KR102018118B1

KR102018118B1 - 민물 김(Prasioloa japonica) 단세포 실내 배양방법

Info

Publication number: KR102018118B1
Application number: KR1020180028753A
Authority: KR
Inventors: 주성수
Original assignee: 강릉원주대학교 산학협력단
Priority date: 2018-03-12
Filing date: 2018-03-12
Publication date: 2019-09-04

Abstract

본 발명은 종래 기술인 민물 김의 포자배양과 차별화되는 민물 김(Prasiola japonica) 단세포 실내배양 방법을 이용하여 대량배양을 통해 희귀지역으로부터 생산되는 제한된 생물량(바이오매스)을 극복하고 약리활성이 높은 자연자원을 대량 확보할 수 있는 민물 김 단세포 실내 배양방법을 제공한다.

Description

민물 김(Prasioloa japonica) 단세포 실내 배양방법{Indoor cultivation method of Prasiola japonica single cell}

본 발명은 민물 김 단세포 실내 배양방법에 관한 것으로서, 더 상세하게는 자연에서 채취한 민물 김으로부터 분리하여 단세포로 대량배양이 가능한 민물 김 단세포 실내배양방법에 관한 것이다.

바다에 서식하는 김(laver)은 홍조류(red algae, Phylum rhodophyta)로서 주로 양식에 의해 가정 식탁에 오르는 해조류 식품이다. 반면, 바다가 아닌 하천에서 생장하는 녹조류(green algae, Phylum chlorophyta)인 Prasiola japonica는 바다가 아닌 소하천에서 자라며 예로부터 물김 또는 민물 김으로 구전되어 해당지역 주민들에게 산후조리 식품으로 애용되어온 지역산물이다. 우리나라에서는 대부분이 사라지거나 더 이상 채취가 되지 않는 종이나 강원도 삼척 소한천의 일부구역에서 민물 김이 자라 주민들이 식품으로 사용하고 있다. 이와 같은 국내 민물 김은 일본 후지산 인근과 큐슈지방에 자생하는 가와노리와 유전자 서열이 100% 일치하여 민물 김의 종명은 Prasiola japonica로 명명하였으며 유성생식과 무성생식을 통해 번식하여 연간 두 시기를 거쳐 생장한다. 계절적으로는 8월~10월에 부동포자에 의한 무성생식으로 증식하며, 11월에 접어들어 엽상체(thallus)에 자웅배우자가 나타나 모자익(mosaic)상을 형성한다. 또한 4월 중순에 접어들면 자웅배우자가 접합하여 6월 말 까지 엽상체로 성장하다가 단포자를 형성하면서 소멸된다. 민물 김의 서식에는 낮은 수온(11℃ 이상에서 발아, 13℃ 전후에서 활발히 증식)과 빠른 유속(평균유속 1.2m/sec) 등의 까다로운 서식환경을 요한다. 이와 관련하여 대한민국 등록특허 제1223232호는 정제수와 민물 김 엽체를 혼합하여 배양액을 제조하는 배양액 제조단계를 포함하는 민물 김의 양식방법에 대해 개시하고 있다.

그러나 상기 선행기술의 경우, 양식조건은 비교적 단순하나 민물 김의 독특한 생육조건 등을 고려하지 않아 대량생산에는 한계가 있다.

본 발명은 종래 민물 김의 포자배양과 차별화되는 민물 김 단세포배양을 통해 실내 배양기술을 접목하여 민물 김 엽상체와 유사한 생리활성물질을 대량 확보할 수 있는 민물 김 단세포 실내 배양방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 멸균 처리한 담수에 한천을 혼합하여 고체배지를 제조하는 고체배지 제조단계; 상기 고체배지에 채취한 민물 김(P. japonia)의 엽상체를 분쇄하여 도말한 후 배양하여 사상체를 형성시키는 고체배양 단계; 및 멸균 처리한 담수와 영양배지를 혼합하여 제조된 액체배지에 상기 사상체를 접종한 후 공기를 공급하여 단세포 상태를 유지하며 배양하는 액체배양 단계를 포함하는, 민물 김 단세포의 대량 배양방법이 제공된다.

