KR102045206B1 - 효소 면역 분석 시스템 및 이를 이용한 효소 면역 분석 방법 - Google Patents

효소 면역 분석 시스템 및 이를 이용한 효소 면역 분석 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 ELISA 방법에서 항원 또는 항체의 부착 면적을 넓히기 위한 구조를 제시하고, 이를 통해 손실되는 항원 또는 항체를 줄임으로써 낮은 농도에서도 진단률을 향상시키고자 한다. 본 발명의 일 실시예에 따른 효소 면역 분석 시스템은 n x m 개의 웰들을 포함하는 웰 플레이트; 및 멤브레인 구조체를 포함한다.

Description

효소 면역 분석 시스템 및 이를 이용한 효소 면역 분석 방법 {Enzyme-Linked Immunosorbent Assay System and method of using thereof}
본 발명은 효소 면역 분석 시스템에 관한 것이고, 또한 이러한 효소 면역 분석 시스템을 이용한 효소 면역 분석 방법에 관한 것이다. 추가적으로 본 발명은 효소 면역 분석을 위한 멤브레인 구조체를 개시하고 있으며, 이러한 멤브레인 구조체를 이용한 효소 면역 분석 시스템을 개시하고 있다.
진단시장은 국내뿐 아니라 전 세계적으로 매년 성장하고 있으며, 간편하고 신속한 진단이 중요한 이슈로 대두되고 있다. 특히 체외 진단은 인체로부터 채취된 대상물을 이용하는 진단법이며, 면역화학적 진단, 자가 혈당 진단, 현장진단, 분자진단, 혈액진단, 임상 미생물학적 진단, 지혈진단, 조직 진단 등 크게 8부분으로 나뉜다. 특히 면역화학적 진단은 체외 진단 분야에서 큰 비중을 차지하고, 널리 이용되는 진단 방법 중 하나이다.
면역 진단은 항원-항체 반응을 이용하고, 일반적으로 항원-항체 반응을 이용하여 각종 암 마커, 감염성 질환, 갑상선 기능, 빈혈, 알레르기, 임신, 약물남용 등의 매우 다양한 질환 진단과 추적에 이용된다. 면역분석 방법 중 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (효소면역측정법,ELISA)은 오랜 기간 동안 전 세계적으로 가장 많이 사용되고 있는 분석방법 중 하나로, 항원-항체반응을 이용하여 항원 또는 항체를 정성, 정량할 수 있는 감도 높은 분석방법이다.
ELISA이란 항체나 항원이 고체상에 흡착 되어지고, 여러 세척과정과 항원-항체 반응으로 반응시키고자 하는 물질과 반응을 시킨 뒤, 항원 또는 항체에 효소를 결합시켜 이 효소와 반응하는 기질 용액의 색변화를 관찰함으로써 반응시키고자 하는 물질을 정성적, 정량적으로 분석할 수 있는 진단방법이다.
ELISA는 효소를 표식자로 하여 항원항체반응을 이용한 항원 또는 항체량 측정 방법을 총칭하는 효소면역분석법을 의미한다. ELISA 플레이트는 도 1에 나타난 것과 같은 웰(well) 형태의 반응용기를 사용한다. 이러한 용기 형태의 기판을 구비하고 있는 웰(well)이나 반응용기(chamber)의 표면에서 항원-항체 반응에 의한 면역반응을 진행한다. 용기의 표면에서 항원-항체 반응에 의한 면역반응을 형광이나 흡광도 변화로 측정하며 이러한 항원-항체 반응에 의한 면역 반응을 위해, 분석시료와 세척시료 및 반응시료를 순차적으로 넣는다. 여기서, 반응 결과물은 colorimetric 효소를 이용하여 용기 내 용액의 색깔변화를 감지하여 분석할 수도 있다.
이러한 종래의 ELISA 방식은 도 2와 같이 웰의 하부 바닥에 항체 또는 항원이 흡착되어 이용되며, 이러한 흡착시 바닥면에서만 흡착이 이루어지기 때문에 항체가 도 2에서와 같이 항원이 부착될 수 있는 형태로 흡착되지 못하고 옆으로 누워있는 경우들이 많이 발생되고, 이러한 경우에는 손실되는 항체 또는 항원이 발생되어 진단률이 낮아지게 되는 문제점이 발생된다.
