KR102044585B1

KR102044585B1 - 결핵의 예방에서 경구 이용을 위한 불활성화된 미코박테리아

Info

Publication number: KR102044585B1
Application number: KR1020157000802A
Authority: KR
Inventors: 페레-후안 카르도나 이글레시아스; 크리스티나 빌라플라나 마싸구에르; 엘레나 마르조 에스카르틴
Original assignee: 펀다시오 인스티투트 퍼 에이 라 인베스티가시오 엔 시엔시에스 데 라 살루트 ＂게르만스 트리아스 아이 푸졸＂(아이지티피); 싸이베르 데 엔페르메다데스 레스피라토리아스 (싸이베레스)
Priority date: 2012-06-15
Filing date: 2013-06-13
Publication date: 2019-11-13
Also published as: ES2694412T3; ZA201500270B; WO2013186409A8; US9579371B2; RU2015101114A; KR20150036051A; WO2013186409A1; JP2015523351A; EP2865388A1; JP6159396B2; RU2657753C2; CN104582721B; EP2865388A4; PL2865388T3; ES2438690A1; EP2865388B1; PH12014502796A1; ES2438690B1; US20150174229A1; CA2876527A1

Abstract

본 발명은 결핵의 예방에서 경구 이용을 위한 불활성화된 미코박테리아에 관계하고, 이들은 예로서, 결핵균에 의한 감염에 대한 관용-구축을 유도하기 위해, 다중-복용량 섭생을 이용하여, 그리고 복용 사이에 감소된 시간 간격에서 투여된다. 불활성화된 세균은 잠복 상태에서 활동성 결핵으로 감염의 진행을 제어하기 위해 전술한 섭생에서 이용될 수 있다.

Description

결핵의 예방에서 경구 이용을 위한 불활성화된 미코박테리아{INACTIVATED MYCOBACTERIA FOR ORAL USE IN THE PREVENTION OF TUBERCULOSIS}

발명의 분야

본 발명은 결핵을 예방하기 위한, 특히 상기 질환의 잠복 감염의 활동성 감염으로의 전환을 제어하기 위해 경구 투여된 약용 산물의 분야에 포함된다.

선행 기술

결핵은 현재 바실루스 결핵균 (M. tuberculosis), 미코박테리움 보비스 (M. bovis), 미코박테리움 미르코티 (M. microti) 및 미코박테리움 아프리카눔 (M. africanum)을 포함하는 군 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis)-복합체 (MTB-C)에 속하는 세균에 의해 유발된 만성 감염성 질환이고, 결핵균 (M. tuberculosis)은 인간 결핵과 관련하여 가장 중요하고 가장 흔한 병원체이다. 상기 질환은 일차적으로 폐에 영향을 주지만, 일부 경우에 다른 장기로도 확산될 수 있다. 적절하게 치료되지 않으면, 결핵은 치명적일 수 있다.

2011년 세계 보건 기구 보고에 따르면, 상기 질환을 나타내는 사람의 매년 9백만 건의 새로운 사례가 전 세계적으로 기록되고, 그리고 약 1.7백만 건의 죽음이 보고된다. 또한, 2,500백만 명 이상이 전 세계적으로 감염되고 약 100 백만 건의 새로운 감염이 매년 발생하는 것으로 고려된다.

결핵은 공기에 의해 전염되고, 따라서 폐 내에 결핵성 공동을 갖는 환자는 예로서, J. Grosset, Studies in short-course chemotherapy for tuberculosis. Basis for short-course chemotherapy, Chest, 1981, 80, 719-720, 그리고 J. Grosset, Mycobacterium tuberculosis in the Extracellular Compartment: an Underestimated Adversary, Antimicrob. Agents Chemother., 2003, 47, 833-836에서 설명된 바와 같이, 이러한 질환의 전파의 주요 출처이다.

상기 논문에서 설명된 바와 같이, 환자는 기침 또는 재채기에 의하여, 바실루스를 운반할 수 있는 많은 양의 점적을 분출하고, 이들은 그들을 흡인하는 개체의 폐포 공간에 들어갈 수 있다.

흡입 후, 바실루스는 폐포 대식세포에 의해 식균되고, 그리고 이러한 세포 내에서 바실루스는 세포 파괴를 유발할 정도까지 성장할 수 있다. 바실루스는 세포외 공간에서 새로운 대식세포에 의해 다시 한 번 식균되고, 그리고 이러한 과정은 이들이 배수되고 감염이 폐문 림프절에서 산출되면, 세포 면역에 기초된 면역 반응이 산출된 때까지 반복된다.

감염 후 약 6 주에, 간균 성장은 중지되고, 숙주는 지연형 과민성 (DTH) 반응에 의해 특징되는 양성 피부 투베르쿨린 검사를 제공하고, 그리고 소위 건락 괴사가 감염의 지점에서 발생된다.

결핵성 감염의 주요 특징 중의 하나는 결핵균 (M. tuberculosis)이 "잠복성" 결핵성 감염의 형태로 상기 질환을 진전시키지 않지만, 활동성 결핵을 발생시킬 가능성을 유지하면서, 수년 동안 숙주의 조직 내에 남아있을 수 있다는 사실이다.

감염의 이러한 잠복 상태는 소위 건락 괴사의 시작에 관련되고, 이것은 초기 폐포 병변 및 주변 폐 조직에서 발생되고, 증배하는 바실루스를 내포하는 대식세포의 파괴를 야기하고, 고체 괴사성 병변을 유발한다.

이러한 괴사성 반응의 기원은 정확히 알려져 있지 않지만, DTH 유형 반응에 관련된다. 본질적으로, 간균 개체군을 제어하도록 허용하는 면역 반응은 Th1 CD4에 의해 일차적으로 주도된 세포 유형 면역 반응이다, 즉, 이것은 DTH 유형 반응을 산출하고, 그리고 또한, 감염된 대식세포를 확인하고 이들이 그 안에 바실루스를 파괴하도록 활성화시킬 수 있다.

약 10%의 감염된 개체에서, 상기 고체 괴사는 연화하고, 이것은 결핵성 감염에서 가장 중요한 에피소드 중에서 한 가지인데, 그 이유는 이것이 이후, 상기 감염이 활동성 결핵, 즉. 결핵성 질환으로 진행하는 때이기 때문이다.

많은 경우에, 연화는 기관세지를 향한 연화된 조직의 배수, 결핵성 공동 형성, 그리고 기관지 개구부를 통한 산소의 입장으로 바실루스의 폭발성 세포외 성장과 연관된다. 기침으로, 바실루스로 가득찬 이러한 연화된 카제움은 기관지의 다른 부분, 폐 및 신체 외측으로 확산된다.

결핵의 약리학적 치료는 연장된 요법으로서 특징화되는데, 이것은 치료 고수를 복잡하게 만들고, 이와 동시에 약제내성 세균의 시작에 우호적이다.

결핵을 억제하기 위한 최선의 전략은 예방적인 접근법에 기초되는 것으로 고려된다.

결핵에 대항하는 예방적 처치에서 이용된, 비경구 투여되는 현재 백신은 미코박테리움 보비스 (M. bovis)의 약화된 변이체인 BCG (바실루스 칼메테 구에린)로 불리는 균주의 세균에 기초된다. 하지만, 이의 효능은 시간의 흐름에서 하락하고, 그리고 이것은 성체에서 질환의 예방에서 무효한 것으로 보인다. 실제로, 이것은 단지, 치명적인 결핵성 질환의 발병의 틈새 (속립성 결핵 또는 결핵 수막염)만을 보호하는 것으로 고려된다.

살아있는 약화된 미코박테리아의 다른 균주 또는 세균 아단위에 일차적으로 기초된 결핵의 다른 예방적 처치가 개발되었다.

게다가, 불활성화된 미코박테리아에 기초된 결핵의 예방적 처치가 또한, 약화된 미코박테리아에 기초된 백신으로 획득된 면역 반응, 즉, 인터페론-γ 생산 Th1과 유사한 면역 반응을 획득하는 목적으로 최신 기술에서 조사되었다.

이런 이유로, 예로서, Opie et al., Protective inoculation against human tuberculosis with heat-killed tubercle bacilli, Am. J. Hyg., 1939, 29, 155-164에 의한 논문은 가열함에 의해 불활성화된 바실루스 결핵균 (M. tuberculosis)의 5회 복용이 상기 질환에 대항하는 보호를 산출하는 목적으로 피내 투여된 임상적 연구를 설명한다.

게다가, Agger et al., Specific acquired resistance in mice immunized with killed mycobacteria, Scand. J. Immunol., 2002, 56, 443-447에 의한 논문은 각 복용 사이에 2-주 간격에서, 가열함에 의해 불활성화된 1000 μg의 바실루스 결핵균 (M. tuberculosis)의 3회 피하 투여된 복용으로 예방접종된 생쥐를 이용한 실험적 연구를 설명하고, 특정한 T-세포 기초된 면역성의 유도를 보여준다.

다른 불활성화된 미코박테리아 역시 정상적으로 비경구로, 결핵에 대항하는 보호를 유도하는 것에 대해 조사되었다.

