ES2438690A1 - Micobacterias inactivadas para su uso por vía oral en la prevención de la tuberculosis - Google Patents
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Abstract
La presente invención se refiere a micobacterias inactivadas para su uso por vía oral en la prevención de la tuberculosis. Dichas bacterias se administran según una pauta de administración de múltiples dosis, administradas con un intervalo temporal reducido entre las mismas, de modo que induce una respuesta tolerizante frente a la infección por el bacilo de la tuberculosis. La utilización de las bacterias inactivadas de acuerdo con dicha pauta permite controlar el progreso de la infección desde un estado latente a tuberculosis activa.
Description
MICOBACTERIAS INACTIVADAS PARA SU USO POR VíA ORAL EN LA
PREVENCiÓN DE LA TUBERCULOSIS
La presente invención se enmarca en la provisión de medicamentos para ser administrados por vía oral para la prevención de la tuberculosis, en particular para controlar el paso de la infección latente a la infección activa de dicha enfermedad.
La tuberculosis es una enfermedad infecciosa crónica ocasionada por las bacterias pertenecientes al grupo Mycobacterium tuberculosis-complex (MTB-C), que incluye actualmente los bacilos M. tuberculosis, M. bovis, M. micro ti y M. africanum, siendo el M. tuberculosis el agente más importante y frecuente en relación con la tuberculosis humana. Dicha enfermedad afecta principalmente a los pulmones, si bien en algunos casos puede extenderse también a otros órganos. Si no se trata adecuadamente, la tuberculosis puede resultar mortal.
Según el informe del 2011 de la Organización Mundial de la Salud, anualmente se registran 9 millones de nuevos casos a nivel mundial de personas que manifiestan la enfermedad y se contabilizan aproximadamente 1,7 millones de fallecimientos. Se considera, así mismo, que en el mundo existen más de 2.500 millones de personas infectadas y que cada año se generan unos 100 millones de infectados nuevos.
La tuberculosis se transmite por el aire, de manera que los pacientes con una cavidad tuberculosa en sus pulmones son la principal fuente de la transmisión de esta enfermedad, tal como se describe, por ejemplo, en J. Grosset, Studies in shorl-course chemotherapy for tuberculosis. Basis for shorlcourse chemotherapy, Chest, 1981, 80, 719-720, Y en J. Grosset, Mycobacterium tuberculosis in the Extracellular Comparlment: an Underestimated Adversary, Antimicrob. Agents Chemother., 2003, 47, 833-836.
Según se describe en dichos artículos, los pacientes expulsan,
mediante la tos o el estornudo, una gran cantidad de microgotas capaces de transportar bacilos, que pueden entrar en el espacio alveolar de la persona que los inhala.
Tras la inhalación, el bacilo es fagocitado por los macrófagos alveolares, y es dentro de esta célula donde el bacilo puede crecer, hasta causar la destrucción de la misma. De nuevo en el espacio extracelular, el bacilo es fagocitado por nuevos macrófagos y este proceso se va repitiendo hasta que, al ser drenados y generar una infección en los ganglios linfáticos hiliares, se genera una respuesta inmune basada en una inmunidad celular.
Unas 6 semanas después de la infección, el crecimiento bacilar cesa, el hospedador positiviza la prueba cutánea de la tuberculina, caracterizada por una respuesta de hipersensibilidad retardada (o DTH, del inglés Delayed Type Hypersensitivity) , y se genera la denominada necrosis caseosa en el punto de infección.
Una de las características principales de la infección tuberculosa, es el hecho de que M. tuberculosis es capaz de permanecer durante años en el tejido del hospedador sin desarrollar la enfermedad, en forma de infección tuberculosa "latente", pero manteniendo sus posibilidades de generar una tuberculosis activa.
Este estado latente de la infección está relacionado con la aparrclon de la denominada necrosis caseosa, que se genera en la lesión alveolar inicial y en el tejido pulmonar circundante, resultando en la destrucción de los macrófagos que contienen los bacilos que se están multiplicando, produciéndose una lesión necrótica sólida.
El origen de esta reacción necrótica no se conoce con exactitud, pero se relaciona con la reacción de tipo DTH. Esencialmente, la respuesta inmune que permite el control de la población bacilar es de tipo celular y mayoritariamente dirigida por linfocitos CD4 de tipo Th1, es decir, capaz de generar la respuesta de tipo DTH y también de identificar macrófagos infectados y de activarlos para destruir a los bacilos de su interior.
Aproximadamente en un 10% de los individuos infectados, dicha
necrosis sólida se reblandece, siendo uno de los episodios más importantes en la infección tuberculosa, puesto que es entonces cuando la infección progresa a tuberculosis activa, o sea a enfermedad tuberculosa.
En la mayoría de los casos, el reblandecimiento se asocia con el drenaje del tejido reblandecido hacia el árbol bronquial, formándose una cavidad tuberculosa, y un crecimiento extracelular explosivo del bacilo, con la entrada de oxígeno a través del orificio bronquial. Con la tos, este caseum reblandecido y repleto de bacilos, es diseminado por otras partes de los bronquios, del pulmón y del exterior.
El tratamiento farmacológico de la tuberculosis se caracteriza por ser una terapia prolongada, cosa que dificulta su seguimiento a la vez que favorece la aparición de bacterias resistentes a los fármacos.
Se considera que la mejor estrategia para la contención de la tuberculosis se basa en un enfoque preventivo de la misma.
La vacuna actual, administrada por vía parenteral, que se emplea en el tratamiento preventivo contra la tuberculosis está basada en bacterias de la cepa denominada BCG (Bacilo de Calmette-Guerin), una variante atenuada de M. bovis. Sin embargo, se ha observado que su eficacia disminuye con el tiempo y que es ineficaz para la prevención de la enfermedad en adultos, de hecho se considera que tan solo protege a los nichos del desarrollo de una enfermedad tuberculosa mortal (miliar o meníngea).
Se han desarrollado otros tratamientos profilácticos de la tuberculosis basados principalmente en otras cepas de micobacterias vivas atenuadas, o bien en subunidades bacterianas.
Así mismo, en el estado de la técnica también se han explorado tratamientos profilácticos de la tuberculosis basados en micobacterias inactivadas, con el objeto de obtener una respuesta inmune análoga a la obtenida con las vacunas basadas en micobacterias atenuadas, es decir, del tipo Th1, generadora de interferón-y.