상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 민물 김(Prasiola japonica) 단세포 실내배양 방법을 이용하여 규격화된 실내공간에서 민물 김 단세포 대량배양을 통해 희귀지역으로부터 생산되는 제한된 생물량(바이오매스)을 극복하고 약리활성이 높은 자연자원을 대량 확보할 수 있는 효과를 구현할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

도 1은 본 발명의 민물 김 엽상체의 고체배지 배양 결과를 나타내는 현미경 사진이다(100X). * A, B) 영양배지 첨가 배양군, C, D) 영양배지 무첨가 배양군, A, C) 배양 2일차, B, D) 배양 8일차. 화살표: 엽상체로부터 생장한 사상체.
도 2는 본 발명의 민물 김 고체배지 배양군 사상체의 염기서열 분석 결과를 나타내는 그림이다. *P. japonica NCBI 유전자 등록번호(gene accession number) KR261683.1과 100%의 상동성을 나타내었다.
도 3은 본 발명의 민물 김 엽상체로부터 생장한 고체배지 배양 사상체의 독립 계대배양 결과를 나타내는 현미경 사진이다(100X).
도 4는 본 발명의 민물 김 엽상체로부터 생장한 고체배지 배양 사상체 계대배양 후 2차 염기서열 분석 결과를 나타내는 그림이다. *P. japonica NCBI 유전자 등록번호(gene accession number) KR261683.1과 100의 상동성을 나타내었다.
도 5는 본 발명의 고체배지 배양 사상체의 도말 결과 나타난 단세포의 모습을 관찰한 현미경 사진이다. *A) 배양 1일차 관찰된 단세포(100X), B) 배양 14일차 관찰된 접합체(400X), 화살표: 완곡형 단세포.
도 6은 본 발명의 민물 김 액체배양 결과를 나타내는 사진이다. 공기주입과 영양배지가 공급되어야 단세포 형태의 민물 김 배양이 가능하다.
도 7은 영양배지 첨가용량별 민물 김의 배양 변화를 관찰한 사진이다. * 영양배지 A)1 mL/L, B)5 mL/L, C)10 mL/L, D)영양배지 10 mL/L 배양군의 현미경 관찰.
도 8은 본 발명의 민물 김 배양체를 관찰한 사진 및 이의 염기서열 분석 결과이다. 부유성 배양체는 민물 김과 상동성 100%의 염기서열을 가지는 단세포로 확인된 반면, 침전하여 벽면에 부착하여 자라는 배양체는 다른 종의 염기서열을 가지고 있음(Ankistrodemus와 93% 상동성).
도 9는 본 발명의 멸균여과 담수에 영양배지 5 mL/L로 처리하고 pH를 조정하여 배양하였을 때 나타나는 변화를 관찰한 사진이다. A)pH 5.5, B) 7.5, C) 11.5.

용어의 정의:

본 문서에서 사용되는 용어 "민물 김(Prasiola japonica)"은 녹조류의 일종으로 바다가 아닌 계곡에서 자생하며, 유속이 빠르고 햇빛이 정당하게 비치는 바위등에 붙어서 8월에서 10월 사이 무성생식으로 증식한다. 민물 김은 현재 세계적으로 우리나라의 삼척과 일본의 일부 지역(큐슈)에만 서식하는 것으로 알려져 있고 차고 맑은 민물에서만 서식하며 칼슘, 인, 아연 및 불포화지방산 함량이 바다 김에 비해 최대 4배 높은 것으로 알려져 있다.

본 문서에서 사용되는 용어 "엽상체(thallus)"는 줄기, 잎, 뿌리의 기관이 분화하지 않은 식물로서 관다발이 없는 단순한 구조이며 전체가 잎으로서의 작용을 하여 물과 양분을 흡수하고 광합성을 한다. 실이나 판 모양의 세포로 이루어졌으며, 크기는 다양하다. 김이나 미역 등의 조류, 균류, 기타 하등생물이 여기에 속한다.