또한, 기존의 ELISA 방법은 항체나 항원이 고체상, 대부분 웰 플레이트의 밑 바닥면과의 흡착(adsorbent)을 이용하게 된다. 바닥면은 원형의 2-D 구조(도 2)로 그 표면적이 한계가 있으며, 흡착(adsorbent)은 반데르발스 힘 또는 약한 물리적 힘에 의해서 표면에 부착되는 것으로 결합력이 약하기 때문에 ELISA에서 이뤄지는 다수의 세척에 의해 항체 또는 항원의 탈착이 용이한 문제점을 갖는다.
본 발명은 ELISA 방법에서 항원 또는 항체의 부착 면적을 넓히기 위한 구조를 제시하고, 이를 통해 손실되는 항원 또는 항체를 줄임으로써 낮은 농도에서도 진단률을 향상시키는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 ELISA 방법에서 항원 또는 항체의 부착을 강하게 하기 위해 표면을 처리하는 방법을 제시함으로써 다수의 세척에 의한 항원 또는 항체의 탈락을 방지하고자 한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 효소 면역 분석법을 위한 멤브레인 구조체는, 지지대; 및 상기 지지대의 하부에 길이 방향을 따라 일정한 간격으로 배치된 복수개의 멤브레인 구조물을 포함하고, 상기 복수개의 멤브레인 구조물에 효소 면역 분석법을 위한 캡쳐 항체(capture antibody)가 부착된다.
상기 멤브레인 구조물은 메쉬 구조이고, 이에 의해 캡쳐 항체가 부착되는 표면적이 넓어진다.
상기 멤브레인 구조물은 합성수지, 플라스틱, 종이 중 어느 하나 이상으로 이루어지는 것이 바람직하다.
상기 멤브레인 구조물의 표면은 항체 또는 항원이 공유 결합으로 부착되도록 작용기 처리되어 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 효소 면역 분석 시스템은, n x m 개의 웰들을 포함하는 웰 플레이트; 및 지지대; 및 상기 지지대의 하부에 길이 방향을 따라 일정한 간격으로 n개의 멤브레인 구조물이 배치된 멤브레인 구조체를 포함하고, 복수개의 멤브레인 구조물에 효소 면역 분석법을 위한 캡쳐 항체가 부착되며, 이 경우 n은 2 이상의 정수이고, m은 2 이상의 정수이다.
상기 멤브레인 구조물은 메쉬 구조이고, 이에 의해 캡쳐 항체가 부착되는 표면적이 넓어진다.
상기 멤브레인 구조물은 합성수지, 플라스틱, 종이 중 어느 하나 이상으로 이루어지는 것이 바람직하다.
상기 멤브레인 구조물의 표면은 항체 또는 항원이 공유 결합으로 부착되도록 작용기 처리되어 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 효소 면역 분석 방법은, i) 제 5 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 효소 면역 분석 시스템을 준비하는 단계; ii) m 열 중 캡쳐 항체가 포함된 용액을 포함한 열의 웰에 상기 멤브레인 구조물을 담금에 의해 상기 멤브레인 구조물에 캡쳐 항체를 부착시키는 단계; iii) m 열 중 타겟 항원이 포함된 용액을 포함한 열의 웰에 상기 멤브레인 구조물을 담금에 의해 타겟 항원이 캡쳐 항체와 반응하는 단계; iv) m 열 중 효소 복합체가 결합된 2차 항체가 포함된 용액을 포함한 열의 웰에 상기 멤브레인 구조물을 담금에 의해 효소 복합체가 결합된 2차 항체가 타겟 항원과 반응하는 단계; v) m 열 중 기질 용액을 포함한 열의 웰에 상기 멤브레인 구조물을 담금에 의해 효소가 기질과 반응하는 단계를 포함한다.
상기 m열의 나머지 열의 웰에는 세척 버퍼(washing buffer) 용액이 포함되어 있고, 상기 ii), iii), iv), v) 단계의 각각의 단계 이후 세척 단계를 추가로 포함한다.
상기 ii) 단계 및 상기 iii) 단계 사이에 블록킹 단계(blocking process)를 추가로 포함한다.