Así, por ejemplo, en el artículo Opie et al., Protective inoculation against human tuberculosis with heat-killed tubercle bacilli, Am. J. Hyg., 1939,
29, 155-164, se describe un estudio clínico en el que se administraron cinco dosis por vía intracutánea de bacilos de M. tuberculosis inactivados por calentamiento, con el objetivo de generar protección frente a la enfermedad.
Así mismo, en el artículo Agger et al. Specific acquired resistance in mice immunized with killed mycobacteria, Scand. J. Immunol., 2002,56,443447, se describe un estudio experimental con ratones que fueron vacunados con tres dosis administradas por vía subcutánea de 1000 I-Ig de bacilos M. tuberculosis inactivados por calentamiento, con un intervalo de 2 semanas entre cada dosis, observándose una inducción de inmunidad específica basada en linfocitos T.
También se han ensayado otras micobacterias inactivadas para inducir protección frente a la tuberculosis, habitualmente por vía parenteral.
Por ejemplo, en Gupta et al., Immunogenicity and protective efficacy of "Mycobacterium w" against Mycobacterium tuberculosis in mice Immunized with live versus heat-killed M. w by the aerosol or parenteral route,
Infect. Immun., 2009, 77 (1), 223-231, se describe que se administraron micobacterias M. w vivas o inactivadas por calentamiento. Estas últimas fueron administradas como monodosis por vía subcutánea, y se observó una respuesta inmunitaria basada en la inducción de linfocitos Th1, que generaban interferonas.
Es particularmente deseable, disponer de un tratamiento profiláctico que sea efectivo por vía oral, ya que dicha vía facilita considerablemente la administración del fármaco y la adherencia al tratamiento.
En este sentido, existen algunos documentos en el estado de la técnica referidos a la administración por vía oral de bacterias inactivadas por el calor de otra micobacteria, Mycobacterium vacae, para conseguir un efecto terapéutico de la tuberculosis activa, según una pauta combinada con los fármacos habituales en quimioterapia.
A nivel experimental, en Hernández-Pando et al., Orally administered Mycobacterium vaccae modulates expression of immunoregulatory molecules in BALB/c mice with pulmonar y tuberculosis, Clin. Vaccine Immunol., 2008, 15(11), 1730-1736, se describe un ensayo realizado
con ratones a los que se les administró por vía oral 5 dosis de 0,1 IJg de M. vaccae inactivado por calentamiento, con un intervalo de 28 días entre cada administración, y induciéndose una infección con M. tuberculosis por vía intratraqueal 23 h después de la primera dosis. En dicho estudio se confirmó que se generaba una respuesta inmune de tipo celular aumentándose la secreción de linfocitos Th1, mientras que disminuía la inmunidad tipo humoral, como se demostraba por una disminución de los linfocitos tipo Th2, y del factor de crecimiento TGF-beta.
En general, en el estado de la técnica se sugiere que es deseable una inducción de tipo Th1, con la consiguiente generación de interferón-y, mientras que una respuesta Th2, con la consiguiente generación de IL-4, o la Th3, que conlleva la generación de células T reguladoras (Treg), pueden tener un efecto inductor de la tuberculosis activa.
Así se describe, por ejemplo, en Kursar et al., Gutting Edge: Regulatory T Gells Prevent Efficient Glearance of Mycobacterium tuberculosis,
J. Immunol., 2007, 178, 2661-2665, en donde la generación de células T reguladoras (Treg) se atribuye a la incapacidad de los linfocitos CD4 para esterilizar las lesiones caseosas y evitar la infección latente en el modelo de tuberculosis experimental en ratón. En dicho artículo se sugiere que una desregulación que permite el desequilibrio entre la respuesta Th1 y Treg a favor de la segunda puede ser la causa de la inducción de tuberculosis activa.
A la vista de lo descrito en el estado de la técnica, subsiste la necesidad de disponer de un tratamiento eficaz de la tuberculosis, administrable por vía oral, para prevenir el desarrollo de la tuberculosis activa, y el subsiguiente surgimiento del estado patológico de la enfermedad, tanto en individuos no infectados (efecto profiláctico) como en individuos infectados por
M. tuberculosis en los que la infección se encuentra en estado latente (efecto terapéutico).
Objeto de la invención
El objeto de la presente invención es el uso de micobacterias inactivadas para la preparación de un medicamento para su administración oral para la prevención de la tuberculosis.
Figura 1
En la Figura 1, el tiempo de supervivencia expresado en días se representa en el eje de abscisas, y el porcentaje de animales supervivientes en el eje de ordenadas. El Grupo Control se representa con un trazo continuo, y los animales del Grupo 1 se representan en trazo discontinuo. Los animales del Grupo 1 fueron sometidos a un tratamiento con micobacterias inactivadas de Mycobacterium tuberculosis por vía oral antes de la infección, mediante la administración de 5 dosis de dichos bacilos, una cada 48 horas empezando el día 10 antes de la infección Los gráficos 1, 2, 3 Y 4 corresponden a los animales de los grupos 1 a, 1b, 1 c y 1 d, respectivamente, a los que se les administró diferente cantidad de producto, según las diluciones 1:1,1:10,1:100 y 1 :1000.
Figura 2
En la Figura 2, el tiempo de supervivencia expresado en días se representa en el eje de abscisas, y el porcentaje de animales supervivientes en el eje de ordenadas. En la misma se compara el Grupo Control (trazo continuo) con el Grupo 2 (trazo discontinuo). Los animales del Grupo 2 fueron sometidos a un tratamiento con micobacterias inactivadas de Mycobacterium tuberculosis por vía oral después de la infección mediante la administración de 5 dosis de dichos bacilos, una cada 48 horas empezando el día 11 después de la infección Los gráficos 5, 6, 7 Y 8 corresponden a los animales de los grupos 2a, 2b, 2c y 2d, respectivamente, a los que se les administró diferente cantidad de producto, según las diluciones 1:1,1:10,1:100 y 1:1000.
Figura 3
En la Figura 3, el tiempo de supervivencia expresado en días se
representa en el eje de abscisas, y el porcentaje de animales supervivientes en el eje de ordenadas. En la misma se compara el Grupo Control (trazo continuo) con los animales del Grupo 1 (trazo discontinuo), que fue tratado con micobacterias inactivadas de M. bovis BCG por vía oral después de la infección.
Figura 4
En la Figura 4, el tiempo de supervivencia expresado en días se representa en el eje de abscisas, y el porcentaje de animales supervivientes en el eje de ordenadas. En la misma se compara el Grupo Control (trazo continuo) con los animales del Grupo 1 (trazo discontinuo), que fue tratado con micobacterias inactivadas de M. bovis BCG por vía oral antes de la infección.
