WO2013186409A1 - Micobacterias in activadas para su uso por vía oral en la prevención de la tuberculosis - Google Patents

Micobacterias in activadas para su uso por vía oral en la prevención de la tuberculosis Download PDF

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WO2013186409A1
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Crístina VILAPLANA MASSAGUER
Elena MARZO ESCARTÍN
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Ciber De Enfermedades Respiratorias (Ciberes)
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Definitions

  • the present invention is part of the provision of medicaments to be administered orally for the prevention of tuberculosis, in particular to control the passage from latent infection to active infection of said disease.
  • Tuberculosis is a chronic infectious disease caused by bacteria belonging to the Mycobacterium tuberculosis-complex (MTB-C) group, which currently includes bacilli M. tuberculosis, M. bovis, M, microti and M. africanum, being M. tuberculosis the most important and frequent agent in relation to human tuberculosis. This disease mainly affects the lungs, although in some cases it can also spread to other organs. If not treated properly, tuberculosis can be fatal.
  • MTB-C Mycobacterium tuberculosis-complex
  • Tuberculosis is transmitted through the air, so that patients with a tuberculous cavity in their lungs are the main source of transmission of this disease, as described, for example, in J. Grosset, Studies in short-course chemotherapy for tuberculosis. Basis for short-course chemotherapy, Chest, 1981, 80, 719-720, and in J. Grosset, Mycobacterium tuberculosis in the Extracellular Compartment: an Underestimated Adversary, Antimicrob. Agents Chemother ,, 2003, 47, 833-836.
  • patients expel, by coughing or sneezing, a large number of micro-drops capable of transporting bacilli, which can enter the alveolar space of the person who inhales them.
  • the bacillus After inhalation, the bacillus is phagocytosed by the alveolar macrophages, and it is within this cell where the bacillus can grow, until causing its destruction. Again in the extracellular space, the bacillus is phagocytized by new macrophages and this process is repeated until, when drained and generated a infection in the hilar lymph nodes, an immune response based on cellular immunity is generated.
  • the bacillary growth ceases, the host positivizes the tuberculin skin test, characterized by a delayed hypersensitivity response (or DTH, from the English Delayed Type Hypersensitivity), and the so-called caseous necrosis is generated in the point of infection
  • tuberculosis infection One of the main characteristics of tuberculosis infection is the fact that M. tuberculosis is able to remain in the host tissue for years without developing the disease, in the form of a "latent" tuberculosis infection, but maintaining its chances of generating a active tuberculosis
  • This latent state of the infection is related to the occurrence of the so-called caseous necrosis, which is generated in the initial alveolar lesion and in the surrounding lung tissue, resulting in the destruction of the macrophages that contain the bacilli that are multiplying, producing a solid necrotic lesion.
  • necrotic reaction is not known exactly, but it is related to the DTH type reaction.
  • the immune response that allows the control of the bacillary population is cell-type and mostly directed by Th4-type CD4 lymphocytes, that is, capable of generating the DTH type response and also of identifying infected macrophages and activating them to destroy the bacilli inside.
  • softening is associated with the drainage of softened tissue into the bronchial tree, forming a tuberculous cavity, and an explosive extracellular growth of the bacillus, with the entry of oxygen through the bronchial orifice. With cough, this caseum softened and full of bacilli, is spread through other parts of the bronchi, lung and outside.
  • the pharmacological treatment of tuberculosis is characterized by being a prolonged therapy, which makes it difficult to monitor while favoring the emergence of drug-resistant bacteria.
  • the best strategy for the containment of tuberculosis is considered to be based on a preventive approach to tuberculosis.
  • the current vaccine administered parenterally, which is used in the preventive treatment against tuberculosis is based on bacteria of the strain called BCG (Bacillus Calmette-Guerin), an attenuated variant of M. bovis.
  • BCG Bacillus Calmette-Guerin
  • M. bovis M. bovis
  • tuberculosis prophylactic treatments have been developed based mainly on other live attenuated mycobacten strains, or on bacterial subunits.
  • prophylactic tuberculosis treatments based on inactivated mycobactenas have also been explored in the state of the art, in order to obtain an immune response analogous to that obtained with attenuated mycobactenase-based vaccines, that is, of the Th1 type, interferon-y generator.
  • Mycobacterium w against Mycobacterium tuberculosis in mice Immunized with Uve versus heat-killed M. w by the aerosol or parenteral route, Infec ⁇ . Immun., 2009, 77 (1), 223-231, it is described that M. w live or inactivated mycobactenas were administered by heating. The latter were administered as a single dose subcutaneously, and an immune response was observed based on the induction of Th1 lymphocytes, which generated interferons.
  • Th1 regulatory T cells
  • Th2 regulatory T cells
  • the object of the present invention is the use of mycobacteria ⁇ nactivated for the preparation of a medicament for oral administration for the prevention of tuberculosis.
  • Control Group is represented with a continuous line, and Group 1 animals are represented in a broken line.
  • Group 1 animals underwent treatment with mycobacterium tuberculosis inactivated mycobacteria orally before infection, by administering 5 doses of these bacilli, one every 48 hours starting on day 10 before infection.
  • 2, 3 and 4 correspond to the animals of groups 1a, 1 b, 1c and 1 d, respectively, to which different amounts of product were administered, according to dilutions 1: 1, 1: 10, 1: 100 and 1: 1000.
  • the survival time expressed in days is represented on the abscissa axis, and the percentage of surviving animals on the ordinate axis.
  • the Control Group continuously line
  • Group 2 broken line
  • Group 2 animals underwent treatment with mycobacterium tuberculosis inactivated mycobacteria orally after infection by administering 5 doses of these bacilli, one every 48 hours starting on day 1 1 after infection.
  • 6, 7 and 8 correspond to the animals of groups 2a, 2b, 2c and 2d, respectively, which were given different amounts of product, according to dilutions 1: 1, 1: 10, 1: 100 and 1: 1000 (Example
  • the survival time expressed in days is represented on the abscissa axis, and the percentage of surviving animals on the ordinate axis.
  • the Control Group continuously line
  • the animals of Group 1 discontinuous line
  • the survival time expressed in days is represented on the abscissa axis, and the percentage of surviving animals on the ordinate axis.
  • the Control Group continuously line
  • the animals of Group 1 discontinuous line
  • the percentage of surviving animals on the ordinate axis is compared with the animals of Group 1 (discontinuous line), which was treated with inactivated mycobacteria of M. bovis BCG orally before infection.
  • Figure 5 the survival time expressed in days is represented on the abscissa axis, and the percentage of surviving animals on the ordinate axis.
  • Figure 1 compares the Control Group (continuous line) with Group 1 (discontinuous line), which was subjected to treatment with inactivated Mycobacterium tuberculosis mycobacteria administered orally initiated before infection.
  • Figure 2 compares the Control Group (continuous line) with Group 2 (discontinuous line), which was subjected to treatment with inactivated mycobacteria administered orally after infection. (Example 4)
  • Figure 6 shows the percentages of regulatory T cells with the CD4 + CD25 + Foxp3 + phenotype, with respect to the total of CD4 + T cells, for each of the treatments with inactivated mycobacteria of M. tuberculosis and the control, at week 3 ( Figure 1) and at week 4 (Figure 2) after infection.
  • said percentage of regulatory T cells is represented.
  • the different groups of animals are represented on the abscissa axis.
  • the squares represent untreated animals (Control Group), the triangles represent animals of Group 1, treated before infection (prophylactic effect), and the circles represent animals of Group 2, treated after infection (therapeutic effect).
  • the horizontal lines drawn represent the arithmetic mean of each group. (Example 4)
  • Figure 7 the survival time expressed in days is represented in the abscissa axis, and the percentage of surviving animals in the ordinate axis.
  • Figure 1 compares the Control Group (continuous line) with Group 1 (discontinuous line), which was subjected to a treatment with mycobacterium kansas ⁇ i inactivated mycobacteria administered orally, initiated before infection (prophylactic effect).
  • Figure 2 compares the Control Group (continuous line) with Group 2 (broken line), which was subjected to a treatment with inactivated mycobacteria of Mycobacterium kansasii administered orally, initiated after infection (therapeutic effect). (Example 5)
  • Figure 8 the survival time expressed in days is represented on the abscissa axis, and the percentage of surviving animals on the ordinate axis.
  • Figure 1 compares the Control Group (continuous line) with Group 1 (discontinuous line), which was subjected to a treatment with inactivated Mycobacterium fortuitum mycobacteria administered orally, initiated before infection (prophylactic effect).
  • Figure 2 compares the Control Group (continuous stroke) with Group 2 (discontinuous stroke), which was subjected to a treatment with inactivated Mycobacterium fortuitum mycobacteria administered orally, initiated after infection (therapeutic effect). (Example 6)
  • Figure 9 Comparation of the Control Group (continuous line) with Group 1 (discontinuous line), which was subjected to a treatment with inactivated Mycobacterium fortuitum mycobacteria administered orally, initiated after infection (therapeutic effect).
  • the survival time expressed in days is represented on the abscissa axis, and the percentage of surviving animals on the ordinate axis.
  • the animals were infected and subsequently treated with the anti-tuberculosis drug RIMSTAR.
  • Group 1 after treatment with RIMSTAR, was subjected to a subsequent tolerant treatment with inactivated Mycobacterium fortuitum mycobacteria administered orally (anti-relapse effect).
  • the Control Group continuously line, without tolerant treatment
  • Group 1 discontinuous line, with tolerant treatment
  • the periods of the RIMSTAR treatment black rectangle
  • the subsequent tolerant treatment white rectangle
  • the object of the present invention is the use of inactivated mycobacteria for the preparation of a medicament for the prevention of tuberculosis, wherein:
  • the number of doses administered is at least 5.
  • the object of the present invention can be formulated as inactivated mycobacteria for use for the prevention of tuberculosis, wherein:
  • - mycobacteria are periodically administered orally, - the interval between doses is not more than 5 days, and
  • the number of doses administered is at least 5.
  • the authors of the present invention have developed a new preventive treatment of tuberculosis based on the administration of inactivated mycobacteria, according to a multiple dose administration schedule, administered with a reduced time interval between administrations.
  • the periodic oral administration of dead bacilli preferably at low doses, and with a reduced time interval between the doses, induces a tolerization or tolerizing response that, surprisingly, has a positive effect on the control of infection by M. tuberculosis, that is, in the transition from latent infection to active infection.
  • the use of the invention is directed to uninfected individuals and to individuals infected with M. tuberculosis in which the infection is in a latent state.
  • the preventive treatment is considered to have a prophylactic effect, while in the second case it is considered to have a therapeutic effect.
  • preventive treatment with therapeutic effect referring to subjects infected with M. tuberculosis in which the infection is in a latent state
  • therapeutic effect referring to subjects infected with M. tuberculosis in which the infection is in a latent state
  • preventive treatment with therapeutic effect is constituted by those individuals who had previously developed active tuberculosis and in those that said disease has subsequently remitted, for example by treatment with conventional anti-tuberculous therapy, having thus reverted tuberculosis again to a latent infection state.
  • This particular case of preventive treatment is considered to have a therapeutic anti-relapse effect.
  • anti-tuberculous agents are well known to those skilled in the art, the main ones being, for example, isoniazid, ethambutol, pyrazinamide, rifampicin, streptomycin; and those of the second line, applied in case of resistance, for example, thioamides (protionamide, ethionamide, among others), aminoglycosides (amikacin, kanamycin, among others), cycloserine, rifabutin, rifapentine, fluorquinolones (moxifloxacin, levofloxacin, ofloxacin, ofloxacin ), PAS, clarithromycin, clofazimide, linezolid or thioridazine among others, or mixtures thereof.
  • thioamides protionamide, ethionamide, among others
  • aminoglycosides amikacin, kanamycin, among others
  • cycloserine rifabutin,
  • preventive treatment means that which allows an individual to be preserved from a disease.
  • preventive treatment is that treatment capable of preventing the development of active tuberculosis by controlling the passage of latent infection to active infection.
  • tolerization is understood as the intentional induction of tolerance by means of biological or chemical agents, wherein the term “tolerance” means a state of hyporesponse specific to the biological or chemical agent.
  • the term "induction of a tolerant response” is understood as a method by which a state of lack of response is induced in the host's immune system against a specific antigen, with The result of an attenuation of the disorder.