예로서, Gupta et al., Immunogenicity and protective efficacy of "Mycobacterium w" against Mycobacterium tuberculosis in mice Immunized with live versus heat-killed M. w by the aerosol or parenteral route, Infect. Immun., 2009, 77 (1), 223-231은 살아있는 M. w 미코박테리아 또는 가열함에 의해 불활성화된 M. w 미코박테리아가 투여된다는 것을 설명한다. 가열함에 의해 불활성화된 M. w 미코박테리아는 단일-복용량으로서 피하 투여되고, 그리고 인터페론-생산 Th1 세포의 유도에 기초된 면역 반응이 관찰되었다.

경구 투여된 효과적인 예방적 처치를 제공하는 것이 특히 바람직한데, 그 이유는 이러한 투여 루트가 약물의 투여 및 치료 고수를 상당히 용이하게 하기 때문이다.

이러한 의미에서, 상용의 화학요법 약물과 합동된 섭생에 따라, 활동성 결핵의 치료적 효과를 달성하기 위해, 미코박테리아, 미코박테리움 바카에 (Mycobacterium vaccae)의 열에 의해 불활성화된 세균의 경구 투여를 언급하는 최신 기술에서 문서가 있다.

실험적 수준에서, Hernandez-Pando et al., Orally administered Mycobacterium vaccae modulates expression of immunoregulatory molecules in BALB/c mice with pulmonary tuberculosis, Clin. Vaccine Immunol., 2008, 15(11), 1730-1736은 가열함에 의해 불활성화된 0.1 μg의 미코박테리움 바카에 (M. vaccae)의 5회 복용량이 각 투여 사이에 28-일 간격에서, 경구 투여되고, 첫 번째 복용량 후 23 시간에 기관내 결핵균 (M. tuberculosis)으로 감염이 유도된 생쥐에서 수행된 검정을 설명한다.

상기 연구에서 세포 면역 반응이 산출되고, Th1 세포 분비가 증가하는 반면, 체액 면역이 Th2 유형 세포와 TGF-베타 성장 인자의 감소에 의해 증명되는 바와 같이 하락하는 것으로 확증되었다.

일반적으로, 최신 기술은 차후 인터페론-γ 생산과 함께 Th1 유도가 바람직한 반면, 조절 T 세포 (Treg) 생산을 수반하는, 차후 IL-4 생산, 또는 Th3 반응과 함께 Th2 반응은 활동성 결핵-유도 효과를 가질 수 있다는 것을 암시한다.

이것은 예로서, Kursar et al., Cutting Edge: Regulatory T Cells Prevent Efficient Clearance of Mycobacterium tuberculosis, J. Immunol., 2007, 178, 2661-2665에서 설명되는데, 여기서 조절 T 세포 (Treg)의 생산은 실험적 결핵의 생쥐 모델에서 건락 병변을 살균하고 잠복 감염을 예방하는 CD4 T 세포의 능력 없음에 기인한다. 상기 논문은 Treg 반응에 우호적인, Th1 반응과 Treg 반응 사이에 불균형을 가능하게 하는 탈규제가 활동성 결핵 유도의 원인일 수 있다는 것을 암시한다.

최신 기술에서 설명된 것에 비추어, 활동성 결핵의 발병, 그리고 비-감염된 개체 (예방적 효과) 및 감염이 잠복 상태에 있는 결핵균 (M. tuberculosis)에 의해 감염된 개체 (치료적 효과) 둘 모두에서 상기 질환의 병리학적 상태의 차후 시작을 예방하는 경구 투여될 수 있는, 결핵에 대한 효과적인 치료법을 제공하는 것이 여전히 요구된다.

발명의 목적

본 발명의 목적은 결핵을 예방하는 경구 투여용 약용 산물을 제조하기 위한 불활성화된 미코박테리아의 용도이다.

도면의 설명
도면 1은 x-축에 표시된 일자로 표현된 생존 시간 및 y-축에 표시된 생존 동물의 백분율을 보여준다. 대조 군은 연속선으로 표시되고, 그리고 군 1에서 동물은 불연속선으로 표시된다. 군 1에서 동물은 감염 전 10 일자에 시작하는 48 시간마다 1회, 상기 바실루스의 5회 복용량의 투여에 의하여 감염 전 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis)의 불활성화된 미코박테리아로 경구 치료에 종속되었다. 그래프 1, 2, 3과 4는 각각, 군 1a, 1b, 1c와 1d에서 동물에 상응하고, 이들에 상이한 양의 산물이 1:1, 1:10, 1:100 및 1:1000 희석에 따라 투여되었다. (실시예 1)
도면 2는 x-축에 표시된 일자로 표현된 생존 시간 및 y-축에 표시된 생존 동물의 백분율을 보여준다. 이러한 도면에서, 대조 군 (연속선)은 군 2 (불연속선)와 비교된다. 군 2에서 동물은 감염 후 11 일자에 시작하는 48 시간마다 1회, 상기 바실루스의 5회 복용량의 투여에 의하여 감염 후 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis)의 불활성화된 미코박테리아로 경구 치료에 종속되었다. 그래프 5, 6, 7과 8은 각각, 군 2a, 2b, 2c와 2d 에서 동물에 상응하고, 여기에 상이한 양의 산물이 1:1, 1:10, 1:100 및 1:1000 희석에 따라 투여되었다. (실시예 1)
도면 3은 x-축에 표시된 일자로 표현된 생존 시간 및 y-축에 표시된 생존 동물의 백분율을 보여준다. 이러한 도면에서, 대조 군 (연속선)은 감염 후 미코박테리움 보비스 (M. bovis) BCG의 불활성화된 미코박테리아로 경구 치료된 군 1에서 동물 1 (불연속선)과 비교되었다. (실시예 2)
도면 4는 x-축에 표시된 일자로 표현된 생존 시간 및 y-축에 표시된 생존 동물의 백분율을 보여준다. 이러한 도면에서, 대조 군 (연속선)은 감염 전 미코박테리움 보비스 (M. bovis) BCG의 불활성화된 미코박테리아로 경구 치료된 군 1에서 동물 (불연속선)과 비교되었다 (실시예 3)
도면 5는 x-축에 표시된 일자로 표현된 생존 시간 및 y-축에 표시된 생존 동물의 백분율을 보여준다. 그래프 1에서, 대조 군 (연속선)은 감염 전 시작된 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis)의 불활성화된 미코박테리아로 경구 투여된 치료에 종속된 군 1 (불연속선)과 비교된다. 그래프 2에서, 대조 군 (연속선)은 그래프 2에서 감염 후 시작된 불활성화된 미코박테리아로 경구 투여된 치료에 종속된 군 2 (불연속선)와 비교된다. (실시예 4)
도면 6은 감염 후 3 주차 (그래프 1)와 4 주차 (그래프 2)에서, 결핵균 (M. tuberculosis)의 불활성화된 미코박테리아 및 대조로 각 치료에 대한 전체 CD4+ T 세포에 대하여 CD4+CD25+Foxp3+ 표현형을 갖는 조절 T 세포의 백분율을 묘사한다. 조절 T 세포의 상기 백분율은 y-축에서 묘사된다. 상이한 동물 군은 x-축에 표시된다. 사각형은 치료되지 않은 동물 (대조 군)을 나타내고, 삼각형은 감염 전 치료된 군 1에서 동물 (예방적 효과)을 나타내고, 그리고 원은 감염 후 치료된 군 2에서 동물 (치료적 효과)을 나타낸다. 속이 차있는 수평선은 각 군의 산술 평균을 나타낸다. (실시예 4)
도면 7은 x-축에 표시된 일자로 표현된 생존 시간 및 y-축에 표시된 생존 동물의 백분율을 보여준다. 그래프 1에서, 대조 군 (연속선)은 감염 전 시작된 미코박테리움 칸사시 (Mycobacterium kansasii)의 불활성화된 미코박테리아로 경구 투여된 치료에 종속된 군 1 (불연속선)과 비교된다 (예방적 효과). 그래프 2에서, 대조 군 (연속선)은 감염 후 시작된 미코박테리움 칸사시 (Mycobacterium kansasii)의 불활성화된 미코박테리아로 경구 투여된 치료에 종속된 군 2 (불연속선)와 비교된다 (치료적 효과) (실시예 5)
도면 8은 x-축에 표시된 일자로 표현된 생존 시간 및 y-축에 표시된 생존 동물의 백분율을 보여준다. 그래프 1에서, 대조 군 (연속선)은 감염 전 시작된 미코박테리움 포르투이툼 (Mycobacterium fortuitum)의 불활성화된 미코박테리아로 경구 투여된 치료에 종속된 군 1 (불연속선)과 비교된다 (예방적 효과). 그래프 2에서, 대조 군 (연속선)은 감염 후 시작된 미코박테리움 포르투이툼 (Mycobacterium fortuitum)의 불활성화된 미코박테리아로 경구 투여된 치료에 종속된 군 2 (불연속선)와 비교된다 (치료적 효과). (실시예 6)
도면 9는 x-축에 표시된 일자로 표현된 생존 시간 및 y-축에 표시된 생존 동물의 백분율을 보여준다. 이들 동물은 감염되고, 그리고 이후, 항-결핵성 약물 RIMSTAR로 치료되었다. RIMSTAR로 치료 후, 군 1은 미코박테리움 포르투이툼 (Mycobacterium fortuitum)의 불활성화된 미코박테리아로 차후 경구 투여된 관용-구축 치료에 종속되었다 (항-재발 효과). 대조 군 (연속선, 관용-구축 치료 없음)은 군 1 (불연속선, 관용-구축 치료 있음)과 비교된다. RIMSTAR 치료 (흑색 직사각형) 및 차후 관용-구축 치료 (백색 직사각형)로 치료 기간은 x-축에서 지시된다. (실시예 7).