Figura 5
En la Figura 5, el tiempo de supervivencia expresado en días se representa en el eje de abscisas, y el porcentaje de animales supervivientes en el eje de ordenadas. En el gráfico 1 se compara el Grupo Control (trazo continuo) con el Grupo 1 (trazo discontinuo), que fue sometido a un tratamiento con micobacterias inactivadas de Mycobacterium tuberculosis administradas por vía oral iniciado antes de la infección. En el gráfico 2 se compara el Grupo Control (trazo continuo) con el Grupo 2 (trazo discontinuo), que fue sometido a un tratamiento con micobacterias inactivadas administradas por vía oral iniciado después de la infección.
Figura 6
En la Figura 6 se representan los porcentajes de células T reguladoras con el fenotipo CD4+CD25+ Foxp3+, respecto el total de células T CD4+, para cada uno de los tratamientos con micobacterias inactivadas de M. tuberculosis y el control, a la semana 3 (gráfico 1) Y a la semana 4 (gráfico 2) después de la infección. En el eje de ordenadas se representa dicho porcentaje de células T reguladoras. En el eje de abscisas se representan los diferentes grupos de animales. Los cuadrados representan animales no tratados (Grupo Control), los triángulos representan animales del Grupo 1, tratados previamente a la infección (efecto profiláctico), y los círculos representan los animales del Grupo 2, tratados posteriormente a la infección (efecto terapéutico). Las líneas horizontales trazadas representan la media aritmética de cada grupo.
Descripción detallada de la invención
El objeto de la presente invención es el uso de micobacterias inactivadas para la preparación de un medicamento para la prevención de la tuberculosis, en donde:
- -
- las micobacterias inactivadas se administran periódicamente por vía oral,
el intervalo entre las dosis no es superior a 5 días, y
- -
- el número de dosis administradas es de al menos 5.
Alternativamente, el objeto de la presente invención se puede formular como micobacterias inactivadas para su uso para la prevención de la tuberculosis, en donde:
las micobacterias se administran periódicamente por vía oral,
- -
- el intervalo entre las dosis no es superior a 5 días, y
- -
- el número de dosis administradas es de al menos 5.
Los autores de la presente invención han desarrollado un nuevo tratamiento preventivo de la tuberculosis que se basa en la administración de micobacterias inactivadas, según una pauta de administración de múltiples dosis, administradas con un intervalo temporal reducido entre las administraciones.
Los autores han observado que dicho tratamiento preventivo, efectuado antes de la infección por M. tuberculosis (efecto profiláctico) o después de la infección (efecto terapéutico) es capaz de prevenir el desarrollo de la tuberculosis activa mediante el control de la progresión de la infección desde un estado latente a tuberculosis activa.
De acuerdo con dicho tratamiento, la administración periódica oral de bacilos muertos, preferentemente a dosis bajas, y con un intervalo temporal reducido entre las dosis, induce una tolerización o respuesta tolerizante que, sorprendentemente, tiene un efecto positivo en el control de la infección por M. tuberculosis, esto es, en el paso de la infección latente a la infección activa.
Efectivamente, los autores han observado que este tipo de tratamiento, tanto administrado previamente, como con posterioridad a la infección por M tuberculosis, desencadena una respuesta tolerizante, caracterizada por un incremento del porcentaje de las células T reguladoras (Treg).
El uso de la invención está dirigido a individuos no infectados y a individuos infectados por M. tuberculosis en el que la infección se encuentra en estado latente. En el primer caso el tratamiento preventivo se considera que tiene un efecto profiláctico, mientras que en el segundo caso se considera que tiene un efecto terapéutico.
En general, se entiende por "tratamiento preventivo" aquel que permite preservar un individuo de una enfermedad.
En este sentido, en el contexto de la invención, el tratamiento preventivo es aquel tratamiento capaz de prevenir el desarrollo de la tuberculosis activa mediante el control de del paso de la infección latente a la infección activa.
En general, se entiende por "tolerización" como la inducción intencionada de tolerancia por medio de agentes biológicos o químicos, en donde el término "tolerancia" significa un estado de hiporespuesta específica al agente biológico o químico.
Por ello, en el contexto de la invención, se entiende por la expresión "inducción de una respuesta tolerizante" como un método por medio del cual se induce un estado de falta de respuesta en el sistema inmune del huésped frente a un antígeno específico, con el resultado de una atenuación del trastorno.
En el estado de la técnica se han descrito pautas de tolerización en el contexto de otras enfermedades como, por ejemplo, la ateroesclerosis. Así, en George et al., Suppression of early atherosclerosis in LDL-receptor deficient mice by oral tolerance with h2-glycoprotein 1, Cardiovasc. Res., 2004, 62, 603-609 se describe el empleo de la J32-glicoproteína I para inducir tolerancia oral y suprimir la ateroesclerosis temprana, y en Harats et al., Oral Tolerance With Heat Shock Protein 65 Attenuates Mycobacterium TuberculosisInduced and High-Fat-Diet-Driven Atherosclerotic Lesions, J. Am. CoII. Cardiol., 2002, 40, 1333-1338, se describe el empleo de la proteína 65 de choque de calor para inducir tolerancia oral frente a lesiones ateroescleróticas.
Micobacterias inactivadas El género de las micobacterias pertenecen a la familia de las Mycobacteriaceae y está formado por bacilos aerobios.
Todos los bacilos pertenecientes al género de las micobacterias forman parte del objeto de la presente invención, por ejemplo las especies M. abscessus, M. africanum, M. asiaticum, M. aurum, M. avium, M. avium para tuberculosis, M. avium silvaticum y M. avium hominissuis, M. bovis, M. bovis BCG, M. chelonae, M. fortuitum, M. gastri, M. goodi, M. gordonae, M. immunogenum, M. haemophilum, M. habana, M. kansasii, M. lentiflavum, M. leprae, M. lepromatosis, M. lufu, M. mageritense, M. malmoense, M. marinum,
M. massiliense, M. microti, M. monacense, M. mucogenicum, M. neoaurum, M. peregrinum, M. phlei, M. scrofulaceum, M. smegmatis, M. terrae, M. triviale, M. tuberculosis, M. microti, M. ulcerans, M. vaccae y M. xenopi, entre otros.