  • the genus of mycobacteria belong to the Mycobacteriaceae family and is made up of aerobic bacilli.
  • All bacilli belonging to the genus of mycobacteria are part of the object of the present invention, for example the species M. abscessus, M. afr ⁇ canum, M. asiaticum, M. aurum, M. avium, M. avium paratuberculosis, M. avium silvaticum and M. avium hominissuis, M. bovis, M. bovis BCG, M. chelonae, M. fortu ⁇ tum, M. gastri, M. goodi, M. gordonae, M. mmunogenum, M. haemophilum, M. habana, M kansasii, M. lentiflavum, M.
  • leprae M. lepromatosis, M. lufu, M. mageritense, M, malmoense, M. marinum, M. massiliense, M. microti, M. monacense, M. mucogenicum, M. neoaurum, M. peregr ⁇ num, M. phlei, M. scrofulaceum, M. smegmatis, M. terrae, M. triviale, M. tuberculosis, M. microti, M. ulcera ns, M. vaccae and M. xenopi, among others.
  • Mycobacteria have many common antigens with M. tuberculosis, and are therefore appropriate for the use of the present invention. Thus, in Stanford's article al., Mycobacteria and their world, Int. J. Mycobacteriol., 2012, 3-12, a classification of the different groups of mycobacterial antigens is described and how they are distributed and shared between different species of the family Mycobacteria ceae.
  • the inactivated mycobacteria that are part of the present invention are: the mycobacteria of the group called Mycobacterium tuberculosis complex (MTB-C), Mycobacterium fortuitum and Mycobacterium kansasii. That is, preferably the inactivated mycobacteria are chosen from the group consisting of M. tuberculosis, M. bovis, M, africanum, and M. microti, M, bovis BCG, M. fortuitum and M. kansasii. More preferably, the inactivated mycobacteria are chosen from the group consisting of M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. fortuitum and M. kansasii.
  • MTB-C Mycobacterium tuberculosis complex
  • inactivated mycobacteria also called dead mycobacteria
  • dead mycobacteria are those mycobacteria that have undergone a physical or chemical treatment that transforms the living mycobacterium into a form unable to replicate.
  • Some suitable methods for inactivating mycobacteria are, for example, treatment with formaldehyde, by irradiation or by heating.
  • the inactivated mycobacteria object of the present invention are inactivated by a heating process.
  • a suitable method for inactivating mycobacteria by heating comprises, for example, cultivating a strain of mycobacteria in a suitable culture medium, as are well known to those skilled in the art, such as, Middlebrook type 7H10 or type 7H1 1 agar. , Sauton culture medium or Proskauer-Beck culture medium, among others.
  • the culture is preferably maintained until a concentration of approximately 1 x 10 5 and 1 x 10 9 colony forming units (CFUs) per ml is achieved.
  • the culture is inactivated by heating.
  • the heating is carried out at a temperature between 70 ° C and 90 ° C.
  • the heating period is between 30 minutes and 3 hours.
  • autoclaving preferably heating at a temperature of 121 ° C for 20 minutes.
  • tuberculosis prevention refers to preventing the manifestation of active tuberculosis by controlling the progression of the infection from a latent state to active tuberculosis.
  • Such prevention can be carried out in uninfected individuals and also in individuals infected with M. tuberculosis in whom the infection is dormant, either because the disease has not yet developed, or because the active disease had already developed and had referred later, for example by treatment with anti-tuberculosis drugs.
  • the authors of the present invention have developed a preventive treatment of tuberculosis that prevents the progression of latent infection, so that the progression of solid caseous lesions to liquefied lesions is avoided and, therefore, the manifestation of the active tuberculosis
  • the authors of the present invention have used an experimental model that is based on the use of C3HeB / FeJ mice, in which a lung pathology can be simulated after infection with M. tuberculosis equivalent to that developed in humans.
  • the preventive effect of the treatment object of the present invention is due to the fact that oral administration of frequent periodic doses of dead bacilli, preferably at low doses, constitutes a capable guideline. of inducing tolerance in the subjects, generating a response in which the regulatory T lymphocytes (Tregs) are preferably induced.
  • Tregs regulatory T lymphocytes
  • These lymphocytes are related to the transforming growth factor-beta beta (TGF-beta), it is that is to say, an immune response is generated mostly of type Th3 or tolerant, unlike traditional vaccination systems, where basically an immune response of type Th1 is triggered.
  • tolerance induction is effective in stopping the progression of M. tuberculosis infection, that is, the transition from latent infection to active infection.
  • inactivated mycobacteria be administered repeatedly and with reduced time intervals between each administration, not exceeding 5 days; preferably, the interval between doses is not more than 3 days; and more preferably, the interval between doses is not more than 2 days.
  • tolerant treatment requires repeated administration of inactivated mycobacteria, the number of doses administered being at least 5; preferably, the number of doses administered is at least 7; more preferably the number of doses administered is at least 9, and even more preferably the number of doses administered is at least 14.
  • an immunologically effective amount of inactivated mycobacteria is administered.
  • the dose to be used depends on the age and weight of the individual to administer the mycobacteria.
  • suitable doses are in the range between 10 3 and 10 10 inactivated mycobacteria; preferably between 10 3 and 10 8 , and more preferably between 10 4 and 10 8 .
  • the C3HeB / FeJ mice used in the model described above were subjected to a protocol in which they were administered orally between 5 and 14 doses of inactivated mycobacteria, with a dose interval between 1 and 3 days.
  • the murine model used simulates a preventive therapy of tuberculosis, either when the treatment is administered before infection, as described in Examples 1 and 3-6, or when the treatment is initiated after M. tuberculosis infection. , as described in Examples 1, 2, and 4-6, but administered at an early stage (up to 15 days after infection when the animals have already developed lesions, but these have not yet evolved towards their liquefaction and consequent manifestation of the disease); or alternatively, as described in Example 7, e! Treatment is given after infection when animals have developed lesions and have liquefied, but these have returned to the form of small lesions characteristic of latent infection.
  • inactivated mycobacteria according to the present invention is considered appropriate for the prevention of tuberculosis.
  • inactivated mycobacteria are administered orally.
  • Said mycobacteria can be administered in the form of any pharmaceutical composition suitable for oral administration, as they are well known to the person skilled in the art.
  • they are suitable for oral administration: tablets, capsules, solutions, suspensions, dispersions, powders, granules, or aerosols.
  • the mycobacteria are administered in the form of capsules or tablets.
  • compositions comprise the inactivated mycobacteria and at least one pharmaceutically acceptable excipient.
  • compositions are prepared according to the usual methods that are well known to those skilled in the art, such as those contained in manuals pharmaceutical technology, such as the book Remington The Science and Practice of Pharmacy, 20 Edition, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, 2000 [ISBN: 0-683-306472].
  • anti-caking agents such as colloidal silica, tribasic calcium phosphate, calcium silicate, magnesium silicate, magnesium trisilicate or talc
  • diluting agents such as anhydrous lactose, lactose monohydrate, calcium phosphate, hydrogen anhydrous calcium phosphate, hydrogen calcium phosphate dihydrate, calcium sulfate, calcium carbonate, calcium carboxymethylcellulose, microcrystalline or powdered cellulose, cellulose acetate, dextrins, dextrins, dextrose, fructose , glyceryl palmitoestearate, kaolin, lactitol, magnesium carbonate, magnesium oxide, maltitol, maltodextrins, maltose, polymethacrylates, pregelatinized starch, sodium chloride, starch, sucrose or sucrose; lubricating agents such as magnesium stearate, calcium stearate, g
  • Example 1 Orally tolerant treatment with inactivated M. tuberculosis bacilli, administered before or after infection (prophylactic or therapeutic effect)
  • TOL-3 M. tuberculosis
  • inactivated mycobacteria was tested in female mice 6 to 8 weeks of age of the C3HeB / FeJ type, free of specific pathogens.
  • mice were divided into three groups of 6 animals each, and each of the groups underwent the following tolerization protocol.
  • Group 1 pre-infection treatment: Treated orally, using a gastric tube, with 5 doses of product containing inactivated mycobacteria, administered every 48 hours starting on day 10 before infection. A volume of 0.3 ml was administered at each dose, and a total of 4 dilutions were tested: 1: 1, 1: 10, 1: 100 and 1: 1000 (groups 1a, 1 b, 1 c and 1 d, respectively )
  • Group 2 (post-infection treatment): Treated orally, using a gastric tube, with 5 doses of product containing inactivated mycobacteria, administered every 48 hours starting on day 1 1 after infection. A volume of 0.3 ml was administered at each dose, and a total of 4 dilutions were tested: 1: 1, 1: 10, 1: 100 and 1: 1000 (groups 2a, 2b, 2c and 2d, respectively)
  • the virulent strain of Mycobacterium tuberculosis (H 37 Rv Pasteur) was used, which was grown in Proskauer-Beck medium until a logarithmic middle phase, and stored in 1 ml aliquots at a temperature of -70 ° C until utilization.
  • mice were infected intravenously by introducing an inoculum of approximately 2 x 10 4 viable bacilli.
  • Figure 1 compares the Control Group (continuous line) with the animals of Group 1 (dashed line), which were treated before infection.
  • Graphs 1, 2, 3 and 4 correspond to the animals of groups 1 a, 1 b, 1 c and 1d, respectively, to which different amounts of product were administered, according to dilutions 1: 1, 1: 10, 1: 100 and 1: 1000.
  • Figure 2 compares the control group (continuous line) with the animals of Group 2 (dashed line), which were treated after infection.
  • Graphs 5, 6, 7 and 8 correspond to the animals of groups 2a, 2b, 2c and 2d, respectively, which were given different amounts of product, according to dilutions 1: 1, 1: 10, 1: 100 and 1: 1000.
  • the therapeutic agent used in this example was prepared from a commercial strain of M. bovis BCG (SSI) grown in Proskauer Beck liquid medium until exponential growth and a concentration of 1, 03 x 10 8 colony forming units (CFUs) were achieved. ) for me. It was inactivated following the same procedure described in Example 1.
  • inactivated mycobacteria was tested in female mice 6 to 8 weeks of age of the C3HeB / FeJ type, free of specific pathogens. At each dose, a volume of 0.3 ml was administered. corresponding to a 1: 10 dilution, which corresponds to 2,575 x 10 5 CFUs.
  • mice were divided into two groups of 12 animals each, and each group underwent the following tolerization protocol:
  • Group 1 post-infection treatment: Treated orally, using a gastric tube, with 5 doses of product containing inactivated mycobacteria, administered every 48 hours starting on day 12 after infection, and then 3 times for week (Monday, Wednesday and Friday) until the end of the experiment, by virtue of the survival time of each mouse
  • the virulent strain of Mycobacterium tuberculosis (H 37 Rv Pasteur) was used, which was grown in Proskauer-Beck medium until a logarithmic middle phase, and stored in 1 ml aliquots at a temperature of -70 ° C until utilization.
  • mice were infected intravenously by introducing an inoculum of approximately 2 x 10 4 viable bacilli.
  • the survival time (in days) is represented on the abscissa axis, while the percentage of survivors is represented on the ordinate axis.
  • Example 3 Orally tolerant treatment with inactivated M. bovis BCG bacilli, administered pre-infection (prophylactic effect)
  • Inactivated bacilli of M. bovis BCG were prepared following the same procedure described in Example 2.
  • inactivated mycobacteria was tested in female mice 6 to 8 weeks of age of the C3HeB / FeJ type, free of specific pathogens.
  • mice were divided into two groups of 12 animals each, and underwent the following treatment:
  • Group 1 pre-infection treatment: Treated orally, using a gastric tube, with 13 doses of product containing inactivated mycobacteria, administered 3 times per week (Monday, Wednesday and Friday) starting 29 days before infection . At each dose, a volume of 0.3 ml was administered. corresponding to a 1: 1000 dilution, which corresponds to 2,575 x 10 3 CFUs.
  • the virulent strain of M. tuberculosis (H 37 Rv Pasteur) was used for the infection, which was grown in Proskauer-Beck medium until a logarithmic middle phase, and stored in 1 ml aliquots. a temperature of -70 ° C until use.
  • mice were infected intravenously by introducing an inoculum of approximately 2 x 10 4 viable bacilli.
  • Control Group continuously line
  • treated Group 1 broken line
  • Example 4 Effectiveness of a tolerant oral treatment with inactivated M. tuberculosis bacilli, administered pre-infection or post-infection (prophylactic or therapeutic effect) and tolerance monitoring induced by analysis of regulatory T cells in the spleen.