발명의 상세한 설명

본 발명의 목적은 결핵을 예방하는 약용 산물을 제조하기 위한 불활성화된 미코박테리아의 용도이고, 여기서:

불활성화된 미코박테리아는 정기적으로 경구 투여되고,

복용 사이에 간격은 5 일 보다 많지 않고, 그리고

투여된 복용의 횟수는 최소한 5이다.

대안으로, 본 발명의 목적은 결핵을 예방하는 용도를 위해 불활성화된 미코박테리아로서 조제될 수 있고, 여기서:

미코박테리아는 정기적으로 경구 투여되고,

복용 사이에 간격은 5 일 보다 많지 않고, 그리고

투여된 복용의 횟수는 최소한 5이다.

본 발명의 저자들은 투여 사이에 감소된 시간 간격에서 투여된 다중-복용량 섭생을 이용한 불활성화된 미코박테리아의 투여에 기초된, 결핵에 대항하는 새로운 예방적 처치를 개발하였다.

이들 저자는 결핵균 (M. tuberculosis)에 의한 감염 전 (예방적 효과) 또는 감염 후 (치료적 효과) 투여된 상기 예방적 처치가 잠복 상태에서 활동성 결핵으로 감염의 진행을 제어함에 의하여 활동성 결핵의 발병을 예방할 수 있다는 것을 관찰하였다.

상기 치료에 따라, 바람직하게는 낮은 복용량에서, 그리고 복용 사이에 감소된 시간 간격으로 죽은 바실루스의 주기적 경구 투여는 관용-구축 또는 관용-구축 반응을 유도하고, 이것은 놀랍게도, 결핵균 (M. tuberculosis)에 의한 감염을 제어하는데 있어서, 다시 말하면, 잠복 감염의 활동성 감염으로의 전환을 제어하는데 있어서 긍정적인 효과를 갖는다.

이들 저자는 결핵균 (M. tuberculosis)에 의한 감염 전후 둘 모두에 투여된 이런 치료는 조절 T 세포 (Treg)의 백분율에서 증가에 의해 특징되는 관용-구축 반응을 촉발한다는 것을 실제로 관찰하였다.

본 발명의 용도는 비-감염된 개체 및 감염이 잠복 상태에 있는 결핵균 (M. tuberculosis)에 의해 감염된 개체에 집중한다. 비-감염된 개체의 경우에, 예방적 처치는 예방적 효과를 갖는 것으로 고려되는 반면, 결핵균 (M. tuberculosis)에 의해 감염된 개체의 경우에 치료적 효과를 갖는 것으로 고려된다.

이러한 두 번째 사례, 즉. 치료적 효과를 갖는 예방적 처치의 특정 양상 (감염이 잠복 상태에 있는 결핵균 (M. tuberculosis)에 의해 감염된 개체를 지칭함)은 활동성 결핵이 이전에 발병했고, 그리고 상기 질환이 예로서 전통적인 항-결핵성 요법으로 치료에 의하여 차후에 관해되고, 결핵이 이런 이유로, 잠복 감염 상태로 되돌아간 개체로 구성된다. 예방적 처치의 이러한 특정 사례는 치료적 항-재발 효과를 갖는 것으로 고려된다.

항-재발 효과를 갖는 예방적 처치의 경우에, 이런 이유로, 개체는 정상적으로 이전에 항-결핵성 작용제로 약리학적 치료에 종속되었다. 이들 항-결핵성 작용제는 당업자에 의해 널리 공지되어 있는데, 일차 항-결핵성 작용제는 예로서, 이소니아지드, 에탐부톨, 피라진아미드, 리팜피신, 스트렙토마이신이고; 내성의 시작의 경우에 적용되는 2선 항-결핵성 작용제는 그 중에서도 특히 예로서, 티오아미드 (프로티온아미드, 에티오나미드, 그 중에서도 특히), 아미노글리코시드 (아미카신, 카나마이신, 그 중에서도 특히), 시클로세린, 리파부틴, 리파펜틴, 플루오르퀴놀론 (목시플록사신, 레보플록사신, 오플록사신), PAS, 클라리트로마이신, 클로파지미드, 리네졸리드 또는 티오리다진, 또는 이들의 혼합물이다.

"예방적 처치"는 일반적으로, 개체를 질환으로 보호하도록 허용하는 치료인 것으로 이해된다.

이러한 의미에서, 본 발명의 문맥에서, 예방적 처치는 잠복 감염의 활동성 감염으로의 전환을 제어함에 의하여 활동성 결핵의 발병을 예방할 수 있는 치료이다.

"관용-구축"은 일반적으로, 생물학적 또는 화학적 작용제에 의하여 관용의 의도적 유도인 것으로 이해되고, 여기서 용어 "관용"은 생물학적 또는 화학적 작용제에 특정한 낮은 반응의 상태를 의미한다.

이런 이유로, 본 발명의 문맥에서, 표현 "관용-구축 반응의 유도"는 특이적 항원에 대한 반응의 결여의 상태가 숙주 면역계에서 유도되고, 장애의 약화를 유발하는 방법인 것으로 이해된다.

관용-구축 섭생은 최신 기술에서 다른 질환, 예를 들면, 예로서, 죽상경화증의 문맥에서 설명되었다. George et al., Suppression of early atherosclerosis in LDL-receptor deficient mice by oral tolerance with h2-glycoprotein I, Cardiovasc. Res., 2004, 62, 603-609는 경구 관용을 유도하고 초기 죽상경화증을 억제하기 위한 β2-당단백질 I의 용도를 설명하고, 그리고 Harats et al., Oral Tolerance With Heat Shock Protein 65 Attenuates Mycobacterium Tuberculosis-Induced and High-Fat-Diet-Driven Atherosclerotic Lesions, J. Am. Coll. Cardiol., 2002, 40, 1333-1338은 죽상경화성 병변에 대한 경구 관용을 유도하기 위한 열 쇼크 단백질 65의 용도를 설명한다.

불활성화된 미코박테리아

미코박테리아의 속은 미코박테리아세아에 (Mycobacteriaceae)의 패밀리에 속하고 호기성 바실루스에 의해 형성된다.

미코박테리아의 속에 속하는 모든 바실루스, 예를 들면, 그 중에서도 특히 종 미코박테리움 아브세수스 (M. abscessus), 미코박테리움 아프리카눔 (M. africanum), 미코박테리움 아시아티쿰 (M. asiaticum), 미코박테리움 아우룸 (M. aurum), 미코박테리움 아비움 (M. avium), 미코박테리움 아비움 파라튜베르쿨로시스 (M. avium paratuberculosis), 미코박테리움 아비움 실바티쿰 (M. avium silvaticum)과 미코박테리움 아비움 호미니스수이스 (M. avium hominissuis), 미코박테리움 보비스 (M. bovis), 미코박테리움 보비스 (M. bovis) BCG, 미코박테리움 켈로내 (M. chelonae), 미코박테리움 포트투이툼 (M. fortuitum), 미코박테리움 가스트리 (M. gastri), 미코박테리움 구디 (M. goodi), 미코박테리움 고르도내 (M. gordonae), 미코박테리움 이뮤노게눔 (M. immunogenum), 미코박테리움 해모필룸 (M. haemophilum), 미코박테리움 하바나 (M. habana), 미코박테리움 칸사시 (M. kansasii), 미코박테리움 렌티플라붐 (M. lentiflavum), 미코박테리움 레프래 (M. leprae), 미코박테리움 레프로마토시스 (M. lepromatosis), 미코박테리움 루푸 (M. lufu), 미코박테리움 마게리텐스 (M. mageritense), 미코박테리움 말모엔세 (M. malmoense), 미코박테리움 마리눔 (M. marinum), 미코박테리움 마씰리엔세 (M. massiliense), 미코박테리움 미르코티 (M. microti), 미코박테리움 모나센세 (M. monacense), 미코박테리움 무코게니쿰 (M. mucogenicum), 미코박테리움 네오아룸 (M. neoaurum), 미코박테리움 페레그리눔 (M. peregrinum), 미코박테리움 펠레이 (M. phlei), 미코박테리움 스크로풀라세움 (M. scrofulaceum), 미코박테리움 스메그마티스 (M. smegmatis), 미코박테리움 테라애 (M. terrae), 미코박테리움 트리비알레 (M. triviale), 결핵균 (M. tuberculosis), 미코박테리움 미르코티 (M. microti), 미코박테리움 울세란스 (M. ulcerans), 미코박테리움 바카에 (M. vaccae) 및 미코박테리움 제노피 (M. xenopi)는 본 발명의 목적의 일부이다.