Las micobacterias tienen muchos antígenos comunes con M. tuberculosis, y por ello resultan apropiadas para el uso de la presente invención. Así, en el artículo de Stanford et al., Mycobacteria and their world, Int. J. Mycobacteriol., 2012, 3-12, se describe una clasificación de los diferentes grupos de antígenos en micobacterias y como estos se distribuyen y comparten entre diferentes especies de la familia Mycobacteriaceae.
Preferiblemente, las micobacterias inactivadas que forman parte de la presente invención son las micobacterias del grupo denominado Mycobacterium tuberculosis complex (MTB-C). Es decir, preferiblemente las mico bacterias inactivadas se eligen de entre el grupo formado por M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, y M. microti, y M. bovis BCG. Más preferiblemente, las micobacterias inactivadas se eligen de entre el grupo formado por M. tuberculosis, M. bovis y M. bovis BCG.
Por micobacterias inactivadas, también denominadas
micobacterias muertas, se entienden aquellas micobacterias que han sido sometidas a un tratamiento físico o químico que transforma la micobacteria viva en una forma incapaz de replicarse.
Algunos métodos adecuados para inactivar las mico bacterias, dentro del ámbito de la presente invención son, por ejemplo, el tratamiento con formaldehído, por irradiación o por calentamiento.
Preferiblemente, las micobacterias inactivadas objeto de la presente invención se inactivan mediante un proceso de calentamiento.
Un procedimiento adecuado para inactivar las micobacterias por calentamiento comprende, por ejemplo, cultivar una cepa de la micobacteria en un medio de cultivo adecuado, según son bien conocidos por el experto en la materia, tales como, el agar Middlebrook tipo 7H10 o tipo 7H11, el medio de cultivo Sauton o el medio de cultivo Proskauer-Beck, entre otros. El cultivo se mantiene preferiblemente hasta conseguir una concentración aproximadamente comprendida entre 1 x 107 y 1 X 108 unidades formadoras de colonias (UFCs) por mI.
A continuación, el cultivo se inactiva por calentamiento. Preferiblemente, el calentamiento se efectúa a una temperatura comprendida entre 70° C y 90° C. Preferiblemente, el período de calentamiento está comprendido entre 30 minutos y 3 horas.
Prevención de la tuberculosis
La expresión "prevención de la tuberculosis" se refiere a prevenir la manifestación de la tuberculosis activa mediante el control de la progresión de la infección desde un estado latente a tuberculosis activa.
Dicha prevención se puede efectuar en individuos infectados por
M. tuberculosis en los que la infección está en estado latente, y no se ha desarrollado aún la enfermedad, y también en individuos no infectados.
Los autores de la presente invención han desarrollado un tratamiento preventivo de la tuberculosis que impide la progresión de la infección latente, de manera que se evita la progresión de las lesiones caseosas sólidas a lesiones Iicuefactadas y, por lo tanto, se evita la manifestación de la tuberculosis activa.
Los autores de la presente invención han utilizado un modelo experimental que se basa en el empleo de ratones C3HeB/FeJ, en los que se puede simular una patología del pulmón tras la infección por M. tuberculosis equivalente a la que se desarrolla en los humanos.
En dichos animales se observa la formación de necrosis caseosas que pueden licuefactar en respuesta a la infección con M. tuberculosis, a diferencia de lo que sucede en otros modelos animales que no desarrollan dicha necrosis, tal como se describe en el artículo Harper et al., Mouse model of necrotic tuberculosis granulomas develops hypoxic lesions, J. Infect. Dis., 2012, 205, 595-601.
En caso de ser infectados con una alta dosis por vía endovenosa, el crecimiento de la necrosis y de las lesiones en dichos animales es tal que puede ocasionar un 100% de mortalidad aproximadamente a las cuatro semanas después de la infección, tal como se describe en el artículo Sissons et al., Multigenic control of tuberculosis resistance: analysis of a QTL on mouse chromosome 7 and its synergism with sst1, Genes Immun., 2009, 10,37-46.
Sin querer estar ligados por ninguna teoría, los autores de la presente invención consideran que el efecto preventivo del tratamiento objeto de la presente invención se debe a que la administración oral de dosis periódicas frecuentes de bacilos muertos, preferiblemente a dosis bajas, constituye una pauta capaz de inducir tolerancia en los sujetos, generándose una respuesta en la que preferiblemente se inducen los linfocitos T reguladores (Tregs). Dichos linfocitos están relacionados con el factor de crecimiento transformante beta (TGF-beta, del inglés transforming growth-factor beta), es decir, se genera una respuesta inmune mayoritariamente de tipo Th3 o tolerizante, a diferencia de los sistemas de vacunación tradicionales, donde básicamente se desencadena una respuesta inmune del tipo Th1.
Sorprendentemente, los autores de esta invención han constatado que la inducción de tolerancia es eficaz para detener la progresión de la infección por M. tuberculosis, esto es, el paso de la infección latente a la infección activa.
Para desencadenar esta respuesta tolerizante es imprescindible que las micobacterias inactivadas se administren de forma repetida y con intervalos temporales redl;lcidos entre cada administración, no superiores a 5 días; preferiblemente, el intervalo entre las dosis no es superior a 3 días; y más preferiblemente, el intervalo entre las dosis no es superior a 2 días.
Así mismo, el tratamiento tolerizante requiere de una administración repetida de las micobacterias inactivadas, siendo el número de dosis administradas de al menos 5; preferiblemente, el número de dosis administradas es de al menos 7; y más preferiblemente el número de dosis administradas es de al menos 9.
En el uso de la invención, se administra una cantidad inmunológicamente efectiva de micobacterias inactivadas. Es conocido que la dosis a emplear depende de la edad y del peso del individuo a administrar las micobacterias. Generalmente las dosis adecuadas se encuentran comprendidas Y 1010
en el rango entre 103 micobacterias inactivadas; preferiblemente entre
103 Y 108, Ymás preferiblemente entre 104 Y 108.
Para demostrar el efecto terapéutico preventivo sobre la licuefacción de las lesiones caseosas de la pauta de administración tolerizante que forma parte de la presente de invención, los ratones C3HeB/FeJ empleados en el modelo descrito anteriormente, se sometieron a un protocolo en el que se administraron por vía oral entre 5 y 13 dosis de micobacterias inactivadas, con un intervalo entre las dosis comprendido entre 2 y 3 días.
