RU2631826C2

RU2631826C2 - Способ упаковки грибных спор в модифицированной атмосфере с целью увеличения срока хранения грибов

Info

Publication number: RU2631826C2
Application number: RU2013108510A
Authority: RU
Inventors: ДЕ ФАРИЯ Маркус РОДРИГЕС
Original assignee: Эмпреза Бразилейра Де Песквиза Агропекуариа-Эмбрапа
Priority date: 2010-07-30
Filing date: 2011-08-01
Publication date: 2017-09-26
Also published as: CA2807103A1; CA2807103C; JP2013534135A; MX357404B; CL2013000291A1; KR20130087528A; AU2018202274A1; MX2013001230A; JP2019154451A; AU2018202274B2; ZA201301530B; KR102045980B1; EP2599857B1; AU2011284816A1; EP2599857A1; BRPI1002615B1; AR083245A1; BRPI1002615A2; EP2599857A4; AU2016203062A1

Abstract

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложен способ упаковки грибных спор, грибные споры, упакованные вышеуказанным способом, и запечатанная упаковка с жизнеспособными спорами грибов. Способ включает снижение исходной активности воды в спорах до менее 0,3, помещения спор в непроницаемую для газа и паров воды упаковку, хранения спор в упаковке при температуре между 15 и 25°С. Запечатанная упаковка включает в своем внутреннем пространстве жизнеспособные споры грибов, окружающую споры грибов среду, агент абсорбции кислорода и агент абсорбции влаги. Причём относительная влажность в среде после размещения спор в упаковке снижается таким образом, что активность воды в спорах составляет менее 0,1 через два дня при температуре между 15 и 25°С. Изобретения обеспечивают увеличение срока поддержания жизнеспособности грибных спор. 3 н. и 11 з.п. ф-лы, 2 ил., 6 табл., 8 пр.

Description

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к способам упаковки грибных спор, таких как споры энтомопатогенных грибов родов Beauveria, Isaria, Lecanicillium, Nomuraea, Metarhizium и Trichoderma, для увеличения срока хранения.

Уровень техники

Биологические пестициды являются альтернативой таковым, получаемым искусственным путем, поскольку они не являются токсичными для людей. Среди них есть такие, которые вырабатываются энтомопатогенными грибами, споры которых высушивают для того, чтобы они оставались жизнеспособными в течение длительных периодов (Moore et al. Effects of moisture contents and temperature on storage of Metarhizium fiavoride conidia. Biocontrol Science and Technology, v.6, p. 51-61). Высушивание также позволяет спорам выживать в экстремальной окружающей среде, характеризующейся сухим жаром, замораживанием и оттаиванием, так же как кислотностью среды.

В течение более столетия исследования описывают взаимодействие между грибами и сельскохозяйственными вредителями. Такое взаимодействие способствует развитию сельскохозяйственных культур через устранение их патогенов, насекомых-вредителей и сорняков. Такие исследования стимулировали применение микопестицидов для борьбы с сельскохозяйственными вредителями. Увеличилось промышленное получение биопестицидов и, частью причин этого увеличения являются спрос потребителей на более здоровые продукты, продукты с меньшим токсическим отходом, большее понимание специалистов в промышленности в отношении применения сельскохозяйственных пестицидов, растущее количество ограничений в законодательстве относительно химических пестицидов и необходимость применения в программах альтернативных продуктов для решения проблемы устойчивости к химикатам.

Грибы, применяемые в биологической борьбе с вредителями и применяемые в качестве пестицидов, подвергаются воздействию высоких температур, достигающих 50°C или более во время транспортировки или хранения. Этот фактор внешней среды воздействует на жизнеспособность грибных спор, таких как Metarhizium, Beauveria, Lecaniciliium и Trichoderma, чувствительных к повышениям температуры. Исследования, проведенные до настоящего времени, были направлены особенно на хранение указанных грибов в условиях охлаждения или температуры окружающей среды ниже приблизительно 30°C. Жизнеспособность микопестицидов быстро снижается во время хранения без охлаждения, и это ставит под угрозу принятие продукта на рынке, вызывая нежелательные результаты при борьбе с целевыми вредителями.

Исследование, проведенное Marques и Alves (Marques, E J., Alves, S.R. «Otimizacao de formulacoes na preservacao de esporos de Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. e Metarhizium anisopliae (Metschn). Sorok em diferentes condicoes de armazenamento. [Оптимизация композиций для хранения спор Beauveria bassiana (Bais). Vuill. и Metarhizium anisopliae (Metschn). Sorok при различных условиях хранения] Arquivos de Biologia e Tecnologia, v. 39, p. 861-877, 1996) продемонстрировало, что жизнеспособность спор с содержанием влаги 15,5%, хранящихся при 30°C, может быть значительно снижена менее чем через 30 дней.

Исследование Sandhu et al. (Sandhu, S.S., Rajak, R.C., Agarwal, G.P. Studies on prolonged storage of Beauveria bassiana conidia: effects of temperature and relative humidity on conidial viability and virulence against chikpea borer. Helicoverpa armigera. Biocontrol Science and Technology, v. 3, p.47-53, 1993) показало, что чем ниже относительная температура и влажность в равновесии, наступающем во время хранения, тем дольше сохраняется жизнеспособность спор Beauveria bassiana.

Большое внимание было уделено хранению энтомопатогенных грибов и других видов в окружающей среде с низкой или умеренной температурой или в пакетах, которые позволяют обмен между внутренней и внешней атмосферами, что не представляет собой подходящие способы хранения при температуре выше 25°C.

Документ США 5989898 раскрывает применение непроницаемых пакетов и агентов абсорбции влаги и кислорода для создания атмосферы с относительной влажностью менее 10% и содержанием кислорода менее 5%. Документ также предлагает устранение кислорода путем вакуумной упаковки или путем введения азота в упаковку со спорами.

Микроорганизмами, примененными для хранения при 25°C и 37°C, являлись Beauveria bassiana и Metarhizium anisopliae. Документ США 5989898 описывает применение поверхностно-активного вещества для реактивирования спор, отличаясь от настоящего изобретения, которое позволяет хранение при температуре выше 37°C путем применения различных нетоксичных газов (CO₂, H₂ и He) вместо кислорода, и заимствует соблюдение периода предварительной инкубации упакованного продукта. Важно, чтобы должным образом упакованные микопестициды были экспонированы к воздействию подходящих температурных условий перед тем, как они будут подвергнуты воздействию экстремальных условий для того, чтобы позволить уровням кислорода и влажности снизиться до подходящих уровней. WO 9718294 описывает двух-шести кратное увеличение срока хранения грибных спор или бактерий путем снижения содержания кислорода, связанного или не связанного со способами снижения влажности. Однако, максимальная оцененная температура хранения составляла 30°C, и только через 70 дней хранения исходная жизнеспособность снижалась на 85% или более при обработке с применением пакетиков с агентом абсорбции O₂ или при обработке с применением азота. Настоящее изобретение позволяет поддерживать жизнеспособность грибных спор, хранящихся при более высоких температурах, например, 40°C в течение трех-шести месяцев.