지지대; 및 상기 지지대의 하부에 길이 방향을 따라 일정한 간격으로 n개의 멤브레인 구조물이 배치된 멤브레인 구조체에 의해, m열의 복수개의 웰을 상기 멤브레인 구조체가 이동하면서 효소 면역 분석을 수행한다. 상기 멤브레인 구조체의 이동이 시간에 따라 제어될 수 있다.
본 발명에 따르면, 멤브레인 구조체의 넓은 표면적과 표면 처리를 하였을 때 기존의 ELISA 방식보다 전체적으로 높은 반응성을 확인하였다. 이는 항원 또는 항체가 기존 ELISA 에 비해 멤브레인 표면에 부착되는 항원 또는 항체가 많음을 의미 하는 것이다. 특히, ELISA의 진단에서 많이 이용되는 낮은 농도(100ng/ml)에서 항체 또는 항원의 부착능력이 10배 높음을 확인함으로써 본 발명의 유용성을 입증하였다.
도 1은 기존의 면역 진단 반응에서 사용되는 96 웰 플레이트(well plate)를 나타내는 도면이다.
도 2는 종래 기술에 따른 웰에 항원 또는 항체가 부착되는 모습을 도시하는 개략도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 효소 면역 분석법을 위한 멤브레인 구조체의 개략도를 도시한다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 멤브레인 구조체의 실제 제작된 형태의 모습을 도시한다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 효소 면역 분석 시스템의 개략도이다.
도 6은 웰 플레이트의 개략도를 도시한다.
도 7은 PMMA를 이용하여 제작한 기둥구조의 구조물의 실제 모습을 도시한다.
도 8은 본 발명의 실시예 및 비교예에서 항원 농도 0~1600ng/ml에서 OD 값을 측정한 것이다.
도 9는 본 발명의 실시예 및 비교예에서 항원 농도 0~100ng/ml에서 OD 값을 측정한 것이다.
다양한 실시예들이 이제 도면을 참조하여 설명되며, 전체 도면에서 걸쳐 유사한 도면번호는 유사한 엘리먼트를 나타내기 위해서 사용된다. 설명을 위해 본 명세서에서, 다양한 설명들이 본 발명의 이해를 제공하기 위해서 제시된다. 그러나 이러한 실시예들은 이러한 특정 설명 없이도 실행될 수 있음이 명백하다. 다른 예들에서, 공지된 구조 및 장치들은 실시예들의 설명을 용이하게 하기 위해서 블록 다이아그램 형태로 제시된다.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명의 실시예에 대해 상세히 설명한다. 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 본문에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 각 도면을 설명하면서 유사한 참조부호를 유사한 구성요소에 대해 사용하였다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시 예를 설명하기 위해 사용된 것으로서 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명은 ELISA 방법에서 항원 또는 항체의 부착 면적을 넓히기 위한 구조를 제시하고, 이를 통해 손실되는 항원 또는 항체를 줄임으로써 낮은 농도에서도 진단률을 향상시키고자 하며, 또한 항원 또는 항체의 부착을 강하게 하기 위해 표면을 처리하는 방법을 제시함으로써 다수의 세척에 의한 항원 또는 항체의 탈락을 방지하고자 한다.
종래의 ELISA 방식은 도 2와 같이 웰의 하부 바닥에 항체 또는 항원이 흡착되어 이용되며, 이러한 흡착시 바닥면에서만 흡착이 이루어지기 때문에 항체가 도 2에서와 같이 항원이 부착될 수 있는 형태로 흡착되지 못하고 옆으로 누워있는 경우들이 많이 발생되고, 이러한 경우에는 손실되는 항체 또는 항원이 발생되어 진단률이 낮아지게 되는 문제점이 발생된다. 본 발명에서는 기존에 웰 바닥면에 항원 또는 항체를 부착시켜서 반응시키는 방법 대신 새로운 멤브레인 구조체를 제작하고 이러한 새로운 멤브레인 구조체에 항원 또는 항체를 부착시켜서 반응을 시키고자 한다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 효소 면역 분석법을 위한 멤브레인 구조체의 개략도를 도시한다.
본 발명의 일 실시에에 따른 효소 면역 분석법을 위한 멤브레인 구조체는, 지지대(10); 지지대의 하부에 길이 방향을 따라 일정한 간격으로 배치된 복수개의 멤브레인 구조물(20)을 포함한다.