  • TOL-3 Inactivated bacilli of M. tuberculosis (TOL-3) were prepared following the same procedure described in Example 1.
  • inactivated mycobacteria was tested in female mice 6 to 8 weeks of age of the C3HeB / FeJ type, free of specific pathogens.
  • mice were divided into three groups of 24 animals each, and underwent the following treatment:
  • Group 1 pre-infection treatment: Treated orally, using a gastric tube, with 5 doses of product containing inactivated mycobacteria, administered every 48 hours, starting on day 10 before infection, and then 3 times for week (Monday, Wednesday and Friday) until the end of the experiment. A volume of 0.3 ml was administered each time with a 1: 1000 dilution.
  • Group 2 (post-infection treatment): Treated orally, using a gastric tube, with 5 doses of product containing inactivated mycobacteria, administered every 48 hours, starting on day 1 1 after infection, and then 3 times per week (Monday, Wednesday and Friday) until the end of the experiment. A volume of 0.3 ml was administered at each dose, with a 1: 10 dilution.
  • the virulent strain of M. tuberculosis (H 37 Rv Pasteur) was used for the infection, which was grown in Proskauer-Beck medium until a logarithmic middle phase, and stored in 1 ml aliquots. a temperature of -70 ° C until use.
  • mice were infected intravenously by introducing an inoculum of approximately 1 x 10 5 viable bacilli. Half of the animals in each group (12) were preserved for survival study. The animals were observed and weighed daily until the conditions of the animal required their sacrifice, according to the same procedure as described in Table 1 of Example 1.
  • regulatory T cells are a group of key cells in the induction of oral tolerance, which are defined as a population involved in the regulation of the immune response, and which express the membrane markers CD4 and CD25.
  • T cells with the CD4 + CD25 + Foxp3 + phenotype are considered to have regulatory function.
  • the animals were sacrificed by cervical dislocation, after inhalation anesthesia with isofluorane. Spleens were removed and splenocytes were obtained by mechanical disintegration, filtration with cell separators (BD Falcon Cell Strainer, Nylon, 40 ⁇ ), and lysis of erythrocytes.
  • the CD4 and CD25 membrane splenocytes and intracellular Foxp3 were mapped using a regulatory T-cell mapping kit (eBioscience), and analyzed by flow cytometry (BD LSR-Fortessa cell analyzer). The results were processed using the BD FACSdiva analysis software.
  • Figure 6 shows the percentages of regulatory T cells, those with the CD4 + CD25 + Foxp3 + phenotype with respect to the total of CD4 + T cells, of the different treatments and control, at week 3 (graph 1) and week 4 (graph 2) post-infection.
  • the percentage of regulatory T cells is represented on the ordinate axis.
  • the different types of treatment and control are represented on the abscissa axis.
  • the squares represent untreated animals (Control Group), the triangles represent animals of group 1, treated before infection, and the circles represent animals of group 2, treated after infection.
  • the horizontal lines drawn represent the arithmetic mean of each group.
  • Example 5 Orally tolerant treatment with inactivated M. kansasii bacilli, administered before or after infection (prophylactic or therapeutic effect)
  • Mycobacterium kansasii is a slow-growing non-tuberculous mycobacterium.
  • TOL M. kansasii
  • mice were divided into three groups of 12 animals each, and each group underwent the following tolerization protocol:
  • Group 1 pre-infection treatment: Treated orally, using a gastric tube, with 13 doses of product containing inactivated mycobacteria, administered 3 times per week (Monday, Wednesday and Friday). The infection was carried out 24 hours after administering the last dose.
  • Group 2 15 days after infection, treatment was carried out orally, using a gastric tube, with 13 doses of product containing the inactivated mycobacteria, administered 3 times per week (Monday, Wednesday and Friday).
  • the virulent strain of Mycobacterium tuberculosis (H 37 Rv Pasteur) was used, which was grown in Proskauer-Beck medium until a logarithmic middle phase, and stored in 1 ml aliquots at a temperature of -70 ° C until utilization.
  • mice were infected intravenously by introducing an inoculum of approximately 2 x 10 4 viable bacilli.
  • Figure 1 refers to prophylactic treatment, comparing the Control Group with Group 1 who underwent a treatment initiated prior to infection. It is observed that the Control Group (continuous line) has a lower survival than Group 1 (discontinuous line), observing significant differences (Log Rank test, p ⁇ 0.0001; Gehan-Breslow-Wilcoxon test, p ⁇ 0.0001) .
  • Figure 2 refers to therapeutic treatment, comparing the Control Group with Group 2, which underwent treatment initiated after infection. It is observed that the Control Group (continuous line) has a survival smaller than the treated Group 2 (dashed line), observing significant differences (Log Rank test, p ⁇ 0.0001; Gehan-Breslow-Wilcoxon test, p ⁇ 0.0001).
  • Example 6 Orally tolerant treatment with inactivated M. fortuitum bacilli, administered before or after infection (prophylactic or therapeutic effect)
  • Mycobacterium fortuitum is a fast-growing non-tuberculous mycobacterium.
  • an environmental strain of M. fortuitum (Manresa strain) was derived from the strain collection of the Unitat de Experimental Tuberculosi of the Germans Trias i Pujol Institute, grown in Middlebrook 7H9 solid medium until a concentration of 2 x 10 9 colony forming units (UFCs) for me.
  • inactivated mycobacteria was tested in female mice 6 to 8 weeks of age of the C3HeB / FeJ type, free of specific pathogens.
  • mice were divided into three groups of 12 animals each, and each group underwent the following tolerization protocol:
  • Group 1 pre-infection treatment: Treated orally, using a gastric tube, with 10 doses of product containing inactivated mycobacteria, administered 5 times per week (Monday to Friday). The infection was carried out 24 hours after administering the last dose.
  • Group 2 post-infection treatment: Treated orally, using a gastric tube, with 10 doses of product containing inactivated mycobacteria, administered 5 times per week (Monday to Friday), starting treatment 5 days after the infection.
  • the virulent strain of Mycobacterium tuberculosis (H 37 Rv Pasteur) was used, which was grown in Proskauer-Beck medium until a logarithmic middle phase, and stored in 1 ml aliquots at a temperature of -70 ° C until utilization.
  • mice were infected intravenously by introducing an inoculum of approximately 2 x 10 5 viable bacilli.
  • Inactivated bacilli of M. fortuitum (Manresa strain) were prepared following the same procedure described in Example 6.
  • inactivated mycobacteria was tested in female mice 6 to 8 weeks of age of the C3HeB / FeJ type, free of specific pathogens.
  • the effectiveness of the tolerant preventive treatment according to the invention was studied in terms of its anti-relapse effect, that is, after the animals had developed active tuberculosis and treated them with anti-tuberculous drugs.
  • mice were infected intravenously by introducing an inoculum of approximately 2 x 10 5 viable bacilli.
  • the virulent strain of Mycobacterium tuberculosis (H 37 Rv Pasteur) was used for infection, which was grown in Proskauer-Beck medium until a logarithmic measured phase, and stored in aliquots of 1 ml at temperature of -70 ° C until use.
  • treatment began using the antibiotic combination contained in the commercial preparation RIMSTAR (isoniazid, ethambutol, pyrazinamide and rifampin), adjusted to the weight of the animal, 5 days a week. The last dose was administered on day 60.
  • RIMSTAR isoniazid, ethambutol, pyrazinamide and rifampin
  • mice were divided into two groups of 12 animals each, and each of the groups underwent the following tolerization protocol:
  • Control Group Without tolerant treatment.
  • Group 1 Treated orally, by means of a gastric tube, with 14 doses of product containing inactivated mycobacteria, administered 7 times a week (Monday to Sunday), starting such a tolerant treatment 72 hours after the end of the treatment of active tuberculosis with RIMSTAR (day 63), and the last dose being administered on day 76.
  • the results obtained regarding the treatment against relapse are represented graphically in Figure 9.
  • the abscissa axis represents the survival time (in days), while the ordinate axis represents the percentage of survivors.
  • the period of treatment with RIMSTAR has been indicated with a black rectangle and the period with the tolerant treatment of Group 1 with a white rectangle.
  • Control Group continuously line
  • treated Group 1 dashed line

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Abstract

Las micobacterias inactivadas para su uso por vía oral en la prevención de la tuberculosis se administran según una pauta de administración de múltiples dosis, administradas con un intervalo temporal reducido entre las mismas, de modo que induce una respuesta tolerizante frente a la infección por el bacilo de la tuberculosis. La utilización de las bacterias inactivadas de acuerdo con dicha pauta permite controlar el progreso de la infección desde un estado latente a tuberculosis activa.

Description

M ICQBACTERI AS IN ACTIVADAS PARA SU USO POR VÍA ORAL EN LA PREVENCIÓN
DE LA TUBERCULOSIS
Campo de ta técnica
La presente invención se enmarca en la provisión de medicamentos para ser administrados por vía oral para la prevención de la tuberculosis, en particular para controlar el paso de la infección latente a la infección activa de dicha enfermedad.
Estado de la técnica anterior
La tuberculosis es una enfermedad infecciosa crónica ocasionada por las bacterias pertenecientes al grupo Mycobacterium tuberculosis-complex (MTB-C), que incluye actualmente los bacilos M. tuberculosis, M. bovis, M, microti y M. africanum, siendo el M. tuberculosis el agente más importante y frecuente en relación con la tuberculosis humana. Dicha enfermedad afecta principalmente a los pulmones, si bien en algunos casos puede extenderse también a otros órganos. Si no se trata adecuadamente, la tuberculosis puede resultar mortal.
Según el informe del 201 1 de la Organización Mundial de la Salud, anualmente se registran 9 millones de nuevos casos a nivel mundial de personas que manifiestan la enfermedad y se contabilizan aproximadamente 1 ,7 millones de fallecimientos. Se considera, así mismo, que en el mundo existen más de 2.500 millones de personas infectadas y que cada año se generan unos 100 millones de infectados nuevos.
La tuberculosis se transmite por el aire, de manera que los pacientes con una cavidad tuberculosa en sus pulmones son la principal fuente de la transmisión de esta enfermedad, tal como se describe, por ejemplo, en J. Grosset, Studies in short- course chemotherapy for tuberculosis. Basis for short- course chemotherapy, Chest, 1981 , 80, 719-720, y en J. Grosset, Mycobacterium tuberculosis in the Extracellular Compartment: an Underestimated Adversary, Antimicrob. Agents Chemother,, 2003, 47, 833-836.
Según se describe en dichos artículos, los pacientes expulsan, mediante la tos o el estornudo, una gran cantidad de microgotas capaces de transportar bacilos, que pueden entrar en el espacio alveolar de la persona que los inhala.
Tras la inhalación, el bacilo es fagocitado por los macrófagos alveolares, y es dentro de esta célula donde el bacilo puede crecer, hasta causar la destrucción de la misma. De nuevo en el espacio extracelular, el bacilo es fagocitado por nuevos macrófagos y este proceso se va repitiendo hasta que, al ser drenados y generar una infección en los ganglios linfáticos hiliares, se genera una respuesta inmune basada en una inmunidad celular.
Unas 6 semanas después de la infección, el crecimiento bacilar cesa, el hospedador positiviza la prueba cutánea de la tuberculina, caracterizada por una respuesta de hipersensibilidad retardada (o DTH, del inglés Delayed Type Hypersensitivity), y se genera la denominada necrosis caseosa en el punto de infección.
Una de las características principales de la infección tuberculosa, es el hecho de que M. tuberculosis es capaz de permanecer durante años en el tejido del hospedador sin desarrollar la enfermedad, en forma de infección tuberculosa "latente", pero manteniendo sus posibilidades de generar una tuberculosis activa.
Este estado latente de la infección está relacionado con la aparición de la denominada necrosis caseosa, que se genera en la lesión alveolar inicial y en el tejido pulmonar circundante, resultando en la destrucción de los macrófagos que contienen los bacilos que se están multiplicando, produciéndose una lesión necrótica sólida.
El origen de esta reacción necrótica no se conoce con exactitud, pero se relaciona con la reacción de tipo DTH. Esencialmente, la respuesta inmune que permite el control de la población bacilar es de tipo celular y mayoritariamente dirigida por linfocitos CD4 de tipo Th1 , es decir, capaz de generar la respuesta de tipo DTH y también de identificar macrófagos infectados y de activarlos para destruir a los bacilos de su interior.