Сущность изобретения

Целью настоящего изобретения является описание способа упаковки грибных спор в целях увеличения их срока хранения. Способ включает стадии: i) снижения исходного содержания влаги в спорах до диапазона активности воды, при которой организмы остаются жизнеспособными; ii) помещения спор в упаковку, непроницаемую для газов и паров воды, по меньшей мере, с одним агентом абсорбции влаги и кислорода; iii) хранения спор в упаковке в течение минимум двух дней при температуре между 15 и 25°C, предпочтительно, при 25°C или другой температуре, подходящей для организмов, перед экспонированием их к воздействию высоких температур.

Второй вариант осуществления настоящего изобретения состоит в обеспечении увеличенного срока хранения для спор родов Beauveria, Isaria, Lecanicillium, Nomuraea, Metarhizium и Trichoderma.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения с применением пакетиков и с инкубационным периодом при подходящей температуре в упаковке, непроницаемой для газов и паров воды, получают запечатанную упаковку, включающую во внутренней части: (i) жизнеспособные споры грибов; и (ii) окружающую среду с пониженным содержанием влаги и кислорода.

Краткое описание чертежей

Фигура 1: Эффект различных газов на жизнеспособность конидий Beauveria bassiana после хранения при 50°С в течение 60 дней. Жизнеспособность оценивали посредством двух протоколов для прорастания (быстрое повторное увлажнение по сравнению с медленным повторным увлажнением).

Фигура 2: Жизнеспособность конидий Beauveria bassiana после введения 20%-го CO₂ (+80% N₂) и хранения при 25, 40 или 50°C.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к способу хранения для увеличения срока хранения грибов в условиях отсутствия охлаждения, в частности, при температуре выше или равной 37°C. При помощи этой методологии споры остаются жизнеспособными даже когда их подвергают воздействию высоких температур окружающей среды.

В следующем описании широко применяются определенные термины. Далее предоставлены следующие определения, чтобы улучшить понимание настоящего изобретения.

Термин «модифицированная атмосфера упаковки» в настоящем описании определен как способ, в котором упаковочный материал внутри указанной упаковки подвергается воздействию газа, имеющего состав, отличающийся от состава атмосферного воздуха, и может включать техники, такие как введение определенного газа или смеси газов внутрь упаковки или применение элементов, компоненты которых реагируют с компонентами упаковки. Эти элементы могут представлять собой, но не ограничены ими, абсорбирующие пакетики, источники газов или абсорбенты паров воды.

Термин «жизнеспособность» относится к проценту прорастания спор, измеряемому способом, в котором применяется быстрое повторное увлажнение, и рассматривается как более подходящий протокол для оценки качества конидий микопестицидов.

Считается, что «пригодной для жизни температурой для организма» является такая, которая не вызывает отмирание или истощение конидий определенных видов. В настоящем изобретении пригодная для жизни температура, предпочтительно, составляет близко к 25°C.

«Активность воды» (a_w) определяется как отношение давления паров воды над материалом к давлению паров над чистой водой при той же самой температуре. Она является мерой содержания воды в материале, которая доступна для химических и биологических реакций и, поэтому, является важным параметром в исследованиях с микроорганизмами.

В целях настоящего изобретения «период предварительной инкубации» или «период установления равновесия» обозначает время, в течение которого споры выдерживают в непроницаемой упаковке до экспонирования к воздействию высоких температур, это время необходимо для того, чтобы снизить активность воды до значений менее 0,1, предпочтительно, между 0,02 и 0,03.

Термин «срок хранения» определен как интервал времени, в течение которого микопестицид может храниться при определенном температурном условии без значительной потери признаков, связанных с его эффективностью действия. Для микопестицидов, упакованных в негерметические упаковки, нужно также учитывать относительную влажность при хранении. В целях настоящего изобретения период 2-6 месяцев считается минимальным желательным сроком хранения для биологических инсектицидов, хранящихся при температуре, близкой к 40°C. Жизнеспособность является признаком, как правило, используемым патологами для оценки качества конидий, и должна составлять, предпочтительно, больше 80%. Поэтому, сроком хранения для микоинсектицидов установлено время, в течение которого жизнеспособность при определенной температуре снижается до 80%.

Способ увеличения срока хранения спор энтомопатогенных грибов состоит из следующих стадий:

i) снижение исходного содержания влаги в спорах до очень низкого уровня активности воды, при которой организмы сохраняют жизнеспособность;

ii) помещение спор в непроницаемую для газов и паров воды упаковку с одним агентом абсорбции кислорода и одним агентом абсорбции влаги, где эти агенты, предпочтительно, находятся в виде пакетиков. По желанию, может быть применен единый пакетик, обладающий способностью к абсорбции и кислорода, и влажности;

iii) хранение спор в упаковке в течение, по меньшей мере, двух дней при умеренной температуре перед экспонированием к воздействию высоких температур.

Снижение исходного содержания влаги увлажненных спор может быть достигнуто путем высушивания во время стадии сбора спор. Получение грибов обычно имеет место в твердых субстратах, таких как вареный рис и т.п. Сразу же после получения грибов колонизированный субстрат может быть выставлен в комнате с низкой относительной влажностью, приводящей к высушиванию конидий, или помещен в камеру, содержащую влагопоглощающий материал, до снижения активности воды до низких значений.

Такие низкие значения активности воды перед заполнением упаковки, предпочтительно, составляют менее 0,1. Этот материал может быть выбран из группы, но не ограничен: сульфат кальция и силикагель. Для снижения содержания влаги в сушильной камере, необходимо подождать два дня или дольше при более низких температурах, предпочтительно, между 15 и 25°C, больше предпочтительно, при приблизительно 25°C или другой температуре, которая не влияет на жизнеспособность спор, при которой может происходить высушивание гриба без ослабления грибной структуры.

Активность воды в организмах значительно снижается после заполнения упаковки, и, таким образом, поддерживается посредством упаковки, непроницаемой для газов и паров воды.

В способе упаковки спор, в качестве средств, обеспечивающих надлежащую атмосферу для их хранения, предпочтительно, применяют пакетики, содержащие агенты абсорбции влаги и кислорода. Эти пакетики могут иметь только одну функцию, то есть, они могут являться индивидуальными абсорбентами кислорода или абсорбентами влаги, или могут иметь двойную функцию, когда единый пакетик действует и как абсорбент кислорода, и как абсорбент влаги. Пакетики должны создавать нетоксичную атмосферу для спор. В качестве абсорбентов влаги могут быть применены сульфат кальция или силикагель. Полезные пакетики для настоящего изобретения могут быть выбраны из, но не ограничены ими: RP-3A (абсорбент кислорода и влаги), Ageless® ZPT 1000 (абсорбент кислорода), OxyFree™ 504A (абсорбент кислорода и диоксида углерода), OxyFree™ 504E (абсорбент кислорода и источник диоксида углерода) или безводный сульфат кальция (абсорбент влаги). Непроницаемые упаковки, применяемые в способе по настоящему изобретению, могут быть, не ограничивая, пакетами из алюминия и стекла.