지지대(10)는 멤브레인 구조물들이 그 지지대 하부에 배치되어 멤브레인 구조물들을 연결하고 있으며, 이러한 지지대를 웰들에서 이동시킴으로써 면역 효소 분석법을 실시할 경우 복수의 웰들에서 순차적으로 일괄 처리가 가능하게 되는 장점을 갖게 된다.
멤브레인 구조물(20)은 지지대의 하부에 길이 방향을 따라 일정한 간격으로 배치된다. 멤브레인 구조물은 웰의 열 방향을 따라 지지대를 이용하게 일괄 이동하게 되며, 따라서 복수개의 멤브레인 구조물이 배치될 수 있고, 일반적으로 8개의 구조물이 하나의 지지대에 연속적으로 부착되어 있다. 이러한 모습은 도 4의 실제 제작예에서 볼 수 있다. 도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 멤브레인 구조체의 실제 제작된 형태의 모습을 도시한다.
복수개의 멤브레인 구조물에는 효소 면역 분석법을 위한 캡쳐 항체(30)가 부착되며, 이러한 항체가 부착된 모습이 도 3에서 도시되어 있다.
도 3의 모습에서와 같이 멤브레인 구조체는 항원 또는 항체를 부착시킬 수 있는 기둥 구조의 멤브레인 구조물과 그 기둥 구조를 옮길 수 있는 지지대로 구성이 된다. 기둥 구조의 수량은 적게는 1개에서 웰의 형상에 따라서 96개까지 제작이 가능하며 더 많은 수량도 제작이 가능하다. 이 기둥 구조는 기존의 도 2와 같이 2-D 구조인 웰 바닥면에 부착시키는 방법 대신 3-D 구조로 옆면과 밑면에 항원 또는 항체의 부착이 가능하며 형상에 따라서 사각기둥, 원기둥, 오각기둥 등으로 제작가능하며 복잡하게는 그물 구조, 스파이럴 구조, 덤벨구조, 등으로 제작이 가능하다. 또한 제작방법으로는 기계가공, 금형가공, 3-D 프린터 가공 등 여러 가지 가공법이 있다. 멤브레인 구조물은 합성수지, 플라스틱, 종이로 이루어질 수 있다. 이처럼 본 발명에서는 3-D로 멤브레인 구조물을 기둥 형태로 제작하고 지지대를 이용하여 웰의 바닥이 아닌 웰의 상부 개방부로부터 아래로 뻗어 있는 기둥 구조물을 이용함으로써 항체 또는 항원이 부착되는 표면적을 넓힐 수 있다.
또한, 본 발명에서는 도 4와 같이 멤브레인 구조물이 메쉬 구조로 제작될 수 있고, 이에 의해 캡쳐 항체가 부착되는 표면적을 더욱 넓힐 수 있다.
추가적으로 본 발명에서 멤브레인 구조물의 표면은 항체 또는 항원이 공유 결합으로 부착되도록 작용기 처리되어 있다. 이에 의해 기존의 기술의 문제점인 웰의 바닥면에 항체 또는 항원이 흡착, 즉 반데르발스 힘 또는 약한 물리적 힘에 의해서 표면에 부착되어 결합력이 약하기 때문에 ELISA에서 이뤄지는 다수의 세척에 의해 항체 또는 항원의 탈락되는 문제점을 해결하였다. 본 발명에서는 강력한 공유결합에 의하여 항원과 항체 부착이 용이하게 하기 위해서 표면 처리를 하였다. 공유 결합에 의해 항원과 항체를 고체상에 결합시킬 수 있는 아미노기, 카르복실기, 수산화기, 황화수소기 등의 작용기로 표면을 처리하는 것이 바람직하다.
지금까지 본 발명의 일 실시예에 따른 효소 면역 분석법을 위한 멤브레인 구조체에 대해 설명하였으며, 이하에서는 이러한 효소 면역 분석법을 위한 멤브레인 구조체를 이용한 효소 면역 분석 시스템 및 이러한 시스템을 이용한 분석 방법에 대해 차례대로 설명하도록 하겠다. 위에서 설명한 내용과 중복되는 부분에 대해서는 반복 설명을 생략하도록 하겠다.
본 발명의 일 실시예에 따른 효소 면역 분석 시스템은 n x m 개의 웰들을 포함하는 웰 플레이트; 및 멤브레인 구조체를 포함한다. 도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 효소 면역 분석 시스템의 개략도이고, 도 6은 웰 플레이트의 개략도를 도시한다.