El modelo murino utilizado simula una terapia preventiva de la tuberculosis, bien al administrarse el tratamiento antes de la infección, tal como se describe en los Ejemplos 1,3 Y 4, o bien cuando el tratamiento se inicia después de la infección por M. tuberculosis, tal como se describe en los Ejemplos 1,2 Y 4, pero administrado en una fase temprana (días 11 o 12 después de la infección) cuando los animales ya han desarrollado lesiones, pero éstas todavía no han evolucionado hacia la su licuefacción y consiguiente manifestación de la enfermedad.
A partir de los resultados obtenidos en los ejemplos, se concluye que la administración por vía oral de pautas tolerizantes de micobacterias inactivadas, tanto antes como después de la infección por M. tuberculosis, aumenta la supervivencia de los animales, al retardarse la inducción de la enfermedad, esto es, el paso de la infección latente a la infección activa.
Composiciones Según el objeto de la presente invención, las micobacterias inactivadas se administran por vía oral.
Dichas micobacterias pueden administrarse en forma de cualquier composición farmacéutica adecuada para la administración oral, como son bien conocidas por el experto en la materia. Por ejemplo, son adecuados para la administración por vía oral: comprimidos, cápsulas, soluciones, suspensiones, dispersiones, polvos, granulados, o aerosoles.
Preferiblemente, las mico bacterias se administran en forma de cápsulas o comprimidos.
En general, las composiciones farmacéuticas comprenden las micobacterias inactivadas y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Las composiciones se preparan de acuerdo con los métodos habituales que son bien conocidos por el experto en la materia, como los que figuran en manuales de tecnología farmacéutica, como el libro Remington The Science and Practice of Pharmacy, 20a edición, Lippincott, Williams & Wilkins, Filadelfia, 2000 [ISBN: 0-683-306472].
Entre los excipientes farmacéuticamente aceptables que se pueden incluir en la composición farmacéutica se encuentran, por ejemplo, agentes antiapelmazantes como sílice coloidal, fosfato cálcico tribásico, silicato cálcico, silicato de magnesio, trisilicato de magnesio o talco; agentes diluyentes como lactosa anhidra, latosa monohidrato, fosfato cálcico, hidrógeno fosfato de calcio anhidro, hidrógeno fosfato de calcio dihidrato, sulfato cálcico, carbonato
lIIIIfi ,p
cálcico, carboximetilcelulosa cálcica, celulosa microcristalina o en polvo, acetato de celulosa, dextratos, dextrinas, dextrosa, fructosa, gliceril palmitoestearato, caolín, lactitol, carbonato magnésico, óxido de magnesio, maltitol, maltodextrinas, maltosa, polimetacrilatos, almidón pregelatinizado, cloruro de sodio, almidón, suerosa o sacarosa; agentes lubrificantes como estearato de magnesio, estearato de calcio, palmitoestearato de glicerina, poloxámeros, óxido de magnesio, benzoato de sodio, sílice coloidal, lauril sulfato de sodio, estearil fumarato de sodio, ácido esteárico, talco o behenato de glicerina; agentes suspensores como goma xantana, goma guar, ácido algínico, bentonita, carbómeros, carboximetilcelulosa sódica o cálcica, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxipropil alginato, celulosa microcristalina o en polvo, sílice coloidal anhidra, dextrinas, gelatinas, caolín, silicato alumínico magnésico, maltitol, povidona, esteres de sorbitán o tragacanto; agentes aglutinantes como trisilicato de magnesio, celulosa, almidón, dextrina, dextrosa, polidextrosa, maltosa, maltodextrina, etilcelulosa, metilcelulosa, polimetacrilatos, talco, povidona, ácido esteárico o sacarosa; agentes disgregantes como hidroxipropilcelulosa de bajo grado de sustitución, fosfato de calcio tribásico, carboximetilcelulosa sódica o cálcica, croscarmelosa sódica, crospovidona o metilcelulosa; agentes de recubrimiento como chitosano, ftalato de dibutilo, sebacato de dibutilo, ftalato de dietilo, ftalato de dimetilo, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hipromelosa, maltodextrina polimetacrilatos, acetato ftalato de polivinilo, o citrato de trietilo; agentes dispersantes como poloxámeros o esteres de sorbitán; agentes edulcorantes como aspartamo, manitol, sorbitol, sacarina de sodio, ciclamato de sodio, sacarosa, dextrosa, fructosa, glucosa, inulina, isomaltosa, lactitol, maltosa, maltol, manitol, sucralosa, trehalosa, xi lito I o taumatina; agentes aromatizantes y saborizantes, y/o mezclas de los mismos.
Una lista más exhaustiva de los excipientes, así como sus características físico-químicas, así como los nOmbres de los productos comerciales bajo los que se comercializan se pueden encontrar en el libro R.e.
4a
Rowe et a/. , Handbook of Pharmaceutical Excipients, edición, Pharmaceutical Press, Londres, 2003 [ISBN: 0-85369-472-9].
Los ejemplos que siguen a continuación tienen como objeto
ilustrar la invención, si bien no deben ser entendidos como limitantes de la misma.
Ejemplo 1.-Tratamiento oral tolerizante con bacilos de M. tuberculosis
inactivados
Para preparar las micobacterias inactivadas se partió de una cepa clínica de M. tuberculosis (TOL-3), proveniente de la colección de cepas de la Unitat de Tuberculosi Experimental del Institut Germans Trias i Pujol, cultivada en medio líquido Proskauer Beck hasta conseguir un crecimiento exponencial y una concentración de 1,7 x 107 unidades formadoras de colonias (UFCs) por mI.
Se procedió a su inactivación tras calentar el cultivo a 750 C durante 2 horas ya su congelación posterior a -800 C. Posteriormente se diluyó
50:50 en una solución de sacarosa al 10%, se embotelló y liofilizó en viales en volúmenes de 0,5 mI. Posteriormente estos viales se reconstituyeron con 3 mi de agua bid estilada, constituyendo la dilución 1:1, equivalente a 4,25 x 106 UCFs.
En los ensayos se administraron 0,3 mi de producto, tanto a esta dilución 1:1, como a diluciones 1:10, 1:100, y 1:1000. Estas administraciones corresponden a unas dosis de, respectivamente, a 4,25 x 105, 4,25 X 104, 4,25 X 103 Y 4,25 X 102 UCFs.
La efectividad de las micobacterias inactivadas se ensayó en ratones hembra de 6 a 8 semanas de edad del tipo C3HeB/FeJ, libres de patógenos específicos.
Los ratones se dividieron en tres grupos de 6 animales cada uno, y cada uno de los grupos se sometió al siguiente protocolo de tolerización.
