刮于孢子从菌丝中释出。以悬浮物中活性孢子的浓度测定，是利用标准的稀释剂和倾注一平板法，利用萨布罗式(Sdborouds)葡萄糖琼脂培养基，作为覆层介质，将适当体积的悬浮物加到饲料的每一个等分彻底试样上，以便得到5.0×103孢子/克。跟着进行彻底的混合，经过称重的一定数量的游霉素予制混合物，加到每一个200克的等分试样中，以便得到O(实验对照物)、5、10、15和20(克游霉素/吨饲料)的浓度。饲料进行再混合，将20克每种已处理的饲料样品，放入250毫升的宽嘴锥形(依氏)烧瓶中，该烧瓶用作呼吸测量器的培育腔室。对每一个等级的游霉素准备4个同样的烧瓶。
所有的烧瓶用橡胶塞密封，并在30℃下持续40小时进行予培育。在此初始予培阶段之后，所有的烧瓶被放在30℃下的微生物培育器中，在并连接到一个呼吸测量器中(“MICRO-OXYMAX”20，哥伦布仪器公司，俄亥俄州哥伦布)。每一个烧瓶(腔室)装备一个增湿器，以保证在实验过程中，始终稳定的饲料湿度。氧的消耗量和二氧化碳生成量的测量，确定为每4小时一次，持续364小时(15天)。累积的氧的消耗量和累积的二氧化碳生成量的所有数据，要进行计算。
水分的可利用性或许对在某一特定培养基上的霉菌生长，是最关键的因素。在本实验中，使用饲料的初始湿度确定为17.70％。这种湿度水准结合某一适当温度(30℃)，对在该培养基上的下念珠菌的生长来说，能够保证霉菌丰富生长。
在接种后的46和71.5小时，在各种的培育物之间，累积的二氧化碳方面设有明显的差别。在接种后的93小时，所有包含游霉素的培育物，所产生的二氧化碳水准明显地低于实验对照培育物。这种相对关系一直持续到接种以后的314小时。
要指出：在相同的时间间隔下氧的消耗，在接种后的46或71.5小时，都没有明显的差别。然而，在接种后的93小时，包含10克/吨或以上浓度的游霉素培育物，消耗氧的水准比该实验对照培育物明显降低。在接种后117.5小时，所有的游霉素都明显不同于该实验对照培育物。这种相互关系一直持续到接种后的286.5小时。
根据在用F念珠菌接的潮湿家畜饲料中，累积的二氧化碳生成量，和氧的消耗量明显降低。就能断定游霉素抑制了家畜饲料中这种有害霉菌的生长。进而，早在接种后的93小时，这种抑制霉菌的能力就得到验证。此外，二氧化碳生成量和氧的消耗量，表明5克/吨及其更多浓度的游霉素，足以明显抑制这种新月菌属的种属。
实例4
根据本发明提出的测量霉菌生长速率的本实例，通过利用鸡用饲料中的红青霉素NRLL 3290演示游霉素，对氧的消耗量和二氧化碳生成量的影响。
人们公认红青霉，是在食料例如玉米、麦类以及精加工饲料中的普遍存在的污染物。由红青霉(P.rubrum)产生的毒性，主要是红色毒素B(rubratoxin)。红色毒素B众所周知，会在家畜中引起致命的出血性综合症，其特征是阻塞内脏器管。在鸡中的红色毒素，已经估计LD50为4.0毫克/千克。根据红青霉对家畜业中所使用的食物污染的高概率，以及由于红青霉的形成所产生的潜在中毒危险，红青霉、已经包括在评估潮湿家畜饲料中的游霉素的抑制菌能力的试验研究中。
使用一种商业的，不含任何药物(表1)的鸡用催肥饲料。该饲料在实验室研磨机中，仔细研磨直到颗粒大小接近1毫米3。然后，对饲料进行杀菌(121℃下持续15分钟)。将样品在强迫通风的加热器中，在135℃下持续2小时干燥，测定其湿度(AOAC Method930.15)。足量的无菌去离子水加到10千克饲料中，并彻底混合以达到理想的湿度17.0％。然后测定最终的实际湿度(AOACMethod 1930.15)。将5个200克的加湿饲料的等分试样，转送到5个2800毫升费氏烧瓶中的每一个中。
红青霉的孢子悬浮物NRRL 3209的准备，是通过将9.0毫米的无菌稀释剂(0.005％“三硝基甲基”X-100溶于水中)加到成熟斜面培养基上。斜面的表面用无菌微生物环状物轻轻革刮，以利于孢子从菌丝中释出。在悬浮物中活性孢子的浓度，借助标准的稀湿剂和倾注一平面法，使用萨布罗式葡萄糖琼脂培养基，作为覆层介质来测定。适量体积的悬浮物，加到每一个饲料的等分试样上，以得到5.0×10孢子/克。跟着进行彻底的混合，经过称重的一定数量的游霉素予制混合物，被加到每一个200克的等分试样中，以便得到O(实验对照物)、5、10、15和20(克游霉素/吨饲料)的浓度。将饲料进行再混合，每种已处理的饲料的20克样品，放入250毫升的宽嘴锥形(依氏)烧瓶，该烧瓶用作呼吸测量器中的培育室。为每一种等级的游霉素，准备4个同样的烧瓶。