발명의 상세한 설명:

상기 민물 김 단세포의 대량 배양방법에 있어서, 상기 영양배지는 NaNO₃ 90 내지 100 중량부, Na₂EDTA 30 내지 50 중량부, H₃BO₃ 25 내지 45 중량부, NaH₂PO₄·2H₂O 15 내지 35 중량부, FeCl₃·6H₂O 0.5 내지 2.5 중량부, MnCl₂·4H₂O 0.3 내지 0.5 중량부, ZnCl₂ 0.02 내지 0.04 중량부, CoCl₂·6H₂O 0.02 내지 0.04 중량부, (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.02 내지 0.04 중량부, CuSO₄·5H₂O 0.04 내지 0.06 중량부, 비타민 B₁(Thiamine) 0.04 내지 0.06 중량부 및 비타민 B₁₂(Cobalamin) 0.005 내지 0.02 중량부를 포함할 수 있다.

상기 민물 김 단세포의 대량 배양방법에 있어서, 상기 멸균 처리 담수 및 상기 영양배지의 혼합비율은 1:300 내지 1:500일 수 있다.

상기 민물 김 단세포의 대량 배양방법에 있어서, 상기 액체 배양단계는 15 내지 19℃ 온도 및 1000 내지 3000 lux의 조도로 배양할 수 있고 상기 액체 배양은 공기펌프를 이용한 공기부양식 배양일 수 있다.

본 발명자들은 점차 사라져가는 민물 김의 종 보존을 위해 지난 수 십 년간 다양한 양식기술개발(포자배양기술)을 통해 기본적인 종의 보존이 가능하게 되었으나 실외의 서식환경 유지, 공간 확보 및 민물 김의 독특한 생활사 등이 양식을 통한 대량생산에는 한계에 봉착해 있음을 인지하고 예의 노력한 결과 종래 민물 김의 포자배양과 차별화되는 민물 김 단세포배양을 통해 실내 배양기술을 접목하여 민물 김 엽상체와 유사한 생리활성물질을 대량 확보할 수 있는 신규한 민물 김 단세포 실내 배양방법을 개발하였다.

일반적으로 민물 김(P. japonica)은 생장을 위해 제한적인 독특한 서식환경(낮은 수온, 빠른 유속 및 풍부한 미네랄)을 요구하며 우리나라 남한의 삼척 소한천에서 유일하게 자생하는 녹조류로 생활환은 민물 김의 형태를 띠는 엽상체에서 자웅배우자가 나타나 단포자를 형성하면서 소멸하는 특징으로부터 포자배양이 가능한 것으로 보고되었으나 본 발명에서 제시하는 P. japonica 비포자 단세포 배양은 세계적으로 아직 보고된 바가 없어 생물다양성보존협약(convention on biological diversity)에 따르는 자원의 제한성에 무관한 기술일 뿐 아니라 본 발명자들의 선행 특허인 P. japonica의 '암 치료용 약학 조성물'특허(등록번호 10-1591401, 등록일 2016.01.28.)의 연계된 발명기술로서 규격화된 실내공간에서 P. japonica 단세포 대량배양을 통해 희귀지역으로부터 생산되는 제한된 생물량(바이오매스)을 극복하고 약리활성이 높은 자연자원을 대량 확보 할 수 있는 획기적인 기술이다.

이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예 및 실험예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예 및 실험예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1: 배양 재료

본 발명자들은 민물 김 단세포의 실내배양 기술의 개발을 위하여 실내배양에 사용한 민물 김 엽상체와 하천수(담수)는 강원도 삼척시 소한천에서 채취한 후 잡균제거를 위해 상기 채취한 엽상체를 앰피실린(ampicillin)과 카나마이신(kanamycin)을 각각 100 μg/mL 처리한 혼합액에 24시간 회전교반하였고, 담수는 121℃에서 15분간 고압증기멸균한 후 0.22 μm 여과지로 여과하여 최종 실내배양에 사용하였다. 또한 실내배양에 사용되는 액체배지는 코니배지(Conwy medium), 미량 금속 용액(trace metal solution) 및 비타민 혼합액(vitamin mix)을 하기 표 1과 같이 증류수 총 1 L 부피에 용해하여 준비하였다.