Aproximadamente en un 10% de los individuos infectados, dicha necrosis sólida se reblandece, siendo uno de los episodios más importantes en la infección tuberculosa, puesto que es entonces cuando la infección progresa a tuberculosis activa, o sea a enfermedad tuberculosa.
En la mayoría de los casos, el reblandecimiento se asocia con el drenaje del tejido reblandecido hacia el árbol bronquial, formándose una cavidad tuberculosa, y un crecimiento extracelular explosivo del bacilo, con la entrada de oxígeno a través del orificio bronquial. Con la tos, este caseum reblandecido y repleto de bacilos, es diseminado por otras partes de los bronquios, del pulmón y del exterior.
El tratamiento farmacológico de la tuberculosis se caracteriza por ser una terapia prolongada, cosa que dificulta su seguimiento a la vez que favorece la aparición de bacterias resistentes a los fármacos.
Se considera que la mejor estrategia para la contención de la tuberculosis se basa en un enfoque preventivo de la misma.
La vacuna actual, administrada por vía parenteral, que se emplea en el tratamiento preventivo contra la tuberculosis está basada en bacterias de la cepa denominada BCG (Bacilo de Calmette-Guerin), una variante atenuada de M. bovis. Sin embargo, se ha observado que su eficacia disminuye con el tiempo y que es ineficaz para la prevención de la enfermedad en adultos, de hecho se considera que tan solo protege a los nichos del desarrollo de una enfermedad tuberculosa mortal (miliar o meníngea).
Se han desarrollado otros tratamientos profilácticos de la tuberculosis basados principalmente en otras cepas de micobactenas vivas atenuadas, o bien en subunidades bacterianas.
Así mismo, en el estado de la técnica también se han explorado tratamientos profilácticos de la tuberculosis basados en micobactenas inactivadas, con el objeto de obtener una respuesta inmune análoga a la obtenida con las vacunas basadas en micobactenas atenuadas, es decir, del tipo Th1 , generadora de interferón-y.
Así, por ejemplo, en el artículo Opie et al., Protective inoculation against human tuberculosis with heat-killed tubercle bacilli, Am. J. Hyg., 1939, 29, 155-164, se describe un estudio clínico en el que se administraron cinco dosis por vía intracutánea de bacilos de M. tuberculosis inactivados por calentamiento, con el objetivo de generar protección frente a la enfermedad.
Así mismo, en el artículo Agger et al. Specific acquíred resistance in míce immunized with killed mycobacteria, Scand. J. Immunol., 2002, 56, 443-447, se describe un estudio experimental con ratones que fueron vacunados con tres dosis administradas por vía subcutánea de 1000 pg de bacilos M. tuberculosis inactivados por calentamiento, con un intervalo de 2 semanas entre cada dosis, observándose una inducción de inmunidad específica basada en linfocitos T.
También se han ensayado otras micobactenas inactivadas para inducir protección frente a la tuberculosis, habitualmente por vía parenteral.
Por ejemplo, en Gupta et al., Immunogenicity and protective efficacy of
"Mycobacterium w" against Mycobacterium tuberculosis in mice Immunized with Uve versus heat-killed M. w by the aerosol or parenteral route, Infecí. Immun., 2009, 77 (1 ), 223-231 , se describe que se administraron micobactenas M. w vivas o inactivadas por calentamiento. Estas últimas fueron administradas como monodosis por vía subcutánea, y se observó una respuesta inmunitaria basada en la inducción de linfocitos Th1 , que generaban interferonas.
Es particularmente deseable, disponer de un tratamiento profiláctico que sea efectivo por vía oral, ya que dicha vía facilita considerablemente la administración del fármaco y la adherencia al tratamiento.
En este sentido, existen algunos documentos en el estado de la técnica referidos a la administración por vía oral de bacterias inactivadas por el calor de otra micobacteria, Mycobacterium vacae, para conseguir un efecto terapéutico de la tuberculosis activa, según una pauta combinada con los fármacos habituales en quimioterapia.
A nivel experimental, en Hernández-Pando ef al., Orally administered Mycobacterium vaccae modulates expression of immunoregulatory molecules in BALB/c mice with pulmonary tuberculosis, Clin. Vaccine Immunol., 2008, 15(1 1 ), 1730-1736, se describe un ensayo realizado con ratones a los que se les administró por vía oral 5 dosis de 0, 1 pg de M. vaccae inactivado por calentamiento, con un intervalo de 28 días entre cada administración, y induciéndose una infección con M. tuberculosis por vía intratraqueal 23 h después de la primera dosis. En dicho estudio se confirmó que se generaba una respuesta inmune de tipo celular aumentándose la secreción de linfocitos Th1 , mientras que disminuía la inmunidad tipo humoral, como se demostraba por una disminución de los linfocitos tipo Th2, y del factor de crecimiento TGF-beta.
En general, en el estado de la técnica se sugiere que es deseable una inducción de tipo Th1 , con la consiguiente generación de interferón-γ, mientras que una respuesta Th2, con la consiguiente generación de IL-4, o la Th3, que conlleva la generación de células T reguladoras (Treg), pueden tener un efecto inductor de la tuberculosis activa.
Así se describe, por ejemplo, en Kursar et al., Cutting Edge: Regulatory T Cells Prevent Efficient Clearance of Mycobacterium tuberculosis, J. Immunol., 2007, 178, 2661 -2665, en donde la generación de células T reguladoras (Treg) se atribuye a la incapacidad de los linfocitos CD4 para esterilizar las lesiones caseosas y evitar la infección latente en el modelo de tuberculosis experimental en ratón. En dicho artículo se sugiere que una desregulación que permite el desequilibrio entre la respuesta Th1 y Treg a favor de la segunda puede ser la causa de la inducción de tuberculosis activa.
A la vista de lo descrito en el estado de la técnica, subsiste la necesidad de disponer de un tratamiento eficaz de la tuberculosis, administrable por vía oral, para prevenir el desarrollo de la tuberculosis activa, y el subsiguiente surgimiento del estado patológico de la enfermedad, tanto en individuos no infectados (efecto profiláctico) como en individuos infectados por M. tuberculosis en los que la infección se encuentra en estado latente (efecto terapéutico).
Objeto de la invención
El objeto de la presente invención es el uso de micobacterias ¡nactivadas para la preparación de un medicamento para su administración oral para la prevención de la tuberculosis. Descripción de las figuras
Figura 1
En la Figura 1 , el tiempo de supervivencia expresado en días se representa en el eje de abscisas, y el porcentaje de animales supervivientes en el eje de ordenadas. E! Grupo Control se representa con un trazo continuo, y los animales del Grupo 1 se representan en trazo discontinuo. Los animales del Grupo 1 fueron sometidos a un tratamiento con micobacterias inactivadas de Mycobacteríum tuberculosis por vía oral antes de la infección, mediante la administración de 5 dosis de dichos bacilos, una cada 48 horas empezando el día 10 antes de la infección Los gráficos 1 , 2, 3 y 4 corresponden a los animales de los grupos 1a, 1 b, 1c y 1 d, respectivamente, a los que se les administró diferente cantidad de producto, según las diluciones 1 :1 , 1 :10, 1 :100 y 1 : 1000. (Ejemplo 1 )
Figura 2
En la Figura 2, el tiempo de supervivencia expresado en días se representa en el eje de abscisas, y el porcentaje de animales supervivientes en el eje de ordenadas. En la misma se compara el Grupo Control (trazo continuo) con el Grupo 2 (trazo discontinuo). Los animales del Grupo 2 fueron sometidos a un tratamiento con micobacterias inactivadas de Mycobacteríum tuberculosis por vía oral después de la infección mediante la administración de 5 dosis de dichos bacilos, una cada 48 horas empezando el día 1 1 después de la infección Los gráficos 5, 6, 7 y 8 corresponden a los animales de los grupos 2a, 2b, 2c y 2d, respectivamente, a los que se les administró diferente cantidad de producto, según las diluciones 1 : 1 , 1 :10, 1 : 100 y 1 :1000. (Ejemplo
1 )
Figura 3
En la Figura 3, el tiempo de supervivencia expresado en días se representa en el eje de abscisas, y el porcentaje de animales supervivientes en el eje de ordenadas. En la misma se compara el Grupo Control (trazo continuo) con los animales del Grupo 1 (trazo discontinuo), que fue tratado con micobacterias inactivadas de M. bovis BCG por vía oral después de la infección. (Ejemplo 2) Figura 4 En la Figura 4, el tiempo de supervivencia expresado en días se representa en el eje de abscisas, y el porcentaje de animales supervivientes en el eje de ordenadas. En la misma se compara el Grupo Control (trazo continuo) con los animales del Grupo 1 (trazo discontinuo), que fue tratado con micobacterias inactivadas de M. bovis BCG por vía oral antes de la infección. (Ejemplo 3)
Figura 5
En la Figura 5, el tiempo de supervivencia expresado en días se representa en el eje de abscisas, y el porcentaje de animales supervivientes en el eje de ordenadas. En el gráfico 1 se compara el Grupo Control (trazo continuo) con el Grupo 1 (trazo discontinuo), que fue sometido a un tratamiento con micobacterias inactivadas de Mycobacterium tuberculosis administradas por vía oral iniciado antes de la infección. En el gráfico 2 se compara el Grupo Control (trazo continuo) con el Grupo 2 (trazo discontinuo), que fue sometido a un tratamiento con micobacterias inactivadas administradas por vía oral iniciado después de la infección. (Ejemplo 4)
Figura 6
En la Figura 6 se representan los porcentajes de células T reguladoras con el fenotipo CD4+CD25+ Foxp3+, respecto el total de células T CD4+, para cada uno de los tratamientos con micobacterias inactivadas de M. tuberculosis y el control, a la semana 3 (gráfico 1 ) y a la semana 4 (gráfico 2) después de la infección. En el eje de ordenadas se representa dicho porcentaje de células T reguladoras. En el eje de abscisas se representan los diferentes grupos de animales. Los cuadrados representan animales no tratados (Grupo Control), los triángulos representan animales del Grupo 1 , tratados previamente a la infección (efecto profiláctico), y los círculos representan los animales del Grupo 2, tratados posteriormente a la infección (efecto terapéutico). Las líneas horizontales trazadas representan la media aritmética de cada grupo. (Ejemplo 4)
Figura 7
En la Figura 7, el tiempo de supervivencia expresado en días se representa en el eje de abscisas, y el porcentaje de anímales supervivientes en el eje de ordenadas. En el gráfico 1 se compara el Grupo Control (trazo continuo) con el Grupo 1 (trazo discontinuo), que fue sometido a un tratamiento con micobacterias inactivadas de Mycobacterium kansasíi administradas por vía oral, iniciado antes de la infección (efecto profiláctico). En el gráfico 2 se compara el Grupo Control (trazo continuo) con el Grupo 2 (trazo discontinuo), que fue sometido a un tratamiento con micobacterias inactivadas de Mycobacterium kansasii administradas por vía oral, iniciado después de la infección (efecto terapéutico). (Ejemplo 5)
Figura 8
En la Figura 8, el tiempo de supervivencia expresado en días se representa en el eje de abscisas, y el porcentaje de animales supervivientes en el eje de ordenadas. En el gráfico 1 se compara el Grupo Control (trazo continuo) con el Grupo 1 (trazo discontinuo), que fue sometido a un tratamiento con micobacterias inactivadas de Mycobacterium fortuitum administradas por vía oral, iniciado antes de la infección (efecto profiláctico). En el gráfico 2 se compara el Grupo Control (trazo continuo) con el Grupo 2 (trazo discontinuo), que fue sometido a un tratamiento con micobacterias inactivadas de Mycobacterium fortuitum administradas por vía oral, iniciado después de la infección (efecto terapéutico). (Ejemplo 6) Figura 9
En la Figura 9, el tiempo de supervivencia expresado en días se representa en el eje de abscisas, y el porcentaje de animales supervivientes en el eje de ordenadas. Los animales fueron infectados y posteriormente tratados con el fármaco antituberculoso RIMSTAR. El Grupo 1 , tras el tratamiento con RIMSTAR, fue sometido a un tratamiento tolerizante posterior con micobacterias inactivadas de Mycobacterium fortuitum administradas por vía oral (efecto anti-recaída). Se compara el Grupo Control (trazo continuo, sin tratamiento tolerizante) con el Grupo 1 (trazo discontinuo, con tratamiento tolerizante). Sobre el eje de abscisas se indican los períodos del tratamiento con RIMSTAR (rectángulo negro) y del tratamiento posterior tolerizante (rectángulo blanco). (Ejemplo 7).