1) Grupo Control: Sin tratamiento.
2) Grupo 1 (tratamiento pre-infección): Tratados por vía oral, mediante una
sonda gástrica, con 5 dosis de producto conteniendo las micobacterias inactivadas, administradas cada 48 horas empezando por el día 10 antes de la infección. Se administró un volumen de 0,3 mi en cada dosis,
y se probaron un total de 4 diluciones: 1:1, 1 :10, 1 :100 y 1 :1000 (grupos 1a, 1b, 1c y 1d, respectivamente) 3) Grupo 2 (tratamiento post-infección): Tratados por vía oral, mediante una sonda gástrica, con 5 dosis de producto conteniendo las micobacterias
5 inactivadas, administradas cada 48 horas empezando por el día 11 después de la infección. Se administró un volumen de 0,3 mi en cada dosis, y se probaron un total de 4 diluciones: 1: 1, 1: 1O, 1:1 00 Y 1:1 000 (grupos 2a, 2b, 2c y 2d, respectivamente)
Para la infección se empleó la cepa virulenta de Mycobacterium
10 tuberculosis (H37Rv Pasteur), que se cultivó en medio Proskauer-Beck hasta una fase media logarítmica, y se conservó en alícuotas de 1 mi a una temperatura de -700 e hasta su utilización. Los ratones se infectaron por vía endovenosa introduciendo un inóculo aproximado de 5 x 104 bacilos viables.
15 Los animales eran observados y pesados diariamente hasta que las condiciones del animal requerían su sacrificio, según el procedimiento detallado en la Tabla 1. TABLA 1
- Observación del animal
- Puntuación
- Peso
- Normal (no hay pérdida de peso, el animal crece normalmente) O
- Pérdida de peso < 10%
- 1
- Pérdida de peso entre 10-15%. Posible alteración del aspecto o cantidad de heces
- 2
- Pérdida de peso> 15%. El animal no consume agua ni alimento
- 3
- Aspecto
- Normal O
- Pelaje en mal estado
- 1
- Pelaje en mal estado y/o presencia de secreciones oculares o nasales
- 2
- Postura anormal
- 3
- Observación de indicios de dolor
- Ausencia de indicios (no se observan automutilaciones ni vocalizaciones extrañas) O
- Observación de automutilaciones o vocalizaciones extrañas
- 3
- Respuesta a estímulos
- Normal (no agresivo ni comatoso) O
- Muy agresivo o comatoso
- 3
- 0-2: normal. 3: Aumentar la frecuencia de la aplicación del protocolo de supervisión a 2 veces/día. Si se obtiene un 3 en más de un concepto, todos los 3 pasan a 4. Cuando una o más de las puntuaciones alcanzan el valor 4, se sacrifica el animal.
Los resultados obtenidos se han representado en forma gráfica en las Figuras 1 y 2, en donde se muestra la evolución de la supervivencia de los animales tras la infección, para los diferentes grupos experimentales. En el eje
5 de abscisas se representa el tiempo de supervivencia, expresado en días, mientras que en el eje de ordenadas se representa el porcentaje de supervivientes.
En la Figura 1 se compara el Grupo Control (trazo continuo) con los animales del Grupo 1 (trazo discontinuo), que fueron tratados antes de la
10 infección. Los gráficos 1, 2, 3 Y 4 corresponden a los animales de los grupos 1a, 1b, 1 c y 1 d, respectivamente, a los que se les administró diferente cantidad de producto, según las diluciones 1:1,1:10,1:100 y 1:1000.
En la Figura 2 se compara el grupo control (trazo continuo) con los animales del Grupo 2 (trazo discontinuo), que fueron tratados después de la 15 infección. Los gráficos 5, 6, 7 Y 8 corresponden a los animales de los grupos
2a, 2b, 2c y 2d, respectivamente, a los que se les administró diferente cantidad de producto, según las diluciones 1:1,1:10,1:100 y 1:1000.
Para valorar el efecto del tratamiento sobre la supervivencia de los animales, se compararon las curvas de supervivencia mediante dos métodos: test de Mantel-Cox (o test Log Rank, LR t) Y test de Gehan-BreslowWilcoxon (GBW t). En el primer método se asume que el riesgo (muertes/unidad de tiempo) es constante durante todo el experimento, mientras que el segundo tiene más en cuenta las muertes en los primeros días (muertes más tempranas). Si el riesgo es constante, el test de Mantel-Cox tiene más poder estadístico, pero si no es así, y hay un grupo que está en mayor riesgo que el otro, el Gehan-Breslow-Wilcoxon resulta más adecuado.
Se observan diferencias estadísticamente significativas en todos los casos (p<0,05, GBW t), respecto a los grupos control. En los tratamientos correspondientes a gráficos 4, 5, 6 Y 7, hay también significación estadística para LR t (p<0,05).
Los resultados reflejan una respuesta protectora cuando se utilizó la pauta pre-infección con la dilución más baja (1 :1000, Figura 1, gráfico 4), mientras que con la pauta post-infección, se observó protección con las diluciones 1:1, 1:10 y 1:100 (Figura 2, gráficos 5,6 Y 7, respectivamente), siendo especialmente importante en la pauta de dilución 1 :10.
Las autopsias en el grupo control reflejaron una evolución muy rápida entre los días 26 y 30, período en el que las lesiones aumentaron mucho de tamaño y acabaron confluyendo generando grandes lesiones con necrosis con consistencia cremosa en su interior.
Por tanto, se puede concluir que la administración de pautas tolerizantes por vía oral, tanto antes (efecto profiláctico) como después de la infección (efecto terapéutico) por M. tuberculosis, aumenta la supervivencia de los animales al retrasar el paso de la infección latente a la infección activa. Por ello, se considera que el uso de micobacterias inactivadas según la invención es apropiado como tratamiento preventivo de la tuberculosis.
Ejemplo 2.-Tratamiento oral tolerizante con bacilos de M. bovis BCG
inactivados. administrados después de la infección (efecto
terapéutico)
El agente terapéutico empleado en este ejemplo fue preparado a partir de una cepa comercial de M. bovis BCG (SSI) cultivada en medio líquido Proskauer Beck hasta conseguir un crecimiento exponencial y una concentración de 1,03 x 108 unidades formadoras de colonias (UFCs) por mI. Se procedió a su inactivación siguiendo el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 1.