민물 김 실내배양 영양배지 조성표(단위 부피당 성분 함량)

성분명	함량 (g/L)
NaNO₃	100
Na₂EDTA	40
H₃BO₃	35
NaH₂PO₄·2H₂O	25
FeCl₃·6H₂O	1.5
MnCl₂·4H₂O	0.4
ZnCl₂	0.03
CoCl₂·6H₂O	0.03
(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O	0.03
CuSO₄·5H₂O	0.05
Vitamin B₁ (Thiamine)	0.02
Vitamin B₁₂ (Cobalamin)	0.01

실시예 2: 고체배양(사상체 분리)

상기 엽상체로부터 사상체의 생장을 유도하기 위해 사용된 고체배지는 멸균처리한 담수 부피당 0.8%의 박토아가(bacto agar)와 상기 표 1의 영양배지 1 mL/L를 혼합하여 제조하였고 상기 제조된 고체배지에 엽상체 1x1 cm(가로ㅧ세로)를 슬라이스하여 배지에 도말한 후 18℃, 2000 lux의 온도와 조도에서 배양하였다. 그 후 엽상체로부터 생장한 사상체는 2차 증식을 위해 사상체만을 분리하여 동일한 배지에 동일한 조건으로 4~5일 동안 배양하였다.

실시예 3: 액체배양(단세포 분리)

상기 고체배양에서 생성된 민물 김 사상체를 상기 표 1의 영양배지 2.5 mL/L가 혼합된 멸균처리 담수 500 mL의 유리병에 접종하였고 공기펌프를 이용한 공기부양식 배양을 수행하였으며 배양 기간 동안 18℃, 2000 lux의 온도와 조도를 유지하였다. 그 후, 상기 배양한 민물 김 단세포는 탁도 1 이상(600 nm) 색도는 초록색에 가까운 상태를 대수기로 정하고 1:10의 비율로 계대배양을 수행하였으며, 세균 등 미생물의 오염 방지를 위해 150 μg/mL의 농도로 앰피실린(ampicillin)을 첨가하였다.

실시예 4: 염기서열 확인

본 발명자들은 상기 수득한 민물 김 엽상체로부터 분리된 단세포의 염기서열을 확인하기 위해 배양 종료 후 단세포 펠렛으로부터 총 세포 DNA(total cell DNA)를 추출하였다. 보다 높은 수율로 DNA를 추출하기 위해 리티케이즈(lyticase)와 리소자임 및 인트론사의 I-genomic plant DNA extraction 키트를 이용하였다. 그 후 최종으로 확보한 DNA를 주형으로 하여 민물 김(P. japonica)의 ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxigenase large subunit(rbcL, NIBRCL0000100964-8) 프라이머를 제작하였고 그래디언트 중합효소 연쇄반응(gradient PCR)을 통해 해당 유전자를 증폭하였다.