Descripción detallada de la invención
El objeto de la presente invención es el uso de micobacterias inactivadas para la preparación de un medicamento para la prevención de la tuberculosis, en donde:
- las micobacterias inactivadas se administran periódicamente por vía oral,
- el intervalo entre las dosis no es superior a 5 días, y
el número de dosis administradas es de al menos 5.
Alternativamente, el objeto de la presente invención se puede formular como micobacterias inactivadas para su uso para la prevención de la tuberculosis, en donde:
- las micobacterias se administran periódicamente por vía oral, - el intervalo entre las dosis no es superior a 5 días, y
- el número de dosis administradas es de al menos 5.
Los autores de la presente invención han desarrollado un nuevo tratamiento preventivo de la tuberculosis que se basa en la administración de micobacterias inactivadas, según una pauta de administración de múltiples dosis, administradas con un intervalo temporal reducido entre las administraciones.
Los autores han observado que dicho tratamiento preventivo, efectuado antes de la infección por M. tuberculosis (efecto profiláctico) o después de la infección (efecto terapéutico) es capaz de prevenir el desarrollo de la tuberculosis activa mediante el control de la progresión de la infección desde un estado latente a tuberculosis activa.
De acuerdo con dicho tratamiento, la administración periódica oral de bacilos muertos, preferentemente a dosis bajas, y con un intervalo temporal reducido entre las dosis, induce una tolerización o respuesta tolerizante que, sorprendentemente, tiene un efecto positivo en el control de la infección por M. tuberculosis, esto es, en el paso de la infección latente a la infección activa.
Efectivamente, los autores han observado que este tipo de tratamiento, tanto administrado previamente, como con posterioridad a la infección por M tuberculosis, desencadena una respuesta tolerizante, caracterizada por un incremento del porcentaje de las células T reguladoras (Treg).
El uso de la invención está dirigido a individuos no infectados y a individuos infectados por M. tuberculosis en los que la infección se encuentra en estado latente. En el primer caso el tratamiento preventivo se considera que tiene un efecto profiláctico, mientras que en el segundo caso se considera que tiene un efecto terapéutico.
Un aspecto particular de este segundo caso, es decir, del tratamiento preventivo con efecto terapéutico (referido a sujetos infectados por M. tuberculosis en los que la infección se encuentra en estado latente) lo constituyen aquellos individuos que previamente habían desarrollado la tuberculosis activa y en los que dicha enfermedad ha remitido posteriormente, por ejemplo mediante tratamiento con terapia anti-tuberculosa convencional, habiendo revertido así de nuevo la tuberculosis a un estado de infección latente. Este caso particular del tratamiento preventivo se considera que tiene un efecto terapéutico anti-recaída.
En el caso del tratamiento preventivo con efecto anti-recaída, por lo tanto, los individuos habitualmente han estado sujetos previamente a un tratamiento farmacológico con agentes anti-tuberculosos. Estos agentes anti-tuberculosos son bien conocidos por el experto en la materia, siendo los principales, por ejemplo, isoniazida, etambutol, pirazinamida, rifampicina, estreptomicina; y los de segunda línea, aplicados en caso de aparición de resistencias, por ejemplo, tioamidas (protionamida, etionamida, entre otros), aminoglicósidos (amikacina, kanamicina, entre otros), cicloserina, rifabutina, rifapentina, fluorquinolonas (moxifloxacina, levofloxacina, ofloxacina), PAS, claritromicina, clofazimida, linezolid o tioridazina entre otros, o sus mezclas.
En general, se entiende por "tratamiento preventivo" aquel que permite preservar un individuo de una enfermedad.
En este sentido, en el contexto de la invención, el tratamiento preventivo es aquel tratamiento capaz de prevenir el desarrollo de la tuberculosis activa mediante el control de del paso de la infección latente a la infección activa.
En general, se entiende por "tolerización" como la inducción intencionada de tolerancia por medio de agentes biológicos o químicos, en donde el término "tolerancia" significa un estado de hiporespuesta específica al agente biológico o químico.
Por ello, en el contexto de la invención, se entiende por la expresión "inducción de una respuesta tolerizante" como un método por medio del cual se induce un estado de falta de respuesta en el sistema inmune del huésped frente a un antígeno específico, con el resultado de una atenuación del trastorno.
En el estado de la técnica se han descrito pautas de tolerización en el contexto de otras enfermedades como, por ejemplo, la ateroesclerosis. Así, en George et al., Suppression of early atherosclerosis in LDL-receptor deficient mice by oral tolerance with h2-glycoprotein I, Cardiovasc. Res., 2004, 62, 603-609 se describe el empleo de la 2-glícoproteína I para inducir tolerancia oral y suprimir la ateroesclerosis temprana, y en Harats et al., Oral Tolerance With Heat Shock Protein 65 Attenuates Mycobacterium Tuberculosis-lnduced and High-Fat-Diet-Driven Atherosclerotic Lesions, J. Am. Coll. Cardiol., 2002, 40, 1333-1338, se describe el empleo de la proteína 65 de choque de calor para inducir tolerancia oral frente a lesiones ateroescleróticas.
Mico bacterias inactivadas
El género de las micobacterias pertenecen a la familia de las Mycobacteriaceae y está formado por bacilos aerobios.
Todos los bacilos pertenecientes al género de las micobacterias forman parte del objeto de la presente invención, por ejemplo las especies M. abscessus, M. afrícanum, M. asiaticum, M. aurum, M. avium, M. avium paratuberculosis, M. avium silvaticum y M. avium hominissuis, M. bovis, M. bovis BCG, M. chelonae, M. fortuítum, M. gastri, M. goodi, M. gordonae, M. ¡mmunogenum, M. haemophilum, M. habana, M. kansasii, M. lentiflavum, M. leprae, M. lepromatosis, M. lufu, M. mageritense, M, malmoense, M. marinum, M. massiliense, M. microti, M. monacense, M. mucogenicum, M. neoaurum, M. peregrínum, M. phlei, M. scrofulaceum, M. smegmatis, M. terrae, M. triviale, M. tuberculosis, M. microti, M. ulcera ns, M. vaccae y M. xenopi, entre otros.
Las micobacterias tienen muchos antígenos comunes con M. tuberculosis, y por ello resultan apropiadas para el uso de la presente invención. Así, en el artículo de Stanford eí al., Mycobacteria and their world, Int. J. Mycobacteriol., 2012, 3-12, se describe una clasificación de los diferentes grupos de antígenos en micobacterias y como estos se distribuyen y comparten entre diferentes especies de la familia Mycobacteria ceae.
Preferiblemente, las micobacterias inactivadas que forman parte de la presente invención son: las micobacterias del grupo denominado Mycobacterium tuberculosis complex (MTB-C), Mycobacterium fortuitum y Mycobacterium kansasii. Es decir, preferiblemente las micobacterias inactivadas se eligen de entre el grupo formado por M. tuberculosis, M. bovis, M, africanum, y M. microti, M, bovis BCG, M. fortuitum y M. kansasii. Más preferiblemente, las micobacterias inactivadas se eligen de entre el grupo formado por M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. fortuitum y M. kansasii.
Por micobacterias inactivadas, también denominadas micobacterias muertas, se entienden aquellas micobacterias que han sido sometidas a un tratamiento físico o químico que transforma la micobacteria viva en una forma incapaz de replicarse.
Algunos métodos adecuados para inactivar las micobacterias, dentro del ámbito de la presente invención son, por ejemplo, el tratamiento con formaldehído, por irradiación o por calentamiento.
Preferiblemente, las micobacterias inactivadas objeto de la presente invención se inactivan mediante un proceso de calentamiento.
Un procedimiento adecuado para inactivar las micobacterias por calentamiento comprende, por ejemplo, cultivar una cepa de la micobacteria en un medio de cultivo adecuado, según son bien conocidos por el experto en la materia, tales como, el agar Middlebrook tipo 7H10 o tipo 7H1 1 , el medio de cultivo Sauton o el medio de cultivo Proskauer-Beck, entre otros. El cultivo se mantiene preferiblemente hasta conseguir una concentración aproximadamente comprendida entre 1 x 105 y 1 x 109 unidades formadoras de colonias (UFCs) por mi.
A continuación, el cultivo se inactiva por calentamiento. Preferiblemente, el calentamiento se efectúa a una temperatura comprendida entre 70° C y 90° C. Preferiblemente, el período de calentamiento está comprendido entre 30 minutos y 3 horas. También mediante el uso del autoclavado, preferiblemente efectuándose el calentamiento a una temperatura de 121°C durante 20 minutos. Prevención de la tuberculosis
La expresión "prevención de la tuberculosis" se refiere a prevenir la manifestación de la tuberculosis activa mediante el control de la progresión de la infección desde un estado latente a tuberculosis activa.
Dicha prevención se puede efectuar en individuos no infectados y también en individuos infectados por M. tuberculosis en los que la infección está en estado latente, bien porque no se ha desarrollado aún la enfermedad, o bien porque la enfermedad activa ya se había desarrollado y había remitido posteriormente, por ejemplo por tratamiento con fármacos anti-tuberculosos.
Los autores de la presente invención han desarrollado un tratamiento preventivo de la tuberculosis que impide la progresión de la infección latente, de manera que se evita la progresión de las lesiones caseosas sólidas a lesiones licuefactadas y, por lo tanto, se evita la manifestación de la tuberculosis activa.
Los autores de la presente invención han utilizado un modelo experimental que se basa en el empleo de ratones C3HeB/FeJ, en los que se puede simular una patología del pulmón tras la infección por M. tuberculosis equivalente a la que se desarrolla en los humanos.
En dichos animales se observa la formación de necrosis caseosas que pueden licuefactar en respuesta a la infección con M. tuberculosis, a diferencia de lo que sucede en otros modelos anímales que no desarrollan dicha necrosis, tal como se describe en el artículo Harper et al., Mouse model of necrotic tuberculosis granulomas develops hypoxic lesions, J. Infect. Dis., 2012, 205, 595-601.
En caso de ser infectados con una alta dosis por vía endovenosa, el crecimiento de la necrosis y de las lesiones en dichos animales es tal que puede ocasionar un 100% de mortalidad aproximadamente a las cuatro semanas después de la infección, tal como se describe en el artículo Sissons et al., Multigenic control of tuberculosis resistance: analysis of a QTL on mouse chromosome 7 and its synergism with sst1, Genes Immun., 2009, 10, 37-46.
Sin querer estar ligados por ninguna teoría, los autores de la presente invención consideran que el efecto preventivo del tratamiento objeto de la presente invención se debe a que la administración oral de dosis periódicas frecuentes de bacilos muertos, preferiblemente a dosis bajas, constituye una pauta capaz de inducir tolerancia en los sujetos, generándose una respuesta en la que preferiblemente se inducen los linfocitos T reguladores (Tregs). Dichos linfocitos están relacionados con el factor de crecimiento transformante beta (TGF-beta, del inglés transforming growth-factor beta), es decir, se genera una respuesta inmune mayoritariamente de tipo Th3 o tolerizante, a diferencia de los sistemas de vacunación tradicionales, donde básicamente se desencadena una respuesta inmune del tipo Th1.
Sorprendentemente, los autores de esta invención han constatado que la inducción de tolerancia es eficaz para detener la progresión de la infección por M. tuberculosis, esto es, el paso de la infección latente a la infección activa.
Para desencadenar esta respuesta tolerizante es imprescindible que las micobacterias inactivadas se administren de forma repetida y con intervalos temporales reducidos entre cada administración, no superiores a 5 días; preferiblemente, el intervalo entre las dosis no es superior a 3 días; y más preferiblemente, el intervalo entre las dosis no es superior a 2 días.
Así mismo, el tratamiento tolerizante requiere de una administración repetida de las micobacterias inactivadas, siendo el número de dosis administradas de al menos 5; preferiblemente, el número de dosis administradas es de al menos 7; más preferiblemente el número de dosis administradas es de al menos 9, y aún más preferiblemente el número de dosis administradas es de al menos 14.