도 5 및 도 6에서 도시된 것처럼, 웰 플레이트(50)는 n x m개의 웰들(55)을 포함하고, 도 6의 모습에서는 n은 8이고 m은 12이다. 도 6에서 웰들은 일정한 간격으로 나란히 배열되며 n=8개를 기준으로 m열을 따라 12열이 배치되어 있다. n은 2 이상의 정수이고, m은 2 이상의 정수일 수 있다.
멤브레인 구조체는 지지대(10); 및 지지대의 하부 방향에 길이 방향을 따라 일정한 간격으로 n개의 멤브레인 구조물이 배치되며, 도 5의 실시예에서는 n은 8이다. 복수개의 멤브레인 구조물에 효소 면역 분석법을 위한 캡쳐 항체가 부착되며, 이 부분은 이미 위에서 설명하였다.
도 3 및 4의 실시예에서 설명한 것처럼, 멤브레인 구조물은 메쉬 구조이고, 이에 의해 캡쳐 항체가 부착되는 표면적이 넓어질 수 있다. 또한, 멤브레인 구조물은 합성수지, 플라스틱, 종이로 이루어질 수 있으며, 멤브레인 구조물의 표면은 항체 또는 항원이 공유 결합으로 부착되도록 작용기 처리되어 있을 수 있다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 효소 면역 분석 방법의 순서도를 도시한다. 본 발명의 일 실시예에 따른 효소 면역 분석 방법은, 효소 면역 분석 시스템을 준비하는 단계(S 710); m 열 중 캡쳐 항체가 포함된 용액을 포함한 열의 웰에 상기 멤브레인 구조물을 담금에 의해 상기 멤브레인 구조물에 캡쳐 항체를 부착시키는 단계(S 720); m 열 중 타겟 항원이 포함된 용액을 포함한 열의 웰에 상기 멤브레인 구조물을 담금에 의해 타겟 항원이 캡쳐 항체와 반응하는 단계(S 730); m 열 중 효소 복합체가 결합된 2차 항체가 포함된 용액을 포함한 열의 웰에 상기 멤브레인 구조물을 담금에 의해 효소 복합체가 결합된 2차 항체가 타겟 항원과 반응하는 단계(S 740); m 열 중 기질 용액을 포함한 열의 웰에 상기 멤브레인 구조물을 담금에 의해 효소가 기질과 반응하는 단계(S 750)를 포함한다.
S 710 단계에서는 위에서 설명한 효소 면역 분석 시스템을 준비한다.
S 720 단계에서는 m 열 중 캡쳐 항체가 포함된 용액을 포함한 열의 웰에 상기 멤브레인 구조물을 담금에 의해 상기 멤브레인 구조물에 캡쳐 항체를 부착시키게 된다.
S 730 단계에서는 m 열 중 타겟 항원이 포함된 용액을 포함한 열의 웰에 상기 멤브레인 구조물을 담금에 의해 타겟 항원이 캡쳐 항체와 반응시키게 된다.
S 740 단계에서는 m 열 중 효소 복합체가 결합된 2차 항체가 포함된 용액을 포함한 열의 웰에 상기 멤브레인 구조물을 담금에 의해 효소 복합체가 결합된 2차 항체가 타겟 항원과 반응시키게 된다.
S 750 단계에서는 m 열 중 기질 용액을 포함한 열의 웰에 상기 멤브레인 구조물을 담금에 의해 효소가 기질과 반응시키게 된다.
바람직하게는 m 열 중 첫번째 열의 웰은 캡쳐 항체가 포함된 용액을 포함하고, 두번째 열의 웰은 타겟 항원이 포함된 용액을 포함하며, 세번째 열의 웰은 효소 복합체가 결합된 2차 항체를 포함한 용액을 포함하고, 네번째 열의 웰은 기질 용액을 포함하고 있는 것이 바람직하다. 이에 의해 본 발명에서는 효소 면역 분석 시스템을 이용한 분석시 병렬적으로 순차적으로 배치된 웰들을 멤브레인 구조체가 순차적으로 이동함으로써 일괄적으로 한번에 효소 면역 분석이 가능하다는 장점을 갖는다.