상기 PCR을 통해 증폭된 유전자는 1.2% 아가로스겔에 로딩하여 약 500bp의 밴드를 확인한 후 DNA를 추출하고 T-easy 벡터시스템을 이용한 클로닝을 수행하였다. 즉, pGEM^?? T-easy vector 1 μL, T4 DNA ligase 1 μL, 2X rapid ligation buffer 5 μL (Promega, USA), 및 상기 확보한 유전자 150 ng을 반응액으로 조성한 후 상온에서 1시간 동안 반응하였다. 반응 종료 후 DH5α competent cell (RBC, Taiwan) 100 μL에 상기 반응액을 모두 첨가하여 4℃에서 20분 반응하였고 42℃에서 30초간 열충격(heat shock) 처리 후 다시 42℃에서 20분 반응하여 DH5α 대장균 세포의 형질전환을 유도하였다. DH5α 대장균 세포의 형질전환 여부를 확인하기 위해 고체배지에는 앰피실린, 아이피티지(IPTG, isopropyl-1-thio-β-galactopyranoside), 엑스갈(X-gal)이 함유된 루리아버타니(Luria-burtani)이 포함되도록 도말하였고 그 후 37℃에서 16시간 배양하여 흰색 군체(white colony)를 선별하는 락 선별(Lac selection)을 수행하였다. 그 후 형질전환이 성공적으로 유도된 DH5α 대장균 세포 군체는 앰피실린(100 μg/mL)이 함유된 액제배지에서 16시간 추가 배양하여 충분한 양의 세포를 확보하였고 rbcL 유전자가 삽입된 플라스미드 추출은 HiYield^TM Plasmid Mini kit(RBC, Taiwan)을 이용하여 확보하였으며, 삽입 유전자 확인은 EcoRI 제한효소를 처리하여 약 500 bp의 유전자를 확인하였다. 아울러 염기서열 분석은 솔젠트(SolGent, Korea)에 의뢰하여, 유전자 매칭분석을 통해 확인하였다. 상기 PCR 반응에 사용된 프라이머의 핵산서열을 하기 표 2에, PCR 반응 조건은 하기 표 3에 요약하였다.

PCR에 사용한 프라이머 서열

프라이머	핵산서열 (5`→3`)	위치	서열번호
rbcL_F	AGTTCCGGCTGAAGAATGT	111~130	1
rbcL_R	CGCATAAATGGTTGTGAG	591~608	2

PCR 반응 조건

단계	온도	시간
First denaturation	95℃	5 min
Denaturation	95℃	30 sec
Annealing	47~54℃	30 sec
Extension	72℃	30 sec
Final extension	72℃	10 min
Holding	16℃	Infinite

실험예 1: 고체배양 결과

본 발명의 일 실시예에 따라 박토아가 0.8% 함유된 담수 고체배지에 민물 김 엽상체를 접종하여 2일간 배양한 결과 상기 표 1의 영양배지(1 mL/L)가 첨가된 실험군(A, B)과 첨가되지 않은 대조군(C, D) 모두에서 엽상체 주변으로 사상체가 생장하는 것을 확인하였다(도 1). 상기 영양배지가 첨가된 고체배지에서 자란 사상체는 곧은 형태로 뻗어나가며 생장하였으나 영양배지가 첨가되지 않은 고체배지에서 자란 사상체는 불규칙한 형태의 생장을 나타냈다. 또한, 유전자 염기서열 분석 결과 영양배지 추가여부에 따른 사상체의 생장 형태 차이에도 불구하고 야생 민물 김과 고체배지에서 자라난 사상체는 동일한 종으로 나타났다(도 2). 아울러, 민물 김 엽상체로부터 생장한 사상체의 독립생장여부를 확인하기 위해 사상체 형태를 띠는 일부를 영양배지(1 mL/L)가 첨가된 고체배제에 옮겨 배양한 결과 유사한 생장 양상을 나타내었으며 유전자 서열분석결과 야생 민물 김과 동일한 것으로 확인되어 민물 김으로부터 단세포 분리 배양이 성공적으로 진행된 것을 확인하였다(도 3 및 4). 또한 추가 배양을 통해 확보한 사상체를 새로운 고체배지에 얇게 도말한 후 배양한 결과 다수의 만곡형 단세포(A)를 확인하였으며 이를 약 2주간 연속하여 배양한 결과 단세포들이 서로 접합하는 특징(B)을 나타내어 무성 및 유성생식을 하는 민물 김의 생활환으로 회귀하여 포자 발생도 가능할 것으로 분석되었다(도 5).

실험예 2: 액체배양 결과

본 발명의 일 실시예에 따라 멸균 여과한 담수에 상기 표 1의 영양배지를 1, 5, 10 mL/L의 농도로 첨가하여 공기부양식 배양을 수행한 결과 5 mL/L 농도의 영양배지를 첨가한 실험군에서 최적의 녹색 단세포 생장을 확인하였고(도 6) 고농도인 10 mL/L 영양배지 첨가군은 엽상체로부터 생장하는 사상체 형태로 생장하여 단세포 생장 조건을 충족하지 못하였다(도 7).