Результат применения пакетиков для упаковки различается в зависимости от исходной активности воды в спорах. При применении пакетика только с абсорбентом кислорода, высокая влажность спор влияет на их сохранность, снижая жизнеспособность после экспонирования к воздействию высоких температур. Следует применять абсорбенты влаги, которые не выделяют пары воды при экспонировании воздействию высоких температур, такие как Drierite™, безводное соединение сульфата кальция, которое выделяет пары воды только при экспонировании к воздействию температур выше 177°C.

Активность воды в итоговом микопестициде и состав атмосферы внутри пакета являются основными факторами поддержания жизнеспособности спор до их применения. Время, в течение которого споры хранятся в непроницаемой упаковке перед экспонированием к воздействию высоких температур, называется предварительной инкубацией или «периодом установления равновесия», это время необходимо для того, чтобы снизить активности воды до значений менее 0,1, предпочтительно, между 0,02 и 0,03. Для гриба Beauveria bassiana, например, период установления равновесия, как правило, составляет два дня для небольших количеств спор или более, в зависимости от факторов, таких как размер упаковки, тип композиции, количество микопестицида и количество и эффективность применяемых пакетиков с абсорбентами.

Грибы, которые могут быть упакованы и реактивированы в соответствии с настоящим изобретением, включают, но не ограничены ими, таковые из родов Beauveria, Isaria, Lecanicillium, Nornuraea, Metarhizium и Trichoderma.

Непроницаемая упаковка, в которую согласно настоящему изобретению упаковывают грибные споры, не ограничивая, может быть из: стекла, материалов из слоистого пластика, содержащих алюминий или керамику, или других материалов, непроницаемых для газов и паров воды.

Следующие примеры приведены с целью иллюстрации и дополнительного объяснения настоящего изобретения, и не должны быть рассмотрены как форма ограничения настоящего изобретения.

Примеры

Пример 1: Введение различных газов в стеклянные упаковки

Образцы спор Beauveria bassiana (0,6 г) хранили в герметических стеклянных флаконах объемом 125 мл (Ball ®, Jarden Corp., Манси, Индиана, США), запечатанных металлическими крышками с резиновыми прокладками. В каждый стеклянный флакон в течение 40 минут при скорости 40 мл*мин^-1 вводили чистый диоксид углерода, азот, гелий или водород, так же как 100%-ый или 21%-ый кислород, уравновешенный N₂ (Airgas East, Inc., Салем, Нью-Хэмпшир, США). Во флаконах, в которые не вводили O₂, концентрацию этого газа измеряли после введения газов, чтобы гарантировать то, что окружающая среда не содержала обнаруживаемой концентрации O₂. Образцы газа (500 мкл) отбирали из каждого флакона при помощи герметического шприца (модель 1750, Hamilton Company, Reno, Невада, США) и вводили в газовый хроматограф (Varian Aerograph, Уолнат-Крик, Калифорния, США), оборудованный детектором теплопроводности. Высоты пиков сравнивали со стандартным коммерческим продуктом, содержащим 6,96% O₂ и 4,91% CO₂, уравновешенным N₂. Каждый вариант обработки, состоявший в экспонировании к газу, повторяли три или четыре раза. Чтобы минимизировать газовый обмен (O₂) во время хранения, стеклянные флаконы объемом 125 мл хранили в герметических емкостях (0,95 л) большего объема Ball®, содержащих ту же самую газовую смесь. Применяя такую систему, стеклянные бутыли инкубировали при 50°C в течение 60 дней. Температуры непрерывно наблюдали при помощи двух цифровых регистрирующих устройств (Hobo®, Onset Computer Corp., Борн, Массачусетс, США) в каждом термостате. После такого хранения в каждом флаконе в качестве показателя герметичности системы снова определяли концентрацию O₂. Активность воды в спорах измеряли при 25°C при помощи измерителя активности воды (LabMaster-a_w, Novasina, Пфеффикон, Швейцария) и определяли прорастание. Жизнеспособность определяли непосредственно путем суспендирования порошка конидий в водном растворе поверхностно-активного вещества и посева этого материала на среду из агара с дрожжевым экстрактом и экстрактом с беномилом (агар с дрожжевым экстрактом/среда с беномилом - YEA). Растворы (вода-поверхностно-активное вещество) уравновешивали с температурой окружающей среды. После выполнения каждого протокола повторного увлажнения инокулированный блок агара (на предметных стеклах) инкубировали в парафинизированных чашках Петри при 25°C в темноте, и подсчет проросших спор проводили через 24 после инокуляции (п.и.). Конидию считали проросшей, если ростковая трубочка любого размера была видна при 400X увеличении с фазово-контрастным освещением. Наблюдали, по меньшей мере, 200 конидий в нескольких полях зрения микроскопа для каждой повторности суспензии каждого варианта эксперимента.

Эксперимент повторяли в другой день без обработки 21%-ым O₂. Флаконы, в которые вводили газы кроме O₂, и в которых происходил значительный газовый обмен (конечное содержание O₂ f>3,5%), исключали. Проводили арксинус-трансформацию данных и анализировали с использованием однофакторного дисперсионного анализа. Средние значения сравнивали критерием подлинной значимости Тьюки-Крамера или t-тестом и считали статистически различными при уровне значимости 5%. Данные анализировали при помощи статистического пакета программ JMP (SAS Institute Inc., Кэри, Северная Каролина, США).

Фигура 1 показывает, что конечная активность воды в спорах в первом анализе не изменялась при обработке газом (P=0,4150, F_5,13=1,1); Общая средняя величина активности воды составляла 0,099±0,0248. Существенные различия в прорастании наблюдали через 60 дней при 50°C (P<0,0001, F_5,13=122,0), в то время как экспонирование к N₂, CO₂, H₂ и He давало эквиваленты жизнеспособности в диапазоне 40-51%, скорости прорастания были очень низкими или даже регистрировали отсутствие жизнеспособных спор при 21%-ом и 100%-ом O₂, соответственно.

Как в первом эксперименте, обработки не приводили к существенным различиям в конечной активности воды в спорах (P=0,29, F_3,11=1,4), средняя активность воды между обработками составляла 0,119±0,0021. Введение 100%-го O₂ также приводило к отсутствию жизнеспособных спор (21%-ый O₂ не тестировали). Хранение со всеми другими газами приводило в результате к большей жизнеспособности спор по сравнению с обработкой O₂, но к низкому эквиваленту (диапазон 10-13%) (Фиг.1B). Эти скорости прорастания были заметно ниже, чем диапазон 49-51%, наблюдавшийся в первом тесте, вследствие более низкой активности воды в спорах в первом эксперименте. За исключением флаконов, в которые вводили O₂, остаточные концентрации O₂ (1,6%-1,9%) не отличались между флаконами, в которые вводили газы (P=0,73, F_2,8=0,3).

Пример 2: Введение N₂ и CO₂ для хранения спор при различных температурах

Применяя такую же систему, как описано в предыдущем примере, вводили образцы спор с 20%-ым CO₂ и 80%-ым N₂. По четыре образца на каждую обработку тестировали на остаточное содержание O₂ и итоговую активность воды после хранения в течение 45, 91, 180 и 240 дней при 40°C. В другой день эксперимент повторяли. Дополнительно, эксперименты проводили для исследования эффектов от хранения при 25°C (оценивали через 46, 120, 180, 365 и 400 дней хранения), и при 50°C (оценивали через 15, 30, 47, 75 и 90 дней хранения). Во всех случаях жизнеспособность также определяли в «нулевой день», то есть, непосредственно перед хранением в термостатах при различных температурах. Образцы отбирали из различных бутылей в один и тот же день проведения оценки и поэтому в этом исследовании не применяли систему повторных измерений.