미코박테리아는 결핵균 (M. tuberculosis)과 공통으로 많은 항원을 갖고, 그리고 이런 이유로, 본 발명의 용도에 적합하다. Stanford et al., Mycobacteria and their world, Int. J. Mycobacteriol., 2012, 3-12에 의한 논문은 미코박테리아에서 항원의 상이한 군의 분류, 그리고 이들이 패밀리 미코박테리아세아에 (Mycobacteriaceae)의 상이한 종 사이에 어떻게 분포되고 공유되는 지를 설명한다.

본 발명의 일부인 불활성화된 미코박테리아는 바람직하게는: 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis) 복합체 (MTB-C)로 불리는 군의 미코박테리아, 미코박테리움 포르투이툼 (Mycobacterium fortuitum)과 미코박테리움 칸사시 (Mycobacterium kansasii)이다. 다시 말하면, 불활성화된 미코박테리아는는 바람직하게는 결핵균 (M. tuberculosis), 미코박테리움 보비스 (M. bovis), 미코박테리움 아프리카눔 (M. africanum), 그리고 미코박테리움 미르코티 (M. microti), 미코박테리움 보비스 (M. bovis) BCG, 미코박테리움 포트투이툼 (M. fortuitum)과 미코박테리움 칸사시 (M. kansasii)로 구성된 군에서 선택된다. 불활성화된 미코박테리아는 더욱 바람직하게는, 결핵균 (M. tuberculosis), 미코박테리움 보비스 (M. bovis), 미코박테리움 보비스 (M. bovis) BCG, 미코박테리움 포트투이툼 (M. fortuitum)과 미코박테리움 칸사시 (M. kansasii)로 구성된 군에서 선택된다.

죽은 미코박테리아로서 또한 지칭되는 불활성화된 미코박테리아는 살아있는 미코박테리아를 복제할 수 없는 형태로 형질전환하는 물리적 또는 화학적 치료에 종속된 미코박테리아인 것으로 이해된다.

본 발명의 범위 내에, 미코박테리아를 불활성화시키는데 적합한 방법은 예로서, 포름알데히드로 치료, 방사선조사 치료 또는 열 치료이다.

본 발명의 목적 불활성화된 미코박테리아는 바람직하게는 가열하는 과정에 의하여 불활성화된다.

가열함에 의해 미코박테리아를 불활성화시키는데 적합한 방법은 예로서, 당업자에게 널리 공지된 적합한 배양 배지, 예를 들면, 그 중에서도 특히 Middlebrook 7H10 또는 7H11 한천, Sauton 배지 또는 Proskauer-Beck 배지에서 미코박테리아의 균주를 배양하는 것을 포함한다. 배양액은 바람직하게는, ml당 약 1 x 10⁵와 1 x 10⁹ 집락 형성 단위 (CFUs) 사이에 포함된 농도를 달성할 때까지 유지된다.

배양액은 이후, 가열함에 의해 불활성화된다. 배양액은 바람직하게는, 70 ℃와 90 ℃ 사이에 포함된 온도에서 가열된다. 가열 기간은 바람직하게는, 30 분과 3 시간 사이에 포함된다. 게다가 오토클레이브를 이용함에 의하여, 배양액은 바람직하게는, 121℃의 온도에서 20 분 동안 가열된다.

결핵의 예방

표현 "결핵의 예방"은 감염의 잠복 상태에서 활동성 결핵으로의 진행을 진행을 제어함에 의하여 활동성 결핵의 소견을 예방하는 것을 지칭한다.

상기 예방은 비-감염된 개체에서뿐만 아니라 감염이 잠복 상태에 있는 결핵균 (M. tuberculosis)에 의해 감염된 개체에서 수행될 수 있는데, 그 이유는 상기 질환이 아직 발병하지 않았거나 또는 활성 질환이 이미 발병했고 예로서 항-결핵성 약물로 치료로 인해 추후 관해되었기 때문이다.

본 발명의 저자들은 잠복 감염의 진행을 예방하고, 따라서 고체 건락 병변의 액화된 병변으로의 진행이 예방되고, 그리고 활동성 결핵의 소견이 이런 이유로 예방되는, 결핵에 대항하는 예방적 처치를 개발하였다.

본 발명의 저자들은 C3HeB/FeJ 생쥐의 이용에 기초된 실험적 모델을 이용하였는데, 여기서 인간에서 발병한 것과 동등한 결핵균 (M. tuberculosis)에 의한 감염 후 폐 병리가 모의될 수 있다.

건락 괴사가 발생하지 않는 다른 동물 모델에서 일어나는 것과 달리, 결핵균 (M. tuberculosis)으로 감염에 응하여 액화할 수 있는 건락 괴사의 형성이 Harper et al., Mouse model of necrotic tuberculosis granulomas develops hypoxic lesions, J. Infect. Dis., 2012, 205, 595-601에 의한 논문에서 설명된 바와 같이, 상기 동물에서 관찰된다.

높은 복용량으로 정맥내 감염되는 경우에, 상기 동물에서 괴사와 병변의 발생은 Sissons et al., Multigenic control of tuberculosis resistance: analysis of a QTL on mouse chromosome 7 and its synergism with sst1, Genes Immun., 2009, 10, 37-46에 의한 논문에서 설명된 바와 같이, 감염 후 약 4 주에 100% 사망률을 유발할 수 있는 정도이다.

임의의 이론에 한정됨 없이, 본 발명의 저자들은 본 발명의 치료 목적의 예방적인 효과는 바람직하게는 낮은 복용량에서 죽은 바실루스의 빈번한 주기적 복용량의 경구 투여가 개체에서 관용을 유도하고, 조절 T 세포 (Tregs)가 가급적 유도되는 반응을 산출하는 섭생이기 때문이라고 고려한다. 상기 세포는 전환 성장-인자 베타 (TGF-베타)에 관련된다, 다시 말하면, 관용-구축 또는 Th3 면역 반응이 기본적으로 Th1 면역 반응이 촉발되는 전통적인 예방접종 시스템과 달리, 일차적으로 산출된다.

본 발명의 저자들은 놀랍게도, 관용의 유도가 결핵균 (M. tuberculosis)에 의한 감염의 진행, 다시 말하면, 잠복 감염의 활동성 감염으로의 전환을 정지시키는데 효과적이라는 것을 발견하였다.

불활성화된 미코박테리아는 이러한 관용-구축 반응을 촉발하기 위해, 반복적으로, 그리고 각 투여 사이에 감소된, 즉, 5 일 보다 많지 않은 시간 간격에서 투여되어야 한다; 바람직하게는, 복용 사이에 간격은 3 일 보다 많지 않다; 그리고 더욱 바람직하게는, 복용 사이에 간격은 2 일 보다 많지 않다.

관용-구축 치료는 또한, 불활성화된 미코박테리아의 반복된 투여를 필요로 하고, 투여된 복용의 횟수는 최소한 5이다; 바람직하게는, 투여된 복용의 횟수는 최소한 7이다; 더욱 바람직하게는, 투여된 복용의 횟수는 최소한 9, 그리고 이보다 더욱 바람직하게는, 투여된 복용의 횟수는 최소한 14이다.

본 발명의 용도에서, 불활성화된 미코박테리아의 면역학적으로 효과량이 투여된다.

이용되는 복용량은 미코박테리아가 투여되는 개체의 연령과 체중에 의존하는 것으로 알려져 있다.

적합한 복용량은 일반적으로, 10³과 10¹⁰사이에, 바람직하게는 10³과 10⁸ 사이에, 그리고 더욱 바람직하게는 10⁴와 10⁸ 사이에 불활성화된 미코박테리아의 범위 내에 포함된다.

본 발명의 일부인 관용-구축 투약 섭생의 건락 병변 액화에 대한 예방적인 치료적 효과를 증명하기 위해, 앞서 설명된 모델에서 이용된 C3HeB/FeJ 생쥐가 불활성화된 미코박테리아의 5 내지 14회 복용량이 1과 3 일 사이에 포함된 복용 사이에 간격에서 경구 투여되는 프로토콜에 종속되었다.

이용된 뮤린 모델은 실시예 1과 3-6에서 설명된 바와 같이, 치료가 감염 전에 투여될 때, 또는 실시예 1, 2, 그리고 4-6에서 설명된 바와 같이, 치료가 결핵균 (M. tuberculosis)에 의한 감염 후 시작될 때, 예방적인 결핵 요법을 모의하지만, 상기 치료는 초기 시기 (이들 동물이 병변이 이미 발생해지만, 이들 병변이 상기 질환의 액화와 차후 소견까지 아직 진행되지 않은 때 감염 후 15 일까지)에서 투여된다; 또는 대안으로, 실시예 7에서 설명된 바와 같이, 치료는 이들 동물이 병변이 발생하고 이들 병변이 액화되지만, 상기 병변이 잠복 감염의 특징적인 작은 병변의 형태로 복귀된 때 감염 후 투여된다.