La efectividad de las mico bacterias inactivadas se ensayó en ratones hembra de 6 a 8 semanas de edad del tipo C3HeB/FeJ, libres de patógenos específicos. En cada dosis, se les administró un volumen de 0,3 mI. correspondiente a una dilución 1:10, lo que corresponde a 2,575 x 105 UFCs.
Los ratones se dividieron en dos grupos de 12 animales cada uno de ellos, y cada uno de los grupos se sometió a al siguiente protocolo de tolerización:
1) Grupo Control: Sin tratamiento.
2) Grupo 1 (tratamiento post-infección): Tratados por vía oral, mediante una
sonda gástrica, con 5 dosis de producto conteniendo las micobacterias
inactivadas, administradas cada 48 horas empezando por el día 12
después de la infección, y posteriormente 3 veces por semana (lunes,
miércoles y viernes) hasta el final del experimento, en virtud del tiempo
de supervivencia de cada ratón
Para la infección se empleó la cepa virulenta de Mycobacterium tuberculosis (H37Rv Pasteur), que se cultivó en medio Proskauer-Beck hasta una fase media logarítmica, y se conservó en alícuotas de 1 mi a una temperatura de -700 C hasta su utilización.
Los ratones se infectaron por vía endovenosa introduciendo un inóculo aproximado de 5 x 104 bacilos viables.
Los animales se observaron y pesaron diariamente hasta que las condiciones del animal requerían su sacrificio, según el mismo procedimiento que se describe en la Tabla 1 del Ejemplo 1.
Los resultados obtenidos se representan de forma gráfica en la Figura 3. En el eje de abscisas se representa el tiempo de supervivencia (en días), mientras que en el eje de ordenadas se representa el porcentaje de supervivientes.
Se observa que el Grupo Control (trazo continuo) presenta una supervivencia menor que el Grupo 1 tratado (trazo discontinuo), observándose diferencias significativas (test Log Rank, p=0,0147; test Gehan-BreslowWilcoxon, p=0,0052).
Los resultados reflejan una respuesta protectora después del tratamiento continuo de los animales infectados. Por lo tanto, se puede concluir que la administración de pautas tolerizantes por vía oral de M. bovis BCG inactivados, después de la infección por M. tuberculosis, aumenta la supervivencia de los animales al retrasarse la inducción de la enfermedad. Por ello, se considera que el uso de micobacterias inactivadas según la invención es apropiado como tratamiento preventivo de la tuberculosis al retrasar el paso de la infección latente a la infección activa.
Ejemplo 3.-Tratamiento oral tolerizante con bacilos de M. bovis BCG
inactivados, administrados pre-infección (efecto profiláctico)
Los bacilos inactivados de M. bovis BCG se prepararon siguiendo el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 2.
La efectividad de las micobacterias inactivadas se ensayó en ratones hembra de 6 a 8 semanas de edad del tipo C3HeB/FeJ, libres de patógenos específicos.
Los ratones se dividieron en dos grupos de 12 animales cada uno, y se sometieron al siguiente tratamiento:
1) Grupo Control: Sin tratamiento.
2) Grupo 1 (tratamiento pre-infección): Tratados por vía oral, mediante una
sonda gástrica, con 13 dosis de producto conteniendo las micobacterias
inactivadas, administradas 3 veces por semana (lunes, miércoles y
viernes) empezando 29 días antes de la infección. En cada dosis, se les administró un volumen de 0,3 mI. correspondiente a una dilución 1:1000,
lo que corresponde a 2,575 x 103 UFCs.
Al igual que en los ejemplos anteriores, para la infección se empleó la cepa virulenta de M. tuberculosis (H37Rv Pasteur), que se cultivó en medio Proskauer-Beck hasta una fase media logarítmica, y se conservó en alícuotas de 1 mi a una temperatura de -700 C hasta su utilización.
Los ratones se infectaron por vía endovenosa introduciendo un inóculo aproximadO de 5 x 104 bacilos viables.
Los animales se observaron y pesaron diariamente hasta que las condiciones del animal requerían su sacrificio, según el mismo procedimiento que se describe en la Tabla 1 del Ejemplo 1.
Los resultados obtenidos se representan de forma gráfica en la Figura 4. En el eje de abscisas se representa el tiempo de supervivencia (en días), mientras que en el eje de ordenadas se representa el porcentaje de supervivientes.
Se observa que el Grupo Control (trazo continuo) presenta una supervivencia menor que el Grupo 1 tratado (trazo discontinuo), observándose diferencias significativas, según el test Log Rank (p=0,0020) y el test GehanBreslow-Wilcoxon (p=0,0019).
Los resultados reflejan una respuesta protectora después de la inducción de tolerancia por administración oral de la micobacteria M. bovis BCG inactivada, previamente a la infección por M. tuberculosis, observándose que dicho tratamiento evita la inducción de la enfermedad en un alto porcentaje.
Ejemplo 4.-Efectividad de un tratamiento oral tolerizante con bacilos de M.
tuberculosis inactivados, administrados pre-infección o post
infección y monitorización de la tolerancia inducida mediante
análisis de las células T reguladoras en el bazo.
Los bacilos inactivados de M. tuberculosis (TOL-3) se prepararon siguiendo el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 1.
La efectividad de las micobacterias inactivadas se ensayó en
ratones hembra de 6 a 8 semanas de edad del tipo C3HeB/FeJ, libres de patógenos específicos. Los ratones se dividieron en tres grupos de 24 animales cada uno,
y se sometieron al siguiente tratamiento: 1) Grupo Control: Sin tratamiento. 2) Grupo 1 (tratamiento pre-infección): Tratados por vía oral, mediante una
sonda gástrica, con 5 dosis de producto conteniendo las micobacterias inactivadas, administradas cada 48 horas, empezando el día 10 antes de la infección, y posteriormente 3 veces por semana (lunes, miércoles y viernes) hasta el final del experimento. Se administró cada vez un volumen de 0,3 mi con una dilución 1 :1000.
3) Grupo 2 (tratamiento post-infección): Tratados por vía oral, mediante una sonda gástrica, con 5 dosis de producto conteniendo las micobacterias inactivadas, administradas cada 48 horas, empezando el día 11 después de la infección, y posteriormente 3 veces por semana (lunes, miércoles y viernes) hasta el final del experimento. Se administró un volumen de 0,3 mi en cada dosis, con una dilución 1:10.
Al igual que en los ejemplos anteriores, para la infección se empleó la cepa virulenta de M. tuberculosis (H37Rv Pasteur), que se cultivó en medio Proskauer-Beck hasta una fase media logarítmica, y se conservó en alícuotas de 1 mi a una temperatura de -700 C hasta su utilización.