Проводили арксинус-трансформацию данных и анализировали с использованием однофакторного дисперсионного анализа. Средние значения сравнивали критерием подлинной значимости Тьюки-Крамера или t-тестом и считали статистически различными при уровне значимости 5%. Данные анализировали при помощи статистического пакета программ JMP (SAS Institute Inc., Кэри, Северная Каролина, США).

В эксперименте хранения при 25°C наблюдали значительное снижение жизнеспособности (P=0,0002, F_5,18=8,8), но это снижение было постепенным и небольшим, а жизнеспособность составляла более 90% на 365 день и 87% на 480 день после хранения, как видно на фигуре 2. Активности воды в спорах увеличилась с 0,104 на 46 день после хранения до 0,204 в конце эксперимента (P<0,0001, F_[4,15]=36,3), и средняя концентрация остаточного O₂, увеличилась с 0,5% до 12,4% (P<0,0001, F_4,15=38,0).

В эксперименте при 40°C имело место статистически значимое снижение жизнеспособности в течение первых 3 месяцев хранения, но снижение составляло только 6 процентных единиц (с 93 до 87%). За этим следовало быстрое снижение до значения жизнеспособности 4% на 240 день после хранения (ANOVA P<0,0001, F_4,34=361,7). В течение промежутка между 45 и 240 днями средняя концентрация остаточного O₂ увеличилась с 1,2% до 6,6% (P=0,0002, F_3,28=9,4) и активности воды увеличилась с 0,104 до 0,145 (P<0,0001, F_3,27=35,4).

При 50°C исходная жизнеспособность быстро уменьшилась с 96 до 81% за первые 15 дней и составляла приблизительно 10% на 90 день после хранения (P<0,0001, F_6,21=129,1). Остаточный O₂ увеличился с 0,8% на 15 день до 3,2% на 90 день после хранения (P=0,0074, F_5,18=4,5), в то время как активность воды в спорах не изменилась значимо за этот период (с 0,104 на 15 день до 0,098 на 90 день: P=0,3448, F_5,18=1,2).

Пример 3: Введение газа и применение активной упаковки (АУ)

Споры Beauveria bassiana высушивали при помощи NaOH в стеклянных флаконах объемом 125 мл в течение 1 дня при 25°C, в результате активность воды составляла 0,083±0,001. Несколько случайных образцов переносили в стеклянные флаконы и вводили N₂. Потерю O₂ снижали за счет применения системы двустороннего заполнения со стеклянными емкостями. Остальные образцы (0,6 г) подвергали одной из трех обработок АУ, включающих: i) алюминиевые мешки (8Ч8,5 см), содержащие пакетик с абсорбентом RP-3A для O₂ и влаги; ii) пленку, абсорбирующую O₂ (code М-0034, партия 19208A, 88,9Ч63,5Ч0,3 мм CSP Technologies, Оберн, Алабама, США), и пленку, абсорбирующую влагу (CSP Technologies, code М-0026, партия 02208A, 63,5Ч38,1Ч0,6 мм) или; ii) пленку, обладающую двойным действием в качестве абсорбента O₂ и влаги (CSP Technologies, code М-0033, партия 10808A, 76,2Ч76,2Ч0,6 мм). В качестве контрольного варианта споры выдерживали в полиэтиленовых мешках толщиной 30 мм (code P827-2.1.2; Empac Agroindustrial Ltda Plastics, Бразилиа, Бразилия) с пакетиком RP-3A.

Все полученные упаковки со спорами предварительно инкубировали при 25°С в течение 5 дней и затем переносили в термостаты, установленные на 50°C. Остаточный O₂ в стеклянных флаконах, в которые вводили N₂, проверяли непосредственно перед инкубацией при повышенной температуре. Для всех обработок применяли три емкости для деструктивного определения активности воды и жизнеспособности спор непосредственно перед перемещением в термостаты, установленные на 50°C. Споры инкубировали при 50°C в течение 56 или 120 дней. После хранения измеряли активность воды и оценивали жизнеспособность конидий. Для каждой обработки и даты, деструктивно оценивали четыре независимо полученные упаковки и, поэтому, систему повторных измерений не применяли.

Пример 4: Пакетики для модифицированной атмосферы

Образцы спор Beauveria bassiana хранили в стеклянных флаконах объемом 125 мл с обезвоживанием посредством сульфата кальция (индикатор Drierite™ 8 меш, W.A. Hammond Drierite Co., Ксения, Огайо, США) в течение двух дней при 25°C. Активность воды в спорах перед наполнением составляла 0,019±0,0005. В другой обработке споры выдерживали над насыщенным раствором NaCl в течение 2 дней при 25°C, что приводило к установлению активности воды перед наполнением на уровне 0,738+0,0007. Затем образцы перемещали в мешки из слоистого пластика (10Ч12 см), содержащие один из следующих пакетиков для модификации атмосферы: RP-SA абсорбент O₂ и влаги, абсорбент O₂ Ageless® ZPT 1000 (Mitsubishi Gas Chemical Co., Япония), абсорбент O₂ и CO₂ OxyFree™ 504A (Tianhua Tech, Китай), абсорбент O₂ и источник CO₂ OxyFree™ 504E (Tianhua Tech, Китай) или абсорбент влаги на основе Drierite™ (56,7 г). В качестве контрольного образца применяли мешки из слоистого пластика без пакетиков. Сумки инкубировали при 50°C без предварительного инкубирования, определяя активность воды в спорах и проводя подсчет через 45 дней. Каждую обработку (тип пакетика - исходная активность воды) повторяли четыре раза.

Таблица 1 Прорастание (%) спор Beauveria bassiana, определенное через 45 дней хранения при 50°С в мешках, содержащих пакетики абсорбента и/или источников газов и паров воды.
Пакетик	Низкая исходная a_w(0,019)		Высокая начальная a_w(0,738)
Пакетик	Итоговая a_w	%	Итоговая a_w	%
Ageless (абсорбент O₂)	0,807± 0,0012 а	0,0% с	0,819±: 0,0015 а	0,0% с
Drierite^TM (абсорбент влаги)	0,022± 0,0003 е	5,2±0,7% b	0,23± 0,0007 e	7,3%± 1,3% b
RP-3A (O₂/абсорбент влаги)	0,794± 0,0003 c	79,0± 1,3% a	0,022± 0,0003 e	72,8%± 3,2% a
504 A (абсорбент O₂ и CO₂)	0,704± 0,0003 c	0,0% c	0,729± 0,0009 c	0,0% c
504 E (абсорбент O₂ и источник CO₂)	0,761± 0,0035 b	0,0% c	0,798± 0,0024 b	0,0% c
Без пакетика (контроль)	0,027±: 0,0003 d	3,8±0,4% b	0,709± 0,0012 d	0,0% c
¹В каждой колонке приведенные средние значения (±стандартная ошибка), за которыми следуют одинаковые буквы, статистически не различаются (критерий подлинной значимости Тьюки, α=0,05). Прорастание определяли при помощи протокола быстрого повторного увлажнения.