실시예에서 획득된 결과에 기초하여, 결핵균 (M. tuberculosis)에 의한 감염 전후 둘 모두에서 불활성화된 미코박테리아의 관용-구축 섭생의 경구 투여는 동물 생존을 증가시키는 것으로 결론되는데, 그 이유는 상기 질환의 유도, 다시 말하면, 잠복 감염의 활동성 감염으로의 전환이 지연되기 때문이다.

이런 이유로, 본 발명에 따른 불활성화된 미코박테리아의 이용은 결핵을 예방하는데 적합한 것으로 고려된다.

조성물

본 발명의 목적에 따라, 불활성화된 미코박테리아가 경구 투여된다.

상기 미코박테리아는 당업자에게 널리 공지된 바와 같이, 경구 투여에 적합한 임의의 제약학적 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 예로서, 정제, 캡슐, 용액, 현탁액, 분산, 분말, 과립, 또는 스프레이가 경구 투여에 적합하다.

미코박테리아는 바람직하게는, 캡슐 또는 정제 형태로 투여된다.

이들 제약학적 조성물은 일반적으로, 불활성화된 미코박테리아 및 최소한 하나의 제약학적으로 허용되는 부형제를 포함한다.

이들 조성물은 제약학적 기술 매뉴얼, 예를 들면 참고서, Remington The Science and Practice of Pharmacy, 20^th edition, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, 2000 [ISBN: 0-683-306472]에서 발견되는 것들과 같은, 당업자에게 널리 공지된 전통적인 방법에 따라 제조된다.

제약학적 조성물 내에 포함될 수 있는 제약학적으로 허용되는 부형제 중에는 예로서, 고결방지제, 예를 들면, 콜로이드성 실리카, 삼염기성 인산칼슘, 칼슘 규산염, 마그네슘 규산염, 마그네슘 삼규산염 또는 활석; 희석제, 예를 들면, 락토오스 무수물, 락토오스 일수화물, 인산칼슘, 칼슘 수소 인산염 무수물, 칼슘 수소 인산염 이수화물, 황산칼슘, 탄산칼슘, 카르복시메틸 셀룰로오스 칼슘, 미정질 셀룰로오스 또는 셀룰로오스 분말, 셀룰로오스 아세트산염, 덱스트레이트, 덱스트린, 텍스트로스, 프룩토오스, 글리세릴 팔미토스테아레이트, 카올린, 락티톨, 탄산마그네슘, 마그네슘 산화물, 말티톨, 말토덱스트린, 말토오스, 폴리메타크릴레이트, 전호화된 전분, 염화나트륨, 전분, 수크로오스; 윤활제, 예를 들면, 마그네슘 스테아르산염, 칼슘 스테아르산염, 글리세린 팔미토스테아레이트, 폴록사머, 마그네슘 산화물, 나트륨 벤조산염, 콜로이드성 실리카, 나트륨 라우릴 황산염, 나트륨 스테아릴 푸마르산염, 스테아르산, 활석 또는 글리세릴 베헤네이트; 현탁제, 예를 들면, 잔탄 검, 구아 검, 알긴산, 벤토나이트, 카보머, 카르복시메틸 셀룰로오스 나트륨 또는 칼슘, 히드록시에틸 셀룰로오스, 히드록시프로필 셀룰로오스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 히드록시프로필 알긴산염, 미정질 셀룰로오스 또는 셀룰로오스 분말, 콜로이드성 무수성 실리카, 덱스트린, 젤라틴, 카올린, 마그네슘 알루미늄 규산염, 말티톨, 포비돈, 소르비탄 에스테르 또는 트래거캔스; 결합제, 예를 들면, 마그네슘 삼규산염, 셀룰로오스, 전분, 덱스트린, 텍스트로스, 폴리덱스트로스, 말토오스, 말토덱스트린, 에틸 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 폴리메타크릴레이트, 활석, 포비돈, 스테아르산 또는 수크로오스; 붕해제, 예를 들면, 저-치환된 히드록시프로필 셀룰로오스, 삼염기성 인산칼슘, 카르복시메틸 셀룰로오스 나트륨 또는 칼슘, 크로스카르멜로스 나트륨, 크로스포비돈 또는 메틸 셀룰로오스; 코팅제, 예를 들면, 키토산, 디부틸 프탈산염, 디부틸 세바케이트, 디에틸 프탈산염, 디메틸 프탈산염, 에틸 셀룰로오스, 히드록시에틸 셀룰로오스, 히드록시프로필 셀룰로오스, 하이프로멜로스, 말토덱스트린, 폴리메타크릴레이트, 폴리비닐 아세트산염 프탈산염, 또는 트리에틸 구연산염; 분산제, 예를 들면, 폴록사머 또는 소르비탄 에스테르; 감미 작용제, 예를 들면, 아스파탐, 만니톨, 소르비톨, 나트륨 사카린, 나트륨 시클라메이트, 수크로오스, 텍스트로스, 프룩토오스, 글루코오스, 이눌린, 이소말토오스, 락티톨, 말토오스, 말톨, 만니톨, 아세설팜, 트레할로스, 자일리톨 또는 타우마틴; 풍미제와 풍미, 및/또는 이들의 혼합물이 있다.

부형제의 더욱 완전한 목록뿐만 아니라 이들의 물리화학적 특징 및 이들이 판매되는 상업적인 산물의 이름은 R.C. Rowe et al., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 4^th edition, Pharmaceutical Press, London, 2003 [ISBN: 0-85369-472-9]에 의한 참고에서 찾아볼 수 있다.

하기 실시예는 본 발명을 예증하는 것을 추구하지만, 이들은 본 발명을 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.

실시예 1.

감염 전후에 투여된 결핵균 ( M. tuberculosis )의 불활성화된 바실루스로 경구 관용-구축 치료 (예방적 또는 치료적 효과)

지수 성장 및 ml당 1.7 x 10⁷ 집락 형성 단위 (CFUs)의 농도를 달성할 때까지 Proskauer Beck 액체 배지에서 배양된, Unitat de Tuberculosi Experimental of Institut Germans Trias i Pujol 균주 수집으로부터 결핵균 (M. tuberculosis)의 임상적 균주 (TOL-3)가 불활성화된 미코박테리아를 준비하는데 이용되었다.

배양액은 75℃에서 2 시간 동안 가열한 후 불활성화되고, 그리고 차후에 -80℃에서 동결되었다. 이것은 차후에 10% 수크로오스 용액에서 50:50 희석되고, 포장되고, 그리고 0.5 ml 부피에서 바이알에서 냉동건조되었다. 이들 바이알은 차후에, 3 ml의 2회 증류된 물로 재구성되고, 1:1 희석을 구성하는데, 이것은 4.25 x 10⁶ CFU에 동등하다.

이들 검정에서, 0.3 ml의 산물이 이러한 1:1 희석, 그리고 1:10, 1:100과 1:1000 희석 둘 모두에서 투여되었다. 이들 투여는 각각, 4.25 x 10⁵, 4.25 x 10⁴, 4.25 x 10³ 및 4.25 x 10² CFU의 여러 복용량에 상응한다.

불활성화된 미코박테리아의 유용성은 특정한 병원체가 없는 6-8 주령 C3HeB/FeJ 암컷 생쥐에서 조사되었다.

이들 생쥐는 각각 6마리 동물의 3가지 군으로 분할되고, 그리고 각 군은 하기 관용-구축 프로토콜에 종속되었다.

대조 군: 치료되지 않음.

군 1 (감염전 치료): 감염 전 10 일자에 시작하여 48 시간마다 투여된, 불활성화된 미코박테리아를 내포하는 5가지 산물 복용량으로 영양에 의해 경구 치료됨. 0.3 ml의 부피가 각 복용량에서 투여되고, 그리고 전체 4가지 희석, 즉, 1:1, 1:10, 1:100 및 1:1000 (각각, 군 1a, 1b, 1c와 1d)이 조사되었다.

군 2 (감염후 치료): 감염 후 11 일자에 시작하여 48 시간마다 투여된, 불활성화된 미코박테리아를 내포하는 5가지 산물 복용량으로 영양에 의해 경구 치료됨. 0.3 ml의 부피가 각 복용량에서 투여되고, 그리고 전체 4가지 희석, 즉, 1:1, 1:10, 1:100 및 1:1000 (각각, 군 2a, 2b, 2c와 2d)이 조사되었다.

Proskauer-Beck 배지에서 중간-대수증식기까지 배양되고 이용 때까지 -70℃의 온도에서 1 ml 분취량에서 보존된 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis) (H₃₇Rv Pasteur)의 독성 균주가 감염에 이용되었다.

이들 생쥐는 약 2 x 10⁴ 생존가능한 바실루스의 접종물을 도입함으로써 정맥내 감염되었다.

이들 동물은 표 1에서 상세하게 설명된 방법에 따라, 희생이 필요한 조건 때까지 매일 관찰되고 칭량되었다.