한편, m열의 나머지 열의 웰에는 세척 버퍼(washing buffer) 용액이 포함되어 있고, S 720 내지 S 750 단계의 각각의 단계 이후 세척 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이 역시 본 발명에서는 효소 면역 분석 시스템에서 지지대를 포함하고 지지대 하부에 멤브레인 구조물이 배치되어 있어 순차적으로 멤브레인 구조체가 버퍼 용액이 포함된 웰로 이동 가능하므로 역시 일괄적으로 한번에 면역 분석 과정이 가능하다. 다시 말하면, 본 발명에서는 지지대; 및 지지대의 하부에 길이 방향을 따라 일정한 간격으로 n개의 멤브레인 구조물이 배치된 멤브레인 구조체에 의해, m열의 복수개의 웰을 상기 멤브레인 구조체가 이동하면서 일괄적으로 한번에 효소 면역 분석을 수행이 가능한 것이다. 종래 기술과 달리 멤브레인 구조체가 직접 웰들을 이동하게 되므로 순차적인 과정을 통해 한번에 분석이 수행 가능하다. 이러한 멤브레인 구조체의 이동이 시간에 따라 제어될 수 있다.
또한, S 720 단계 및 S 730 사이에는 블록킹 단계(blocking process)를 추가로 포함할 수 있다.
지금까지 본 발명의 효소 면역 분석 시스템 및 이를 이용한 효소 면역 분석 방법에 대해서 설명하였으며, 이하에서는 구체적인 실시예와 함께 본 발명의 내용을 추가적으로 설명하도록 하겠다.
플라스틱 멤브레인을 제작함에 있어서 실시예에서는 plastic 재질 중 PMMA를 이용하여 기둥구조의 구조물을 제작하였다. 제작된 구조물의 실제 모습은 도 7에서 도시되어 있다. 기둥구조의 지름이 약 0.35cm 이며 길이는 1.2cm, 기둥 구조 간의 중심거리는 0.9cm이며 항원 또는 항체 반응을 할 수 있는 반응 길이는 약 1cm 정도 된다. 기둥 구조의 표면처리는 30% KOH 에서 10분 동안 정치시켜 표면에 OH 기를 만들었으며, 이와 반응되는 1% APTES (in 5% EtOH)에 37도에서 120분간 정치시켜 표면에 아미노기를 생성하였다. 또한 2% GA (in PB solution) 에 상온에서 120분간 정치시켜 antibody와 부착될 수 있도록 알데하이드기를 생성하였다. 이후 96 웰-플레이트에 기둥구조가 충분히 담길 수 있는 용량의 10ug/ml의 캡쳐 항체(in PBS, mouse IgG)를 분주한 뒤 1시간 동안 37도에서 정치시켜 기둥구조에 캡쳐 항체를 부착시켰다. 워싱 1(PBS), 블록킹 (0.5% casein in 1×PBS), 워싱 2 (PBST)를 거치며 부착이 되지 않은 캡쳐 항체를 제거하였다. 또한 항원(in mouse serum) 과 2차 항체(mouse IgG, 2.5ug/ml), 효소인 HRP(1:2,500)가 결합된 용액을 각 웰에 기둥구조가 충분히 담길 수 있는 양을 분주한 뒤 30분간 37도에서 정치시켜 캡쳐 항체에 반응시켰다. 워싱(washing) 3 (PBST)를 통하여 부착되지 않은 항원, 2차 항체, HRP를 세척해 주고 TMP를 이용하여 상온에서 10분 정치한 뒤 OD(optical density) 값을 측정하였다.
또한 이와 비교하려고 하는 비교예인 일반 ELISA는 항원과 항체, 효소는 위의 것과 동일하게 이용하였다. 먼저 각 웰 에 캡쳐 항체(in PBS, 10ug/ml)을 100ul 씩 분주한다. 1시간 동안 37도에서 정치시켜 웰 바닥면에 캡쳐 항체를 부착시켰다. 워싱 1(PBS), 블록킹 (0.5% casein in 1×PBS), 워싱 2 (PBST)를 거치며 부착이 되지 않은 캡쳐 항체를 제거하였다. 또한 항원( in mouse serum)과 2차 항체(mouse IgG, 2.5ug/ml), 효소인 HRP가 결합된 용액을 각 웰에 100ul 씩 분주한 뒤 30분간 37도에서 정치시켜 캡쳐 항체에 반응시켰다. 워싱 3 (PBST)를 통하여 부착되지 않은 항원, 2차 항체, HRP(1:2,500)를 세척해 주고 TMP를 이용하여 상온에서 10분 정치한 뒤 OD(optical density) 값을 측정하였다.