Применение нескольких пакетиков с модифицированной атмосферой привело к высоко значимым различиям в жизнеспособности спор как для исходно низкой (P<0,0001, F_[5,12]=1631,4), так и для исходно высокой активности воды (P<0,0001, F_[5,12]=522,4) (Таблица 1). Как ожидалось, учитывая поглощающую способность различных пакетиков, итоговая активность воды в спорах в обработках с низкой или высокой исходной активностью воды также заметно различалась. Применение пакетиков, которые выделяют влагу во время хранения (Ageless, 504A и 504E) или абсорбируют влагу, но не O₂ (Drierite™), привело в результате к более низкой жизнеспособности по сравнению с применением абсорбента двойного действия, абсорбирующего O₂ и влагу (RP-3A).

Пример 5: Комбинирование пакетиков с модифицированной атмосферой для удлинения срока хранения

Образцы спор Beauveria bassiana высушивали с Drierite™ в течение 2 дней при 25°C (с получением величины активности воды 0,020±0,0008), и затем перемещали в мешки из слоистого пластика размером 16Ч20 см, содержащие различные пакетики: RP-5A для абсорбции O₂ и влаги (та же самая композиция, что и RP-3A, но подходящая для больших упаковок) 504E для абсорбции O₂ и выделения CO₂ или пакетик 504E плюс пакетик Drierite™ (56,7 г). Каждую обработку повторяли три раза, и определяли активности воды в спорах, так же как прорастание через 148 и 180 дней после хранения при 40°С.

Пакетик, который абсорбирует O₂, но выделяет влагу (504E), был эффективен при тестировании вместе с осушителем (Drierite™), но отдельное применение пакетика 504E привело к полной потере жизнеспособности (Таблица 2). Стратегия объединения применения пакетиков была так же хороша, как применение пакетика двойного действия (RP-5A), как через 148 дней (P<0,0001, F_2,6=309,0), так и через 178 дней хранения при 40°C (P<0,0001, F_2,6=2,035).

Таблица 2 Эффект абсорбента O₂ и источника CO₂, с или без осушающего пакетика, на активность воды и жизнеспособность спор Beauveria bassiana, хранящихся при 40°C в течение 5-6 месяцев.
Пакетик	День 148		День 178
Пакетик	Итоговая a_w ¹	%	Итоговая a_w ¹	%
504 E (абсорбент O₂ и источник CO₂)	0,793± 0,0038 a	0,0% b	0,809± 0,0168 a	0,0% b
504 E + DrieriteTM (абсорбент влаги)	0,030± 0,0003 b	81,0± 4,5% a	0,030± 0,0003 b	79,3± 1,9% a
RP-5A (O₂/абсорбент влаги)	0,026± 0,0000 b	83,5± 2,2% a	0,028± 0,0003 b	81,8± 0,4% a
¹Aw начальная активность составляла 0,020+0,0008, и споры предварительно не инкубировали при умеренной температуре перед экспонированием к 40°C. ²В каждой колонке средние значения (± оценка вероятности), за которыми следуют одинаковые буквы, статистически не различаются (критерий подлинной значимости Тьюки, α=0,05). Прорастание определяли при помощи протокола быстрого повторного увлажнения.

Пример 6: Эффект периода установления равновесия на срок хранения

Активность воды в чистых спорах Beauveria bassiana приходила к равновесию внутри упаковки перед экспонированием воздействию высоких температур. Образцы Beauveria bassiana хранили с Drierite™ или NaCl в течение 2 дней при 25°C, в результате чего активность воды составляла 0,020±0,0008 и 0,740±0,0018, соответственно. Затем, споры перемещали в мешки из слоистого пластика, каждый из которых содержал RP-3A (абсорбент O₂ и влаги) и предварительно инкубировали в течение дополнительного периода в 5 дней при 25°C перед хранением при целевых температурах (25, 40 и 50°C). Альтернативно, образцы хранили с Drierite™ или NaCl в течение 7 дней при 25°C, перемещали в сумки из слоистого пластика, содержащие пакетики RP-3A, и сразу же помещали на хранение при целевых температурах без 5-дневного периода приведения в равновесие при 25°C. Каждую обработку повторяли четыре раза, и измерения активности воды и жизнеспособности проводили через 60 дней при 50°C и 180 дней при 25 или 40°C.

Итоговая активность воды в спорах не варьировала между обработками при каждой температуре хранения (Таблица 3). Проценты прорастания через 180 дней при 25°C были высокими (91-94%) для всех обработок, за исключением обработки с высокой исходной активностью воды и периодом приведения в равновесие, в течение которого жизнеспособность снизилась до 68%. Через 180 дней при 40°C жизнеспособность составляла 87-89% для большинства обработок, но была значительно ниже (75%) в обработке с высокой исходной активностью воды и без периода приведения в равновесие (P 0,0068, F_3,8=8,7). Наконец, через 60 дней при 50°C, ту же самую тенденцию наблюдали с жизнеспособностью почти для всех обработок в диапазоне 83-86%, за исключением обработки с высокой исходной активностью воды и без периода равновесия, в течение которого жизнеспособность значительно снизилась до 60% (P<0,0001, F_3,8=37,8).

Сроки хранения, наблюдаемые в этом исследовании, значительно выше сроков, полученных ранее. Атмосферы, измененные после введения газов кроме O₂ (CO₂, N₂, H₂ и He), в результате привели к сопоставимым показателям жизнеспособности через 2 месяца хранения при 50°C. При тестировании атмосферы 20%-го CO₂ (+ 80%-ый N₂) во флаконах, время, за которое жизнеспособность спор снизилась до 80%, превосходило 91 и 15 дней при температуре 40 и 50°C, соответственно. Эти времена похожи на оценки, полученные из данных, опубликованных Hong et al. (2001) (Hong, TD, et al. The effect of storage environment on the longevity of conidia of Beauveria bassiana. Mycological Research v. 105, c. 597-602, 2001), указывая на то, что споры теряют воду в атмосфере с влажностью вплоть до 5%, и хранение с атмосферным воздухом в герметично запечатанных емкостях сохраняет 80%-ую жизнеспособность в течение 80 и 17 дней при 40 и 50°C, соответственно. Это были, до тех пор, самые длительные сроки хранения, когда-либо зарегистрированные для этих видов гриба при высоких температурах. Однако, при применении активной упаковки (с пакетиками, которые абсорбируют O₂ и влагу в герметических упаковках), и при введении периода приведения в равновесие, жизнеспособность достигла беспрецедентных значений в пределах от 80 до 90% через 6 месяцев хранения при 40°C или 2 месяцев при 50°C.