En el uso de la invención, se administra una cantidad inmunológicamente efectiva de micobacterias inactivadas.
Es conocido que la dosis a emplear depende de la edad y del peso del individuo a administrar las micobacterias.
Generalmente las dosis adecuadas se encuentran comprendidas en el rango entre 103 y 1010 micobacterias inactivadas; preferiblemente entre 103 y 108, y más preferiblemente entre 104 y 108.
Para demostrar el efecto terapéutico preventivo sobre la licuefacción de las lesiones caseosas de la pauta de administración tolerizante que forma parte de la presente de invención, los ratones C3HeB/FeJ empleados en el modelo descrito anteriormente, se sometieron a un protocolo en el que se administraron por vía oral entre 5 y 14 dosis de micobacterias inactivadas, con un intervalo entre las dosis comprendido entre 1 y 3 días.
El modelo murino utilizado simula una terapia preventiva de la tuberculosis, bien al administrarse el tratamiento antes de la infección, tal como se describe en los Ejemplos 1 y 3-6, o bien cuando el tratamiento se inicia después de la infección por M. tuberculosis, tal como se describe en los Ejemplos 1 ,2, y 4-6, pero administrado en una fase temprana (hasta 15 días después de la infección cuando los animales ya han desarrollado lesiones, pero éstas todavía no han evolucionado hacia la su licuefacción y consiguiente manifestación de la enfermedad); o alternativamente, según se describe en el Ejemplo 7, e! tratamiento se administra después de la infección cuando los animales han desarrollado lesiones y han licuefactado, pero éstas han regresado a la forma de las pequeñas lesiones características de la infección latente.
A partir de los resultados obtenidos en los ejemplos, se concluye que la administración por vía oral de pautas tolerizantes de micobacterias inactivadas, tanto antes como después de la infección por M. tuberculosis, aumenta la supervivencia de los animales, al retardarse la inducción de la enfermedad, esto es, el paso de la infección latente a la infección activa.
Por ello, se considera que el uso de micobacterias inactivadas según la presente invención es apropiado para la prevención de la tuberculosis.
Composiciones
Según el objeto de !a presente invención, las micobacterias inactivadas se administran por vía oral.
Dichas micobacterias pueden administrarse en forma de cualquier composición farmacéutica adecuada para la administración oral, como son bien conocidas por el experto en la materia. Por ejemplo, son adecuados para !a administración por vía oral: comprimidos, cápsulas, soluciones, suspensiones, dispersiones, polvos, granulados, o aerosoles.
Preferiblemente, las micobacterias se administran en forma de cápsulas o comprimidos.
En general, las composiciones farmacéuticas comprenden las micobacterias inactivadas y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Las composiciones se preparan de acuerdo con los métodos habituales que son bien conocidos por el experto en la materia, como los que figuran en manuales de tecnología farmacéutica, como el libro Remington The Science and Practice of Pharmacy, 20a edición, Lippincott, Williams & Wilkins, Filadelfia, 2000 [ISBN: 0-683- 306472].
Entre los excipientes farmacéuticamente aceptables que se pueden incluir en la composición farmacéutica se encuentran, por ejemplo, agentes antiapelmazantes como sílice coloidal, fosfato calcico tribásico, silicato cálcico, silicato de magnesio, trisilicato de magnesio o talco; agentes diluyentes como lactosa anhidra, latosa monohidrato, fosfato cálcico, hidrógeno fosfato de calcio anhidro, hidrógeno fosfato de calcio dihidrato, sulfato cálcico, carbonato cálcico, carboximetilcelulosa cálcica, celulosa microcristalina o en polvo, acetato de celulosa, dextratos, dextrinas, dextrosa, fructosa, gliceril palmitoestearato, caolín, lactitol, carbonato magnésico, óxido de magnesio, maltitol, maltodextrinas, maltosa, polimetacrilatos, almidón pregelatinizado, cloruro de sodio, almidón, sucrosa o sacarosa; agentes lubrificantes como estearato de magnesio, estearato de calcio, palmitoestearato de glicerina, poloxámeros, óxido de magnesio, benzoato de sodio, sílice coloidal, lauril sulfato de sodio, estearil fumarato de sodio, ácido esteárico, talco o behenato de glicerina; agentes suspensores como goma xantana, goma guar, ácido algínico, bentonita, carbómeros, carboximetilcelulosa sódica o calcica, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxipropil alginato, celulosa microcristalina o en polvo, sílice coloidal anhidra, dextrinas, gelatinas, caolín, silicato alumínico magnésico, maltitol, povidona, esteres de sorbitán o tragacanto; agentes aglutinantes como trisilicato de magnesio, celulosa, almidón, dextrina, dextrosa, polidextrosa, maltosa, maltodextrina, etilcelulosa, metilcelulosa, polimetacrilatos, talco, povidona, ácido esteárico o sacarosa; agentes disgregantes como hidroxipropilcelulosa de bajo grado de sustitución, fosfato de calcio tribásico, carboximetilcelulosa sódica o cálcica, croscarmelosa sódica, crospovidona o metilcelulosa; agentes de recubrimiento como chitosano, ftalato de dibutilo, sebacato de dibutilo, ftalato de dietilo, ftalato de dimetilo, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hipromelosa, maltodextrina polimetacrilatos, acetato ftalato de polivini!o, o citrato de trietilo; agentes dispersantes como poloxámeros o esteres de sorbitán; agentes edulcorantes como aspartamo, manitol, sorbitol, sacarina de sodio, ciclamato de sodio, sacarosa, dextrosa, fructosa, glucosa, inulina, isomaltosa, lactitol, maltosa, maltol, manitol, sucralosa, trehalosa, xilitol o taumatina; agentes aromatizantes y saborizantes, y/o mezclas de los mismos.
Una lista más exhaustiva de los excipientes, así como sus características físico-químicas, así como los nombres de los productos comerciales bajo los que se comercializan se pueden encontrar en el libro R.C. Rowe et al., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 4a edición, Pharmaceutical Press, Londres, 2003 [ISBN: 0- 85369-472-9].
Los ejemplos que siguen a continuación tienen como objeto ilustrar la invención, si bien no deben ser entendidos como limitantes de la misma. Ejemplo 1.- Tratamiento oral tolerizante con bacilos de M. tuberculosis inactivados, administrados antes o después de la infección (efecto profiláctico o terapéutico)
Para preparar las micobacterias inactivadas se partió de una cepa clínica de M. tuberculosis (TOL-3), proveniente de la colección de cepas de la Unitat de Tuberculosi Experimental del Institut Germans Trias i Pujol, cultivada en medio líquido Proskauer Beck hasta conseguir un crecimiento exponencial y una concentración de 1 ,7 x 107 unidades formadoras de colonias (UFCs) por mi.
Se procedió a su inactivación tras calentar el cultivo a 75° C durante 2 horas y a su congelación posterior a -80° C. Posteriormente se diluyó 50:50 en una solución de sacarosa al 10%, se embotelló y liofilizó en viales en volúmenes de 0,5 mi. Posteriormente estos viales se reconstituyeron con 3 mi de agua bidestilada, constituyendo la dilución 1 : 1 , equivalente a 4,25 x 106 UCFs.
En los ensayos se administraron 0,3 mi de producto, tanto a esta dilución 1 : 1 , como a diluciones 1 :10, 1 : 100, y 1 : 1000. Estas administraciones corresponden a unas dosis de, respectivamente, a 4,25 x 105, 4,25 x 104, 4,25 x 103 y 4,25 x 102 UCFs.
La efectividad de las micobacterias inactivadas se ensayó en ratones hembra de 6 a 8 semanas de edad del tipo C3HeB/FeJ, libres de patógenos específicos.
Los ratones se dividieron en tres grupos de 6 animales cada uno, y cada uno de los grupos se sometió al siguiente protocolo de tolerización.
1 ) Grupo Control: Sin tratamiento.
2) Grupo 1 (tratamiento pre-infección): Tratados por vía oral, mediante una sonda gástrica, con 5 dosis de producto conteniendo las micobacterias inactivadas, administradas cada 48 horas empezando por el día 10 antes de la infección. Se administró un volumen de 0,3 mi en cada dosis, y se probaron un total de 4 diluciones: 1 :1 , 1 :10, 1 :100 y 1 :1000 (grupos 1a, 1 b, 1 c y 1 d, respectivamente)
3) Grupo 2 (tratamiento post-infección): Tratados por vía oral, mediante una sonda gástrica, con 5 dosis de producto conteniendo las micobacterias inactivadas, administradas cada 48 horas empezando por el día 1 1 después de la infección. Se administró un volumen de 0,3 mi en cada dosis, y se probaron un total de 4 diluciones: 1 : 1 , 1 : 10, 1 :100 y 1 : 1000 (grupos 2a, 2b, 2c y 2d, respectivamente)
Para la infección se empleó la cepa virulenta de Mycobacterium tuberculosis (H37Rv Pasteur), que se cultivó en medio Proskauer-Beck hasta una fase media logarítmica, y se conservó en alícuotas de 1 mi a una temperatura de -70° C hasta su utilización.
Los ratones se infectaron por vía endovenosa introduciendo un inoculo aproximado de 2 x 104 bacilos viables.
Los animales eran observados y pesados diariamente hasta que ias condiciones del animal requerían su sacrificio, según el procedimiento detallado en la Tabla 1. TABLA 1
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Los resultados obtenidos se han representado en forma gráfica en las Figuras 1 y 2, en donde se muestra la evolución de la supervivencia de los animales tras la infección, para los diferentes grupos experimentales. En el eje de abscisas se representa el tiempo de supervivencia, expresado en días, mientras que en el eje de ordenadas se representa el porcentaje de supervivientes. En la Figura 1 se compara el Grupo Control (trazo continuo) con los animales del Grupo 1 (trazo discontinuo), que fueron tratados antes de la infección. Los gráficos 1 , 2, 3 y 4 corresponden a los animales de los grupos 1 a, 1 b, 1 c y 1d, respectivamente, a los que se les administró diferente cantidad de producto, según las diluciones 1 : 1 , 1 :10, 1 :100 y 1 : 1000.
En la Figura 2 se compara el grupo control (trazo continuo) con los animales del Grupo 2 (trazo discontinuo), que fueron tratados después de la infección. Los gráficos 5, 6, 7 y 8 corresponden a los animales de los grupos 2a, 2b, 2c y 2d, respectivamente, a los que se les administró diferente cantidad de producto, según las diluciones 1 :1 , 1 : 10, 1 :100 y 1 :1000.
Para valorar el efecto del tratamiento sobre la supervivencia de los animales, se compararon las curvas de supervivencia mediante dos métodos: test de Mantel-Cox (o test Log Rank, LR t) y test de Gehan-Breslow-Wilcoxon (GBW t). En el primer método se asume que el riesgo (muertes/unidad de tiempo) es constante durante todo el experimento, mientras que el segundo tiene más en cuenta las muertes en los primeros días (muertes más tempranas). Si el riesgo es constante, el test de Mantel-Cox tiene más poder estadístico, pero si no es así, y hay un grupo que está en mayor riesgo que el otro, el Gehan-Breslow-Wilcoxon resulta más adecuado.
Se observan diferencias estadísticamente significativas en todos los casos (p<0,05, GBW t), respecto a los grupos control. En los tratamientos correspondientes a gráficos 4, 5, 6 y 7, hay también significación estadística para LR t (p<0,05).
Los resultados reflejan una respuesta protectora cuando se utilizó la pauta pre-infección con la dilución más baja (1 :1000, Figura 1 , gráfico 4), mientras que con la pauta post-infección, se observó protección con las diluciones 1 : 1 , 1 :10 y 1 :100 (Figura 2, gráficos 5, 6 y 7, respectivamente), siendo especialmente importante en la pauta de dilución 1 : 10.
Las autopsias en e! grupo control reflejaron una evolución muy rápida entre los días 26 y 30, período en el que las lesiones aumentaron mucho de tamaño y acabaron confluyendo generando grandes lesiones con necrosis con consistencia cremosa en su interior.