각 OD 값은 백그라운드 레벨(background level)을 제외하여 산출되었으며 그 결과는 도 8과 도 9로 표현된다. 도 8은 항원 농도 0~1600ng/ml에서 OD 값을 측정한 것이다. 붉은 선은 표면 처리한 PMMA 멤브레인을 이용한 것이며 검은 선은 기존의 ELISA를 이용한 것이다. 붉은 선은 표면 처리한 PMMA 멤브레인의 경우 전체적으로 OD 값이 높게 나왔다. 또한 ELISA 진단에서 많이 측정되는 0~100ng/ml의 OD 값을 나타낸 것이 도 9인데, 이를 보면 항원 농도 10ng/ml에서 최대 10배 이상의 OD 값을 확인할 수 있었다.
실시예 2에서는 재질로서 PP 와 PMMA의 재질의 플라스틱을 이용하여 순서대로 ELISA를 진행하였다. 각 재질의 기둥 구조의 표면처리는 30% KOH을 이용하여 OH 기를 만들었으며, 1% APTES (in 5% EtOH)을 이용하여 표면에 아미노기를 생성, 그리고 2% GA (in PB solution)을 이용하여 알데하이드기를 생성하였다. 이후 96 웰 플레이트에 기둥구조가 충분히 담길 수 있는 용량의 10ug/ml의 캡쳐 항체(in PBS, mouse IgG)를 분주한 뒤 overnight 동안 상온에서 정치시켜 기둥구조에 캡쳐 항체를 부착시켰다. 워싱 1(PBS), 블록킹 (0.5% casein in 1×PBS), 워싱 2 (PBST)를 거치며 부착이 되지 않은 캡쳐 항체를 제거하였다. 또한 항원( in mouse serum)과 2차 항체(mouse IgG, 2.5ug/ml), 효소인 HRP(1:2,500)가 결합된 용액을 각 웰에 기둥구조가 충분히 담길 수 있는 양을 분주한 뒤 30분간 37도에서 정치시켜 캡쳐 항체에 반응시켰다. 워싱 3 (PBST)를 통하여 부착되지 않은 항원, 2차 항체, HRP를 세척해 주고 TMP를 이용하여 상온에서 10분 정치한 뒤 OD(optical density) 값을 측정하여 도 10과 같은 결과를 도출하였다. PMMA가 OD 값이 PP에 비해서 약간 높았으나 그 경향성은 비슷한 것으로 확인할 수 있었다. 이러한 실시예 2를 통해 기둥구조의 PP, PMMA를 이용한 ELISA를 진행해서 기타 다른 플라스틱의 기둥구조물에서도 ELISA 가 가능함을 확인하였다.
제시된 실시예들에 대한 설명은 임의의 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명을 이용하거나 또는 실시할 수 있도록 제공된다. 이러한 실시예들에 대한 다양한 변형들은 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백할 것이며, 여기에 정의된 일반적인 원리들은 본 발명의 범위를 벗어남이 없이 다른 실시예들에 적용될 수 있다. 그리하여, 본 발명은 여기에 제시된 실시예들로 한정되는 것이 아니라, 여기에 제시된 원리들 및 신규한 특징들과 일관되는 최광의의 범위에서 해석되어야 할 것이다.

Claims (13)

  1. 지지대; 및
    상기 지지대의 하부에 길이 방향을 따라 일정한 간격으로 배치된 복수개의 멤브레인 구조물을 포함하고,
    상기 복수개의 멤브레인 구조물에 효소 면역 분석법을 위한 캡쳐 항체(capture antibody)가 부착되며,
    상기 멤브레인 구조물은 메쉬 구조이고, 이에 의해 캡쳐 항체가 부착되는 표면적이 넓어진,
    효소 면역 분석법을 위한 멤브레인 구조체.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 멤브레인 구조물은 합성수지, 플라스틱, 종이 중 어느 하나 이상으로 이루어진,
    효소 면역 분석법을 위한 멤브레인 구조체.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 멤브레인 구조물의 표면은 항체 또는 항원이 공유 결합으로 부착되도록 작용기 처리되어 있는,
    효소 면역 분석법을 위한 멤브레인 구조체.