Таблица 3 Эффект исходной активности воды и периода приведения в равновесие (предварительная инкубация) на прорастание спор Beauveria bassiana, хранящихся в мешках из слоистого пластика, содержащих пакетик с абсорбентом O₂ и влаги.
Условия	180 дней при 25°C		180 дней при 40°C		60 дней при 50°C
Условия	Итоговая a_w ²	%	Итоговая a_w ²	%	Итоговая a_w ²	%
Низкая исходная a_w/предварительная инкубация	0,029± 0,0000 a	93,2± 0,4% ab	0,028± 0,0003 a	87,8± 0,9% a	0,022± 0,0000	84,8± 3,5% a
Низкая исходная a_w/без предварительной инкубации	0,029± 0,0003 a	94,0± 1,1% a	0,028± 0,0003 a	88,8± 0,8% a	0,022± 0,0000	86,3± 3,8% a
Высокая исходная a_w/предварительная инкубация	0,029± 0,0000 a	91,0± 1,3% ab	0,028± 0,0000 a	88,0± 2,6% a	0,021± 0,0000	82,5± 1,0% a
Высокая исходная a_w/без предварительной инкубации	0,029± 0,0003 a	88,3± 0,4% b	0,028± 0,0003a	75,3± 2,2% b	0,021± 0,0000	60,0± 3,0% b

¹В каждой колонке представлено среднее (±оценка вероятности), за которыми следуют одинаковые буквы, статистически не различаются (критерий подлинной значимости Тьюки, α=0,05). Прорастание определяли при помощи протокола быстрого повторного увлажнения.
²Низкая и высокая исходная a_w составляли 0,020±0,0008 и 0,740+0,0018, соответственно.

Пример 7: Эффект стадии высушивания (перед упаковыванием) на срок хранения

В таблице 4 можно удостовериться, что период приведения в равновесие продолжительностью 7 дней при 25°C применяли для всех обработок. Однако, в одном эксперименте, обнаружили, что простое применение пакетика RP-3A (который абсорбирует пары воды и кислорода в упаковке) недостаточно, чтобы гарантировать высокие уровни прорастания. В обработке «Увлажнение + RP-3A» стадию подсушивания образца перед упаковыванием не проводили, даже при снижении активности воды до 0,050 в конце периода приведения в равновесие (и 0,020 в конце 16 месяцев хранения), окончательный результат был ниже, чем в предыдущей обработке, где активность воды в конце периода приведения в равновесие и в течение всего периода хранения при 40°C оставалась на уровне менее 0,1, и в пределах идеального диапазона от 0,02 до 0,03. В эксперименте 2, эти две обработки следовали за рекомендуемыми стадиями (подсушивание, применение пакетика(ов) для поглощения влаги и кислорода, соблюдение периода приведения в равновесие для удаления кислорода и снижения активности воды до уровней, близких к 0,03 перед экспонированием воздействию высоких температур), и, таким образом, результаты были удовлетворительными. В первом эксперименте обработки 2 применяли пакетик с двойной функциональностью (абсорбция влаги и кислорода), в то время как во втором применяли отдельный пакетик для каждой функции. Важно подчеркнуть, что технологии и способы, известные в области техники, никогда не были в состоянии обеспечить жизнеспособность (процент прорастания) гриба Beauveria bassiana на уровне 70% через 16 месяцев хранения конидий при 40°C.

Таблица 4 Эффект активности воды (a_w) на жизнеспособность конидий Beauveria bassiana, хранящихся при 40°С в течение 18 месяцев.
	День 0^b		16 месяцев
Обработка	Исходная a_w	Процент прорастания	Исходная a_w	Процент прорастания
Эксперимент 1
Предварительное увлажнение + RP-3A (O₂/H₂O абсорбент)^a	0,026± 0,000	92,5±1 76 а	0,020± 0,000	71,0±1,51 а
Предварительное увлажнение + RP-3A	0,050± 0,001	89,3± 1,59 а	0,020± 0,000	52,7±5,02 b
Эксперимент 2
Предварительное увлажнение + RP-3A^a	0,025± 0,000	95,5± 1,09 a	0,020± 0,000	71,4±0,92 a
	0,032 0,001	95,2± 0,14 a	0,024± 0,000	70,6±1,16 a
^а Обработки со стадиями, рекомендуемыми настоящим изобретением. В обработке «Увлажнение + RP-3A» отсутствие соблюдения первой стадии (снижение активности воды в спорах путем высушивания перед упаковыванием до уровней менее 0,3) привело к величине активности воды в конце периода приведения в равновесие выше оптимального предела (0,02-0,03), что привело в результате к меньшим процентам прорастания, чем в предыдущей обработке, где соблюдали все стадии, рекомендуемые в настоящем патенте. ^b Данные собирали непосредственно перед хранением при высокой температуре, следующим за начальным периодом приведения в равновесие в 7 дней при 25°C.

Пример 8: Эффект активной упаковки на срок хранения гриба Metarhizium anisopliae при 40°C

В экспериментах, где соблюдали период приведения в равновесие (8 дней в 25°C) для спор Metarhizium anisopliae (Таблица 5), применение пакетика RP-3K (абсорбирует кислород, но выделяет пары воды) не было достаточно для обеспечения удовлетворительных результатов. При применении его в отдельности выпускаемые пары воды увеличивают активности воды в спорах до очень высоких значений и, следовательно, срок хранения резко снижается. С другой стороны обработка с пакетиком RP-3A, который в дополнение к абсорбции кислорода также абсорбирует пары воды в упаковке, поддерживает активность воды в спорах в пределах оптимальных значений, таким образом, делая вклад в повышенный процент прорастания через 2 недели хранения при 40°C.

Данные в таблице 6 демонстрируют, что способ по настоящему изобретению позволяет достигать жизнеспособности (процента прорастания) порядка 70% для гриба Metarhizium anisopliae через более чем 5 месяцев хранения при 40°C, что никогда не было возможно для этого вида общепринятыми способами. Вообще, минимальная приемлемая жизнеспособность для коммерческих продуктов (микопестицидов) составляет порядка 80%. На основе экстраполяции данных, полученных выше, этот процент мог быть достигнут способом по настоящему изобретению через 4 месяца хранения при 40°C. Эти значения значительно выше, чем таковые, приведенные, например, в патенте США 5989893 авторами Jin et al. (1999), в котором жизнеспособность на уровне приблизительно 80% наблюдали через 2 месяца хранения при 37°C.

Таблица 5 Эффект активности воды (a_w) в конце периода приведения в равновесие на жизнеспособность спор Metarhizium anisopliae, хранящихся при 40°C в течение 2 недель.
	День 0^b		2 недели
Обработка	Исходная a_w	Процент прорастания	Обработка	Исходная a_w
Высушивание + RP-3A (O₂/H₂O абсорбент)^a	0,028± 0,001	80,0±4,00 a	0,027± 0,001	78,9±2,21 a
Высушивание + RP-3K (O₂ абсорбент)	0,246± 0,005	79,3±5,13 a	0,286± 0,006	26,9±10,45 b
^a Обработки со стадиями, рекомендуемыми настоящим изобретением. ^b Данные собирали непосредственно перед хранением при высокой температуре, следующим за начальным периодом приведения в равновесие в течение 8 дней при 25°C.