所有的烧瓶用橡胶塞密封，并在30℃下持续115小时进行予培育。在此初始予培阶段之后，所有的烧瓶被放入30℃下的微生物培育器中，并连接到呼吸测量器(“MICRO-OXYMAX”20，哥伦布仪器公司，俄亥俄州哥伦布)，每一个烧瓶(腔室)装备一个增湿器，以保证在实验过程中，稳定的饲料湿度。氧的消耗量和二氧化碳生成量的测量，确定为每4小时一次持续340小时(14天)。累积氧的消耗量和累积二氧化碳生成量的所有数据，被计算子。
水分的可利用性或许对在某一特定培养基上的霉菌生长，是最关键的因素。在本实验中所使用饲料的初始湿度，确定为17.20％。这种湿度水准结合适当温度(30℃)，对在该培养基上的红青霉来说，保证了这种霉菌的繁殖。众所周知，青霉属作为一个种属与其它有毒性种属例如曲霉属和新月菌属，比较需要较高湿度水准和水的作用。虽然，曲霉属和新月菌属在大约17％的湿度下能够快速生长，但这种湿度水准对大多数青霉属试样，并不具有等量的生长速率。
直到接种后的219小时，对在所有培育物中的青霉属种属，在累积的二氧化碳生成量方面设有观察到有明显的变化。在其后的所有时间阶段，累积的二氧化碳也没有明显的变化。在饲料中游霉素的缺乏，显示出累积的二氧化碳生成量方面一贯地明显减少，这可能是由于这种特定的霉菌的生长速率低。例如，由曲霉属寄生物生成总量为76.3毫升的二氧化碳，与之相比在同样的时间阶段内，由红青霉素仅生成总量为16.4毫升的二氧化碳。如前面所解释的，在具有相似湿度的相同培养基上，青霉属的种属并不像曲霉属和新月菌属的种属那样快速生长。
在实验中的二氧化碳生成量与氧消耗量之间的差别表明了：为了精确地评定游霉素的抑制霉菌能力，以及出于相似的目的而使用的其它化合物，需要同时测量这两种气体。还有，鉴定这些化合物，必须注意为不同种和属的霉菌生长，所需要的最佳湿度之间的差别。
上述实例基本上论述真菌抑制剂的能效力，同时在有机基质上，包括面包和其它食物，皮革、潮湿的纤维材料和其它类似物上，以同样的方式进行自然霉菌生长的测量。使用包括制霉菌系和其类似物的真菌抑制剂，也可以采用相似的方式进行霉菌生长的测量。还可以在未经处理的和真菌抑制剂处理的，有机培养基上，以同样的方式进行其它霉菌生长的测量。
Claims (9)
1、一种检测霉菌在饲料上生长速度的方法，该方法包括：
(a)将含霉菌孢子的饲料样品放入一个密闭容器中，该容器内为空气气氛，所述样品具有利于霉菌在其上快速生长的湿含量，
(b)使所述容器保持于有利霉菌快速生长的基本上恒定的温度和基本上恒定的相对湿度下，并保持样品有均匀的湿含量，
(c)周期性地更新所述容器中的空气，使氧和二氧化碳浓度有利于霉菌生长，
(d)周期性地从所述容器中抽出空气样品并检测其中选自氧和二氧化碳的至少一种代谢气体的浓度，
(e)从连续测定中确定所述容器中至少一种代谢气体浓度的变化，以及
(f)确定所述代谢气体浓度变化与霉菌生长速率的相互关系。
2、如权利要求1所述的方法，其特征在于：将所述样品放入所述腔室之前，其中的所述样品用至少一种霉菌进行接种。
3、如权利要求1所述的方法，其特征在于：将所述样品存入所述腔室之前，其中的所述样品用霉菌抑制剂进行处理。
4、如权利要求1所述的方法，其特征在于：将所述样品放入所述腔室之前，其中的所述样品用至少一种霉菌进行接种，用霉菌抑制剂进行处理并进行灭菌。
5、如权利要求3所述的方法，其特征在于：其中所述霉菌抑制剂由游霉素，制霉菌素，丙酸及其灭霉菌的盐类所组成的族中进行选择。
6、如权利要求1所述的方法，其特征在于：其中所述饲料由谷粒、油籽和坚果所组成的族中进行选择。
7、如权利要求1所述的方法，其特征在于：其中所述的饲料是磨碎的家畜饲料。
8、如权利要求7所述的方法，其特征在于：其中所述的饲料、在放入所述的腔室以前，用游霉素进行处理。
9、一种测量霉菌生长的装置，包括：
(a)至少一个密封的样品容器，该容器保持在黑暗环境中，容器内部保持于基本上恒定的所选温度，
(b)该容器连接一个加湿器，以在试验期间保持该容器内部于所选的相对湿度，
(c)该容器连接一个呼吸测定器，以更新该容器内部的空气，密封试验期间限制该容器内部代谢气体的变化，
(d)该容器连接至少一个样品室，以便在试验期间定期地从该容器内部抽取空气样品，和
(e)该样品室至少连接一个探测器，以测定空气样品中至少一种代谢气体的浓度。
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