  5. n x m 개의 웰들을 포함하는 웰 플레이트; 및
    지지대; 및 상기 지지대의 하부에 길이 방향을 따라 일정한 간격으로 n개의 멤브레인 구조물이 배치된 멤브레인 구조체를 포함하고,
    복수개의 멤브레인 구조물에 효소 면역 분석법을 위한 캡쳐 항체가 부착되는,
    n은 2 이상의 정수이고, m은 2 이상의 정수이며,
    상기 멤브레인 구조물은 메쉬 구조이고, 이에 의해 캡쳐 항체가 부착되는 표면적이 넓어진,
    효소 면역 분석 시스템.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 멤브레인 구조물은 메쉬 구조이고, 이에 의해 캡쳐 항체가 부착되는 표면적이 넓어진,
    효소 면역 분석 시스템.
  7. 제 5 항에 있어서,
    상기 멤브레인 구조물은 합성수지, 플라스틱, 종이 중 어느 하나 이상으로 이루어진,
    효소 면역 분석 시스템.
  8. 제 5 항에 있어서,
    상기 멤브레인 구조물의 표면은 항체 또는 항원이 공유 결합으로 부착되도록 작용기 처리되어 있는,
    효소 면역 분석 시스템.
  9. i) 제 5 항, 제 7 항 및 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 효소 면역 분석 시스템을 준비하는 단계;
    ii) m 열 중 캡쳐 항체가 포함된 용액을 포함한 열의 웰에 상기 멤브레인 구조물을 담금에 의해 상기 멤브레인 구조물에 캡쳐 항체를 부착시키는 단계;
    iii) m 열 중 타겟 항원이 포함된 용액을 포함한 열의 웰에 상기 멤브레인 구조물을 담금에 의해 타겟 항원이 캡쳐 항체와 반응하는 단계;
    iv) m 열 중 효소 복합체가 결합된 2차 항체가 포함된 용액을 포함한 열의 웰에 상기 멤브레인 구조물을 담금에 의해 효소 복합체가 결합된 2차 항체가 타겟 항원과 반응하는 단계;
    v) m 열 중 기질 용액을 포함한 열의 웰에 상기 멤브레인 구조물을 담금에 의해 효소가 기질과 반응하는 단계를 포함하고,
    상기 ii) 단계 및 상기 iii) 단계 사이에 블록킹 단계(blocking process)를 추가로 포함하는,
    효소 면역 분석 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 m열의 나머지 열의 웰에는 세척 버퍼(washing buffer) 용액이 포함되어 있고, 상기 ii), iii), iv), v) 단계의 각각의 단계 이후 세척 단계를 추가로 포함하는,
    효소 면역 분석 방법.
  11. 삭제
  12. 제 9 항에 있어서,
    지지대; 및 상기 지지대의 하부에 길이 방향을 따라 일정한 간격으로 n개의 멤브레인 구조물이 배치된 멤브레인 구조체에 의해, m열의 복수개의 웰을 상기 멤브레인 구조체가 이동하면서 효소 면역 분석을 수행하는,
    효소 면역 분석 방법.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 멤브레인 구조체의 이동이 시간에 따라 제어되는,
    효소 면역 분석 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004037453A (ja) * 2002-04-15 2004-02-05 Becton Dickinson & Co アンカー装置としての多ピンプラットフォームの使用
KR101168166B1 (ko) 2012-02-29 2012-07-24 케이맥(주) 생체물질 검출용 소자
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100517112B1 (ko) * 2002-04-12 2005-09-27 김희태 지지체로서 멤브레인을 사용한 마이크로웰 플레이트단백질 칩, 이의 제조 방법 및 이를 이용하여 단백질을측정하는 방법
KR20170050399A (ko) * 2015-10-30 2017-05-11 전자부품연구원 자동 면역 검사 시스템 및 방법

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004037453A (ja) * 2002-04-15 2004-02-05 Becton Dickinson & Co アンカー装置としての多ピンプラットフォームの使用
KR101168166B1 (ko) 2012-02-29 2012-07-24 케이맥(주) 생체물질 검출용 소자
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