획득된 결과는 도면 1과 2에서 그래픽적으로 묘사되는데, 이들은 상이한 실험 군에 대한 감염 후 이들 동물의 생존의 진행을 보여준다. 일자로 표현된 생존 시간은 x-축에 표시되고, 반면 생존자의 백분율은 y-축에 표시된다.

도면 1에서, 대조 군 (연속선)은 감염 전 치료된 군 1에서 동물 (불연속선)과 비교된다. 그래프 1, 2, 3과 4는 각각, 군 1a, 1b, 1c와 1d에서 동물에 상응하고, 이들에 상이한 양의 산물이 1:1, 1:10, 1:100 및 1:1000 희석에 따라 투여된다.

도면 2에서, 대조 군 (연속선)은 감염 후 치료된 군 2에서 동물 (불연속선)과 비교된다. 그래프 5, 6, 7과 8은 각각, 군 2a, 2b, 2c와 2d에서 동물에 상응하고, 이들에 상이한 양의 산물이 1:1, 1:10, 1:100 및 1:1000 희석에 따라 투여된다.

이들 동물의 생존에 대한 치료의 효과를 평가하기 위해, 생존 곡선은 2가지 방법에 의하여 비교되었다: Mantel-Cox 검사 (또는 로그 순위 검사, LR t) 및 Gehan-Breslow-Wilcoxon 검사 (GBW t). 첫 번째 방법에서, 위험 (죽음/시간 단위)은 전체 실험 내내 일정한 반면, 두 번째 방법은 첫 번째 수일에서 죽음 (조기 죽음)을 더욱 고려하는 것으로 추정된다. 위험이 일정하면, Mantel-Cox 검사가 더욱 높은 통계학적 검증력을 갖지만, 그러한 경우가 아니고, 그리고 다른 것보다 더욱 높은 위험에 처해있는 군이 있으면, Gehan-Breslow-Wilcoxon 방법이 더욱 적합하다.

통계학적으로 유의한 차이는 대조 군에 대하여 모든 사례에서 관찰된다 (p<0.05, GBW t). 또한, 그래프 4, 5, 6과 7에 상응하는 치료에서 LR t에 대한 통계 유의성 (p<0.05)이 있다.

이들 결과는 감염전 섭생이 가장 낮은 희석 (1:1000, 도면 1, 그래프 4)에서 이용될 때 보호 반응을 반영하는 반면, 감염후 섭생으로 보호는 희석 1:1, 1:10 및 1:100 (도면 2, 각각 그래프 5, 6과 7)에서 관찰되고, 1:10 희석 섭생에서 특히 중요하였다.

대조 군에서 부검은 26과 30 일자 사이에 매우 급속한 진행을 반영하였는데, 이 기간 동안 병변이 크기에서 크게 증가하고 결국 수렴하여, 내부 크림 같은 경도를 갖는 괴사가 있는 큰 병변을 발생시킨다.

이런 이유로, 결핵균 (M. tuberculosis)에 의한 감염 전 (예방적 효과)과 감염 후 (치료적 효과) 둘 모두에서 관용-구축 섭생의 경구 투여는 잠복 감염의 활동성 감염으로의 전환을 지연함으로써 이들 동물의 생존을 증가시키는 것으로 결론될 수 있다. 이런 이유로, 본 발명에 따른 불활성화된 미코박테리아의 이용은 결핵에 대항하는 예방적 처치로서 적합한 것으로 고려된다.

실시예 2. 감염 후 투여된 미코박테리움 보비스 ( M. bovis ) BCG의 불활성화된 바실루스로 경구 관용-구축 치료 (치료적 효과)

본 실시예에서 이용된 치료제는 지수 성장 및 ml당 1.03 x 10⁸ 집락 형성 단위 (CFUs)의 농도를 달성할 때까지 Proskauer Beck 액체 배지에서 배양된 미코박테리움 보비스 (M. bovis) BCG의 상업적인 균주 (SSI)로부터 제조되었다. 배양액은 실시예 1에서 설명된 동일한 방법에 따라 불활성화되었다.

불활성화된 미코박테리아의 유용성은 특정한 병원체가 없는 6-8 주령 C3HeB/FeJ 암컷 생쥐에서 조사되었다. 2.575 x 10⁵ CFU에 상응하는 1:10 희석에 상응하는 0.3 ml의 부피가 각 복용량에서 투여되었다.

이들 생쥐는 각각 12마리 동물의 2가지 군으로 분할되고, 그리고 각 군은 하기 관용-구축 프로토콜에 종속되었다:

대조 군: 치료되지 않음.

군 1 (감염후 치료): 감염 후 12 일자에 시작하여 48 시간마다, 그리고 각 생쥐의 생존 시간에 따라, 실험의 종결 때까지 차후에 주 3 회 (월요일, 수요일 및 금요일) 투여된, 불활성화된 미코박테리아를 내포하는 5가지 산물 복용량으로 영양에 의해 경구 치료됨.

이들 동물은 실시예 1의 표 1에서 상세하게 설명된 동일한 방법에 따라, 희생이 필요한 조건 때까지 매일 관찰되고 칭량되었다.

획득된 결과는 도면 3에서 그래픽적으로 묘사된다. 생존 시간 (일자)은 x-축에 표시되고, 반면 생존자의 백분율은 y-축에 표시된다.

대조 군 (연속선)은 치료된 군 1 (불연속선)보다 더욱 낮은 생존율을 갖는 것으로 관찰되고, 유의미한 차이가 관찰된다 (로그 순위 검사, p=0.0147; Gehan-Breslow-Wilcoxon 검사, p=0.0052).

이들 결과는 감염된 동물의 연속성 치료 후 보호 반응을 반영한다. 이런 이유로, 결핵균 (M. tuberculosis)에 의한 감염 후 불활성화된 미코박테리움 보비스 (M. bovis) BCG의 관용-구축 섭생의 경구 투여는 상기 질환의 유도를 지연함으로써 이들 동물의 생존율을 증가시키는 것으로 결론될 수 있다. 이런 이유로, 본 발명에 따른 불활성화된 미코박테리아의 이용은 잠복 감염의 활동성 감염으로의 전환을 지연함으로써 결핵에 대항하는 예방적 처치로서 적합한 것으로 고려된다.

실시예 3. 감염전 투여된 미코박테리움 보비스 ( M. bovis ) BCG의 불활성화된 바실루스로 경구 관용-구축 치료 (예방적 효과)

미코박테리움 보비스 (M. bovis) BCG의 불활성화된 바실루스는 실시예 2에서 설명된 동일한 방법에 따라 제조되었다.

이들 생쥐는 각각 12마리 동물의 2가지 군로 분할되고, 그리고 이들은 하기 치료에 종속되었다:

대조 군: 치료되지 않음.

군 1 (감염전 치료): 감염 전 29 일자에 시작하여 주 3 회 (월요일, 수요일 및 금요일) 투여된, 불활성화된 미코박테리아를 내포하는 13가지 산물 복용량으로 영양에 의해 경구 치료됨. 2.575 x 10³ CFU에 상응하는 1:1000 희석에 상응하는 0.3 ml의 부피가 각 복용량에서 투여되었다.

전술한 실시예에서처럼, Proskauer-Beck 배지에서 중간-대수증식기까지 배양되고 이용 때까지 -70℃의 온도에서 1 ml 분취량에서 보존된 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis) (H₃₇Rv Pasteur)의 독성 균주가 감염에 이용되었다.

획득된 결과는 도면 4에서 그래픽적으로 묘사된다. 생존 시간 (일자)은 x-축에 표시되고, 반면 생존자의 백분율은 y-축에 표시된다.

대조 군 (연속선)은 치료된 군 1 (불연속선)보다 더욱 낮은 생존율을 갖는 것으로 관찰되고, 유의미한 차이가 로그 순위 검사 (p=0.0020) 및 Gehan-Breslow-Wilcoxon 검사 (p=0.0019)에 따라 관찰된다.

이들 결과는 결핵균 (M. tuberculosis)에 의한 감염에 앞서, 불활성화된 미코박테리아 미코박테리움 보비스 (M. bovis) BCG의 경구 투여에 의한 관용의 유도 후 보호 반응을 반영하고, 상기 치료가 높은 백분율에서 상기 질환의 유도를 예방한다는 것을 관찰한다.

실시예 4. 감염전 또는 감염후 투여된 결핵균 (M. tuberculosis)의 불활성화된 바실루스로 경구 관용-구축 치료 (예방적 또는 치료적 효과)의 유용성, 그리고 비장에서 조절 T 세포를 분석함에 의하여 유도된 관용의 모니터링

결핵균 (M. tuberculosis)의 불활성화된 바실루스 (TOL-3)는 실시예 1에서 설명된 동일한 방법에 따라 제조되었다.

이들 생쥐는 각각 24마리 동물의 3가지 군으로 분할되고, 그리고 이들은 하기 치료에 종속되었다:

대조 군: 치료되지 않음.