Por tanto, se puede concluir que la administración de pautas tolerizantes por vía oral, tanto antes (efecto profiláctico) como después de la infección (efecto terapéutico) por M. tuberculosis, aumenta la supervivencia de los animales al retrasar el paso de la infección latente a la infección activa. Por ello, se considera que el uso de micobacterias ¡nactivadas según la invención es apropiado como tratamiento preventivo de la tuberculosis. Ejemplo 2.- Tratamiento oral tolerizante con bacilos de M. bovis BCG inactivados, administrados después de la infección (efecto terapéutico)
El agente terapéutico empleado en este ejemplo fue preparado a partir de una cepa comercial de M. bovis BCG (SSI) cultivada en medio líquido Proskauer Beck hasta conseguir un crecimiento exponencial y una concentración de 1 ,03 x 108 unidades formadoras de colonias (UFCs) por mi. Se procedió a su inactivación siguiendo el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 1.
La efectividad de las micobacterias inactivadas se ensayó en ratones hembra de 6 a 8 semanas de edad del tipo C3HeB/FeJ, libres de patógenos específicos. En cada dosis, se les administró un volumen de 0,3 mi. correspondiente a una dilución 1 :10, lo que corresponde a 2,575 x 105 UFCs.
Los ratones se dividieron en dos grupos de 12 animales cada uno de ellos, y cada uno de los grupos se sometió al siguiente protocolo de tolerización:
1 ) Grupo Control: Sin tratamiento.
2) Grupo 1 (tratamiento post-infección): Tratados por vía oral, mediante una sonda gástrica, con 5 dosis de producto conteniendo las micobacterias inactivadas, administradas cada 48 horas empezando por el día 12 después de la infección, y posteriormente 3 veces por semana (lunes, miércoles y viernes) hasta el final del experimento, en virtud del tiempo de supervivencia de cada ratón
Para la infección se empleó la cepa virulenta de Mycobacterium tuberculosis (H37Rv Pasteur), que se cultivó en medio Proskauer-Beck hasta una fase media logarítmica, y se conservó en alícuotas de 1 mi a una temperatura de -70° C hasta su utilización.
Los ratones se infectaron por vía endovenosa introduciendo un inoculo aproximado de 2 x 104 bacilos viables.
Los animales se observaron y pesaron diariamente hasta que las condiciones del animal requerían su sacrificio, según el mismo procedimiento que se describe en la Tabla 1 del Ejemplo 1.
Los resultados obtenidos se representan de forma gráfica en la Figura 3.
En el eje de abscisas se representa el tiempo de supervivencia (en días), mientras que en el eje de ordenadas se representa el porcentaje de supervivientes.
Se observa que el Grupo Control (trazo continuo) presenta una supervivencia menor que el Grupo 1 tratado (trazo discontinuo), observándose diferencias significativas (test Log Rank, p=0,0147; test Gehan-Breslow-Wilcoxon, p=0,0052). Los resultados reflejan una respuesta protectora después del tratamiento continuo de los animales infectados. Por lo tanto, se puede concluir que la administración de pautas tolerizantes por vía oral de M. bovis BCG inactivados, después de la infección por M. tuberculosis, aumenta la supervivencia de los animales al retrasarse la inducción de la enfermedad. Por ello, se considera que el uso de micobacterias inactivadas según la invención es apropiado como tratamiento preventivo de la tuberculosis al retrasar el paso de la infección latente a la infección activa.
Ejemplo 3.- Tratamiento oral tolerizante con bacilos de M. bovis BCG inactivados, administrados pre-infección (efecto profiláctico)
Los bacilos inactivados de M. bovis BCG se prepararon siguiendo el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 2.
La efectividad de las micobacterias inactivadas se ensayó en ratones hembra de 6 a 8 semanas de edad del tipo C3HeB/FeJ, libres de patógenos específicos.
Los ratones se dividieron en dos grupos de 12 animales cada uno, y se sometieron al siguiente tratamiento:
1 ) Grupo Control: Sin tratamiento.
2) Grupo 1 (tratamiento pre-infección): Tratados por vía oral, mediante una sonda gástrica, con 13 dosis de producto conteniendo las micobacterias inactivadas, administradas 3 veces por semana (lunes, miércoles y viernes) empezando 29 días antes de la infección. En cada dosis, se les administró un volumen de 0,3 mi. correspondiente a una dilución 1 :1000, lo que corresponde a 2,575 x 103 UFCs.
Al igual que en los ejemplos anteriores, para la infección se empleó la cepa virulenta de M. tuberculosis (H37Rv Pasteur), que se cultivó en medio Proskauer-Beck hasta una fase media logarítmica, y se conservó en alícuotas de 1 mi a una temperatura de -70° C hasta su utilización.
Los ratones se infectaron por vía endovenosa introduciendo un inoculo aproximado de 2 x 104 bacilos viables.
Los animales se observaron y pesaron diariamente hasta que las condiciones del animal requerían su sacrificio, según el mismo procedimiento que se describe en la Tabla 1 del Ejemplo 1.
Los resultados obtenidos se representan de forma gráfica en la Figura 4. En el eje de abscisas se representa el tiempo de supervivencia (en días), mientras que en el eje de ordenadas se representa el porcentaje de supervivientes.
Se observa que el Grupo Control (trazo continuo) presenta una supervivencia menor que el Grupo 1 tratado (trazo discontinuo), observándose diferencias significativas, según el test Log Rank (p=0,0020) y el test Gehan-Breslow- Wilcoxon (p=0,0019).
Los resultados reflejan una respuesta protectora después de la inducción de tolerancia por administración oral de la micobacteria M. bovis BCG inactivada, previamente a la infección por M. tuberculosis, observándose que dicho tratamiento evita la inducción de la enfermedad en un alto porcentaje.
Ejemplo 4.- Efectividad de un tratamiento oral tolerizante con bacilos de M. tuberculosis inactivados, administrados pre-infección o post-infección (efecto profiláctico o terapéutico) y monitorización de la tolerancia inducida mediante análisis de las células T reguladoras en el bazo.
Los bacilos inactivados de M. tuberculosis (TOL-3) se prepararon siguiendo el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 1.
La efectividad de las micobacterias inactivadas se ensayó en ratones hembra de 6 a 8 semanas de edad del tipo C3HeB/FeJ, libres de patógenos específicos.
Los ratones se dividieron en tres grupos de 24 animales cada uno, y se sometieron al siguiente tratamiento:
1 ) Grupo Control: Sin tratamiento.
2) Grupo 1 (tratamiento pre-infección): Tratados por vía oral, mediante una sonda gástrica, con 5 dosis de producto conteniendo las micobacterias inactivadas, administradas cada 48 horas, empezando el día 10 antes de la infección, y posteriormente 3 veces por semana (lunes, miércoles y viernes) hasta el final del experimento. Se administró cada vez un volumen de 0,3 mi con una dilución 1 :1000.
3) Grupo 2 (tratamiento post-infección): Tratados por vía oral, mediante una sonda gástrica, con 5 dosis de producto conteniendo las micobacterias inactivadas, administradas cada 48 horas, empezando el día 1 1 después de la infección, y posteriormente 3 veces por semana (lunes, miércoles y viernes) hasta el final del experimento. Se administró un volumen de 0,3 mi en cada dosis, con una dilución 1 :10.
Al igual que en los ejemplos anteriores, para la infección se empleó la cepa virulenta de M. tuberculosis (H37Rv Pasteur), que se cultivó en medio Proskauer-Beck hasta una fase media logarítmica, y se conservó en alícuotas de 1 mi a una temperatura de -70° C hasta su utilización.
Los ratones se infectaron por vía endovenosa introduciendo un inoculo aproximado de 1 x 105 bacilos viables. La mitad de los animales de cada grupo (12) se preservaron para el estudio de la supervivencia. Los animales se observaron y pesaron diariamente hasta que las condiciones del animal requerían su sacrificio, según el mismo procedimiento que se describe en la Tabla 1 del Ejemplo 1.
En la Figura 5, en los gráficos 1 y 2, se muestran los resultados de supervivencia de los diferentes grupos experimentales. En el eje de abscisas se representa el tiempo de supervivencia (en días), mientras que en el eje de ordenadas se representa el porcentaje de animales supervivientes.
En el gráfico 1 se compara el Grupo Control (trazo continuo) con el Grupo 1 (trazo discontinuo), que fue sometido a un tratamiento iniciado previamente a la infección. Se observa que el grupo control presenta una supervivencia menor que el grupo tratado, con unos resultados estadísticamente significativos según el test Log Rank (p= 0,001 1 ) y Gehan-Breslow-Wilcoxon (p=0,0014).
En el gráfico 2 se compara el Grupo Control (trazo continuo) con el Grupo 2 (trazo discontinuo), que fue sometido a un tratamiento iniciado después de la infección. Se observa que el grupo control presenta una supervivencia menor que el grupo tratado, con unos resultados estadísticamente significativos según el test Log Rank (p=0, 04541 ), mientras que según el test Gehan-Breslow-Wilcoxon las diferencias no son estadísticamente significativas.
En ambos casos se concluye que los animales tratados con una pauta tolerizante con micobacterias inactivadas sobreviven más tiempo tras la infección con M. tuberculosis que los animales no tratados.
Del resto de animales de cada grupo (12), la mitad se sacrificó a la semana 3 (6 animales por grupo) y la otra mitad a la semana 4 (6 animales por grupo) para el estudio de las células T reguladoras presentes entre los esplenocitos.
Según se describe en el artículo Faria et ai, Oral tolerance, Immunol. Rev., 2005, 206(1 ), 232-259, las células T reguladoras son un grupo de células claves en la inducción de tolerancia oral, que se definen como una población implicada en la regulación de la respuesta inmunológica, y que expresan los marcadores de membrana CD4 y CD25.
En el artículo 2003 Hori et al.. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3, Science, 2003, 299(5609), 1057-61 , se describe que el factor de transcripción Foxp3 resulta clave para el desarrollo de las células T reguladoras. Por eso se considera que las células T con el fenotipo CD4+CD25+Foxp3+ tienen función reguladora. Los animales se sacrificaron mediante dislocación cervical, previa anestesia ¡nhalatoria con isofluorano. Se extrajeron los bazos y se obtuvieron los esplenocitos mediante disgregación mecánica, filtración con separadores celulares (BD Falcon Cell Strainer, Nylon, 40 μηη), y lisis de los eritrocitos. Se realizó el mareaje de los esplenocitos CD4 y CD25 de membrana, y Foxp3 intracelular mediante un Kit de mareaje de células T reguladoras (eBioscience), y se analizaron mediante citometría de flujo (BD LSR-Fortessa cell analyzer). Los resultados se procesaron mediante el software de análisis BD FACSdiva.
En la figura 6 se han representado los porcentajes de células T reguladoras, aquéllas que tienen el fenotipo CD4+CD25+Foxp3+ respecto el total de células T CD4+, de los distintos tratamientos y el control, a semana 3 (gráfico 1 ) y semana 4 (gráfico 2) post-infección. En el eje de ordenadas se representa el porcentaje de células T reguladoras. En el eje de abscisas se representan los distintos tipos de tratamiento y el control.
Los cuadrados representan animales no tratados (Grupo Control), los triángulos representan animales del grupo 1 , tratados previamente a la infección, y los círculos representan los animales del grupo 2, tratados posteriormente a la infección. Las lineas horizontales trazadas representan la media aritmética de cada grupo.
Se observa que, efectivamente, hay un aumento del porcentaje de células T reguladoras entre la semana 3 y la semana 4, sólo en los grupos tratados de acuerdo con la pauta tolerizante, ya sea iniciada antes de la infección con M. tuberculosis, o posteriormente a !a misma.
Ejemplo 5.- Tratamiento oral tolerizante con bacilos de M. kansasii inactivados, administrados antes o después de la infección (efecto profiláctico o terapéutico)
El Mycobacterium kansasii es una micobacteria no tuberculosa de crecimiento lento. Para preparar las micobacterias inactivadas se partió de una cepa clínica de M. kansasii (TOL), proveniente de la colección de cepas de la Unitat de Tuberculosi Experimental del Institut Germans Trias i Pujol, cultivada en medio líquido Proskauer Beck hasta conseguir un crecimiento exponencial y una concentración de 8,07 x 104 unidades formadoras de colonias (UFCs) por mi.
Se procedió a su inactivación tras autoclavar el cultivo a 121° C durante 20 minutos y a su congelación posterior a -80° C. Posteriormente se diluyó 50:50 en una solución de sacarosa al 10%, se embotelló en viales en volúmenes de 2 mi y se conservaron a -80°C. La efectividad de tas micobacterias inactivadas se ensayó en ratones hembra de 6 a 8 semanas de edad del tipo C3HeB/FeJ, libres de patógenos específicos.