Los ratones se infectaron por vía endovenosa introduciendo un inóculo aproximado de 1 x 105 bacilos viables.
La mitad de los animales de cada grupo (12) se preservaron para el estudio de la supervivencia. Los animales se observaron y pesaron diariamente hasta que las condiciones del animal requerían su sacrificio, según el mismo procedimiento que se describe en la Tabla 1 del Ejemplo 1.
En la Figura 5, en los gráficos 1 y 2, se muestran los resultados de supervivencia de los diferentes grupos experimentales. En el eje de abscisas se representa el tiempo de supervivencia (en días), mientras que en el eje de ordenadas se representa el porcentaje de animales supervivientes.
En el gráfico 1 se compara el Grupo Control (trazo continuo) con el Grupo 1 (trazo discontinuo), que fue sometido a un tratamiento iniciado previamente a la infección. Se observa que el grupo control presenta una supervivencia menor que el grupo tratado, con unos resultados estadísticamente significativos según el test Log Rank (p= 0,0011) Y GehanBreslow-Wilcoxon (p=0,0014).
En el gráfico 2 se compara el Grupo Control (trazo continuo) con el Grupo 2 (trazo discontinuo), que fue sometido a un tratamiento iniciado después de la infección. Se observa que el grupo control presenta una supervivencia menor que el grupo tratado, con unos resultados estadísticamente significativos según el test Log Rank (p=0,04541), mientras que según el test Gehan-Breslow-Wilcoxon las diferencias no son estad í sticamente sig n ificativas.
En ambos casos se concluye que los animales tratados con una pauta tolerizante con mico bacterias inactivadas sobreviven más tiempo tras la infección con M. tuberculosis que los animales no tratados.
Del resto de animales de cada grupo (12), la mitad se sacrificó a la semana 3 (6 animales por grupo) y la otra mitad a la semana 4 (6 animales por grupo) para el estudio de las células T reguladoras presentes entre los esplenocitos.
Según se describe en el artículo Faria et al., Oral toleran ce, Immunol. Rev., 2005, 206(1), 232-259, las células T reguladoras son un grupo de células claves en la inducción de tolerancia oral, que se definen como una población implicada en la regulación de la respuesta inmunológica, y que expresan los marcadores de membrana CD4 y CD25.
En el artículo 2003 Hori et al., Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3, Science, 2003, 299(5609), 105761, se describe que el factor de transcripción Foxp3 resulta clave para el desarrollo de las células T reguladoras. Por eso se considera que las células T con el fenotipo CD4+CD25+Foxp3+ tienen función reguladora.
Los animales se sacrificaron mediante dislocación cervical, previa anestesia inhalatoria con isofluorano. Se extrajeron los bazos y se obtuvieron
ll j 11 llll l ll ,
los esplenocitos mediante disgregación mecánica, filtración con separadores celulares (SD Falcon Cell Strainer, Nylon, 40 j..Im), y lisis de los eritrocitos. Se realizó el marcaje de los esplenocitos CD4 y CD25 de membrana, y Foxp3 intracelular mediante un Kit de marcaje de células T reguladoras (eSioscience),
5 y se analizaron mediante citometría de flujo (SD LSR-Fortessa cell analyzer). Los resultados se procesaron mediante el software de análisis SD FACSdiva.
En la figura 6 se han representado los porcentajes de células T reguladoras, aquéllas que tienen el fenotipo CD4+CD25+Foxp3+ respecto el total de células T CD4+, de los distintos tratamientos y el control, a semana 3
10 (gráfico 1) Y semana 4 (gráfico 2) post-infección. En el eje de ordenadas se representa el porcentaje de células T reguladoras. En el eje de abscisas se representan los distintos tipos de tratamiento y el control.
Los cuadrados representan animales no tratados (Grupo Control), los triángulos representan animales del grupo 1, tratados previamente a la
15 infección, y los círculos representan los animales del grupo 2, tratados posteriormente a la infección. Las líneas horizontales trazadas representan la media aritmética de cada grupo.
Se observa que, efectivamente, hay un aumento del porcentaje de células T reguladoras entre la semana 3 y la semana 4, sólo en los grupos 20 tratados de acuerdo con la pauta tolerizante, ya sea iniciada antes de la
infección con M. tuberculosis, o posteriormente a la misma.
Claims (14)
- REIVINDICACIONES1.-Uso de micobacterias inactivadas del grupo denominado Mycobacterium tuberculosis complex (MTB-C) que se eligen de entre el grupo formado por M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, y M. microti, y M. bovis BCG para la preparación de un medicamento para la prevención de la tuberculosis.
- 2.-Uso según la reivindicación 1, caracterizado porque: -las micobacterias se administran periódicamente por vía oral, -el intervalo entre las dosis no es superior a 5 días, y -el número de dosis administradas es de al menos 5.
- 3.-Uso según la reivindicación 2, caracterizado porque las micobacterias inactivadas se eligen entre M. tuberculosis, M. bovis y M. bovis BCG.
- 4.-Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque las micobacterias se inactivan mediante un proceso de calentamiento.
- 5.-Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el intervalo entre las dosis no es superior a 3 días.
- 6.-Uso según la reivindicación 5, caracterizado porque el intervalo entre las dosis no es superior a 2 días.
- 7.-Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el número de dosis administradas es de al menos 7.
- 8.-Uso ~egún la reivindicación 7, caracterizado porque el número de dosis administradas es de al menos 9.
- 9.-Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque la cada dosis comprende entre 103 y 1010 micobacterias inactivadas.
- 10.-Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque las micobacterias se administran en forma de una composición farmacéutica quecomprende las micobacterias inactivadas y al menos un excipiente farmacéutica mente aceptable.
- 11.-Uso según la reivindicación 10, caracterizado porque la composición farmacéutica 5 está en forma de cápsulas.
- 12.-Uso según la reivindicación 10, caracterizado porque la composición farmacéutica está en forma de comprimidos.10 13.-Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque se administra a un individuo infectado por M. tuberculosis en el que la infección se encuentra en estado latente.
- 14.-Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque se 15 administra a un individuo no infectado por M. tuberculosis.Figura 1100 80•L••,ttI,L.o100 80 60 40 20 o 3100 80 60 40 20 O100 80 60 40 20 20 30 40 50 60 70 80,•.., ,•lo.,,t.••20 30 40 50 60 70 80••..,•t.•
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