군 1 (감염전 치료): 감염 전 10 일자에 시작하여 48 시간마다, 그리고 실험의 종결 때까지 차후에 주 3 회 (월요일, 수요일 및 금요일) 투여된, 불활성화된 미코박테리아를 내포하는 5가지 산물 복용량으로 영양에 의해 경구 치료됨. 1:1000 희석에서 0.3 ml의 부피가 각 복용량에서 투여되었다.

군 2 (감염후 치료): 감염 후 11 일자에 시작하여 48 시간마다, 그리고 실험의 종결 때까지 차후에 주 3 회 (월요일, 수요일 및 금요일) 투여된, 불활성화된 미코박테리아를 내포하는 5가지 산물 복용량으로 영양에 의해 경구 치료됨. 1:10 희석에서 0.3 ml의 부피가 각 복용량에서 투여되었다.

이들 생쥐는 약 1 x 10⁵ 생존가능한 바실루스의 접종물을 도입함으로써 정맥내 감염되었다.

각 군에서 동물 절반 (12)은 생존 연구를 위해 한쪽으로 치워두었다. 이들 동물은 실시예 1의 표 1에서 상세하게 설명된 동일한 방법에 따라, 희생이 필요한 조건 때까지 매일 관찰되고 칭량되었다.

도면 5에서, 그래프 1과 2는 상이한 실험 군의 생존의 결과를 보여준다. 생존 시간 (일자)은 x-축에 표시되고, 반면 생존 동물의 백분율은 y-축에 표시된다.

그래프 1에서, 대조 군 (연속선)은 감염 전 시작된 치료에 종속된 군 1 (불연속선)과 비교된다. 대조 군은 치료된 군보다 더욱 낮은 생존율을 갖는 것으로 관찰되고, 통계학적으로 유의한 결과가 로그 순위 검사 (p= 0.0011) 및 Gehan-Breslow-Wilcoxon 검사 (p=0.0014)에 따라 관찰되었다.

그래프 2에서, 대조 군 (연속선)은 감염 후 시작된 치료에 종속된 군 2 (불연속선)와 비교된다. 대조 군은 치료된 군보다 더욱 낮은 생존율을 갖는 것으로 관찰되고, 상기 차이는 로그 순위 검사 (p=0.04541)에 따라 통계학적으로 유의한 결과인 반면, Gehan-Breslow-Wilcoxon 검사에 따라 통계학적으로 유의하지 않다.

양쪽 사례에서, 불활성화된 미코박테리아를 이용한 관용-구축 섭생으로 치료된 동물은 치료되지 않은 동물보다, 결핵균 (M. tuberculosis)으로 감염 후 더욱 긴 시간 동안 생존하는 것으로 결론된다.

각 군에서 나머지 동물 (12)에 대하여, 비장세포 중에 존재하는 조절 T 세포를 조사하기 위해 절반의 동물은 3 주차에서 (군당 6마리 동물), 그리고 다른 절반은 4 주차 (군당 6마리 동물)에서 희생되었다.

Faria et al., Oral tolerance, Immunol. Rev., 2005, 206(1), 232-259에 의한 논문에서 설명된 바와 같이, 조절 T 세포는 면역 반응을 조절하는데 관련된 개체군으로서 정의된, 경구 관용의 유도에서 핵심인 일군의 T 세포이고, 그리고 이들은 CD4와 CD25 막 마커를 발현한다.

Hori et al., Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3, Science, 2003, 299(5609), 1057-61에 의한 2003년 논문은 전사 인자 Foxp3이 조절 T 세포의 발달에 핵심이라는 것을 설명한다. 이런 이유로, CD4+CD25+Foxp3+ 표현형을 갖는 T 세포는 조절 기능을 갖는 것으로 고려된다.

이들 동물은 이소플루오란으로 흡입 마취 후 경부 탈구에 의하여 희생되었다. 비장은 이전되고, 그리고 비장세포는 기계적 분해, 셀 스트레이너 (BD Falcon Cell Strainer, 나일론, 40 μm)로 여과, 그리고 적혈구 용해에 의하여 획득되었다. CD4와 CD25 막 비장세포 및 세포내 Foxp3은 조절 T 세포 표지화 키트 (eBioscience)에 의하여 표지화되고, 그리고 유세포분석법 (BD LSR-Fortessa 세포 분석기)에 의하여 분석되었다. 이들 결과는 BD FACSdiva 분석 소프트웨어에 의하여 치료되었다.

도면 6은 감염후 3 주차 (그래프 1)와 4 주차 (그래프 2)에서 상이한 치료와 대조의, 전체 CD4+ T 세포에 대하여 조절 T 세포, CD4+CD25+Foxp3+ 표현형을 갖는 T 세포의 백분율을 묘사한다. 조절 T 세포의 백분율은 y-축에 표시된다. 상이한 유형의 치료와 대조는 x-축에 표시된다.

사각형은 치료되지 않은 동물 (대조 군)을 나타내고, 삼각형은 감염 전 치료된 군 1에서 동물을 나타내고, 그리고 원은 감염 후 치료된 군 2에서 동물을 나타낸다. 고체 수평선은 각 군의 산술 평균을 나타낸다. 결핵균 (M. tuberculosis)으로 감염 전 또는 후에 시작되는 지에 상관없이 관용-구축 섭생에 따라 치료된 군에서만 3 주차와 4 주차 사이에 조절 T 세포의 백분율에서 증가가 실재하는 것으로 관찰된다.

실례 5.- 감염 전후에 투여된 미코박테리움 칸사시 ( M. kansasii )의 불활성화된 바실루스로 경구 관용-구축 치료 (예방적 또는 치료적 효과)

미코박테리움 칸사시 (Mycobacterium kansasii)는 느린-성장 비-결핵성 미코박테리움이다. 지수 성장 및 ml당 8.07 x 10⁴ 집락 형성 단위 (CFUs)의 농도를 달성할 때까지 Proskauer Beck 액체 배지에서 배양된, Unitat de Tuberculosi Experimental of Institut Germans Trias i Pujol 균주 수집으로부터 미코박테리움 칸사시 (M. kansasii)의 임상적 균주 (TOL)가 불활성화된 미코박테리아를 제조하는데 이용되었다.

배양액은 121℃에서 20 분 동안 고압살균 후 불활성화되고, 그리고 -80℃에서 차후에 동결되었다. 이것은 차후에, 10% 수크로오스 용액에서 50:50 희석되고, 2 ml 부피에서 바이알에서 포장되고, 그리고 -80℃에서 보존되었다.

2.42 x 10⁴ CFU에 상응하는 1:10 희석에 상응하는 0.3 ml의 부피가 각 복용량에서 투여되었다.

이들 생쥐는 각각 12마리 동물의 3가지 군으로 분할되고, 그리고 각 군은 하기 관용-구축 프로토콜에 종속되었다:

대조 군: 치료되지 않음.

군 1 (감염전 치료): 주 3 회 (월요일, 수요일 및 금요일) 투여된, 불활성화된 미코박테리아를 내포하는 13가지 산물 복용량으로 영양에 의해 경구 치료됨. 상기 군은 최종 복용량을 투여한 후 24 시간 시점에 감염되었다.

군 2 (감염후 치료): 감염 후 15 일 시점에, 상기 군은 주 3 회 (월요일, 수요일 및 금요일) 투여된, 불활성화된 미코박테리아를 내포하는 13가지 산물 복용량으로 영양에 의해 경구 치료되었다.

도면 7, 그래프 1과 2는 상이한 군의 생존의 결과를 보여준다. 생존 시간 (일자)은 x-축에 표시되고, 반면 생존자의 백분율은 y-축에 표시된다.

그래프 1은 예방적 처치를 지칭하고, 대조 군을 감염 전 시작된 치료에 종속된 군 1과 비교한다. 대조 군 (연속선)은 군 1 (불연속선)보다 더욱 낮은 생존율을 갖는 것으로 관찰되고, 유의미한 차이가 관찰된다 (로그 순위 검사, p<0.0001; Gehan-Breslow-Wilcoxon 검사, p<0.0001).

그래프 2는 치료적 처치를 지칭하고, 대조 군을 감염 후 시작된 치료에 종속된 군 2와 비교한다. 대조 군 (연속선)은 치료된 군 2 (불연속선)보다 더욱 낮은 생존율을 갖는 것으로 관찰되고, 유의미한 차이가 관찰된다 (로그 순위 검사, p<0.0001; Gehan-Breslow-Wilcoxon 검사, p<0.0001).

양쪽 사례에서, 이들 결과는 보호 반응을 반영한다. 이런 이유로, 결핵균 (M. tuberculosis)에 의한 감염 전후에 투여된, 느린-성장, 비-결핵성 불활성화된 미코박테리아 (미코박테리움 칸사시 (M. kansasii))의 관용-구축 섭생으로 경구 치료는 상기 질환의 유도를 지연함으로써 이들 동물의 생존율을 증가시키는 것으로 결론될 수 있다. 이런 이유로, 본 발명에 따른 불활성화된 미코박테리아의 이용은 잠복 감염의 활동성 감염으로의 전환을 지연함으로써 결핵에 대항하는 예방적 처치로서 적합한 것으로 고려된다.