Таблица 6 Процент прорастания спор после хранения Metarhizium anisopliae при 40°C в течение 5,4 месяца.
	День 0^b		16 месяцев
Обработка	Исходная a_w	Процент прорастания	Обработка	Исходная a_w
RP-3A (O₂/H₂O абсорбент)^a	0,037± 0,001	94,5±1,73	0,021± 0,001	68,3± 3,32
^a Обработки со стадиями, рекомендуемыми настоящим изобретением. ^b Данные собирали непосредственно перед хранением при высокой температуре, следующим за начальным периодом приведения в равновесие в течение 5 дней при 25°C.

В исследованиях предшествующей области техники, приведенных в настоящем описании, наблюдали, что атмосферы, в которых воздух был замещен на CO₂ и N₂, увеличивали срок жизнеспособности спор Beauveria bassiana. Предыдущие попытки увеличить срок хранения этих видов проводили в присутствии воздуха, несмотря на то, что благоприятные эффекты от удаления O₂ (или увеличение концентрации CO₂) во время краткосрочного хранения Metarnizium anisopliae были продемонстрированы уже несколько десятилетий назад авторами Clerk и Madelin (19A5) (Clerk, CG; Madelin, M.F. The longevity of conidia of three insect-parasitizing hyphomycetes. Transactions of the British Mycological Society 48, 193-209, 1965). Патент США 5989898 раскрывает, что споры Metarhizium, высушенные при помощи Drierite™ и хранившиеся в атмосферах, предположительно, без O₂, полученных с применением пакетиков Ageless, вставленных в мешки, непроницаемые для влаги и газа, показали 74%-ую жизнеспособность через 2 месяца при 37°C и не показывали жизнеспособность, если их держали в мешках без абсорбента O₂ или с высокой относительной влажностью в пределах от 40 до 100%. Leite et al. (2002) (Leite, L.G., et al. Preservacao de micelio de Batkoa sp. e Furia sp. (Entomophthorales) em combinacao com dessecantes e redutores de oxigenio. [Сохранение мицелия видов Batkoa и Furia (Entomophthorales) в комбинации с осушителями и поглотителями кислорода] Arquivos do Instituto Biologico 69, 117-122, 2002). Сохраненный сухой мицелий видов Batkoa и Furia в течение 3 месяцев при 23°C с применением Ageless и силикагеля, но дополнительные исследования в отношении упаковки энтомопатогенных грибов в модифицированной атмосфере не известны.

В негерметических пакетах доступность воздуха для спор значительна (Hong, T.O., et al. Saturated salt solutions for humidity control and the survival of dry powder formulations and or of Beauveria bassiana conidia. Journal of Invertebrate Pathology, v.89, p. 136-143, 2005), и поэтому результаты, наблюдаемые в отношении сроков жизнеспособности спор обескураживают. Настоящее изобретение показало, что применение пластмассовых полимеров с высокой проницаемостью для O₂ и влаги совсем нежелательно для упаковки микопестицидов, даже при объединении с эффективным пакетиком для создания активной упаковки. Введение газа (в течение 40 минут) в стеклянные емкости оказалось намного более эффективно, чем применение негерметической упаковки, но менее эффективно, чем применение слоистых пластиков (+ пакетики для создания активной упаковки) для увеличения срока хранения спор Beauveria bassiana по настоящей технологии из-за того, что активность воды после введения газа составляет больше желаемого значения, воздух обменивается с внешней средой, и из-за невозможности удалить больше O₂, присутствующего в упаковке, по применяемым протоколам введения газов. Исследование Teshler et al (2007) (Teshler, M.P. et al. Increased shelf life of the bioherbicide through combining modified atmosphere packaging and low temperatures. Biocontrol Science and Technology 17, 387-400, 2007) раскрывает, что остаточная концентрация O₂ составляет 0,26% после введения газа в упаковку из слоистого пластика. Активности воды оставалась на низких и постоянных уровнях после герметичного заполнения алюминием и применения эффективного абсорбента O₂ и абсорбента влаги. У ангидробиотических организмов могут протекать отдельные ферментативные реакции, которые приводят к образованию свободных радикалов, и неферментативные реакции, опосредованные этими свободными радикалами. Например, могут протекать реакции разложения фосфолипидов с накоплением побочных продуктов (жирные кислоты) в мембранах (McKersie, B.D. et al. Senaratna, T, Walker, MA, Kendall, E.J., Hetherington, P.R. Deterioration of membranes during aging in plants: Evidence for free radical mediation. In: L.D. Nooden, L.D., Leopold, A.C. (Eds.), Senescence and Aging in Plants. Сан-Диего: Academic Press, p. 442-464, 1088). Однако, старение в условиях атмосферы и в отсутствие O₂ и чрезвычайной сухости протекает значительно медленнее, чем в негерметических условиях.

Большинство пакетиков для активных упаковок, протестированные и применяемые в пищевой промышленности, были неэффективны в увеличении жизнеспособности спор Beauveria bassiana, либо поскольку уровни активности воды в спорах увеличивались до нежелательных уровней или поскольку O₂ не снижался до низких уровней. Пакетик с двойным действием, который способен абсорбировать O₂ и влагу, был более эффективен, чем пакетики, которые обладают только одним свойством. Хотя известно, что CO₂ обладает фунгистатическим действием по отношению к росту некоторых грибов (Tabak и Cooke, 1968; Abellana et al. 2000), никакого вредного эффекта не наблюдали в отношении хранящихся энтомопатогенных спор, что предлагает возможность применения активной упаковки при помощи абсорбентов O₂ и пакетиков, выделяющих CO₂.

Срок хранения продолжительностью приблизительно в один год зарегистрирован для относительно теплоустойчивого M. acridum при влажности 6,2% (но то же самое не достигнуто для спор с содержанием воды 7,0%) при 27-32°С и хранящегося под вакуумом (Hong et al., 1999), так же как для масляных композиций Beauveria bassiana при 25°C (Wraight et al., 2001). Согласно настоящему изобретению достигается срок хранения в 8 месяцев для спор с влажностью от 2,1 до 2,4%, упакованных в активную упаковку, что является достаточным количеством времени для распространения в регионах со средними температурами около 40°C. Эксперименты также проводили при 50°C. Подобные или более высокие температуры могут иметь место в определенных регионах (Hong, T.D., Ellis, R.H. Moore, D. Development of a model to predict the effect of temperature and moisture on fungal spore longevity. Annals of Botany, v. 79, p. 121-128, 1997) или во время транспортировки (Ostrem и Godshall, 1979).