따라서 본 발명의 단세포 실내 배양방법의 최적 조건인 1) 멸균여과 담수, 2) 영양배지 5 mL/L, 3) 공기부양식 배양, 4) 수온 15~18℃ 및 5) 조도 2000 lux로 배양한 부유성 단세포로부터 추출한 총 세포 DNA(total cell DNA)를 주형으로 민물 김(P. japonica)의 ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxigenase large subunit(rbcL) 유전자를 증폭하여 염기서열 분석을 수행한 결과 민물 김 유전자와 100% 동일한 서열이 확인되어 단세포 분리배양이 성공적으로 진행되었음을 확인하였고, 동시에 배양되는 침전 또는 부착성 세포는 녹조류의 일종인 Ankistrodemus와 93% 상동성을 나타내어 야생의 민물 김과 함께 공생하는 종으로 확인되었다(도 8). 또한, 배양액의 pH 조건을 확인하기 위해 산성에서 알칼리성 순으로(pH 5.5, 7.5, 11.5) 구배하여 배양한 결과 산성에서는 생장저해를 나타내었고 알칼리성 조건에서는 활발한 생장활성을 나타내어 액체배양의 최적 pH는 9.5 전후임을 파악하였다.

결론적으로 본 발명의 민물 김(P. japonica) 단세포 실내 배양방법은 종래 기술인 민물 김의 포자배양과 차별화되는 민물 김 단세포 배양을 규격화된 실내공간에서 민물 김 엽상체와 유사한 생리활성물질을 대량 확보할 수 있으므로 희귀지역으로부터 제한된 생산량을 극복하고 약리활성이 높은 자연자원을 대량확보하는데 활용 가능하다.

본 발명은 상술한 실시예 및 실험예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예 및 실험예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

<110> GANGNEUNG-WONJU NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMY COOPERATION GROUP <120> Indoor cultivation method of Prasiola japonica single cell <130> PD18-5630 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rbcL_F <400> 1 agttccggct gaagaatgt 19 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rbcL_R <400> 2 cgcataaatg gttgtgag 18

Claims

멸균 처리한 담수에 한천을 혼합하여 고체배지를 제조하는 고체배지 제조단계;
상기 고체배지에 채취한 민물 김(P. japonia)의 엽상체를 분쇄하여 도말한 후 배양하여 사상체를 형성시키는 고체배양 단계; 및
멸균 처리한 담수와 영양배지를 혼합하여 제조된 액체배지에 상기 사상체를 접종한 후 공기를 공급하여 단세포 상태를 유지하며 배양하는 액체배양 단계를 포함하는, 민물 김 단세포의 대량 배양방법.
제1항에 있어서,
상기 영양배지는 NaNO₃ 90 내지 100 중량부, Na₂EDTA 30 내지 50 중량부, H₃BO₃ 25 내지 45 중량부, NaH₂PO₄·2H₂O 15 내지 35 중량부, FeCl₃·6H₂O 0.5 내지 2.5 중량부, MnCl₂·4H₂O 0.3 내지 0.5 중량부, ZnCl₂ 0.02 내지 0.04 중량부, CoCl₂·6H₂O 0.02 내지 0.04 중량부, (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.02 내지 0.04 중량부, CuSO₄·5H₂O 0.04 내지 0.06 중량부, 비타민 B₁(Thiamine) 0.04 내지 0.06 중량부 및 비타민 B₁₂(Cobalamin) 0.005 내지 0.02 중량부를 포함하는, 방법.
제1항에 있어서,
상기 액체배양 단계에서 멸균 처리한 담수 및 영양배지의 혼합비율은 1:300 내지 1:500인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 액체배양 단계는 15 내지 19℃ 온도 및 1000 내지 3000 lux의 조도로 배양하는, 방법.
제1항에 있어서,
상기 액체배양은 공기펌프를 이용한 공기부양식 배양인, 방법.