실시예 6. 감염 전후에 투여된 미코박테리움 포트투이툼 ( M. fortuitum )의 불활성화된 바실루스로 경구 관용-구축 치료 (예방적 또는 치료적 효과)

미코박테리움 포르투이툼 (Mycobacterium fortuitum)은 빠른-성장, 비-결핵성 미코박테리움이다. ml당 2 x 10⁹ 집락 형성 단위 (CFUs)의 농도를 달성할 때까지 Middlebrook 7H9 고형 배지에서 배양된, Unitat de Tuberculosi Experimental of Institut Germans Trias i Pujol 균주 수집으로부터 미코박테리움 포트투이툼 (M. fortuitum)의 환경 균주 (Manresa 균주)가 불활성화된 미코박테리아를 제조하는데 이용되었다.

배양액은 121℃에서 20 분 동안 고압살균 후 불활성화되고, 그리고 -80℃에서 차후에 동결되었다. 이것은 차후에, 10% 무균 수크로오스 용액에서 50:50 희석되고, 2 ml 부피에서 바이알에서 포장되고, 그리고 -80℃에서 보존되었다.

6 x 10⁵ CFU에 상응하는 1:1000 희석에 상응하는 0.3 ml의 부피가 각 복용량에서 투여되었다.

대조 군: 치료되지 않음.

군 1 (감염전 치료): 주 5 회 (월요일에서 금요일) 투여된, 불활성화된 미코박테리아를 내포하는 10가지 산물 복용량으로 영양에 의해 경구 치료됨. 상기 군은 최종 복용량을 투여한 후 24 시간 시점에 감염되었다.

군 2 (감염후 치료): 감염 후 5 일 시점에 치료를 시작하여, 주 5 회 (월요일에서 금요일) 투여된, 불활성화된 미코박테리아를 내포하는 10가지 산물 복용량으로 영양에 의해 경구 치료됨.

이들 생쥐는 약 2 x 10⁵ 생존가능한 바실루스의 접종물을 도입함으로써 정맥내 감염되었다.

도면 8, 그래프 1과 2는 상이한 군의 생존의 결과를 보여준다. 생존 시간 (일자)은 x-축에 표시되고, 반면 생존자의 백분율은 y-축에 표시된다.

예방적 처치에 관하여 획득된 결과는 그래프 1에서 도시된다. 대조 군 (연속선)은 치료된 군 1 (불연속선)보다 더욱 낮은 생존율을 갖는 것으로 관찰되고, 유의미한 차이가 관찰된다 (로그 순위 검사, p<0.0001; Gehan-Breslow-Wilcoxon 검사, p<0.0001).

치료적 처치에 관하여 획득된 결과는 그래프 2에서 도시된다. 대조 군 (연속선)은 치료된 군 2 (불연속선)보다 더욱 낮은 생존율을 갖는 것으로 관찰되고, 유의미한 차이가 관찰된다 (로그 순위 검사, p<0.0001; Gehan-Breslow-Wilcoxon 검사, p<0.0001).

양쪽 사례에서, 이들 결과는 보호 반응을 반영한다. 이런 이유로, 결핵균 (M. tuberculosis)에 의한 감염 전후에 빠른-성장, 비-결핵성 미코박테리아 (미코박테리움 포트투이툼 (M. fortuitum))의 관용-구축 섭생의 경구 투여는 상기 질환의 유도를 지연함으로써 이들 동물의 생존율을 증가시키는 것으로 결론될 수 있다. 이런 이유로, 본 발명에 따른 불활성화된 미코박테리아의 이용은 잠복 감염의 활동성 감염으로의 전환을 지연함으로써 결핵에 대항하는 예방적 처치로서 적합한 것으로 고려된다.

실례 7. 실험적 활동성 결핵의 치료 후 투여된, 미코박테리움 포트투이툼 ( M. fortuitum )의 불활성화된 바실루스로 경구 관용-구축 치료 (재발에 대항하는 효과)

미코박테리움 포트투이툼 (M. fortuitum)의 불활성화된 바실루스 (Manresa 균주)는 실시예 6에서 설명된 동일한 방법에 따라 제조되었다.

6 x 10⁶ CFU에 상응하는 1:100 희석에 상응하는 0.3 ml의 부피가 각 복용량에서 투여되었다.

이러한 사례에서, 본 발명에 따른 예방적 관용-구축 치료의 유용성은 항-재발 효과에 대하여, 다시 말하면, 동물에서 활동성 결핵이 발병하고, 그리고 이들 동물이 항-결핵성 약물로 치료된 후 조사되었다.

이런 이유로, 실험의 시작 시점에, 이들 생쥐는 약 2 x 10⁵ 생존가능한 바실루스의 접종물을 도입함으로써 정맥내 감염되었다.

전술한 실시예에서와 유사하게, Proskauer-Beck 배지에서 중간-대수증식기까지 배양되고 이용 때까지 -70℃의 온도에서 1 ml 분취량에서 보존된 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis) (H₃₇Rv Pasteur)의 독성 균주가 감염에 이용되었다.

이러한 시간 (21 일자)에서, 치료는 주 5 일, 동물의 체중에 맞게 조정된, RIMSTAR로 불리는 상업적인 조합제 (이소니아지드, 에탐부톨, 피라진아미드 및 리팜피신)에 내포된 항생제 조합을 이용하여 시작되었다. 최종 복용량은 60 일자에 투여되었다.

이들 생쥐는 이후, 각각 12마리 동물의 2가지 군으로 분할되고, 그리고 각 군은 하기 관용-구축 프로토콜에 종속되었다:

대조 군: 관용-구축 치료 없음.

군 1: RIMSTAR로 활동성 결핵에 대한 치료 (63 일자)를 종결한 후 72 시간 시점에 상기 관용-구축 치료를 시작하고, 그리고 76 일자에 최종 복용량을 투여하는, 주 7 회 (월요일에서 일요일) 투여된, 불활성화된 미코박테리아를 내포하는 14가지 산물 복용량으로 영양에 의해 경구 치료됨.

재발에 대항하는 치료에 대하여 획득된 결과는 도면 9에서 그래픽적으로 묘사된다. 생존 시간 (일자)은 x-축에 표시되고, 반면 생존자의 백분율은 y-축에 표시된다. 게다가, 시간 x-축에서, RIMSTAR로 치료 기간은 흑색 직사각형으로 지시되고, 그리고 군 1의 관용-구축 치료로 기간은 백색 직사각형으로 지시된다.

대조 군 (연속선)은 치료된 군 1 (불연속선)보다 더욱 낮은 생존율을 갖는 것으로 관찰된다.

이들 결과는 보호 반응을 반영하고, 그리고 이런 이유로, 미코박테리아의 관용-구축 섭생의 경구 투여는 활동성 결핵에 대한 치료를 받은 후 재발을 예방하는 것으로 결론될 수 있다.

Claims

결핵의 예방을 위한, 불활성화된 미코박테리아 및 최소한 하나의 제약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 제약학적 조성물, 여기서:
미코박테리아는 정기적으로 경구 투여되고;
복용 사이에 간격은 5 일 보다 많지 않고;
투여되는 복용 횟수는 최소한 5회이며; 그리고
각 복용량은 10³ 내지 10¹⁰ 불활성화된 미코박테리아를 포함.
청구항 1에 있어서, 불활성화된 미코박테리아는 미코박테리움 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis), 미코박테리움 보비스 (Mycobacterium bovis), 미코박테리움 아프리카눔 (Mycobacterium africanum), 미코박테리움 미르코티 (Mycobacterium microti), 미코박테리움 보비스 BCG (Mycobacterium bovis BCG), 미코박테리움 포트투이툼 (Mycobacterium fortuitum) 및 미코박테리움 칸사시 (Mycobacterium kansasii)로 구성된 그룹에서 선택됨을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
청구항 2에 있어서, 불활성화된 미코박테리아는 미코박테리움 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis), 미코박테리움 보비스 (Mycobacterium bovis), 미코박테리움 보비스 BCG (Mycobacterium bovis BCG), 미코박테리움 포트투이툼 (Mycobacterium fortuitum) 및 미코박테리움 칸사시 (Mycobacterium kansasii)로 구성된 그룹에서 선택됨을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 미코박테리아는 가열하는 과정에 의하여 불활성화됨을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 복용 사이에 간격은 3 일 보다 많지 않은 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
청구항 5에 있어서, 복용 사이에 간격은 2 일 보다 많지 않은 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 투여되는 복용의 횟수는 최소한 7인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
청구항 7에 있어서, 투여되는 복용의 횟수는 최소한 9인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
삭제
청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 캡슐 형태인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 정제 형태인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 감염이 잠복 상태인, 미코박테리움 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis)에 의해 감염된 개체에서 결핵의 예방을 위한 것임을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
청구항 12에 있어서, 개체는 이전에 활동성 결핵이 발병한 적이 있었음을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 미코박테리움 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis)에 의해 감염되지 않은 개체에서 결핵의 예방을 위한 것임을 특징으로 하는 제약학적 조성물.