En cada dosis, se les administró un volumen de 0,3 mi. correspondiente a una dilución 1 : 10, lo que corresponde a 2,42 x 104 UFCs.
Los ratones se dividieron en tres grupos de 12 animales cada uno de ellos, y cada uno de los grupos se sometió a al siguiente protocolo de tolerización:
1 ) Grupo Control: Sin tratamiento.
2) Grupo 1 (tratamiento pre-infección): Tratados por vía oral, mediante una sonda gástrica, con 13 dosis de producto conteniendo las micobacterias inactivadas, administradas 3 veces por semana (lunes, miércoles y viernes). La infección se llevó a cabo 24 horas después de administrar la última dosis.
3) Grupo 2 (tratamiento post-infección): 15 días después de la infección, se procedió al tratamiento por vía oral, mediante una sonda gástrica, con 13 dosis de producto conteniendo las micobacterias inactivadas, administradas 3 veces por semana (lunes, miércoles y viernes).
Para la infección se empleó la cepa virulenta de Mycobacterium tuberculosis (H37Rv Pasteur), que se cultivó en medio Proskauer-Beck hasta una fase media logarítmica, y se conservó en alícuotas de 1 mi a una temperatura de -70° C hasta su utilización.
Los ratones se infectaron por vía endovenosa introduciendo un inoculo aproximado de 2 x 104 bacilos viables.
Los animales se observaron y pesaron diariamente hasta que las condiciones del animal requerían su sacrificio, según el mismo procedimiento que se describe en la Tabla 1 del Ejemplo 1.
En la Figura 7, en los gráficos 1 y 2, se muestran los resultados de supervivencia de los diferentes grupos. En el eje de abscisas se representa el tiempo de supervivencia (en días), mientras que en el eje de ordenadas se representa el porcentaje de supervivientes.
El gráfico 1 se refiere al tratamiento profiláctico, comparándose el Grupo Control con el Grupo 1 que fue sometido a un tratamiento iniciado previamente a la infección. Se observa que el Grupo Control (trazo continuo) presenta una supervivencia menor que el Grupo 1 (trazo discontinuo), observándose diferencias significativas (test Log Rank, p<0,0001 ; test Gehan-Breslow-Wilcoxon, p<0,0001 ).
El gráfico 2 se refiere al tratamiento terapéutico, comparándose el Grupo Control con el Grupo 2, que fue sometido a un tratamiento iniciado después de la infección. Se observa que el Grupo Control (trazo continuo) presenta una supervivencia menor que el Grupo 2 tratado (trazo discontinuo), observándose diferencias significativas (test Log Rank, p<0,0001 ; test Gehan-Breslow-Wilcoxon, p<0,0001 ).
En ambos casos, los resultados reflejan una respuesta protectora. Por lo tanto, se puede concluir que el tratamiento con pautas tolerizantes por vía oral de micobacterias no tuberculosas de crecimiento lento {M. kansasii) inactivadas, administradas antes o después de la infección por M. tuberculosis, aumenta la supervivencia de los animales al retrasarse la inducción de la enfermedad. Por ello, se considera que el uso de micobacterias inactivadas según la invención es apropiado como tratamiento preventivo de la tuberculosis al retrasar el paso de la infección latente a la infección activa.
Ejemplo 6.- Tratamiento oral tolerizante con bacilos de M. fortuitum inactívados, administrados antes o después de la infección (efecto profiláctico o terapéutico)
El Mycobacterium fortuitum es una micobacteria no tuberculosa de crecimiento rápido. Para preparar las micobacterias inactivadas se partió de una cepa ambiental de M. fortuitum (cepa Manresa), proveniente de la colección de cepas de la Unitat de Tuberculosi Experimental del Instituí Germans Trias i Pujol, cultivada en medio sólido Middlebrook 7H9 hasta conseguir una concentración de 2 x 109 unidades formadoras de colonias (UFCs) por mi.
Se procedió a su inactivación tras autoclavar el cultivo a 121° C durante 20 minutos y a su congelación posterior a -80° C. Posteriormente se diluyó 50:50 en una solución estéril de sacarosa al 10%, se embotelló en viales en volúmenes de 2 mi y se conservaron a -80°C.
La efectividad de las micobacterias inactivadas se ensayó en ratones hembra de 6 a 8 semanas de edad del tipo C3HeB/FeJ, libres de patógenos específicos.
En cada dosis, se les administró un volumen de 0,3 mi, correspondiente a una dilución 1 : 1000, lo que corresponde a 6 x 105 UFCs.
Los ratones se dividieron en tres grupos de 12 animales cada uno de ellos, y cada uno de los grupos se sometió al siguiente protocolo de tolerización:
1 ) Grupo Control: Sin tratamiento.
2) Grupo 1 (tratamiento pre-infección): Tratados por vía oral, mediante una sonda gástrica, con 10 dosis de producto conteniendo las micobacterias inactivadas, administradas 5 veces por semana (de lunes a viernes). La infección se llevó a cabo 24 horas después de administrar la última dosis. 3) Grupo 2 (tratamiento post-infeccíón): Tratados por vía oral, mediante una sonda gástrica, con 10 dosis de producto conteniendo las micobacterias inactivadas, administradas 5 veces por semana (de lunes a viernes), empezando el tratamiento 5 días después de la infección.
Para la infección se empleó la cepa virulenta de Mycobacterium tuberculosis (H37Rv Pasteur), que se cultivó en medio Proskauer-Beck hasta una fase media logarítmica, y se conservó en alícuotas de 1 mi a una temperatura de -70° C hasta su utilización.
Los ratones se infectaron por vía endovenosa introduciendo un inoculo aproximado de 2 x 105 bacilos viables.
Los animales se observaron y pesaron diariamente hasta que las condiciones del animal requerían su sacrificio, según el mismo procedimiento que se describe en la Tabla 1 del Ejemplo 1.
En la Figura 8, en los gráficos 1 y 2, se muestran los resultados de supervivencia de los diferentes grupos. En el eje de abscisas se representa el tiempo de supervivencia (en días), mientras que en el eje de ordenadas se representa el porcentaje de supervivientes.
Los resultados obtenidos en cuanto al tratamiento profiláctico se muestran en el gráfico 1. Se observa que el Grupo Control (trazo continuo) presenta una supervivencia menor que el Grupo 1 tratado (trazo discontinuo), observándose diferencias significativas (test Log Rank, p<0,0001 ; test Gehan-Breslow-Wilcoxon, p<0,0001 ).
Los resultados obtenidos en cuanto al tratamiento terapéutico se muestran en el gráfico 2. Se observa que el Grupo Control (trazo continuo) presenta una supervivencia menor que el Grupo 2 tratado (trazo discontinuo), observándose diferencias significativas (test Log Rank, p<0,0001 ; test Gehan-Breslow-Wilcoxon, p<0,0001 ).
En ambos casos, pues, los resultados reflejan una respuesta protectora. Por lo tanto, se puede concluir que la administración de pautas tolerizantes por vía oral de micobacterias no tuberculosas de crecimiento rápido (M. fortuitum), antes o después de la infección por M. tuberculosis, aumenta la supervivencia de los animales al retrasarse la inducción de la enfermedad. Por ello, se considera que el uso de micobacterias Inactivadas según la invención es apropiado como tratamiento preventivo de la tuberculosis al retrasar el paso de la infección latente a la infección activa. Ejemplo 7.- Tratamiento oral tolerízante con bacilos de M. fortuitum inactivados, administrados después del tratamiento de la tuberculosis activa experimental (efecto contra la recaída)
Se prepararon bacilos inactivados de M. fortuitum (cepa Manresa) siguiendo el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 6.
La efectividad las micobacterias inactivadas se ensayó en ratones hembra de 6 a 8 semanas de edad del tipo C3HeB/FeJ, libres de patógenos específicos.
En cada dosis, se les administró un volumen de 0,3 mi correspondiente a una dilución 1 : 100, lo que corresponde a 6 x 106 UFCs.
En este caso se estudió la efectividad del tratamiento preventivo tolerízante según la invención en cuanto a su efecto anti-recaída, es decir, tras haber desarrollado los animales la tuberculosis activa y haberlos tratado con fármacos anti-tuberculosos.
Así, al inicio del experimento, los ratones se infectaron por vía endovenosa introduciendo un inoculo aproximado de 2 x 105 bacilos viables.
Al igual que en los ejemplos anteriores, para la infección se empleó la cepa virulenta de Mycobacterium tuberculosis (H37Rv Pasteur), que se cultivó en medio Proskauer-Beck hasta una fase medía logarítmica, y se conservó en alícuotas de 1 mi a una temperatura de -70° C hasta su utilización.
Los animales se observaron y pesaron diariamente hasta que las condiciones del animal indicaban que se tendría que proceder a su sacrificio, según el mismo procedimiento que se describe en la Tabla 1 del Ejemplo 1.
En este momento (día 21 ) se empezó a hacer un tratamiento utilizando la combinación antibiótica contenida en el preparado comercial RIMSTAR (isoniazida, etambutol, pirazinamida y rifampicina), ajustada al peso del animal, 5 días a la semana. La última dosis se administró el día 60.
A continuación, los ratones se dividieron en dos grupos de 12 animales cada uno, y cada uno de los grupos se sometió al siguiente protocolo de tolerización:
1 ) Grupo Control: Sin tratamiento tolerízante.
2) Grupo 1 : Tratados por vía oral, mediante una sonda gástrica, con 14 dosis de producto conteniendo las micobacterias inactivadas, administradas 7 veces por semana (de lunes a domingo), iniciándose dicho tratamiento tolerízante 72 horas después de finalizar el tratamiento de la tuberculosis activa con RIMSTAR (día 63), y administrándose la última dosis el día 76.
Los resultados obtenidos en cuanto al tratamiento contra la recaída se representan de forma gráfica en la Figura 9. En el eje de abscisas se representa el tiempo de supervivencia (en días), mientras que en el eje de ordenadas se representa el porcentaje de supervivientes. Así mismo, sobre el eje de temporal de abscisas se ha indicado con un rectángulo negro el período de tratamiento con RIMSTAR y con un rectángulo blanco el período con el tratamiento tolerizante del Grupo 1.
Se observa que el Grupo Control (trazo continuo) presenta una supervivencia menor que el Grupo 1 tratado (trazo discontinuo).
Los resultados reflejan una respuesta protectora y, por lo tanto, se puede concluir que la administración de pautas tolerizantes por vía oral de micobactena, previene contra la recaída posterior al tratamiento de la tuberculosis activa.

Claims

REIVINDICACIONES
1. - Uso de micobacterias inactivadas para la preparación de un medicamento para la prevención de la tuberculosis, en donde:
- las micobacterias se administran periódicamente por vía oral,
el intervalo entre las dosis no es superior a 5 días, y
el número de dosis administradas es de al menos 5.
2. - Uso según la reivindicación 1 , caracterizado porque las micobacterias inactivadas se eligen de entre el grupo formado por M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, y M. microti,
M. bovis BCG, M. fortuitum y M. kansasii.
3. - Uso según la reivindicación 2, caracterizado porque las micobacterias inactivadas se eligen entre M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. fortuitum y M. kansasii.
4. - Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque las micobacterias se ¡nactivan mediante un proceso de calentamiento.
5. - Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el intervalo entre las dosis no es superior a 3 días.
6. - Uso según la reivindicación 5, caracterizado porque el intervalo entre las dosis no es superior a 2 días.
7.- Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el número de dosis administradas es de al menos 7.
8. - Uso según la reivindicación 7, caracterizado porque el número de dosis administradas es de al menos 9.
9. - Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque la cada dosis comprende entre 103 y 1010 micobacterias inactivadas.
10. - Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque las micobacterias se administran en forma de una composición farmacéutica que comprende las micobacterias inactivadas y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
1 1. - Uso según la reivindicación 10, caracterizado porque la composición farmacéutica está en forma de cápsulas.
12. - Uso según la reivindicación 10, caracterizado porque la composición farmacéutica está en forma de comprimidos.
13. - Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque se administra a un individuo infectado por M. tuberculosis en el que la infección se encuentra en estado latente.
14. - Uso según la reivindicación 13, caracterizado porque el individuo había desarrollado previamente la tuberculosis activa.
15. - Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque se administra a un individuo no infectado por M. tuberculosis.
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