В дополнение к факторам, связанным с хранением по своей природе, факторы до хранения, такие как исходное качество пропагул гриба, которые в свою очередь зависят от условий культивирования (Agosin, E. et al. Effect of culture conditions on spore shelf life of the biocontrol agent Trichoderma harzianum. World Journal of Microbiology and Biotechnology v. 13, p. 225-232, 1997; Frey, S., Magan, N. Production of the fungal biocontrol agent Ulocladium atrum by submerged fermentation: accumulation of endogenous reserves and shelf-life studies. Applied Microbiology and Biotechnology, v, 56, p. 372-377, 2001; Tarocco et al. Optimization of erythritol and glycerol accumulation in conidia of Beauveria bassiana by solid-state fermentation, using response surface methodology. Applied Microbiology and Biotechnology v.68, p. 481-488, 2005), высушивание и стадии сбора (Sandoval-Coronado, C.F. et al. Drying and formulation of blastospores of Paecilomyces fumosoroseus (Hyphomycetes) produced in two different liquid media. World Journal of Microbiology and Biotechnology v. 17, p. 423-428, 2001; Bateman, R. Constraints and enabling technologies for mycopesticide development. Outlooks on Pest Management April, p. 64-69. 2004; Jackson, M.A., Payne A.R., Evaluation of the desiccation tolerance of blastospores of Paecilomyces fumosoroseus (Deuteromycotina: Hyphomycetes) using a labscale, air-drying chamber with controlled relative humidity, Biocontrol Science and Technology, v. 17, p. 709-719, 2007.) и составление в композиции (Sandoval Coronado. C.F.. Luna-Olvera, H.A., Arevalo-Nino, K, Jackson, M.A., Poprawski, T.J., Galan-Wong, L.J. Drying and formulation of blastospores of Paecilomyces fumosoroseus (Hyphomycetes) produced in two different liquid media. World Journal of Microbiology and Biotechnology v, 17, p. 423-428, 2001: Batta, Y.A. Production and testing of novel formulations of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae (Metschinkoff) Sorokin (Deuteromycotina:Hyphomycetes). Crop Protection, v. 22, p. 415-422, 2003; Friesen, T. J. et al. Effect of conditions and protectants on the survival of Penicillium bilaiae during storae. Biocontrol Science and Technology, v. 16, p. 80-08, 2006), оказывают сильное влияние на сохранение жизнеспособности при хранении. Это изобретение показывает, что необходимо высушивать упаковываемые споры и выдерживать в умеренных условиях перед экспонированием к воздействию высоких температур так, чтобы высокая исходная активность воды достигала желаемых уровней, и, таким образом, избегать преждевременного отмирания или истощения спор. Факторы после хранения, такие как протокол прорастания, хотя и не связаны непосредственно с продолжительностью хранения, могут привести к ложной жизнеспособности при ненадлежащем выполнении. Сроки хранения, показанные в этом примере, оценивали с акцентом на протокол с быстрым повторным увлажнением (без предварительного экспонирования спор к режиму медленного повторного увлажнения внутри камеры увлажнения в течение 24 ч).

Активность воды предварительно увлажненных спор, находящихся в герметических мешках с Drierite™ или абсорбентом O₂ и влаги, стабильно составляла в диапазоне от 0,010 до 0,030 (относительная влажность в равновесии 1,9-3,0%). Эта небольшая вариация наблюдалась между измерениями, сделанными зимой (лабораторный охладитель и осушитель воздуха) и в сезоны с более высокой температурой и относительной влажностью. Важность высушивания образованных на воздухе грибных спор для увеличения срока хранения была показана ранее (Clerk, C.G.; Madelin, M.F. The longevity of conidia of three insectparasitizing hyphomycetes. Transactions of the British Mycological Society 48, 193-209, 1965; Feng, M.G., Poprawski, T.J., Khachatourians, G.G. Production, formulation and application of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana for insect control: current status. Biocontrol Science and Technology v.4, p 3-34, 1994; Shimizu, S; Mitani, T. Effects of temperature on viability of conidia from Beauveria bassiana in oil formulations. Japanese Journal of Applied Entomology and Zoology v. 44, p.51-53, 2000). В исследованиях с герметическим хранением, при котором воздух не удаляли из упаковок (Hong, T.D., et al Gunn, J The effect of storage environment on the longevity of conidia of Beauveria bassiana. Mycological Research 105, 597-602, 2001), сообщалось, что срок хранения двух изолятов Beauveria bassiana значительно не увеличивался, когда содержание влаги при хранении уменьшалось до значений ниже диапазона 4,6-5,2% в равновесии с относительной влажностью 11-14% при 20°C. В этом исследовании наилучшее значение активности воды в спорах было постоянно связано с Driorite™, в присутствии которого влажность значительно ниже 5%. Результаты, полученные в настоящем изобретении, указывают на то, что при фактически анаэробных условиях (<0,03% O₂) оптимальные значения активности воды для хранения меньше, чем в аэробных атмосферах.

Claims

1. Способ упаковки грибных спор, отличающийся тем, что включает стадии:

(i) снижения исходной активности воды в спорах до менее 0,3;

(ii) помещения спор в непроницаемую для газа и паров воды упаковку, содержащую один агент абсорбции кислорода и один агент абсорбции влаги;

(iii) хранения спор в упаковке в течение, по меньшей мере, двух дней при температуре между 15 и 25°С.

2. Способ согласно п. 1, отличающийся тем, что указанный агент абсорбции влаги выбран из сульфата кальция или силикагеля.

3. Способ согласно любому из пп. 1 или 2, отличающийся тем, что указанные агенты находятся в виде одного или более пакетиков, нетоксичных для спор.

4. Способ согласно п. 1, отличающийся тем, что указанная непроницаемая для газа и паров воды упаковка сделана из материала, выбранного из группы, состоящей из стекла, материалов из слоистого пластика, содержащих алюминий или керамику.

5. Способ согласно п. 1, отличающийся тем, что итоговые значения активности воды после стадии (ii) составляют менее 0,1, предпочтительно, между 0,02 и 0,03.

6. Способ согласно п. 1, отличающийся тем, что указанные споры выбраны из группы родов Metarhizium, Beauvoria, Isaria, Lecanicitlium, Nomuraea и Trichoderma.

7. Грибные споры с увеличенным сроком хранения, упакованные способом по пп. 1-6.

8. Грибные споры согласно п. 7, отличающиеся тем, что они выбраны из родов Metarhizium, Beauvoria, Isaria, Lecanicillium и Nomuraea Trichodormo.

9. Запечатанная упаковка с жизнеспособными спорами грибов, отличающаяся тем, что она непроницаема для газов и паров, и включает в своем внутреннем пространстве:

(i) жизнеспособные споры грибов, упакованные способом по пп. 1-6;

(ii) среду, окружающую споры грибов, в которой относительная влажность после размещения спор в упаковке снижается таким образом, чтобы активность воды в спорах составляла менее 0,1 через промежуток времени, по меньшей мере, в два дня при температуре между 15 и 25°С;

(iii) один агент абсорбции кислорода и один агент абсорбции влаги.

10. Упаковка согласно п. 9, отличающаяся тем, что указанный агент абсорбции влаги выбран из сульфата кальция или силикагеля.

11. Упаковка согласно любому из пп. 9 или 10, отличающаяся тем, что указанные агенты находятся в виде одного или более пакетиков, нетоксичных для спор.

12. Упаковка согласно п. 9, отличающаяся тем, что она сделана из материала, выбранного из группы, состоящей из стекла, материалов из слоистого пластика, содержащих алюминий или керамику.

13. Упаковка согласно п. 9, отличающаяся тем, что итоговые значения активности воды составляют между 0,02 и 0,03.

14. Упаковка согласно п. 9, отличающаяся тем, что указанные споры выбраны из группы родов Metarhizium, Beauvoria, Isaria, Lecanicitlium, Nomuraea и Trichoderma.